转基因大豆DNA检测芯片的研究

第一届ICMSF —中国国际食品安全会议论文选登

转基因大豆DNA 检测芯片的研究

刘 郑文杰　赵卫东　贺　艳　唐丹舟　刘　辉

(天津出入境检验检疫局,天津　300201)

摘　要:为提高对转基因大豆的监督检测能力,研制了转基因大豆DNA 检测芯片。根据转基因大

豆(R oundup Ready )中所转入的外源基因,选择CaMV 35S 启动子、NOS 终止子、NOS ΠEPS PE 基因和内源Lectin 基因设计特异性引物,采用多重PCR 法对待测样品进行扩增,通过缺口平移法合成DIG 2dUTP 标记杂交探针,并制备基因芯片。在对PCR 反应和扩增产物与芯片杂交条件进行优化的同时,比较了芯片检测的特异性和重复性,并对检测的灵敏度进行测试。结果表明,该方法具有较好的特异性和重复性,检测灵敏度可达015%,由于采用了多重PCR 技术,一次可同时检测多个基因,提高了检测的准确性和效率。

关键词:植物,转基因;黄豆;DNA 芯片;聚合酶链反应

R esearch of gene chip for detection of genetically modified soybean

LI U Xuan ,ZHE NG Wen 2jie ,ZH AO Wei 2dong ,HE Y an ,T ANG Dan 2zhou ,LI U Hui

(T ianjin Entry 2Exit Inspection and Quarantine Bureau ,T ianjin 300201,China )

Abstract :According to the plasmid map of genetically m odified s oybean (R oundup Ready ),three ex ogenous gene (CaMV 35S prom oter ,NOS terminator ,NOS ΠEPS PE gene )and one endogenous gene (Lectin )were selected as target genes to design and synthesize their primers.The probe was synthesized using the method of nick translation and labeled with DIG 2dUTP.Multiplex PCR was used to am plify the target sequence in s oybean sam ple DNA ,then the DNA chips were hybridized with PCR product ,at last the chips displayed the hybridization result.The DNA chip for identifying genetically m odified s oybean was highly specific and reproducible and its sensitivity was 015%,meanwhile the detection efficiency was highly im proved with the use of multiplex PCR.S o genetically m odified s oybean could be detected and identified rapidly and correctly.K ey Words :Plants ,T ransgenic ;S oybeans ;DNA Chip ;P olymerase Chain Reaction

基金项目:天津市科委基金项目(033182811)作者简介:刘 女　工程师通讯作者:郑文杰　女　高级工程师

This w ork w as supported by the Science and T echnology P lan of Tianjin ,China .(033182811)

出于对转基因作物安全性考虑,中国、欧盟、日本、韩国等国家和组织纷纷制定相应的法律和法规要求对转基因作物和加工食品进行标识,以对人、动物的健康和生态环境多样性进行保护。建立一套简便、快速、准确的检验技术以满足日常检测的要求是十分必要的。目前国际上常用的检测方法有PCR -电泳检测、E LIS A 检测、实时荧光定量PCR 检测以

及试纸条检测,上述方法的局限性在于对含有多个外源基因的转基因作物一次只能检测一个基因,因

此费时、费力,容易造成假阴性[1,2]

。

基因芯片(gene chip )又称DNA 芯片(DNA

chip ),是指在表面积较小的基片表面有序地固定大

量的基因探针(probe ),从而形成DNA 微阵列。芯片

上每一特定位置的核苷酸序列都是已知的,与待测样品杂交后根据各点产生的信号的强弱,利用激光共聚焦扫描和电藕荷器件(CC D )成像等方法对杂交结果进行检测,因此DNA 芯片技术具有高度并行性、高通量、微型化和自动化等优点,具有广泛的应

用前景[3]

。

在所有转基因作物中,转基因大豆的种植面积最大,在国际贸易中占有重要的地位。为了有效地对转基因大豆进出口贸易进行监测,保证我国对外贸易的可持续性发展,本研究将多重PCR 技术与

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231—中国食品卫生杂志

CHI NESE JOURNA L OF FOOD HYGIE NE

2005年第17卷第2期

DNA芯片技术相结合对转基因大豆DNA芯片检测方法进行了研究。

1　材料与方法

111　仪器

PCR仪　T gradient,德国Biometra公司;杂交炉MAX14,英国Hy Baid公司;紫外交联仪C L508,英国UVI公司;低温高速离心机Allergra64R,美国Beckman公司;核酸蛋白分析仪lambda35,美国PE 公司;化学发光荧光可见光系统Chemilmager4400,美国Alpha公司;芯片点样仪612型,上海棱光生物技术公司;微量加样器法国Dils on公司。

112　材料

转基因大豆(R oundup Ready)和非转基因大豆均由美国S DI公司提供。

113　试剂及试剂盒

植物基因组DNA提取试剂盒　Promega(Wizard Magnetic DNA Purification System F or F ood);多重PCR 扩增试剂盒　QI AGE N(Multiplex PCR K it);核酸杂交试剂盒　R oche(DIG High Primer DNA Labeling and Detection starter K it);T aq酶体系　Promega;dNTPs Promega;SSC　Promega;杂交膜　Pharmacia(Hybond2 N+)。

114　引物

通过引物设计软件(Olig o610)进行引物设计,针对位点为CaMV35S启动子、NOS终止子、CaMV35S2EPS PS、NOS2EPS PS、内源Lectin等基因片段。为进行多重PCR,在引物设计时尽可能使它们的退火温度相近,本研究设计的5对引物退火温度均为54℃,PCR扩增片段控制在100～200bp范围内。

CaMV35S启动子:　5’2G CT CCT ACA AAT G CC ATC A23’

(195bp)　5’2G AT AGT GGGATT GTG CGT CA23’

NOS终止子:　5’2TTA AG A TTGAAT CCT GTT G CC G23’

(180bp)　5’2TAA TTT ATC CTA GTT TG C G CG C23’

CaMV35S2EPSPS　5’2TGG CG C CCA TGG CCT G CA TG23’

(209bp)　5’2CCT TCG CAA G AC CCT TCC TCT ATA23’

NOS2EPSPS　5’2G CGAAGATC G AA CTC TCC G23’

(147bp)　5’2TG A TAA TCA TCG CAA G AC CGG23’

Lectin　5’2G CC CTC TAC TCC ACC CCA ATC C23’

(118bp)　5’2G CC CAT CTG CAA G CC TTT TTG TG23’

115　探针标记

用114中设计的引物对样品基因组核酸进行PCR扩增,扩增产物通过K lenow酶和DIG2dUTP,采用切口平移法进行标记,按试剂盒说明进行操作(R oche,DIG High Primer DNA Labeling and Detection starter K it)。

图1　芯片阵列116　DNA芯片的制备

用114中设计的引物扩

增样品核酸提取物,扩增产物

通过芯片点样仪点到杂交膜

上,每点点样5次,将芯片干

燥、紫外交联等处理后,得到

可用于检测的DNA芯片。点

样阵列见图1。

图1中芯片面积为15mm×15mm,第1列为空白对照,第2列为内源Lectin基因,第3列为CaMV35S,第4列为NOS,第5列为CaMV35S2 EPS PS,第6列为NOS2EPS PS,每列重复6次,以保证结果的重复性和准确性。

117　样品基因组DNA的提取

将转基因大豆R oundup Ready纯品(阳性样品)与非转基因大豆(阴性样品)分别制成质量百分比为5%、1%、015%、011%的试样。将上述试样各称取200mg,采用基因组DNA提取试剂盒(Promega)提取DNA,具体步骤参照试剂盒使用说明。提取产物经核酸蛋白分析仪测定DNA浓度和纯度,并通过015%琼脂糖凝胶电泳观察产物的质量。提取DNA 于-20℃冷冻保存备用。

118　多重PCR扩增

将试样DNA稀释10倍作为反应模板,终浓度为50～100ngΠμl,在200μl离心管中依次加入PCR 反应缓冲液、dNTPS、5对引物、H otstar T ap酶、DNA 模板、补足ddH2O使反应总体积为50μl。各组分的终浓度参照试剂盒(QI AGE N,Multiplex PCR K it)说明。

多重PCR扩增条件为95℃变性10min;94℃30 s;54℃退火30s;72℃延伸1min;72℃最后延伸40 min,共40个循环。

119　探针的制备

将118中扩增产物通过缺口平移法制备探针混合物。

1110　芯片杂交和结果判读

预杂交　在杂交皿中加入300μl预杂交液(R oche杂交试剂盒提供);

杂交　将119中PCR产物探针混合物100℃煮沸10min,迅速于冰水混合物中冷冻5min,加入200μl杂交反应液(杂交试剂盒提供)涡旋混匀,加入杂交皿中,于杂交炉中45℃杂交1h。

清洗　2×SSC,2×15min;1×SSC,3×10min, 011×SSC,2×15min。

封闭与显色　参照杂交试剂盒说明进行。

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转基因大豆DNA检测芯片的研究———刘 郑文杰　赵卫东等

结果判读　若芯片上相应位点出现蓝紫色斑点表明此试样含有该基因序列,结果通过化学发光荧光可见光系统成像保存,数据分析备用。2　结果和讨论

211　用试剂盒法获得的DNA 质量可满足PCR 反应

的要求

采用Promega 公司植物基因组DNA 提取试剂盒获得的大豆基因组DNA 经核酸蛋白分析仪测定

A 260为01937,A 260Π280为11996;DNA 经琼脂糖电泳,结

果表明DNA 片段完整,没有明显的降解。212　检测中采用转基因大豆作为阳性对照可防止假阴性结果的出现

在对未知大豆样品进行检测时,必须以转基因大豆的芯片杂交结果作为对照,避免假阴性结果的出现,造成漏检。在芯片质量合格和杂交反应条件正常的情况下,阳性样品中的内外源基因的PCR 扩增片段与芯片上相应位点的探针进行杂交可出现蓝紫色的杂交斑点,若未出现斑点说明芯片质量不合格、探针浓度过低或杂交反应条件需进一步优化。213　影响多重PCR 扩增的因素

PCR 扩增缓冲液的影响　常规PCR 缓冲液使

用标准缓冲液,由115mm ol ΠL Mg 2+

,10mm ol ΠL T ris ?HCl (pH813)和50mm ol ΠL K Cl 组成。据文献报道T MAC 、T riton 2X 100、明胶能增强PCR 扩增的特异性[4]

,因而,在多重PCR 缓冲液中可加入1mm ol ΠL T MAC 和011%T riton 2X 100。

循环参数的影响　为了使反应后加尾整齐,多重PCR 的延伸时间比常规PCR (循环时延伸时间为40s ,最后延伸为5min )长,通过反复的优化实验,我们认为循环时延伸时间为1min ,最后延伸时间为40min 扩增效果较好,扩增产物加尾整齐。

H otstar DNA 聚合酶的影响　在PCR 起始阶段,模板量较低,在起始循环较低温度下形成非特异性配对进行非特异性延伸对目的扩增的影响尤其大,导致杂带产生甚至目的片段无法扩增。而H otstar DNA 聚合酶在常温下没有活性,需95℃激活15min

才具有聚合酶的活性,可以避免起始循环较低温度下形成非特异性配对延伸,大大地提高了PCR 反应的特异性和灵敏度,尤其适合于多重PCR 扩增中基因组模板复杂、样品量较少、目的扩增片段长度多样化等特点。214　影响地高辛探针标记的因素

使用地高辛标记系统时,可根据地高辛系统的

不同用途、获得的用以制备探针的模板的类型、以及

探针可达到的灵敏度,选择探针标记方法[5]

。本研究中采用了切口平移法进行探针标记,该方法快速、简便、灵敏度较高,可满足转基因植物产品检测的要求。DNA 模板的纯度越高,标记的效率也就越高,因此在进行标记前应对PCR 扩增产物进行回收纯化或使用苯酚、氯仿等试剂抽提DNA 模板。215　重复性

将转基因大豆和非转基因大豆各制备10份进行10次检测,并分别设立空白对照和阳性对照。结果表明多重PCR 2DNA 芯片杂交检测体系结果稳定,10次检测结果基本一致,有较好的重复性。说明芯片质量稳定,可满足检测的要求。216　灵敏度对转基因大豆质量百分比分别为5%、1%、015%、和011%的试样进行检测。进行基因组DNA 提取、多重PCR 扩增、与芯片杂交。随着转基因大豆含量的递减,杂交后显色斑点的大小和颜色的深浅也呈现相应的衰减趋势。对于5%、1%、015%试样,检测信号较强,内外源基因均可检出,而当含量降低为011%时,信号较弱,只检出Lectin 基因和CaMV 35S 启动子基因,因此该芯片检测方法的灵敏度可定为015%。参考文献

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[收稿日期:2004-12-26]

中图分类号:R15;Q34311;S52 文献标识码:A 文章编号:1004-8456(2005)02-0132-03

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