基于结构的O-GlcNAc转移酶抑制剂的虚拟筛选
CHINESE JOURNAL OF CHEMICAL PHYSICS MAY24,2016
ARTICLE
Virtual Screening of Human O-GlcNAc Transferase Inhibitors
Qing-tong Zhou a,b,Hao-jun Liang a?,Eugene Shakhnovich b?
a.Department of Polymer Science and Engineering,CAS Key Laboratory of Soft Matter Chemistry,
University of Science and Technology of China,Hefei230026,China
b.Department of Chemistry and Chemical Biology,Harvard University,Cambridge MA02138,USA
(Dated:Received on October14,2015;Accepted on December10,2015)
O-GlcNAc transferase(OGT)is one of essential mammalian enzymes,which catalyze the
transfer of N-acetylglucosamine from UDP-N-acetylglucosamine(UDP-GlcNAc)to hydroxyl
groups of serines and threonines(Ser/Thr)in proteins.Dysregulations of cellular O-GlcNAc
have been implicated in diabetes,neurodegenerative disease,and cancer,which brings great
interest in developing potent and speci?c small-molecular OGT inhibitors.In this work,we
performed virtual screening on OGT catalytic site to identify potential inhibitors.7134792
drug-like compounds from ZINC(a free database of commercially available compounds for
virtual screening)and4287550compounds generated by FOG(fragment optimized growth
program)were screened and the top116compounds ranked by docking score were analyzed.
By comparing the screening results,we found FOG program can generate more compounds
with better docking scores than ZINC.The top ZINC compounds ranked by docking score
were grouped into two classes,which held the binding positions of UDP and GlcNAc of UDP-
https://www.wendangku.net/doc/ff10833873.html,bined with individual fragments in binding pocket,de novo compounds were
designed and proved to have better docking score.The screened and designed compounds
may become a starting point for developing new drugs.
Key words:O-GlcNAc transferase,Virtual screening,Inhibitors,ZINC,FOG,Drug design
I.INTRODUCTION
O-linked N-acetylglucosamine cylation(O-GlcNAcylation)[1]is one kind of protein post-translational modi?cation.Due to its important e?ect on protein stability,subcellular localization, phosphorylation and ubiquitination,the dysregulation of cellular O-GlcNAc has been implicated in diabetes, neurodegenerative disease and cancer.There are two enzymes responsible for the regulation of O-GlcNAc: one is O-GlcNAc transferase(OGT),the other is O-GlcNAc hydrolase(OGA)which cleaves the glycosidic bond that reverses the modi?cation.OGT is comprised by a multidomain catalytic region,an N-terminal region with di?erent numbers of tetratricopeptide repeats(TPRs)and a linker region.TPRs are far from the catalytic site and not essential for glycosyl transfer onto acceptor peptides,while it is thought to be closely related to OGT subcellular localizations.There are at least three di?erent isoforms of human OGT: nucleocytoplasmic OGT(ncOGT)contains12.5TPRs, mitochondrial OGT(mOGT)contains9.5TPRs and short OGT(sOGT)2.5TPRs.Given the importance of ?Authors to whom correspondence should be addressed.E-mail: hjliang@https://www.wendangku.net/doc/ff10833873.html,,shakhnovich@https://www.wendangku.net/doc/ff10833873.html,,Tel./ FAX:+86-551-63607824O-GlcNAc modi?cations in signaling pathways,several potent and selective human O-GlcNAc transferase (hOGT)inhibitors were designed.Alloxan is the?rst reported hOGT inhibitor[2],which is thought to inhibit hOGT by binding to the uracil binding pocket or alternatively has been proposed to act through a covalent modi?cation of cysteine residues.Besides, benzyl2-acetamido-2-deoxy-α-D-galactopyranoside (BAGDP)is reported to perturb O-GlcNAc in cells, while it is not clear whether it could selectively inhibit OGT in cells.Several crystal structure of OGT bound with UDP-GlcNAc analogs[3–6]including UDP-5SGlcNAc,UDP-S-GlcNAc,UDP-GlcNAcF3, S P-αS-UDP-GlcNAc,R P-αS-UDP-GlcNAc were deter-mined to reveal the mechanisms of GlcNAc transfer and substrate recognition.Experimental high-throughput screening(HTS)[7–9]has been greatly involved in hOGT inhibitors discovery and identi?ed several novel hOGT inhibitors,while the challenge of building robust nonradiometric assay strategies to detect glycosylation limits its application.
With the development of computational chemistry and biology[10–13],virtual screening[14–19]is be-coming increasing important in identifying novel com-pounds in many drug discovery projects.Recently,sev-eral computational techniques like molecular dynamics simulation[20,21],molecular docking[22–24],QSAR [25],pharmacophore designing[25–27]have been de-veloped to speed up the drug discovery process.As
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the chemical space of all possible chemical structures is extraordinarily large,it is reasonable to screen a drug target against a selection of chemicals which cover as much of the appropriate chemical space as possible.To address that,chemical libraries can be classi?ed as di-verse oriented,drug-like,natural product-like,and tar-geted against a speci?c family of biological targets such Kinases,GPCRs,PPI etc.ZINC[28](drugs now)is one widely-used database containing only compounds with drug-like properties(“Lipinski’s rule of?ve”)[29]. FOG library is prepared by fragment optimized growth (FOG)program[30]in Shakhnovich group,which sta-tistically biases the growth of molecules with desired features,such as stability in water,synthetic accessi-bility,or druglikeness[31].Here FOG(FDA approved drugs)was prepared by generating new compounds in a chemical space that is similar to the compounds that were trained on2713drugs from Hutter database,which has better druglikeness than with a random growth. The present study was to search for potential in-hibitors for OGT started from FOG and ZINC com-pound database.We chose one of the best molecular docking programs available currently GLIDE[32]and performed virtual screening to identify the potential in-hibitors.We investigated the practical application of FOG and found FOG library contains more compounds with better docking scores than ZINC.By the combina-tion of individual fragments in binding pocket,we de-signed new compounds with better docking score,which could be a start-point for lead optimizations.
https://www.wendangku.net/doc/ff10833873.html,PUTATIONAL DETAILS
A.Protein and grid preparation
The crystal structure of hOGT with UDP-GlcNAc (PDB ID:4GZ5)[3,33]determined a resolution of 3.08?A was retrieved from the Protein Data Bank.We adopted the hOGT with UDP(PDB ID:3PE3)and UDP-5SGlcNAc(PDB ID:4GZ6)complexes as refer-ences.The structures were prepared using the pro-tein preparation wizard of Schr¨o dinger module.OPLS-2005force?eld was used for energy minimization to ac-quire an energetically stable geometry.Hydrogen atoms were added to the protein to correct ionization and tau-tomeric states of amino acid residues.The shape and properties of the receptors were represented on a grid by several di?erent sets of?elds that provide progres-sively accurate scoring of the ligand poses using Recep-tor Grid Generation Panel.We have generated the grid that covers all the catalytic residues with peptide in the cavity.
B.Ligand library preparation
The ligand library including7134792drug-like compounds was extracted from the ZINC database (https://www.wendangku.net/doc/ff10833873.html,/subsets/drugs-now).FOG li-brary is composed by4287550compounds generated by FOG program.These compounds were prepared in Lig-Prep Wizard where hydrogens were added and followed by minimization and optimization in OPLS?2005force ?eld,while the original chirality were retained.
C.Virtual screening study
Virtual Screening Work?ow in Maestro was used to dock the lead-like compounds to identify potential lig-ands.The Glide(grid-based ligand docking with en-ergetic)algorithm approximates a systematic search of positions,orientations,and conformations of the lig-and in the receptor binding site using a series of hier-archical?lters.There are three di?erent level of dock-ing precision,namely high throughput virtual screening (HTVS),standard precision(SP)and extra precision (XP).The XP glide scoring function[32]is presented in Eq.(1)while the favorable binding terms and unfa-vorable terms are presented in Eq.(2)and Eq.(3),re-spectively.
Glide XP docking score=E coul+E vdW+
E bind+E penalty(1)
E bind=E hyd-enclosure+E nb-nn-motif+E hb-cc-motif+
E PI+E hb-pair+E phobic-pair(2)
E penalty=E desolv+E ligand-strain(3) The contributions from the Coulomb and van der Waals protein-ligand interaction energies by Schr¨o dinger’s “active-site mapping”technology are E coul and E vdW.
E hb-pair is standard ChemScore-like hydrogen bond term while E phobic-pair is lipophilic pair term.To im-prove the accuracy of favorable binding terms E bind,hy-drophobic interactions enclosure E hyd-enclosure,special neutral-neutral hydrogen-bond motifs E nb-nn-motif,spe-cial charged-charged hydrogen-bond motifs E hb-cc-motif, andπstacking andπ-cation interactions rewarded terms E PI were introduced to the score function.Strain energy of the ligand and/or protein,loss of entropy of ligand and protein,and desolvation of the ligand or protein are adverse to the binding,thus E desolv(rapid docking of explicit waters)and E ligand
?strain
(contact penalties)were developed to penalize XP binding score. Compared with other docking programs[11],Glide has the advantage on?nding the correct binding modes for a large set of test cases,especially the predicted binding poses have lower RMS deviations from na-tive co-crystallized structures.As a complete solution for ligand-receptor docking,Glide is continuously op-timized to improve speed and accuracy.Thus in the current work,Glide was adopted to perform ligand-receptor docking.
All compounds was?rst screened on chain D of4GZ5 through HTVS stage,then the top8%from ZINC and the top15%from FOG were subjected to SP stage.Af-ter SP docking,the top5%from ZINC and the top6%
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Inhibitors FIG.1Docking score of UDP-GlcNAc analogs and experimental discovered inhibitors by Glide XP.
from FOG were subjected to XP docking(Table I).Fi-nally,we selected the top116ranked by docking score compounds and performed multiple receptor conforma-tions docking to model protein?exibility[34],i.e.,we docked them to other11OGT receptors(chain A,B,C of4GZ5,chain A,B,C,D of4GZ6and3PE3)to obtain averaged docking score.
III.RESULTS AND DISCUSSION
A.Virtual screening
UDP-GlcNAc analogs and several experimental OGT inhibitors[7,8,35]were docked to OGT to evaluate the performance of docking program Glide.As presented in Fig.1,there were obvious di?erence in docking score be-tween UDP-GlcNAc analogs and experimental discov-ered inhibitors.We found the predicted binding confor-mations of UDP-GlcNAc analogs are in consistent with experimental crystal structures,the averaged docking score of UDP and UDP-GlcNAc on twelve receptors (chain A,B,C,and D of4GZ5,4GZ6and3PE3)are ?12.40(the more negative,the better)and?15.91,re-spectively.The?rst reported hOGT inhibitor alloxan (IC50=18±1μmol/L)has an averaged docking score
?7.56(the lowest is?8.74,chain C of4GZ5),which supports the thought that alloxan is an e?cient binder in terms of ligand e?ciency[35].Three validated OGT inhibitors discovered through HTS[8]were docked to OGT with docking score ranged from?4.38to?6.30, which agrees with their IC50values between0.9and20μmol/L.In current research,we chose UDP,the docking score is?12.40,as one reference.
The top ten FOG and ZINC compounds are listed in Table II.The averaged docking score of FOG have TABLE I Screened ligand library in virtual screening study. Subset of FOG are named according to molecular weight (M W),like MW-250is comprised by the compounds whose molecular weight ranged from250g/mol to300g/mol.
Compound number
Library For HTVS For SP For XP FOG-MW-2506958331066008710 FOG-MW-3006381571035008425 FOG-MW-350566766922007635 FOG-MW-400401864609005020 FOG-MW-450435734667005460 FOG-MW-500385327587004220 FOG-MW-600405481682005910 FOG-MW-700332941592004270 FOG428755068420059100 ZINC-P0636579050926326787 ZINC-P1769002615204398 ZINC(drug now)713479257979331185
ranges of?10.41to?11.17,while ZINC is?9.75to ?11.20.The lowest docking score on chain D of4GZ5 are?12.97and?13.39for FOG and ZINC,respectively. As presented in Fig.2,we found,sorted by the aver-aged docking score,FOG contain more compounds with lower docking score than ZINC,which demonstrated the advantage of FOG in library preparation during virtual screening.Unfortunately,the best ZINC and FOG compounds isolated by HTVS have higher dock-ing score than UDP,which means these compounds can hardly compete with UDP(IC50=1.8±1.0μmol/L)in
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al. FIG.2(a)Distribution of FOG and ZINC library over the values of docking score at XP stage.MW-250library is generated by FOG program and comprised by the compounds whose molecular weight ranged from250g/mol to300g/mol.
(b)Comparison of the averaged docking score for the top116FOG and ZINC compounds.
TABLE II Docking score of the top ten compounds from FOG and ZINC Library.The averaged docking scores of the twelve receptors(chain A,B,C and D of4GZ5,4GZ6and 3PE3)were determined,listed as“twelve grids”.FOG com-pounds whose molecular weight are lower than500g/mol are chosen to compare with ZINC library.
FOG(M W≤500g/mol)ZINC(drugs now) Rank4GZ5-D Twelve grids4GZ5-D Twelve grids 1?12.97?11.17?13.39?11.20
2?12.62?10.88?12.60?10.80
3?12.61?10.87?12.58?10.58
4?12.24?10.78?12.41?10.30
5?12.12?10.77?12.41?10.03
6?12.09?10.67?12.25?9.998
7?11.97?10.60?12.24?9.945
8?11.96?10.52?12.22?9.94
9?11.96?10.45?12.20?9.79
10?11.90?10.41?12.14?9.75
the binding site.To address this question,we performed virtual screening based drug design.
B.FOG and ZINC
FOG program generated new compounds by adopting the parameters which were trained on Hotter database (2713drugs),thus the produced compounds enjoy the desired features such as druglikeness,stability in water, while there’s not clear in its performance during vir-tual screening.To evaluate practical value of FOG in drug screening,we compared it with ZINC at two as-pects:docking score distribution and fragment novelty of chemical compounds.
At HTVS stage,only74.4%compounds from FOG can be docked to OGT while that value for ZINC is 95.3%.At SP stage,we found as the MW of FOG compounds increasing,the distribution of docking score move to the left,that means the compounds with higher MW tend to have lower docking scores.At XP stage, ZINC compounds concentrated in the range from?6 to?8.5,while FOG is more widely distributed.1.04% of XP-screening ZINC compounds have lower docking score than?10.As MW of FOG compound increased, the percentage of compounds that located at low score region(docking score
As presented in Fig.3,the top three ZINC compounds (chain D of4GZ5)shared2-hydroxybenzimidazole group,which form hydrogen bonds with Ala896,π-πstacking interaction with Phe868,His901.Among 116best ZINC compounds,the functional group2-hydroxybenzimidazole were observed sixteen times,and most of them occupied identical position in the bind-ing pocket.As for the best three FOG compounds, there are distinctly structural diverse but could strongly interact with the residues around the binding pock-ets,which bring the low docking score.We performed structure-based clustering in a hierarchical manner for the top116FOG and ZINC compounds using JKlustor [36].116best ZINC compounds were clustered into8 top level cluster count and45top cluster count while 116best FOG compounds were clustered into15top
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Inhibitors FIG.3Chemical structures of three OGT inhibitors with highest docking scores from ZINC and FOG virtual screening. Docking score is based on the receptor chain D of4GZ5.
level cluster count and112top cluster count.Thus FOG program have generated more novel fragments when compared with ZINC,which would be of great importance for further drug design.
C.Drug design
Although screened ZINC(drugs now)library has drug-like properties(“Lipinski’s rule of?ve”)that ex-pected to have satisfactory physicochemical properties as drug candidates,the best compounds like ZINC-32, ZINC-11,ZINC-14have about2?3higher docking score than that of UDP,that means they are poor lead com-pounds for drug discovery because of the high IC50. Therefore,we decided to make chemical modi?cations on the identi?ed inhibitors to design more potent OGT inhibitors with at least UDP-level inhibitory activity. The best docked compounds from ZINC were grouped into two classes which held the binding positions of UDP and GlcNAc of https://www.wendangku.net/doc/ff10833873.html,pounds like ZINC-11,ZINC-22,ZINC-80,and ZINC-89formed hy-drogens bonds with Thr560,Leu653,His920,Thr921, Thr922of OGT in the same positions of the GlcNAc part of UDP-GlcNAc,which formed hydrogens bonds with Thr560,Leu653,His498,Gly654,His920and Thr921.The docked conformations of other compounds have signi?cant overlap with the UDP of UDP-GlcNAc. Take ZINC-14for an example,2-hydroxybenzimidazole group form hydrogen bonds with Ala896,π-πstack-ing interaction with Phe868,His901,while nucleotidase uracil of UDP form hydrogen bond with Ala896and is surrounded by Phe868,His901.The pyrophosphate group and the pentose sugar ribose of UDP contribute nine hydrogens bonds with Lys842,Lys898,His920, Thr921,Thr922,Asp925.Limited by the number of hydrogen bonds donors and acceptors,ZINC-14form ?ve hydrogen bonds with Gln839,Thr921,His920,and Thr922.The di?erent orientation of potential ZINC in-hibitors distributed in the binding pocket brings the probability of linking individual fragments to design new inhibitors.
Following compound combination strategy,we de-signed a new compound D230-211(Fig.4),which is the combination of ZINC-11and ZINC-14.As shown in Table III,the averaged docking scores of ZINC-11and ZINC-14are?11.20and?9.65,respectively.The de novo designed compound D230-211has much better docking score,?12.22,which is very close to UDP.That means the designed compound can inhibit OGT catal-ysis activity similar to UDP.But compared with UDP-GlcNAc’s docking score(?15.91),the designed com-pound is far from full inhibition of OGT activity,that means the dose could be reasonable high.Nonetheless, current design strategy can be applied for general drug design projects.
IV.CONCLUSION
O-GlcNAc transferase(OGT)is one of essential en-zymes in protein glycosylation regulations.In this work,
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al. FIG.4Binding poses of two ZINC compounds(ZINC-14and ZINC-11),which occupied two di?erent regions of theOGT catalytic site.As the combination of two compounds,de novo compounds D230-211was designed and proved to have better docking score,which suggest a good strategy in further drug design.
TABLE III Docking score of de novo compounds designed by compound combination strategy.
Name4GZ5-chain D Twelve grids UDP?14.10?12.40 UDP-GlcNAc?17.14?15.91 ZINC-11?12.13?11.20 ZINC-14?11.89?9.65
D230-211?12.91?12.22 Note:4GZ5-Chain D is the docking score performed on the chain D of4GZ5while the“twelve grids”is the averaged docking score on twelve receptors(chain A,B,C and D of 4GZ5,4GZ6and3PE3).
we performed virtual screening on ZINC(drugs now) and FOG compound library to identify OGT inhibitors. Through the XP docking on UDP-GlcNAc analogs,we veri?ed that Glide can correctly predict the binding con-formations with very low docking score.We found that all of ZINC and FOG compounds have higher docking score than UDP and UDP-GlcNAc,which suggest the potential inhibitors do not naturally exist in the library. Following compound combination strategy,compound D230-211,whose docking score is close to UDP,were designed and could be used as a start point for further lead optimization.We investigated the practical value of FOG in drug screening from the aspects:docking score distribution and novelty of chemical compounds. We found FOG library generate more compounds with better docking scores and present remarkable structure diversity simultaneously,which will be of great practical signi?cance to drug screening.
V.ACKNOWLEDGMENTS
This work is supported by the FAS Division of Sci-ence,Research Computing Group at Harvard Uni-versity and the Supercomputing Center of USTC by the National Natural Science Foundation of China (No.20934004and No.91127046),the National Insti-tutes of Health(No.GM068670),and the China Schol-arship Council.
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Nature469,564(2011).
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Shoichet,Nature Chem.6,575(2014).
[35]H. C.Dorfmueller,V.S.Borodkin, D. E.Blair,S.
Pathak,I.Navratilova,and D.M.van Aalten,Amino Acids40,781(2011).
[36]JKlustor,https://www.wendangku.net/doc/ff10833873.html,,ChemAxon:J.
Chem.11.2.0,(2015).
DOI:10.1063/1674-0068/29/cjcp1510211c?2016Chinese Physical Society
抑制肿瘤细胞增殖的药物筛选方法
抑制肿瘤细胞增殖的药物筛选方法 09级生科3班余振洋200900140156 一、【实验原理】 1．关于恶性肿瘤和抗肿瘤药物： 恶性肿瘤是一种常见病，严重威胁着人类的生存质量，被称为人类健康的第一杀手。多年来人类一直在不断的进行抗肿瘤药物的研究，抗肿瘤药物的筛选是整个研究过程中很重要的个环节，而进行药物的筛选首先离不开合理的筛选方法和系统。寻找选择性强、对实体瘤有效的新型抗肿瘤药物，是摆在抗肿瘤药物研究人员面前的重要任务。世界各国对抗肿瘤药物的筛选都非常重视，投入了大量的人力、物力、财力，每年都有大量的化合物(合成药、天然产物和微生物发酵产物)待筛，抗肿瘤药物筛选方法的发展经历了一个探索的过程。 8O年代中期以前，普遍采用的筛选方法是以体内小鼠白血病／淋巴瘤模型P388和L1210为基础的 J，所有化合物在进一步的临床研究之前必须通过这种小鼠肿瘤模型的筛选。即小鼠白血病P388和L1210作为第一轮初筛，能通过第一轮初筛的化合物才能被允许进入第二轮筛选。这种方法有一个很明显的缺陷就是一些在临床上有活性的药物将被筛选掉，无法保证所有具有抗肿瘤作用的药物都能通过筛选。鉴于以前的筛选方法存在较大的缺陷，1985年之后以NCI为首的一些研究单位普遍开始采用针对疾病的筛选方法来代替针对化合物的筛选方法，即放弃体内小鼠筛选，代之为体外代表各种常见实体瘤的人类肿瘤细胞株筛选。这种筛选系统是一种高通量的抗肿瘤筛选体系，其主要优势有两点：其一是多种细胞株初筛有可能筛选出对特殊的人类肿瘤或对特殊组织亚型有活性的物质；其二是这种体外筛选尤其适合于复杂天然产物提取物中有效成份的证实，过去动物筛选需较大量的天然产物，而现在天然产物的需要量就大大减少，可以指导有效成份的进一步分离纯化，使得从天然产物中发现新的抗肿瘤药物更加便利。 2．关于筛选方法： 下面为现阶段较为普遍采用的一些抗肿瘤药物的筛选方法的实验原理。 1）以端粒酶活性为作用靶点筛选抗肿瘤药物 端粒是染色体特殊结构，起着保护染色体的完整和稳定性的作用，端粒酶是一种核糖核蛋白返转录酶，由RNA和蛋白质组成，可以以自身的RNA为模板合成端粒末端。已发现在正常的体细胞和良性肿瘤组织中端粒酶活性是阴性，而在人体恶性肿瘤组织和人的肿瘤细胞株中都表达了很高的活性。因此，认为端粒酶与恶性肿瘤的发生发展有密切的关系，有可能成为肿瘤治疗的靶点。 2）应用快速荧光素测定法筛选抗肿瘤药物 快速荧光素测定法是一种近几年发展起来的应用非常广泛的体外药物敏感性测定方法，其原理为采用一些特殊的荧光染料，对细胞的特定成份进行染色或标记。或通过细胞酶的作用使无荧光性的材料分解或转换为荧光材料，通过测定荧光强度从而测定出活细胞的量。现在普遍采用一种特殊的荧光染 FDAL1u(Fluoreseein diacetate)，在正常情况下它不具有荧光，但当它加人到具有完整细胞膜的肿瘤细胞的营养液中时，由于细胞分泌的水解酶的作用，FDA
酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物研究方法进展
现代生物医学进展https://www.wendangku.net/doc/ff10833873.html, Progress in Modern Biomedicine Vol.10NO.16AUG.2010 酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物研究方法进展* 刘振凯1艾 菁2耿美玉1,2△ （1中国海洋大学医药学院山东青岛266003；2中国科学院上海药物研究所上海201203） 摘要：酪氨酸激酶（protein tyrosine kinases,PTKs ）在肿瘤细胞的增殖、分化、迁移、侵袭等相关信号通路中起到了关键的调控作用，已经成为肿瘤靶向性治疗的重要靶点。本文对靶向酪氨酸激酶的小分子抑制剂的筛选和评价方法进行综述，以期促进酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物的研究。 关键词：酪氨酸激酶；抗肿瘤药物；小分子抑制剂；抑制剂筛选 中图分类号： R730.5，R915文献标识码：B 文章编号：1673-6273（2010）16-3134-04Advances in Research of Protein-tyrosine Kinases Inhibitors as Anticancer Drug* LIU Zhen-kai 1,AI Jing 2,GENG Mei-yu 1,2△ （1Marine drug and food Institute,Ocean university of China,Qingdao,266003,China;2Shanghai Institute of Materia Medica,Chinese Academy of Sciences,Shanghai,201203,China ） ABSTRACT:Protein tyrosine kinases (PTKs)have long been recognized as promosing therapeutic targets involved in a variety of human diseases and in particular several types of cancer.They play important roles in regulating intracellular signal transduction path-ways closely associated with the invasion,metastasis and angiogenesis of many tumors.An effort towards the development of new and more effective PTK inhibitors represents an attractive therapeutic strategy for cancer therapy.In this paper,we review the screening and evaluation methods of small-molecule inhibitors of PTKs with a view to promote the study of PTKs. Key words:Protein-tyrosine kinases;Antitumordrugs;Small-molecule inhibitors;Inhibitors screening Chinese Library Classification （CLC ）:R730.5R915Document code:B Article ID:1673-6273(2010)16-3134-04 *基金项目：国家杰出青年科学基金资助（No 30725046） 作者简介：刘振凯（1983-），男，硕士。研究方向：分子药理学。E-mail ：lzkai111@https://www.wendangku.net/doc/ff10833873.html, △通讯作者：耿美玉（1963-），研究员、博士生导师。E-mail ：mygeng@https://www.wendangku.net/doc/ff10833873.html, (收稿日期:2010-05-07接受日期：2010-06-01) 恶性肿瘤是严重威胁人类生命和健康的疾病。目前，临床上常用的抗肿瘤药物主要是细胞毒类药物，这类药物大多存在难以避免的选择性差、毒副作用强、易产生耐药等缺点[1]。近年来，随着生命科学研究的飞速发展，恶性肿瘤细胞内的信号转导、 细胞周期的调控、细胞凋亡的诱导、血管生成以及细胞与胞外基质的相互作用等各种基本过程正在被逐步阐明，给抗肿瘤药物的研发理念带来了巨大转变。以一些与肿瘤细胞分化增殖相关的细胞信号转导通路的关键酶/蛋白作为药物靶点，筛选发现选择性强、高效、低毒的新型抗癌药物已成为当今抗肿瘤药物研究开发的重要方向[2]。 蛋白酪氨酸激酶是一类具有酪氨酸激酶活性的蛋白质，它们能催化ATP 分子上的γ-磷酸基转移到底物蛋白的酪氨酸残基上，使其发生磷酸化。酪氨酸激酶分为受体型和非受体型两种。受体酪氨酸激酶是一种单次跨膜蛋白，目前至少已有近六十种分属20个家族的受体酪氨酸激酶被识别。不同的受体酪氨酸激酶和配体结合后，受体自身发生二聚化或结构重排，并进一步使受体胞内区特异的酪氨酸残基发生自身磷酸化或交叉磷酸化，从而激活下游的信号转导通路[3]。它们在信号由胞外转导至胞内的过程中发挥重要的作用。而非受体酪氨酸激酶是一种胞浆蛋白，现已经确认的有约30种，分为10大家族。蛋白酪氨酸激酶在细胞信号转导通路中占据了十分重要的地位， 调节细胞生长、分化、死亡等一系列生理生化过程。蛋白酪氨酸激酶功能失调则引发生物体内一系列疾病。大量资料表明，超过50%的原癌基因和癌基因产物都具有蛋白酪氨酸激酶活性，它们的异常激活或过度表达将导致细胞无限增殖，周期紊乱，最终导致肿瘤的发生发展[4]。 同时，酪氨酸激酶调控异常还与肿瘤的侵袭、 转移，肿瘤新生血管生成，肿瘤化疗抗性等密切相关。事实上，以酪氨酸激酶为靶点进行抗肿瘤药物的开发已成为国际研究的前沿。 1酪氨酸激酶抑制剂的开发策略 目前酪氨酸激酶抑制剂的开发策略主要分为胞外、胞浆和核内三个层面：细胞外策略主要是针对于受体型，配体与受体的生物拮抗剂以及特异性抗体，通过拮抗配体和受体的相互作用，抑制酪氨酸激酶的激活[5]；胞浆内策略主要分为抑制激酶区的激酶活性和拮抗酪氨酸激酶与其下游信号分子的相互作用两个方面[6]；核内策略主要是利用miRNA 降解或者干扰酪氨酸激酶的mRNA ，抑制激酶的蛋白表达而达到抑制激酶活性的目的[7,8]。其中研究最多的是抑制激酶区激酶活性的小分子抑制剂，而本文也主要是针对这部分抑制剂的研究方法进行探讨。酪氨酸激酶的自磷酸化过程和催化下游信号分子磷酸化的过程都涉及到ATP 上磷酸基团的转移，这一反应过程是酪氨酸 3134··
酪氨酸酶抑制剂的研究进展
龙源期刊网 https://www.wendangku.net/doc/ff10833873.html, 酪氨酸酶抑制剂的研究进展 作者：张启勤 来源：《科技资讯》2015年第18期 摘要：酪氨酸酶在黑色素的生物合成过程中起着关键性的作用，是黑色素合成的限速 酶，该酶决定了哺乳动物皮肤、头发的颜色。部分色素沉着性疾病，如皮肤病，如黄褐斑、雀斑等，是由于过量水平的黑色素在表皮沉积而形成。因此，可以选择应用酪氨酸酶抑制剂，通过抑制酪氨酸酶的活性，阻断黑色素的合成反应链，减少其在皮肤内的生成，从而达到祛斑增白的效果。近年来，由于其在化妆品领域的广泛应用，使得不断有更新更有效的酪氨酸酶抑制剂得到研究并开发。 关键词：酪氨酸酶抑制剂植物来源人工合成 中图分类号：Q356.1 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2015）06（c）-0200-02 酪氨酸酶（Tyrosinase），又称多酚氧化酶，是一种含铜金属酶，广泛存在于细菌、真菌、裸子植物、被子植物、哺乳动物等生物中，并存在于生物界系统发育阶段的各个水平。一般认为，羽毛，毛发，眼睛，昆虫表皮，种子等呈现出黑色、褐色、浅黄色等色素，都是酪氨酸酶作用的结果。酪氨酸酶在不同的生物中具有各异但却都很重要的功能。酪氨酸酶兼有单加氧酶和氧化酶双重功能，是生物体内参与黑色素（melanin）合成的关键酶。酪氨酸酶催化L-酪氨酸最终形成黑色素是一个非常复杂的过程。黑色素的合成途径一般被分为两个阶段：远端步骤和近端步骤。近端步骤包括单酚和/或邻-二酚的酶氧化，由含铜酪氨酸酶催化形成邻醌；远端步骤包括化学反应和酶反应，最终合成黑色素。 酪氨酸酶抑制剂作为黑色素祛除剂可以在皮肤美白化妆品具有重要作用，因此，可以通过酪氨酸酶的活性抑制实验来确定这些美白剂。 酪氨酸酶抑制剂的来源非常广泛，不仅有天然产物，而且有很多是人工合成化合物。如表1和表2所列，这些化合物在抑制酪氨酸酶单酚酶酶活的同时也抑制了二酚酶的酶活。 1 植物来源的酪氨酸酶抑制剂 众多的具有生物活性、副作用小的化合物来源于植物。如表1所示，很多植物源的天然产物对酪氨酸酶活性具有抑制作用，并且这些化合物的抑制能力及其抑制类型不尽相同。 1.1 高等植物来源的酪氨酸酶抑制剂 多酚类化合物，如单宁酸，广泛的存在于自然界中，与花的颜色有关。一些存在于植物中的树皮、根和叶子的多酚类化合物结构复杂，另一些存在于新鲜水果、蔬菜和茶叶中多酚类化合物结构却相对简单。酪氨酸酶强抑制剂黄酮类化合物，如4’，5，7-三羟基黄酮、槲皮素、
菌种筛选方法 (2)
菌种筛选方法 在实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网。因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次。初筛的手段应尽可能快速、简单。复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，所以，复筛步骤以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标,测得的数据要能够反映将来的生产水平。 1 从菌体形态变异分析有时，有些菌体的形态变异与产量的变异存在着一定的相关性，这就能很容易地将变异菌株筛选出来。尽管相当多的突变菌株并不存在这种相关性，但是在筛选工作中应尽可能捕捉、利用这些直接的形态特征性变化。当然，这种鉴别方法只能用于初筛。有人曾统计过3,484个产维生素B2的阿舒假囊酵母(Eremoth ecium ashbyii)的变异菌落，发现高产菌株的菌落形态有以下特点：菌落直径呈中等大小（8-10毫米），凡过大或过小者均为低产菌株；色泽深黄色，凡浅黄或白色者皆属低产菌株。又如，在灰黄霉素产生菌荨麻青霉(Penicillium urticae)的育种中，曾发现菌落的棕红色变深者往往产量有所提高，而在赤霉素生产菌藤仓赤霉（Gibberell a fujikuroi）中，却发现菌落的紫色加深者产量反而下降。 2 平皿快速检测法平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的
"形态"变化。具体的有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等，见图。这些方法较粗放，一般只能定性或半定量用，常只用于初筛，但它们可以大大提高筛选的效率。它的缺点是由于培养平皿上种种条件与摇瓶培养，尤其是发酵罐深层液体培养时的条件有很大的差别，有时会造成两者的结果不一致。图平皿快速检测法示意图平皿快速检测法操作时应将培养的菌体充分分散，形成单菌落，以避免多菌落混杂一起，引起"形态"大小测定的偏差。 1) 纸片培养显色法将饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片搁于培养皿中，用牛津杯架空，下放小团浸有3%甘油的脱脂棉以保湿，将待筛选的菌悬液稀释后接种到滤纸上，保温培养形成分散的单菌落，菌落周围将会产生对应的颜色变化。从指示剂变色圈与菌落直径之比可以了解菌株的相对产量性状。指示剂可以是酸碱指示剂也可以是能与特定产物反应产生颜色的化合物。 2) 变色圈法将指示剂直接掺入固体培养基中，进行待筛选菌悬液的单菌落培养，或喷洒在已培养成分散单菌落的固体培养基表面，在菌落周围形成变色圈。如在含淀粉的平皿中涂布一定浓度的产淀粉酶菌株的菌悬液，使其呈单菌落，然后喷上稀碘液，发生显色反应。变色圈越大，说明菌落产酶的能力越强。而从变色圈的颜色又可粗略判断水解产物的情况。 3) 透明圈法在固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成浑浊、不透明的培养基背景。将待筛选在菌落周围就
蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP_1的中药抑制剂筛选
第46卷 第6期吉林大学学报(理学版) Vol .46 No .6 2008年11月JOURNAL OF J I L I N UN I V ERSI TY (SC I E NCE E D I TI O N ) Nov 2008 蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP 21的中药抑制剂筛选 李婉南1 ,李 莹1 ,庄 妍1 ,李 贺1 ,陈颖丽2 ,赵志壮 1,3 ,付学奇 1 (1.吉林大学生命科学学院,长春130012;2.吉林省中医药科学院,长春130021; 3.美国俄克拉荷马大学健康科学中心,俄克拉荷马城73104,美国) 摘要:用含有蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP 21催化结构域(ΔSHP 21)的质粒转化大肠杆菌,得到 ΔSHP 21的高效表达,经分离纯化后,以ΔSHP 21为靶标,通过体外酶反应动力学实验,对157种中药水提液的抑制效果进行研究,筛选出两种对ΔSHP 21具有显著抑制作用的中药:山茱萸和蒲公英,并对其I C 50及抑制类型做了进一步研究.为建立蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂的筛选方法和中药在治疗免疫疾病和糖尿病上的开发和应用提供了理论依据.关键词:包含SH2结构域的蛋白质酪氨酸磷酸酶1(SHP 21);中药;抑制剂;筛选中图分类号:Q55 文献标识码:A 文章编号:167125489(2008)0621211206 Screen i n g Traditi onal Chi n ese M edi ci n es for I nhi bitors of Prote i n Tyrosi n e Phosphat ase SHP 21 L IW an 2nan 1 ,L I Ying 1 ,ZHUANG Yan 1 ,L I He 1 ,CHEN Ying 2li 2 ,ZHAO Zhi 2zhuang 1,3 ,F U Xue 2qi 1 (1.College of L ife Sciences,J ilin U niversity,Changchun 130012,China; 2.A cade m y of Traditional Chinese M edicine and Herbs of J ilin P rovince,Changchun 130021,China; 3.Health Sciences Center ,O klaho m a U niversity,O klaho m a C ity 73104,USA ) Ab s trac t:W ith pT7as a vect or,ΔSHP 21,a recombinant p r otein containing the catalytic domain of p r otein tyr osine phos phatase SHP 21,was highly exp ressed in E .coli cells .The enzy me was further purified t o near homogeneity .W ith the purified recombinant enzy me as a target,aqueous extracts of 157traditi onal Chinese herb medicines were analyzed f or their abilities t o inhibit SHP 21.T wo most potent inhibit ors,na mely,cornel and dandeli on,were identified,and their I C 50values and inhibit ory types were further analyzed .This study thus established a good syste m t o screen inhibit ors of SHP 21and de monstrated the potential of traditi onal Chinese medicines in treat m ent of i m munol ogical diseases and diabetes . Key wo rd s:SH22containing tyr osine phos phatase 1(SHP 21);traditi onal Chinese herb;inhibit or;screening 收稿日期:2008201215. 作者简介:李婉南(1975～),女,汉族,博士,讲师,从事蛋白质酪氨酸结构与功能的研究,E 2mail:wyshshk@https://www.wendangku.net/doc/ff10833873.html,.联系人:付学奇(1960～),男,汉族,博士,教授,博士生导师,从事细胞信号传导与药物筛选的研究,E 2mail:fxq@jlu .edu .cn . 基金项目:吉林省科技发展计划项目基金(批准号:20060563;200705394;20080434). 蛋白质酪氨酸磷酸酶(Pr otein Tyr osine Phos phatase,PTPs )与蛋白质酪氨酸激酶(Pr otein Tyr osine Kinases,PTKs )协同作用,控制着蛋白质酪氨酸的磷酸化过程,调节细胞生长发育,并在细胞信号传导过程中发挥重要作用 [1] ,许多生理和病理现象都与此相关 [2] .研究表明,一些疾病如某些癌症、糖尿 病、白血病、免疫缺陷病、努南氏综合症等正是由于PTPs 的基因突变或异常表达导致的[3,4] ,因此 PTPs 已经成为继PTKs 之后又一个热门的研究领域.SHP 21(SH22Containing Tyr osine Phos phatase 1),又称为HCP,SHPTP1或PTP1C,是含有SH2结构域的具有高度保守序列的蛋白质酪氨酸磷酸酶的亚家
酶抑制剂类抗糖尿病药物的分子水平筛选方法研究进展
酶抑制剂类抗糖尿病药物的分子水平筛选方法研究进展 张海枝，刘鹏，李川，刘长鹰 天津药物研究院天津市新药设计与发现重点实验室，天津 300193 摘 要：酶抑制剂类抗糖尿病药物是目前药物研究的热点，而药物筛选技术是制约此类抗糖尿病新药研发速度的关键步骤。主要从分子水平总结近年来报道的与糖尿病相关的酶抑制剂类候选药物的筛选方法，包括传统方法和前沿方法，着重介绍极具潜力的毛细管电泳法、质谱法、生物传感法和微通道筛选方法等。 关键词：抗糖尿病药物；酶抑制剂；分子水平；药物筛选方法 中图分类号：R977.3 文献标志码：A 文章编号：1674 - 5515(2014)08 - 0947 - 06 DOI: 10.7501/j.issn.1674-5515.2014.08.028 Research progress on drug screening methods at the molecular level for enzyme inhibitors used as anti-diabetic drugs ZHANG Hai-zhi, LIU Peng, LI Chuan, LIU Chang-ying Tianjin Key Laboratory of Molecular Design and Drug Discovery, Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300193, China Abstract: Various enzyme inhibitors have been demonstrated to be a hotspot in the research area of anti-diabetic drugs, whose development has been greatly limited by the efficiency of diverse drug screening methods. This paper concerns on different types of drug screening methods in the molecular level for enzyme inhibitors used in diabete treatment, including both traditional and advanced methods. Importantly, several screening methods with great potential have been emphasized here, such as capillary electrophoresis, mass spectrometry, biosensors, screening methods based on microchannel and so on. Key words: anti-diabetic drugs; enzyme inhibitors; molecular level; drug screening methods 糖尿病是全世界发病率最高的疾病之一，是一种与胰岛素产生和作用异常相关、以高血糖为主要特征的代谢性疾病。现有报道证实，体内参与血糖调节的多种酶已经成为抗糖尿病药物作用的关键靶点，可为研制治疗糖尿病的药物提供新途径。以靶标酶为作用对象的酶抑制剂可有效抑制血糖的升高，减缓糖尿病并发症的发生和发展，是抗糖尿病药物研发的希望所在[1-2]。目前报道的可用于治疗糖尿病的酶抑制剂包括α-葡萄糖苷酶抑制剂、醛糖还原酶（AR）抑制剂、一氧化氮合酶（NOS）抑制剂、血管紧张素转换酶（ACE）抑制剂、基质金属蛋白酶（MMPs）抑制剂、蛋白质酪氨酸磷酸酶1B （PTP-1B）抑制剂、果糖-1,6-二磷酸酶抑制剂、磷酸二酯酶（PDE）抑制剂、环氧酶-2（COX-2）抑制剂、二肽基肽酶-Ⅳ（DPP-Ⅳ）抑制剂等[3]。 近年来，组合化学的快速发展已经解决了酶抑制剂类候选药物的大批量合成问题，而如何快速高效准确地筛选出此类抗糖尿病新药是药物研发中的关键难题。现有报道中关于酶抑制剂类候选药物的筛选方法较多，根据所选用的材料和药物作用的对象以及操作特点，可将这些方法大致分为4个水平：整体动物水平、组织器官水平、细胞水平和分子水平。其中，基于分子水平的酶抑制剂类药物筛选方法具有反应体积小、筛选速度快、药物作用机制明确，可实现大规模筛选等优点，在药物筛选方面具有广阔的应用前景。基于此，本文详细综述了酶抑制剂类抗糖尿病药物的分子水平筛选方法，力图为此类药物的高通量筛选提供借鉴和参考，以期提高抗糖尿病新药的研发速度。目前文献中报道的与糖尿病相关的酶抑制剂类药物分子水平筛选方法主要 收稿日期：2014-06-28 作者简介：张海枝（1985—），女，湖北黄冈市人，博士，助理研究员，研究方向为分析化学。Tel: (022)23006859 E-mail: zhanghz@https://www.wendangku.net/doc/ff10833873.html,
葡萄糖苷酶抑制剂筛选方法
葡萄糖苷酶抑制剂筛选方法 α-葡萄糖苷酶抑制剂是一类以延缓肠道碳水化合物吸收而达到治疗糖尿病的口服降糖药物。其作用机制为：竞争性抑制位于小肠的各种α-葡萄糖苷酶，使淀粉类分解为葡萄糖的速度减慢，从而减缓肠道内葡萄糖的吸收，降低餐后高血糖。 α-葡萄糖苷酶抑制活性筛选的原理是：对-硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷(pNPG)作反应底物；该底物是无色的。经α-葡萄糖苷酶水解后可以释放出对-硝基苯酚(pNP)，pNP在碱性条件下是黄色的，因此可以通过测定410nm处的吸光度反应出pNP的浓度(吸光度与pNP浓度成正比关系)。吸光度越小，说明pNP的浓度越小，即酶被抑制的程度越大。 设不加样品时，测得的吸光度为c0, 加样品后测的吸光度为c1. 那么酶的抑制率可通过1-c1/c0计算出来。 一实验试剂： α-Glucosidase(α-葡萄糖苷酶)、4Nitrphtnylα-D-glucopyranoside(4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷)（PNPG）、Acarbose(阿卡波糖) 均购自Sigma公司，无水Na2CO3、Na2HPO4、KH2PO4等, 均为分析纯。水为超纯水。苦瓜提取物。 二实验器材： Bio Tek酶标仪、电子天平、Eppendorf的移液器、pH计、酶标板、恒温水浴器 三实验方法： （一） 试剂配制 （1）pH值6.8的0.1 mol/L磷酸缓冲液 分别配制0.1 mol/L Na2HPO4和KH2PO4(13.6 g配成1L)，用这两种溶液混匀互调pH 值至6.8即得0.1 mol/L磷酸缓冲液 （2）用pH值6.8的0.1 mol/L磷酸缓冲液配制0.26 U/mlα-Glucosidase （3）底物(PNPG)用pH值6.8的0.1 mol/L磷酸缓冲液配制成浓度为5 mmol/L (1.505mg/ml) （4）反应终止液：0.2 mol/L Na2CO3。 （5）阳性药的配制：精密称取阿波卡糖样品，以磷酸缓冲液为溶剂溶解，配成10 mg/ml 的浓度。 （二） 实验方法 1. 各浓度药液按每孔50 μL加入酶标板，每浓度设三复孔。另设一药物对照孔、空白反应孔及空白对照孔。然后向药物反应孔和空白反应孔加入50 μL 0.26 U/mL的 -葡萄糖苷酶，其他组加50 μL 磷酸缓冲液，经此步骤后，各孔的组成为： 药物反应孔：50 μL药液+ 50 μL酶 药物对照孔：50 μL药液+ 50 μL磷酸缓冲液 空白反应孔：50 μL磷酸缓冲液+ 50 μL酶 空白对照孔：50 μL磷酸缓冲液+ 50 μL磷酸缓冲液 上述反应体系在微型振荡器上震荡30秒，置于恒温37 o C水浴中孵育10min。
药物筛选方法
药物筛选的方法 分子水平筛选 Microbead FCM联合筛选 原理：FCM（流式细胞术）（flow cytometry）是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术，它可以根据穿过毛细管的细胞荧光强度或类型分离细胞。由于不同的分子与标记有不同荧光素的受体或抗体结合，利用和细胞大小相似的Microbead作为固相载体取代细胞通过FCM，不同荧光标记的Microbead就被分离出来，于是靶分子或目标分子就很容易的被分离、纯化。 应用：Lanza等利用这项技术测定了患有脊髓发育不良综合症和急性骨髓源白血病病人体内的各种细胞因子受体CR表达量的变化。 蛋白质-蛋白质；蛋白质-RNA相互作用。 免疫共沉淀（co-immunoprecipitation） 原理：它是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的Protein A或G特异性地结合到抗体（免疫球蛋白）的Fc片段的现象开发出来的方法。其基本原理是，在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Agarose珠上的Protein A或G，若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一种复合物：“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—Protein A或G”，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。然后经免疫印迹或质谱检测目的蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内与兴趣蛋白天然结合的，符合体内实际情况，得到的结果可信度高。 应用：免疫共沉淀一般用于低丰度蛋白的富集和浓缩，为SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）和MS质谱分析鉴定准备样品，常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。主要用于检测大分子和大分子相互作用。 放射免疫性检测（RIA）（与EIA，FIA相比灵敏度更高，但由于放射性元素，RIA的使用受到了限制）原理： （1）竞争结合分析：Ag（非标记抗原）+ Ab（特异性抗体） - AgAb *Ag（标记抗原）+ Ab（特异性抗体）- *AgAb （2）IRMA（免疫放射分析） 应用： （1）肿瘤相关抗原的测定：AFP，CEA，CA199，CA125，CA153，CA724，CYFRA211，PSA等
药物筛选
药物筛选 药物筛选是现代药物开发流程中检验和获取具有特定生理活性化合物的一个步骤，系指通过规范化的实验手段从大量化合物或者新化合物中选择对某一特定作用靶点具有较高活性的化合物的过程。药物筛选的过程从本质上讲就是对化合物进行药理活性实验的过程，随着药物开发技术的发展，对新化合物的生理活性实验从早期的验证性实验，逐渐转变为筛选性实验，即所谓的药物筛选。作为筛选，需要对不同化合物的生理活性做横向比较，因此药物筛选的实验方案需具有标准化和定量化的特点。随着组合化学和计算化学的发展，人们开始有能力在短时间内大规模合成和分离多种化合物，因而在现代新药开发流程中药物筛选逐渐成为发现先导化合物的主要途径之一。 筛选模型: 筛选模型就是在药物筛选实验中所应用的药理实验模型，由于药物筛选要求实验方案有标准化和定量化的特征，因而在传统药理实验中常见的动物实验在药物筛选中较少应用，根据实验模型的不同，药物筛选可以分为生化水平的筛选和细胞水平的筛选。 生化水平的药物筛选用拟开发药物作用的靶点设计实验，一般而言这种作用靶点是具有特定生理功能的蛋白质，如酶和受体等，此外一些编码功能明确的DNA也越来越多地成为药物作用的靶点。候选化合物与靶点混合后，可以通过酶连免疫、荧光显色、核磁共振等方法定量测定化合物与靶点的相互作用，从而成为筛选化合物的依据。 细胞水平的药物筛选是更接近生理条件的一种药物筛选模型，其模型是拟设计药物作用的靶细胞，应用细胞培养技术获取所需细胞，将这些细胞与候选化合物相互作用，通过与生化水平筛选类似的检测技术测定化合物的作用能力，从而对化合物进行筛选。 生化水平的药物筛选操作相对简单，成本较低，但是由于药物在体内的作用并不仅仅取决于其与靶酶的作用程度，吸收、分布、代谢、排泄均会对药物的作用产生极大的影响，仅仅一道薄薄的细胞膜就能够阻挡住许多候选化合物成为药物的道路，因而生化水平的药物筛选不确定因素更多，误筛率更高。细胞水平的药物筛选模型更接近生理条件，筛选的准确率更高，但是需要建立细胞模型，操作更复杂，成本更高，数据之间的平行形较差，另外由于技术的限制，有些靶标还不能进行细胞水平的药物筛选。 高通量筛选 高通量筛选最初是伴随组合化学而产生的一种药物筛选方式。1990年代末，组合化学的出现改变了人类获取新化合物的方式，人们可以通过较少的步骤在短时间内同时合成大量化合物，在这样的背景下高通量筛选的技术应运而生。高通量筛选技术可以在短时间内对大量候选化合物完成筛选，经过近十年的发展，已经成为比较成熟的技术，不仅仅应用于对组合化学库的化合物筛选，还更多地应用于对现有化合物库的筛选。目前世界各大药物生产商都建立有自己的化合物库和高通量筛选机构，对有潜力形成药物的化合物进行篦梳式的筛选。 一个高通量药物筛选体系包括微量和半微量的药理实验模型、样品库管理系统、自动化的实验操作系统、高灵敏度检测系统以及数据采集和处理系统，这些系统的运行保证了筛选体系能够并行操作搜索大量候选化合物。高通量筛选技术结合了分子生物学、医学、药学、计算科学以及自动化技术等学科的知识和先进技术，成为当今药物开发的主要方式。完整的高通量筛选体系由于高度的整合和自动化，因而又被称作“药物筛选机器人系统”
药物筛选药物筛选方法学概论药物筛选概况一
第二篇药物筛选 第五章药物筛选方法学概论 第一节药物筛选概况 一、药物筛选定义 药物筛选：是对可能作为药用的物质进行初步药理活性的检测和试验，以求发现其药用价值和临床用途，为新药研究和开发提供最初始的依据和资料。成功的筛选能够缩短创新药物研究与开发的周期、降低成本、减少风险和提高效率。 虽然偶然发现的药物在药物研究中具有一定的作用，但过程是不可控的，因而不可能成为发现药物的主要途径。新药的发现，必须依赖主动寻找的过程，或称为广义的药物筛选过程。 二、药物筛选形式 （一）定向筛选 即采用特定的方法，专门筛选防治某种疾病的药物。这种方法是现代医学研究过程中长期使用的方法，并在药学研究中取得了巨大的成就，如治疗心血管疾病的药物、抗肿瘤药物等。定向筛选对于发现某一类型的药物行之有效，但对于被筛选的物质来讲，却不能全面反映出内在的作用，因此理想的方法是在定向筛选的同时能够实现一药多筛，从多方面发现这些物质的作用。 （二）对特定样品的筛选 其特点在于利用已有信息，在特定的样品范围内进行筛选。例如抗生素类药物的筛选，筛选多种细菌产物的抗菌活性，从而发现了大量新的抗生素。对中药的研究也是采取这种方法，根据中药已有的相关信息，筛选特定中药的有效成分。这种方式具有较高的成功率，但被筛选的范围受到限制，忽略了广泛的资源，样品间对比的范围较小，易造成对低效样品的高投入研究，特别是信息资料不可靠时可能产生误导。 （三）比较筛选 根据对现有药物的认识，以确定的模型进行筛选，由此发现同类型而作用更好的新药物，其中包括“me－too”药。可利用的药物信息包括药物作用机制、药物代谢过程以及病理机制等。例如根据甾体激素类药物的结构，找到了大量抗炎药物；根据阿片类镇痛作用原理，发现了新的镇痛药物等。 （四）随机筛选 是对可能作为药用的样品进行药理活性的广泛筛选。这种筛选方法是新药发现的最基本方式，也是在医药发展过程中人们一直进行的方式。特点是能够发现全新的药物，但成功率不可预测。要保证药物随机筛选的成功率，就必须有足够的被筛选样品量和广泛的药物作用筛选方法。 （五）计算机筛选 计算机筛选实际上是根据药理学、药物化学、计算机科学等多学科的知识和理论，应用
酶抑制剂筛选模型研究进展
酶抑制剂筛选模型研究进展 通过查阅文献，综述目前酶抑制剂筛选的主要模型，包括动物模型、高通量筛选模型及固定化酶反应器。并对其应用原理、应用情况及优缺点进行了阐述。 标签：酶抑制剂；筛选模型；靶点；验证 20世纪60年代，日本科学家梅译滨夫提出了酶抑制剂的概念，从而将抗生素的研究扩大到酶抑制剂的新领域。随着酶学研究的深入，对酶结构的认识，已能在分子水平上认识酶的作用机制，并根据酶的作用原理来设计各种酶的专一抑制剂作为药物，来调节体内的异常代谢。 酶抑制剂作为药物的治疗基础是通过限制酶催化底物的反应能力，使底物浓度增高或代谢产物浓度降低，以达到改善症状的目的。在一系列酶促反应中，以抑制限速酶或关键酶的效果最好。在目前上市的药物中，以受体为靶点的药物占52%，以酶为靶点的药物占22%，以离子通道为靶点的药物占6%，以核酸为靶点的药物占3%。酶抑制剂的开发是新药的重要来源。随着现代生物科学技术的发展，酶抑制剂作为药物越来越受到医药界的重视。 药物筛选模型是用于证明某种物质具有药理活性（生物活性、治疗作用）的实验方法，是寻找和发现药物的重要途径之一。在长期寻找药物的实践过程中，建立了大量用于新药筛选的各类模型，在新药发现和研究中发挥了积极的作用。随着生命科学的发展，新的药物筛选模型不断出现，不仅促进了药物的发现，而且对药物筛选的方法、理论、技术都产生了巨大影响[1]。 酶抑制剂的筛选模型主要为动物模型和细胞分子水平筛选模型。动物模型由于规模小、效率低、样品量大、成本高等缺点，不适合作为药物初筛的模型。细胞和分子水平的筛选模型，具有材料用量少、药物作用机制比较明确、可实现大规模筛选和一药多筛等特点[1]，已成为目前酶抑制剂筛选的主要方法。本文就近几年来酶抑制筛选的主要模型进行综述。 1 高通量筛选模型 高通量筛选是以分子细胞水平的实验方法为基础，以微型板为实验工具载体，以自动化操作系统执行实验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验数据，以计算机对实验获得的数据进行分析处理，同时对数以万计的样品进行检测。高通量筛选以其高效、快速的优点，已成为酶抑制剂新药发现的主要手段。酶抑制剂的高通量筛选模型，主要为分子水平的筛选模型，也有少量细胞水平的筛选模型。筛选以酶为作用靶点的药物，不仅要观察酶与药物的结合，更要观察药物对酶活性的影响。根据酶的特点，酶的反应底物和产物都可作为检测指标[2]。以酶为作用靶点的高通量检测方法，绝大多数是直接检测酶的活性，主要有基于放射性的方法和基于比色、荧光的方法两大类[3]。
药物筛选
一．高通量药物筛选在新药研发中的应用 高通量药物筛选的原理，就是药物多是通过特异地作用于体内的靶点蛋白质（受体、酶、离子通道等）而重新调整病人的生理状态，达到治疗目的。该技术是指以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行试验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，以计算机对实验数据进行分析处理，同一时间对数以千万样品检测，并以相应的数据库支持整体系运转的技术体系。高通量筛选在创新先导物的发现过程中具有高效、快速、微量等特点。 高通量药物筛选的基本模式是以单一的筛选模型对大量样品的生物活性进行评价,从中发现针对某一靶点具有活性的样品。随着人类基因组计划的完成,潜在药物靶点不断被发现,新的药物靶点不断出现,不仅为创新药物的发现提供了机遇,也对高通量筛选效率提出新的要求。 1 高通量药物筛选开发新药的基本过程 药物筛选与新药发现的基本过程由于高通量筛选获得的结果是分子水平或细胞水平的活性结果，多数情况下只能反映出样品的作用机制的信息，并不能完全证明对某种疾病具有防治作用，这是其与传统筛选方法的重要区别。传统的药理学研究一般是首先研究其客体作用进而研究作用机制。而采用高通量筛选方法则是从分子水平开始，这一过程又称作反向药理学。采用高通量筛选方法发现和开发药物一般要经过药物的初筛和复筛、深入筛选、确证筛选过程。 1.1 初筛和复筛 是在分子或细胞水平筛选样品，证明某一样品对该靶点具有药理活性（或亲和力）。初筛以后，选择具有活性的化合物，采用系列浓度，进行同一模型的复筛，阐明其对该靶点的作用特点、作用强度和量效关系，由此发现活性化合物（样品）。 1.2 深入筛选 在初筛和复筛的基础上，将得到的样品，采用与初筛不同但相关的分子、细胞模型作进一步的筛选，包括证明样品的选择性、细胞毒性，以及其他性质。经过深入筛选，为比较全面地评价活性化合物的药用价值提供更充分的实验资料。根据这些资料，并结合活性化合物的化学结构、性质特点，进行综合分析，确定在结构和作用方面具有新颖性和开发价值的化合物，作为先导化合物。同时也可以结合组织器官或整体动物模型，证明其药理作用，为样品提供更加充分的实验依据。 1.3 确证筛选 对深入筛选获得的先导化合物或优化后被选定的活性最好的化合物进行更深入广泛的研究，包括药理作用、药物代谢过程、一般毒性等多方面的筛选，以确定其开发前景。将符合要求的样品确定为药物候选化合物，进入开发研究程序，即临床前研究，为临床研究准备必要的资料。 2 高通量药物筛选技术对药物开发策略的转变 新方法和新技术的应用，必然会对现有的操作方式产生冲击，在药物发现过程中更是如此，由于大量新技术的应用，传统的筛选模式肯定不能适应新技术发挥作用。因此，为了提高成功率和筛选速度，积极应用新技术是必须的，但是，在研究的策略方面不进行调整和改变，就会制约新技术的应用和研究进程的发展，甚至会导致错误的结果。 2.1 随机筛选策略的改变 高通量药物筛选技术的应用，改变了传统的药物发现的模式。由于筛选方法是建立在分子细胞水平，由此来分析药物的治疗作用，必然存在着大量需要解决的问题。分子水平的某点变化，在疾病的病理表现中可能是微不足道的，或是要受到多种干扰。因此，用这种方法发现药物，就必须改变传统的模式，建立全新的新药发现策略建立基于高通量药物筛选技术上的药物发现新模式，需要解决的主要问题是活性的评价、筛选模型与疾病的相关性、影响筛选
药物筛选简要流程protocol
药物筛选简要流程protocol 药物筛选是现代药物开发流程中检验和获取具有特定生理活性化合物的一个步骤，系指通过规范化的实验手段从大量化合物或者新化合物中选择对某一特定作用靶点具有较高活性的化合物的过程。药物筛选的过程从本质上讲就是对化合物进行药理活性实验的过程，随着药物开发技术的发展，对新化合物的生理活性实验从早期的验证性实验，逐渐转变为筛选性实验，即所谓的药物筛选。作为筛选，需要对不同化合物的生理活性做横向比较，因此药物筛选的实验方案需具有标准化和定量化的特点。随着组合化学和计算化学的发展，人们开始有能力在短时间内大规模合成和分离多种化合物，因而在现代新药开发流程中药物筛选逐渐成为发现先导化合物的主要途径之一。 筛选模型 筛选模型就是在药物筛选实验中所应用的药理实验模型，由于药物筛选要求实验方案有标准化和定量化的特征，因而在传统药理实验中常见的动物实验在药物筛选中较少应用，根据实验模型的不同，药物筛选可以分为生化水平的筛选和细胞水平的筛选。 生化水平的药物筛选用拟开发药物作用的靶点设计实验，一般而言这种作用靶点是具有特定生理功能的蛋白质，如酶和受体等，此外一些编码功能明确的DNA也越来越多地成为药物作用的靶点。候选化合物与靶点混合后，可以通过酶连免疫、荧光显色、核磁共振等方法定量测定化合物与靶点的相互作用，从而成为筛选化合物的依据。 细胞水平的药物筛选是更接近生理条件的一种药物筛选模型，其模型是拟设计药物作用的靶细胞，应用细胞培养技术获取所需细胞，将这些细胞候选化合物相互作用，通过与生化水平筛选类似的检测技术测定化合物的作用能力，从而对化合物进行筛选。 生化水平的药物筛选操作相对简单，成本较低，但是由于药物在体内的作用并不仅仅取决于其与靶酶的作用程度，吸收、分布、代谢、排泄均会对药物的作用产生极大的影响，仅仅一道薄薄的细胞膜就能够阻挡住许多候选化合物成为药物的道路，因而生化水平的药物筛选不确定因素更多，误筛率更高。细胞水平的药物筛选模型更接近生理条件，筛选的准确率更高，但是需要建立细胞模型，操作更复杂，成本更高，数据之间的平行形较差，另外由于技术的限制，有些靶标还不能进行细胞水平的药物筛选。 高通量筛选 高通量筛选最初是伴随组合化学而产生的一种药物筛选方式。1990年代末，组合化学的出现改变了人类获取新化合物的方式，人们可以通过较少的步骤在短时间内同时合成大量化合物，在这样的背景下高通量筛选的技术应运而生。高通量筛选技术可以在短时间内对大量候选化合物完成筛选，经过近十年的发展，已经成为比较成熟的技术，不仅仅应用于对组合化学库的化合物筛选，还更多地应用于对现有化合物库的筛选。目前世界各大药物生产商都建立有自己的化合物库和高通量筛选机构，对有潜力形成药物的化合物进行篦梳式的筛选。