地高辛标记Northern Starter 试剂盒

名称：地高辛标记Northern Starter 试剂盒

产品货号： 12039672910

产地： Roche

供应商：

英文名： DIG Northern Starter Kit

保存条件：低温

包含标记DIG RNA探针及进行Northern 印迹的所有必需试剂,配合DIG Wash and Block BuffeRSet方便地进行Northern 印迹;能作10个标记反应及10次检测(100mm2膜),特别适合初用者使用;标记混合物经最优化,配合提供的化学发光

底物CDP-Star,能产生最高的灵敏度.

Catalog # Product name / Packsize

12039672910

(2039672) DIG Northern Starter Kit

1 kit (10 labeling reactions and detection of 10 blots of 10 x 10 cm2)

Application

The DIG Northern Starter Kit produces DIG-labeled RNA probes that can be used in conjunction with the supplied chemiluminescent detection reagents for northern blotting techniques.

Using linearized DNA as a template, SP6, T3, or T7 RNA Polymerases are used to incorporate DIG-11-UTP into the RNA transcript. After labeling, the DIG-labeled probe is immediately ready for use in hybridization. For convenience, DIG Easy Hyb can be used for hybridization. The DIG Easy Hyb granules are easily reconstituted by adding 64 ml DEPC-treated (RNase-free) water directly to the bottle (once reconstituted, DIG Easy Hyb is stable for 1 month at room temperature). After hybridization, the hybridization solution containing the DIG-labeled RNA probe can be stored at · 15 to -25°C for future re-use (up to 1 year).

Product Description

Sensitivity and specificity: Using 1 μg of linearized template DNA, the labeling reaction typically yields 20 μg of newly synthesized

DIG-labeled RNA within 1 h. The DIG-labeled RNA probe can detect 0.1 pg of homologous DNA or RNA in a dot blot. Rare mRNAs can be detected in 0.1 μg of total RNA.

Background Information

The DIG Northern Starter Kit was designed for the novice DIG system user. It contains the reagents proven to provide successful, reproducible

results in northern blots. Additionally, the more convenient forms of standard DIG system products are included (e.g., CDP Star, ready-to-use). The small number of reactions allows the user to gain a firm foundation using the DIG system, then “graduate” to the standard pack sizes. For optimum success, use this kit with the DIG Wash and Block Buffer Set.

Contents

Labeling Mix, 40 μl, 5x conc.

Transcription Buffer, 40 μl, 5x conc.

SP6 RNA Polymerase, 20 μl, [20 U/μl]

T7 RNA Polymerase, 20 μl, [20 U/μl]

T3 RNA Polymerase, 20 μl, [20 U/μl]

Anti-digoxigenin-AP, Fab fragments, 60 μl, [750 U/ml]

DNase I, RNase free, 20 μl, [10 U/μl]

CDP-Star, ready-to-use, 20 ml

Actin RNA Probe, DIG-labeled Antisense Probe, length 588 bases, [10 ng/μl]

DIG Easy Hyb Granules, 2 bottles for 100 ml solution each

Blocking Solution, 2 x 100 ml, 10x conc.

NORTHERN 试剂盒(含膜)(Amresco E685-5(15X15CM))

产品详细参数

名称：NORTHERN 试剂盒(含膜)(Amresco E685-5(15X15CM))

产品货号：美国Amresco:E685-5(15X15CM)

产地：美国

品牌商标：美国Amresco

英文名：TOTALBLOT NORTHERN KIT WITH MEMBRANES

地高辛标记与检测DNA试剂盒说明书

地高辛标记与检测DNA试剂盒DIG DNA Labeling and Detection Kit 采用地高辛-dUTP进行随机引物DNA标记，碱性标记，利用NBT/BCIP 酶联免疫，随时即用。 此试剂盒可对10ng-3μgDNA进行25次标记反应， 可检测10×10cm2面积的杂交膜50张 指导手册 1 前言 1.1 内容表 1 前言 1.1 内容表 1.2 试剂盒成分 2.介绍 2.1 产品简介 3. 操作步骤和所需材料 3.1 在你开始前 3.2 流程图 3.3 地高辛标记DNA 3.4 标记效率的确定 3.5 DNA的转移和固定 3.6 杂交 3.7 免疫检测

3.8 DNA印记的洗脱和再杂交1.2 试剂盒的成分 瓶号标记 内容包括功能 1 无标记对照DNA1 2 无标记对照DNA2 3 DNA稀释缓冲液2管1mL 50μg/mL鱼精DNA,10mM Tris-HCl,1mM EDTA, pH8.0 在25℃ 澄清溶液 4 DIG标记的对照 DNA 20μL 5μg/mL 质粒pBR328 DNA （用Bam HI线性 化） 澄清溶液 用于确定标记效率 5 六聚核苷酸混合物 6 标记用混合物 7 DNA聚合酶1大片 段 标记级 8 抗地高辛的碱性磷 酸酶结合物 200μL 750U/mL 从羊中获取的，Fab段，结合碱性磷酸酶 澄清溶液 9 NBT/BCIP 10 封阻试剂附加仪器与所需试剂

除了上表中列出的试剂外，你必须准备一些溶液。在下表中，你可以找到不同操作程序需要准备的设备概要。 在每个操作程序的前面提供了详细的信息。 操作程序仪器设备试剂 3.3 DIG-DNA标记水浴灭菌的双蒸水 0.2M pH8.0 灭菌的 EDTA 3.4 标记效率的半定量带正电荷的尼龙膜* 地高辛洗涤和封阻缓冲 组合* TE缓冲液 或者 洗涤缓冲液 马来酸缓冲液 检测缓冲液 3.5 DNA转移和固定紫外光盒或者商业化可用 于紫外交联的其他设备2×SSC 或者10×SSC 3.6 杂交尼龙膜，带正电荷* 杂交袋*，或者耐热的塑料 袋或者滚筒瓶（分子杂交 炉） 注意：当用地高辛杂交缓冲 液工作时，不要用开口的托 盘。DIG Easy Hyb （杂交缓冲液，需单独购买） 3.7 免疫检测耐热的塑料袋或者滚筒瓶 杂交袋* 地高辛洗涤和封阻缓冲组合* TE缓冲液 或者 洗涤缓冲液 马来酸缓冲液 检测缓冲液 3.8 DNA 斑点的脱色和大的托盘DMF

地高辛标记探针在Southern杂交分析中的技术要点

地高辛标记探针在Sou thern杂交分析中的技术要点陆小平　周文军(苏州大学生命科学学院江苏苏州215006) 小岛峰雄(日本信州大学纤维学部) 外源基因是否成功导入受体材料的基因组中,必须从转化植株中找到分子生物学的检测证据。目前,PCR、Southern杂交等作为常用检测手段而被广泛采用。虽然PCR技术可以快速得到结果,但是,以农杆菌介导的材料必须慎重这一结论,以免由于农杆菌污染造成假阳性。而Southern分析由于操作程序繁琐,对植物基因组DNA的提取、纯化、酶切等技术要求较高,有时使杂交结果不甚理想。我们在植物基因转化的研究中,对荞麦,桑树,紫景天,洋麻等基因组DNA的提取、纯化、酶切进行了探讨,对流程中的有关步骤进行技术改良,使酶切后的PNA在凝胶板上是涂布状完全达到了Southern杂交的技术要求,并用地高辛(D ig)标记探针对外源DNA进行分析,取到了较好的效果。现简述如下∶ 1　植物基因组D NA的提取及纯化 1)提取高纯度的DNA是Southern杂交的关键, DNA的粗提物中,往往含有大量的蛋白质、多糖、单宁、色素等大分子杂质。这些杂质通常与DNA共同沉淀或与DNA聚合成大分子复合物。一旦复合物形成,即便在以后的操作中用酚、氯仿多次纯化,也很难将其除去。我们的经验是:当用液氮破碎新鲜样品的细胞壁后,先用蒸馏水洗脱两次(洗脱温度为42℃),每次5m in。以达到洗脱多糖的目的。每次洗脱后离心5m in(13000 r m in),弃去上层液。该上层液中含有粘度较高的胶状体,其主要成分可能是粘性多糖。在提取桑树基因组DNA时,最好用叶柄或幼茎、幼叶作提取材料。在样品有限时,也可用成熟叶甚至老叶代替。据C lark M S (1998)介绍,取样前对材料进行除淀粉处理(减少光照、黑暗处理24h),可以抑制多糖的污染。但我们采用除淀粉处理后的实验结果并不理想,其效果远不及用蒸馏水洗脱。另外,该方法不仅可以用于桑树DNA提取,而且也适用于其他植物材料(果树、花卉)。 2)由于桑叶中也含有酚类、色素,提取DNA时,常有茶褐色物质混入DNA中,由此而影响DNA的纯度。为了防止DNA的褐变,我们在液氮磨碎后,立即置冰箱下层或4℃条件下任其自然解冻,待粉末完全解冻后再加入DNA提取液。 3)做一次Southern杂交所需10Λg纯DNA,一般取0.2g新鲜样品即可得到10Λg以上纯DNA。因此,用该方法提取DNA无论是产量还是质量都能满足一定要求。为了保证DNA的纯度,每管加样量不要太多,以0.2～0.25g新鲜样品为宜,用30mL液氮研磨成粉末,置4℃条件下解冻后分别加600ΛL提取液 和200ΛL提取液 ,再稍稍研磨后全部转入2mL的离心管中,其余步骤仍按试剂盒要求操作。 4)在去除蛋白质的干扰时,我们仍用蛋白酶K,但其中添加了80ΛL酶解缓冲液(60mmo l T h is2HC l、60mmo l ED TA、3%SD S、pH7.8),置55℃条件下酶切过夜。结束后再用苯酚、氯仿处理。 5)纯化后的DNA可以通过测定波长为230、260、280的紫外吸收光谱来确定其浓度,但这些数据只能作为参考,因即便有较高的OD值,仍会存有影响酶切的干扰物质,我们建议最好采用凝胶电泳检测。 2　酶切 DNA的酶切时间一般是1～3h,但结束前最好取10ΛL(总量为200ΛL)酶切产物在小孔胶上检测是否完全酶切,即DNA片段弥散于各泳道中,若加样孔下方仍有亮度较强的条带出现(重复序列例外),这表明DNA尚未完全酶切,需继续延长酶切时间。 3　Southern印迹 将完全酶切的DNA上大孔胶电泳,若DNA在胶板上呈涂布状,便可进行Southern印迹。若近加样孔一侧的泳带,其前沿参差不齐;加样孔变形;孔内残留物较多;泳道中DNA分布不匀等,这些均为干扰物存在所致。在条件许可时应重新酶切。Southern印迹可按常规方法操作,将胶板分别用0.25mo l HC l、变性液、中和液浸泡15～30m in后,用20XSSC溶液将变性DNA全部转移至尼龙膜(H ybo rdN+m em bane)上。但印迹操作时,须戴手套作业,以免污染尼龙膜而影响DNA的固定。吸水纸上的重量要逐次添加,以防泳道变形和凝胶毛细管过早堵塞。 4　杂交 1)固定　印迹结束后,取下尼龙膜,置室温中自然干燥1h,用紫外仪[FUNA2UV L IKER(FS21500)]将DNA固定到尼龙膜上(约30s)。 2)预杂交　将尼龙膜装入小塑料袋中,加入10mL 预杂交液后,驱尽袋中的气泡,封口后置65℃杂交炉(EYELA H YBR I D Z A T I ON OV EN M H S2301)中孵育1h。 3)杂交　剪开小塑料袋的一角,直接加入10ΛL变性D ig探针,赶尽气泡后重新封口,继续置65℃杂交炉中慢速振摇过夜。 该步骤的关键是小塑料袋中不能留有气泡,否则,

罗氏地高辛说明书

DIG DNA Labeling and Detection Kit 采用地高辛-dUTP进行随机引物DNA标记，碱性标记，利用NBT/BCIP 酶联免疫，随时即用。 此试剂盒可对10ng-3μgDNA进行25次标记反应， 可检测10×10cm2面积的杂交膜50张 指导手册 1 前言 1.1 内容表 1 前言 1.1 内容表 1.2 试剂盒成分 2.介绍 2.1 产品简介 3. 操作步骤和所需材料 3.1 在你开始前 3.2 流程图 3.3 地高辛标记DNA 3.4 标记效率的确定 3.5 DNA的转移和固定 3.6 杂交 3.7 免疫检测 3.8 DNA印记的洗脱和再杂交

除了上表中列出的试剂外，你必须准备一些溶液。在下表中，你可以找到不同操作程序需要准备的设备概要。

2.介绍 2.1 产品概况 实验原则 此试剂盒采用DIG(地高辛)，一种甾类半抗原，steroid hapten去标记DNA 应用 地高辛标记DNA探针可以用于：所有类型的滤膜杂交 样品材料 至少100bp的DNA片段 线性的质粒，cos质粒或者DNA 超螺旋的DNA 实验时间

检测数量 一个试剂盒足够用于: 25个标准的标记反应，每个反应的膜板DNA不超过3μg； 并可以检测50张10×10cm2的杂交膜。 质量控制 根据操作步骤中的说明对未标记的对照DNA 【pBR328】进行标记，并按 照下面的标准检测操作方法在点杂交中用0.1pg 同源DNA点在膜上16h后成色 显影检测。 试剂盒的储存和稳定性 未开封的试剂盒在保质期内可以稳定的存放在-15℃到-25℃（保质期印在标签上）。在干冰中运输。 一旦开封，请根据下表选择适宜的储存条件。 采用southern杂交从1μg人胎盘DNA（经BglⅡ或EcoRⅠ酶切）中检测到单拷贝基因。

地高辛使用注意事项

xx合理使用与注意事项 地高辛为强心类药物，主要用于治疗各类急、慢性心功能不全及室上性心动过速、心房颤动或扑动等，由于其治疗指数低、安全范围小、毒副作用大、药动学及药效学个体差异大，常规剂量亦可导致中毒或达不到疗效，治疗浓度与中毒浓度问又存在重叠现象，使其有效治疗剂量难以掌握。进行地高辛血药浓度监测是临床上调整给药方案、维持有效血药浓度、预防药物中毒的主要方法，下面对地高辛的主要特点及注意事项做一简要介绍。 [xx血药浓度范围] xx的治疗药物浓度参考范围为 0."8- 2."0ng/ml，当浓度超过 2."0ng/ml后，病人易出现心律紊乱等毒性反应，取血时间一般在达到稳态后取血，成人为7-11天，儿童为2-10天，于服药后8-24hr取血。 由于老年人对本品耐受低，血药浓度最好调至正常范围的下限，但波动不宜太大，故以少量多次的用药方案为安全且有效。 [xx的适应症] 1．用于高血压、瓣膜性心脏病、先天性心脏病等急性和慢性心功能不全。尤其适用于伴有快速心室率的心房颤动的心功能不全；对于肺源性心脏病、心肌严重缺血、活动性心肌炎及心外因素如严重贫血、甲状腺功能低下及维生素B1缺乏症的心功能不全疗效差； 2．用于控制伴有快速心室率的心房颤动、心房扑动患者的心室率及室上性心动过速。 [xx的用法用量] 成人常用量。常用 0."125～

0."5㎎，每日一次，7天可达稳态血药浓度；若达快速负荷量，可每6～8小时给药 0.25㎎，总剂量 0."75～ 1."25㎎/日；维持量，每日一次 0."125～ 0."5㎎。 [xx的不良反应] 1.常见的不良反应包括： 促心律失常作用、胃纳不佳或恶心、呕吐(刺激延髓中枢)、下腹痛、异常的无力、软弱。 2.少见的反应包括： 视力模糊或"色视"，如黄视、绿视、腹泻、中枢神经系统反应如精神抑郁或错乱。 3.罕见的反应包括： 嗜睡、头痛及皮疹、寻麻疹(过敏反应)。 [xx药动学过程] 本品吸收不完全，也不规则，片剂生物利用度为60%～80%，口服起效时间 0."5～2小时，血浆浓度达峰时间2～3小时，获最大效应时间为4～6小时。地高辛消除半衰期平均为36小时。血浆蛋白结合率低，为20%～25%，表观分布容积为6～10L/㎏。地高辛在体内转化代谢很少，主要以原形由肾排除，尿中排出量为用量的50%～70%。 [影响xx血药浓度的生理因素]

分子标记技术的种类

分子标记技术的种类-标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII

分子标记技术的种类根据不同的核心技术基础，DNA分子标记技术大致可分为三类: 第一类以Southern杂交为核心, 其代表性技术为RFLP；第二类以PCR技术为核心，如RAPD、SSR、AFLP、STS、SRAP、TRAP等；第三类以DNA序列(mRNA或单核苷酸多态性)为核心，其代表性技术为EST标记、SNP标记等。理想的分子标记应达到以下的要求：①具有高的多态性； ②共显性遗传；③能够明确辨别等位基因；④分布于整个基因组中；⑤选择中性(即无基因多效性)；⑥检测手段简单、快速； ⑦开发成本和使用成本尽量低廉；⑧在实验室内和实验室间重复性好。目前，没有任何一种分子标记均满足以上的要求，它们 均具有各自的优点和不足。其特点比较见表一。 1限制性内切酶片段长度多态性标记（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）1974年，Grozdicker 等人鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时，发现了经限制性内切酶酶解后得到的DNA片段产生了差异，由此首创了第一代DNA分子标记技术——限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP)。其原理是由于不同个体基因型中内切酶位点序列不同(可能由碱基插入、缺失、重组或突变等造成)，利用限制性内切酶酶解基因组DNA时，会产生长度不同的DNA酶切片段，通过凝胶电泳将 DNA片段按各自的长度分开，通过Southern印迹法，将这些大小不同的DNA片段转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，再用经同位素或地高辛标记的探针与膜上的酶切片段分子杂交，最后通过放射性自显影显示杂交带，即检出限制性片段长度多态性。进行 RFLP时，酶切要彻底，注意内切酶的选择，对于亲缘关系很近的物种，可增加内切酶的使用种类。目前RFLP的使用领域很广泛，其具有以下优点：①RFLP标记源于基因组DNA的自身变异，理论上可覆盖整个基因组，能提供丰富的遗传信息；②标记不受组织、环境和发育阶段的影响；③呈共显性，即杂交时等位DNA片段均呈现带，能区分纯合基因型和杂合基因型，F2表现出 1∶2∶1的孟德尔分离定律[3]，提供标记座位完全的遗传信息；④由于限制性内切酶的专一性使结果稳定可靠，重复性好。其缺点是：①操作繁琐，费时；②酶切后的DNA质量要求高；③使用放射性同位素进行分子杂交，有危险性等。 2随机扩增多态性DNA标记 (Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD) 20世纪80年代，基于PCR技术的第二代分子标记技术诞生并迅速发展起来。1990年，Williams 等发表了一种不需预先知道DNA序列信息的检测核苷酸序列多态性的方法，即随机扩增多态性DNA标记(RAPD)。其原理是以碱基顺序随机排列的寡核苷酸单链(8-10bp)为引物，以组织中分离出来的基因组DNA为模板进行扩增。随机引物在基因组DNA序列上有其特定结合位点，一旦基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物的数量和大小发生改变，表现出多态性。用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，溴化乙锭染色后可在紫外光下显现出基因组相应区域DNA的多态性。与RFLP相比，RAPD方便易行，DNA用量少，设备要求简单，不需DNA探针，设计引物也不需要预先进行序列分析，不依赖于种属特异性和基因组的结构；合成一套引物可以用于不同生物基因组分析，用一个引物就可扩增出许多片段，并且不需使用同位素，安全性好。但因为引物较短导致退火温度较低，易产生错配，故实验的稳定性和重复性差，且为显性标记，不能区分纯合子和杂合子。 RAPD 标记技术利用单引物扩增多个基因位点使其在一定程度上对反应条件敏感，这会限制其应用。将RAPD-PCR变成经典的PCR可克服此限制，即设计更长的引物。1993年，Paran提出的序列特征化扩增区域标记(Sequenced Characterized Amplified Region，SCAR)即为以经典PCR为基础的分子标记技术[1]。SCAR标记技术通过对产生的RAPD片段克隆和测序，设计一对互补于原

分子标记技术

分子标记技术 摘要：分子标记技术就是利用现代分子生物学基础分析DNA分子特性，并借助 一些统计工具，将不同物种或同一物种的不同类群区分开来，或者将生物体的某些性状与DNA分子特性建立起来的关联关系，已广泛应用于植物遗传与育种研究的众多领域，包括遗传图谱的构建、遗传多样性分析、物种起源与进化、品种资源与纯度鉴定、分子辅助育种等多个方面，具有重大作用。 关键词：分子标记技术原理RFLP RAPD SSR AFLP EST SNP TRAP 分子标记技术应用 引言 分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA 水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。 一．常用分子标记原理 分子标记技术的种类根据不同的核心技术基础，DNA分子标记技术大致可分为三类: 第一类以Southern杂交为核心, 其代表性技术为RFLP；第二类以PCR 技术为核心，如RAPD、SSR、AFLP、STS、SRAP、TRAP等；第三类以DNA序列(mRNA 或单核苷酸多态性)为核心，其代表性技术为EST标记、SNP标记等。理想的分子标记应达到以下的要求：①具有高的多态性；②共显性遗传；③能够明确辨别等位基因；④分布于整个基因组中；⑤选择中性(即无基因多效性)；⑥检测手段简单、快速；⑦开发成本和使用成本尽量低廉；⑧在实验室内和实验室间重复性好。目前，没有任何一种分子标记均满足以上的要求，它们均具有各自的优点和不足。其特点比较见表一。 1．限制性内切酶片段长度多态性标记（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP） 1974年，Grozdicker 等人鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时，发现了经限制性内切酶酶解后得到的DNA片段产生了差异，由此首创了第一代DNA 分子标记技术——限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP)。其原理是由于不同个体基因型中内切酶位点序列不同(可能由碱基插入、缺失、重组或突变等造成)，利用限制性内切酶酶解基因组DNA时，会产生长度不同的DNA酶切片段，通过凝

原位杂交-经典方法-地高辛标记探针

原位杂交 (In situ hybridization) 一、目的 掌握核酸探针原位杂交操作技术，并利用该技术对单细胞的靶目标进行定位，用于细胞生物学基础研究。 二、原理 原位杂交技术（in situ hybridization）是分子生物学和组织化学成功结合的产物，是特定标记的已知序列核酸作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交并对其实行检测的方法。其基本原理是含互补序列的标记DNA或RNA片段，即探针，在适宜的条件下与细胞内特定的DNA或RNA形成稳定的杂交体。 原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其它成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。 三、仪器设备 烘箱，切片机，展片机，染色缸，湿盒，原位PCR仪，显微镜、镊子、量筒、烧杯、吸水纸、枪与枪头、载玻片、盖玻片、冰盒等。 四、材料和试剂 1．材料：带有病原体的水生动物，如感染WSSV病毒的对虾、感染虹彩病毒的水生动物等。 2．试剂： Davidson’s AFA固定液: 330 ml 95％乙醇 220 ml 福尔马林（37～39％甲醛水溶液） 115 ml 冰醋酸 335 ml H2O 混匀后封口，室温放置； DIG标记与检测试剂盒（Roche公司）； TNE：50 mmol/L Tris-HCl 6.57 g Tris Base 10 mmol/L NaCl 0.58 g NaCl 1 mmol/L EDTA 0.37 g EDTA ddH2O 900 ml （定容至1L） 用HCl调pH至7.4，高压灭菌，4℃保存；

地高辛合理使用与注意事项

地高辛合理使用与注意事项 地高辛为强心类药物，主要用于治疗各类急、慢性心功能不全及室上性心动过速、心房颤动或扑动等，由于其治疗指数低、安全范围小、毒副作用大、药动学及药效学个体差异大，常规剂量亦可导致中毒或达不到疗效，治疗浓度与中毒浓度问又存在重叠现象，使其有效治疗剂量难以掌握。进行地高辛血药浓度监测是临床上调整给药方案、维持有效血药浓度、预防药物中毒的主要方法，下面对地高辛的主要特点及注意事项做一简要介绍。 [地高辛血药浓度范围] 地高辛的治疗药物浓度参考范围为，当浓度超过ml后，病人易出现心律紊乱等毒性反应，取血时间一般在达到稳态后取血，成人为7-11天，儿童为2-10天，于服药后8-24hr取血。由于老年人对本品耐受低，血药浓度最好调至正常范围的下限，但波动不宜太大，故以少量多次的用药方案为安全且有效。 [地高辛的适应症] 1．用于高血压、瓣膜性心脏病、先天性心脏病等急性和慢性心功能不全。尤其适用于伴有快速心室率的心房颤动的心功能不全；对于肺源性心脏病、心肌严重缺血、活动性心肌炎及心外因素如严重贫血、甲状腺功能低下及维生素B1缺乏症的心功能不全疗效差； 2．用于控制伴有快速心室率的心房纤颤、心房扑动患者的心室率及阵发性室上性心动过速。 [地高辛的用法用量] 成人常用量。常用～㎎，每日一次，7天可达稳态血药浓度；若达快速负荷量，可每6～8小时给药㎎，总剂量～㎎/日；维持量，每日一次～㎎。 [地高辛的不良反应] 1. 常见的不良反应包括：促心律失常作用、胃纳不佳或恶心、呕吐(刺激延髓中枢)、下腹痛、异常的无力、软弱。 2. 少见的反应包括：视力模糊或"色视"，如黄视、绿视、腹泻、中枢神经系统反应如精神抑郁或错乱。 3. 罕见的反应包括：嗜睡、头痛及皮疹、寻麻疹(过敏反应)。 [地高辛药动学过程]

探针标记

核酸探针已被广泛用于筛选重组克隆、基因多样性的种性检测和真菌种群内及种群之间的系统发育关系评价。最早使用的放射性同位素标记核酸探针具有敏感性高、特异性好、分辨力强的特点，但放射性同位素标记也存在着一系列令人困扰的问题,如成本高、探针半衰期短、放射性物质危害人体健康等。而且在进行放射性同位素标记实验时,需要有专门的实验室及相应的实验保护设施，还需要由经过培训的专业人员来操作,因而限制了在普通实验室进行分子生物学实验。 近几年发展起来的非放射性核酸探针大多通过酶促、光化学和化学手段掺入一种报道基团,这种报道基团可通过高灵敏度的冷光、荧光或金属沉淀等检测系统检测。另外,应用pH电极或感应器技术的电化学检测系统也有报道。在这些检测系统中,灵敏度最高的是生物素- 亲合素检测系统和半抗原-抗半抗原地高辛检测系统。由于生物样品中常含有内源性生物素及生物结合蛋白，生物素标记的核酸探针会发生一些非特异性结合，从而影响实验效果。与生物素-亲合素系统同样具有高灵敏度，却减少了非特异性结合的地高辛检测系统，已为人们所接受,并得到广泛的应用。 地高辛(Digoxigenin ,DIG) 又称异羟基洋地黄毒甙元，是一种类固醇半抗原分子。 第四节非放射性标记的核酸探针 放射性标记核酸探针在使用中的限制，促使非放射性标记核酸探针的研制迅速发展，在许多方面已代替放射性标记，推动分子杂交技

术的广泛应用。目前已形成两大类非放射标记核酸技术，即酶促反应标记法和化学修饰标记法。 酶促反应标记探针是用缺口平移法，随机引物法或末端加尾法等把修饰的核苷酸如生物素-11-dUTP掺入到探针DNA中，制成标记探针，敏感度高于化学修饰法，但操作程序复杂，产量低，成本高。 化学修饰法是将不同标记物用化学方法连接到DNA分子上，方法简单，成本低，适用于大量制备（>50μg）如光敏生物素标记核酸方法，不需昂贵的酶，只在光照10～20min，生物素就结合在DNA 或RNA分子上。 非放射性标记核酸探针方法很多，现介绍常用的几种方法如下： 一、生物素标记核酸探针方法 生物素标记的核苷酸是最广泛使用的一种，如生物素-11-dUTP，可用缺口平移或末端加尾标记法。实验发现生物素可共价连接在嘧啶环的5位上，合成TTP或UTP的类似物。在离体条件下，这种生物素化dUTP可作为大肠杆菌多聚酶I（DNA酶I）的底物掺入带有缺口的DNA或RNA，得到生物素标记的核酸探针。这种标记方法称为缺口平移法。用标记在DNA上的生物素与链霉亲合素-酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）标记物进行检测。

地高辛标记及检测试剂盒说明书讲述

仅仅研究于生命科学，不适合在诊断过程使用 只能在体外使用 地高辛DNA标记和检测试剂盒1 和NBT/BCIP一起用于颜色检测 通过酶联免疫法采用地高辛-dUTP进行随机引物DNA标记，碱性标记和检测货号：11 745 832 910 此试剂盒储存条件-15o C—-25o C 此试剂盒可对10ng-3ugDNA进行12次标记反应 可检测100cm2面积的杂交膜24张 指导手册 2009.11版

1前言 1.1内容表 1前言 (2) 1.1内容表 (2) 1.2试剂盒内容 (3) 2简介 (5) 2.1产品概述 (5) 3步骤和所需材料 (8) 3.1开始之前 (8) 3.2地高辛DNA标记 (9) 3.3 标记效率的测定 (11) 3.4 DNA 的转移和固定 (14) 3.5杂交 (16) 3.6免疫检测 (18) 3.7 DNA印记的洗脱和再杂交 (20) 4结果 (21) 4.1典型的结果 (21) 5附录 (23) 5.1故障排除 (23) 5.2引用 (24) 5.3订购信息 (25)

1.2 试剂盒内容

附加仪器与所需试剂 除了上表中列出的试剂外，你必须准备一些溶液。在下表中，你可以找到不同操作程序需要准备的设备概要。 *标记的产品可以从Roche Applied Science 获得

2 介绍 2.1 产品概况 实验原则 此试剂盒采用地高辛（DIG），一种甾类半抗原，去标记DNA探针从而通过酶免疫分析

应用 地高辛标记DNA探针可以用于： 所有类型的滤膜杂交 总基因组DNA中单拷贝基因的检测，甚至对于高度复杂的生物也可以进行 检测，如人，大麦和小麦。 样品材料 至少100bp的DNA片段 线性的质粒，cos质粒或者λDNA 超螺旋的DNA 实验时间 此表格列出了每一步实验所需的反应时间 检测数量 一个试剂盒足够用于： 不超过3ug的模板DNA的12个标准的标记反应 和100cm2有24个斑点的检测 质量控制 根据操作步骤中的描述，对未标记的对照品DNA（PBR328）进行标记，0.1pg同源DNA 在点杂交中通过16h的显色来检测（1pg同源DNA可以通过1小时的显色进行检测）。

地高辛标记探针的Southern 杂交

地高辛标记探针的Southern杂交 1.探针标记(20μL体系)： 1)将10ng-1μg模板DNA用无菌去离子水补足至16μl。 2)沸水浴或干浴锅98o C10分钟，使DNA变性成单链并迅速冰浴冷却。 3)充分混匀DIG-high Primer（1#管），并取4μl至变性DNA管，混匀并离 心； 4)37o C温育1小时或过夜（最大到不超过20小时）； 5)停止反应，加2μL0.2M EDTA（pH8.0）或65o C加热10分钟。若不用 将于-20o C冰箱保存。 2.探针标记效率检测： 将地高辛标记好的探针作一系列的稀释，点到一条尼龙膜上，同时用地高辛标记的control DNA作对照标准，120℃固定30分钟；然后用地高辛抗体免疫检测，按BNT/BCIP显色步骤显色；比较显色结果，选择带有可以接受的背景的最高探针浓度做正式的杂交。操作步骤如下： 1)根据表1DIG-High Prime DNA标记及检测试剂盒理想条件下探针的标记 产量将标记的探针稀释到1ng/μl，将试剂盒提供的control DNA稀释到1ng/μl(原始浓度是5ng/μl)，然后按照表2作一系列的稀释探针及control DNA稀释 表1DIG-High Prime DNA标记及检测试剂盒理想条件下探针标记产量 Template DNA1h20h 10ng45ng600ng 30ng130ng1050ng 100ng270ng1500ng 300ng450ng2000ng 1000ng850ng2300ng 3000ng1350ng2650ng

表2探针DNA及Control DNA系列表 Tube DNA(μl)From Tube#DNA dilution buffer(μl) Dilution Final concentration 1Diluted orginal 1ng/μl 2211981:10010pg/μl 3152351:3.33pg/μl 452451:101pg/μl 553451:100.3pg/μl 654451:100.1pg/μl 755451:100.03pg/μl 856451:100.01pg/μl 90-50-0 1)将上述稀释的2-9号管的control DNA及探针DNA各取1μL点膜； 2)120o C固定30min或紫外交链3-5min； 3)将膜放入装有20mL Maleic acid buffer的塑料器皿中，室温振荡2min； 4)将膜放入10mL Blocking solution中室温温育30min； 5)将膜放入10mL Antibody solution中室温温育30min； 6)用10mL Washing buffer洗2次，每次15min； 7)在10mL Detection buffer平衡2-5min； 8)将膜放入2mL新配制的Color substrate solution(从试剂5#中取100ul到 5mL)中暗室条件下显色。显色过程中不要摇动或振荡! 9)当斑点或带显示出来后，用50ml灭菌的双蒸水洗膜5分钟，照相 染色至0.1pg的Control DNA出现斑点，比较标记的探针与Control DNA染色情况计算出地高辛标记的DNA的量：如果0.1pg的探针及对照稀释点都显色，则探针标记理想；如果0.1pg的对照显色，0.1pg的标记探针没显色，但0.3pg 显色，则计算探针浓度（约为理想浓度的1/3）以确定杂交时加多少探针（25ng 探针/ml杂交液）；如果0.1pg的对照显色，但标记探针0.3pg的斑点没显色，则应重新标记探针。

洋地黄、地高辛作用

医生须知 1 药理作用 具剂量依赖性的直接选择性正性肌力作用；增强迷走神经活性，抑制交感神经；减轻神经内分泌异常；纠正窦弓及心内压力感受器的敏感性；降低窦房结自律性，提高浦肯野氏纤维自律性，减慢房室结传导速度，缩短心房和浦肯野氏纤维的有效不应期等；能收缩下肢、肠系膜和冠脉血管，提高外周阻力，使平均动脉压升高；轻度利尿作用。 2 分类 （1）快速作用类：适用于急性心衰或慢性心衰急性加重时，如西地兰、毒毛花甙K； （2）中速或缓慢作用类：适用于轻、中度心衰或维持治疗，如地高辛、洋地黄毒甙。 3 适应证 （1）心力衰竭：心衰病人应用洋地黄类药后，症状可明显改善。长期使用，尚无明确临床试验证实对心衰的病死率、发病率和生活质量有益。对肺心病、严重心肌损伤、急性重症心肌炎、风湿活动期心衰，疗效差；对严重单纯二尖瓣狭窄和缩窄性心包炎，疗效很差或无效。 （2）心律失常：洋地黄治疗房颤的目的是减慢心室率，目前仍是改善快室率房颤的首选药物之一。 4 用法 （1）维持量法：逐日地高辛～，6～7天即可达稳态有效浓度。负荷量加维持量法：首次地高辛～，后每6～8小时给，至总量～，2～3天后地高辛维持量～。 （2）西地兰快速饱和量首次～，后每2～4h给～，总量1～。 5 毒副作用及防治 （1）毒副作用：

·胃肠道反应：厌食、恶心、呕吐、腹泻等。应注意洋地黄用量不足、心衰未控制时常因胃肠道瘀血也可出现上述反应。 ·中枢神经系统反应：眩晕、头痛、疲乏、失眠、谵妄等。 ·视力障碍：黄视、绿视、视力模糊等。 ·心脏毒性反应：最早、最常见为室早（33％）；Ⅱ、Ⅲ度房室传导阻滞（1 8％）；交界性心动过速（17％）；交界性逸搏（12％）；房性心动过速（10％）；室性心动过速（8％）；窦性停搏（2％）。 （2）防治原则（早期诊断、及时停药）： ·注意诱发因素：低钾、高钙、低镁血症、心肌缺血、缺氧等； ·警惕中毒先兆：室早出现或增多、窦缓（＜50～60次/min）、色视障碍等； ·测定血药浓度（地高辛＞3ng/ml或洋地黄毒甙＞45ng/ml，即可确诊中毒）； ·一旦确诊即停药； ·补充K+、Mg++； ·苯妥英钠能与洋地黄竞争膜Na+-K+ ATP酶，具解毒效应。 ·利多卡因也可用于治疗洋地黄中毒所致的室速和室颤，1～3mg/kg静推后以 1～4mg/min维持； ·阿托品用于治疗中毒时的心动过缓及Ⅱ、Ⅲ度房室传导阻滞，1～2 mg静推； ·静推地高辛抗体Fab片段，每80mg能拮抗1mg 地高辛； ·电复律属禁忌，若以上方法无效，可用小能量直流电复律。 ·必要时人工心脏起搏。 6 药物间相互作用 （1）能提高地高辛浓度、增强疗效的药物： ·奎尼丁能使90％患者的地高辛浓度提高1倍，二药合用时，酌减地高辛用量1/2～1/3。

四种分子杂交的原理及方法

Southern杂交 基本概念及原理：Southern印迹杂交（Southern blot）是1975年由英国人southern创建，是研究DNA图谱的基本技术，在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。 Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA 片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。 Southern印迹杂交技术是分子生物学领域中最常用的具体方法之一。其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。但为了进一步构建出DNA分子的遗传图，或进行目的基因序列的测定以满足基因克隆的特殊要求，还必须掌握DNA分子中基因编码区的大小和位置。有关这类数据资料可应用Southern 印迹杂交技术获得。 Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）；二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。 早期的Southern印迹是将凝胶中的DNA变性后，经毛细管的虹吸作用，转移到硝酸纤维膜上。印迹方法如电转法、真空转移法；滤膜发展了尼龙膜、化学活化膜（如APT、ABM纤维素膜）等。利用Southern印迹法可进行克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中某一基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片断长度多态性分析（RFLP）等。 下面以哺乳动物基因组DNA为例，介绍Southern印迹杂交的基本步骤。 步骤：一、待测核酸样品的制备 （一）制备待测DNA 基因组DNA是从动物组织（或）细胞制备。1.采用适当的化学试剂裂解细胞，或者用组织匀浆器研磨破碎组织中的细胞；2.用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白质和RNA；3.用有机试剂（酚/氯仿）抽提方法去除蛋白质。 （二）DNA限制酶消化 基因组DNA很长，需要将其切割成大小不同的片段之后才能用于杂交分析，通常用限制酶消化DNA。一般选择一种限制酶来切割DNA分子，但有时为了某些特殊的目的，分别用不同的限制酶消化基因组DNA。切割DNA的条件可根据不同目的设定，有时可采用部分和充分消化相结合的方法获得一些具有交叉顺序的DNA片段。消化DNA 后，加入EDTA，65℃加热灭活限制酶,样品即可直接进行电泳分离，必要时可进行乙醇沉淀，浓缩DNA样品后再进行电泳分离。

分子标记技术的类型原理及应用

分子标记 1.分子标记技术及其定义 1974年,Grozdicker等人在鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时, 利用限制性内切酶酶解后得到的DNA片段的差异, 首创了DNA分子标记。所谓分子标记是根据基因组DNA存在丰富的多态性而发展起来的可直接反映生物个体在DNA水平上的差异的一类新型的遗传标记,它是继形态学标记、细胞学标记、生化标记之后最为可靠的遗传标记技术。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质分子。通常所说的分子标记是指以DNA多态性为基础的遗传标记。分子标记技术本质上都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映基因组之间差异。 2.分子标记技术的类型 分子标记从它诞生之日起, 就引起了生物科学家极大的兴趣,在经历了短短几十年的迅猛发展后, 分子标记技术日趋成熟, 现已出现的分子标记技术有几十种, 部分分子标记技术所属类型如下。 2.1 建立在Southern杂交基础上的分子标记技术 (1) RFLP ( Rest rict ion Fragment Length Polymorphism)限制性内切酶片段长度多态性标记； (2) CISH ( Chromosome In Situ Hybridization) 染色体原位杂交。 2.2 以重复序列为基础的分子标记技术 (1) ( Satellite DNA ) 卫星DNA； (2) ( Minisatellite DNA ) 小卫星DNA; (3) SSR( Simple Sequence Repeat ) 简单序列重复, 即微卫星DNA。 2.3 以PCR为基础的分子标记技术 (1) RAPD ( Randomly Amplif ied Polymorphic DNA ) 随机扩增多态性DNA； (2) AFLP( Amplif ied Fragment Length Polymorphism) 扩增片段长度多态性； (3) SSCP( Single Strand Conformation Polymorphism) 单链构象多态性； (4) cDNA-AFLP( cDNA- AmplifiedFragment Length Polymorphism) cDNA -扩增片段长度多态性； (5) TRAP( Target Region Amplified Polymorphism) 靶位区域扩增多态性； (6) SCAR ( Sequence Char acterized Amplified Region) 序列特征化扩增区域； (7) SRAP ( Sequencerelated Amplified Polymorphism) 相关序列扩增多态性。 2.4以mRNA为基础的分子标记技术

地高辛的临床药学监护

地高辛的临床药学监护 地高辛属于洋地黄类药物，临床上主要用于充血性心力衰竭、控制心房颤动、心房扑通的心室率，是较常用的经典药物之一。但是此药物安全范围窄，个体差异大，治疗量与中毒量接近，合并用药不当可诱发或加重洋地黄中毒，临床上需要进行药物监测。近年来，随着治疗药物监测的开展，不良反应发生率已明显下降。但地高辛的合理使用仍存在一些值得重视的问题：一是电解质水平的监测，二是与药物相互作用的认识，三是积极进行治疗药物监测。 1、注意电解质水平的监测 在使用地高辛治疗的患者中，进行电解质水平的监测十分重要。我们知道地高辛的作用机制是通过对心肌细胞膜Na+-K+-ATP酶的抑制作用，使细胞内Na+水平升高，转而促进Na+-Ga2+交换，细胞内Ga2+水平随之升高，而有正性肌力作用。在有低钾血症或低镁血症的患者，药物浓度尽管在2ng/ml（地高辛有效血药浓度在0.8-2ng/ml）以下时毒性反应仍可能发生。因为K+或Mg2+的缺失增加了心肌对地高辛的敏感性。因此，在使用地高辛治疗的患者，最好保持正常的血清K+和Mg2+的浓度。这些电解质的缺乏可能会导致腹泻及呕吐等地高辛中毒的消化道症状。我们临床上已观察到几例老年患者就是在地高辛浓度不高的情况下，由于电解质紊乱而出现了这样的典型情况。因此在合并可引起电解质紊乱的药物如利尿剂、两性霉素及可的松等时应尤其注意监测患者的电解质浓度。并且在使用地高辛时，血钾浓度维持在3.8mmol/ml以上较安全。 2、关注地高辛与药物的相互作用 在住院患者中，地高辛的应用以老年患者居多，多种疾病共存的现象导致联合用药十分普遍。多种药物都可以与地高辛发生相互作用。下面列出需要特别注意且临床意义比较大的一些药物，供医生参考。 2.1地高辛与大环内酯类 研究表明，大环内酯类抗生素为磷糖蛋白(p hosphor-glycoprotein，P-gp) 抑制剂，而地高辛为P-gp 底物，所有大环内酯类抗生素均抑制P-gp介导的地高辛跨细胞膜转运，增加其在小肠的吸收，减少其在肾脏的排泄，导致血药浓度升高50 %。

地高辛标记核酸探针的标记方法

地高辛标记核酸探针的标 记方法 Last revision on 21 December 2020

地高辛标记核酸探针的标记方法 核酸探针已被广泛用于筛选重组克隆、基因多样性的种性检测和真菌种群内及种群之间的系统发育关系评价。最早使用的放射性同位素标记核酸探针具有敏感性高、特异性好、分辨力强的特点，但放射性同位素标记也存在着一系列令人困扰的问题,如成本高、探针半衰期短、放射性物质危害人体健康等。而且在进行放射性同位素标记实验时,需要有专门的实验室及相应的实验保护设施，还需要由经过培训的专业人员来操作,因而限制了在普通实验室进行分子生物学实验。 近几年发展起来的非放射性核酸探针大多通过酶促、光化学和化学手段掺入一种报道基团,这种报道基团可通过高灵敏度的冷光、荧光或金属沉淀等检测系统检测。另外,应用pH电极或感应器技术的电化学检测系统也有报道。在这些检测系统中,灵敏度最高的是生物素- 亲合素检测系统和半抗原-抗半抗原地高辛检测系统。由于生物样品中常含有内源性生物素及生物结合蛋白，生物素标记的核酸探针会发生一些非特异性结合，从而影响实验效果。与生物素-亲合素系统同样具有高灵敏度，却减少了非特异性结合的地高辛检测系统，已为人们所接受,并得到广泛的应用。 地高辛(Digoxigenin ,DIG) 又称异羟基洋地黄毒甙元，是一种类固醇半抗原分子。其化学结构如图1 所示。 采用人工方法可以将地高辛的线型间隔臂与dUTP 连接起来,形成DIG-11-dUTP，通过随机引物法或PCR法将其掺入到DNA

探针中。RNA探针的标记是使用噬菌体信息编码的RNA聚合酶，通过体外转录将DIG-11-dUTP掺入到RNA探针中。寡核苷酸探针的标记则是通过末端转移酶催化，在3'末端加上DIG-11-dUTP/dATP 或DIG-11-ddUTP 尾巴。 对于目的DNA 或RNA 来说，分子杂交后,杂交部分可通过ELISA 实验程序加以检测，即加入一种结合有碱性磷酸酶的地高辛-特异性抗体，它与地高辛半抗原分子形成酶联抗体-半抗原(DIG) 复合物，再加入相应的显色底物，使杂交部分得以显示。 1 地高辛标记核酸探针的主要标记方法 1. 1 DNA 探针的标记方法 1. 1. 1 PCR 掺入法这种标记方法是通过聚合酶链式反应，在Taq 酶的作用下，将DIG-11-dUTP 掺入到新合成的DNA 链中。以本法标记的探针不但灵敏度高，产量也很高。少量的基因组DNA(1ng～50ng) 便可直接通过PCR 进行扩增、标记。 1. 1. 2 随机引物法用随机引物法可将DIG-11-dUTP 标记于DNA 链上。为得到最佳标记效果，标记前模板DNA 需作线性处理，而且至少要用苯酚-氯仿进行一次抽提，再用乙醇沉淀。100～10000 碱基的模板链均可被有效地标记，但大于10000 碱基的模板链则需要在标记前作限制酶切消化。处理好的模板加入随机引物，按碱基互补原则，随机引物与模板DNA 退火后由Klenow 片段从引物3' 端延伸引物，便可将DIG-11-dUTP 均匀掺入到新合成的DNA 链中。