5-羟甲基糠醛对皮质酮损伤型海马神经元P-synapsin+Ⅰ蛋白表达的影响

?基础研究?

５－羟甲基糠醛对皮质酮损伤型海马神经元Ｐ－ｓｙｎａｐｓｉｎⅠ蛋白表达的影响

张丽娜　张天良１　金国琴　戴薇薇　林　梅２

　（上海中医药大学基础医学院生化教研室，上海　２０１２０３）

〔摘　要〕　目的　观察熟地有效成分５－羟甲基糠醛对高浓度皮质酮致海马神经元损伤及学习记忆相关蛋白Ｐ－ｓｙｎａｐｓｉｎＩ蛋白表达的影响。方法

　用２４ｈ新生大鼠制备原代海马神经细胞。培养第８天用皮质酮、ＲＵ３８４８６、５－ＨＭＦ处理细胞，将细胞分为正常组、模型组（１×１０－４ｍｏｌ／Ｌ皮质酮）、拮抗剂组（１０－４ｍｏｌ／Ｌ皮质酮＋３ｎｍｏｌ／ＬＲＵ３８４８６）、５－羟甲基糠醛组（１０－４ｍｏｌ／Ｌ皮质酮＋０畅５ｍｇ／Ｌ５－ＨＭＦ）。２４ｈ后，通过ＳＹＴＯ１３－ＰＩ双荧光染色法观

察各组细胞的形态及存活情况，ＭＴＴ法测定细胞活性，生化方法检测衰老特异性指标β－半乳糖苷酶活性，Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹检测学习记忆相关分子Ｐ－ｓｙｎ－ａｐｓｉｎⅠ的蛋白表达。结果　与正常组相比，模型组细胞死亡较多，细胞活力下降，β－半乳糖苷酶活性升高，Ｐ－ｓｙｎａｐｓｉｎⅠ蛋白表达显著性降低；如上改变均被皮质酮受体拮抗剂ＲＵ３８４８６逆转；一定浓度的５－羟甲基糠醛明显减少死细胞数量，提高细胞活力，降低β－半乳糖苷酶活性，提高模型细胞Ｐ－ｓｙｎａｐｓｉｎⅠ蛋白表达。结论　０畅５ｍｇ／Ｌ５－羟甲基糠醛可以保护大鼠海马神经细胞免遭高浓度皮质酮的损伤，通过调节学习记忆信号转导途径中的重要蛋白Ｐ－ｓｙｎａｐｓｉｎⅠ的蛋白表达，可能在延缓学习记忆功能退化中发挥作用。

〔关键词〕　５－羟甲基糠醛；海马神经元；皮质酮；Ｐ－ｓｙｎａｐｓｉｎⅠ；熟地

〔中图分类号〕　R966 〔文献标识码〕　A 〔文章编号〕　1005－9202（2015）09－2305－03；doi ：10畅3969／j 畅issn 畅1005－9202畅2015畅09畅001

Protein expression of P －synapsin Ⅰfollowing 5－HMF of SHUDI treatment in hippocampal neurons with corticosterone injury ZHANG Li －Na ，ZHANG Tian －Liang ，JIN Guo －Qin ，et al 畅

Department of Biochemistry ，College of Basic Medicine ，Shanghai University of TCM ，Shanghai 201203，China

【Abstract 】　Objective Ｔｏｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆ５－ＨＭＦｉｎＳＨＵＤＩｔｏＰ－ｓｙｎａｐｓｉｎⅠｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｉｎｊｕｒｅｄｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌｎｅｕ－ｒｏｎｓｂｙｈｉｇｈｄｏｓｅｏｆｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅ（ＣＯＲＴ）畅Methods Ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌｎｅｕｒｏｎｓｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄｆｒｏｍｎｅｗｂｏｒｎ（２４ｈ）ｒａｔｓ畅Ｏｎｔｈｅｅｉｇｈｔｈｄａｙ

ｔｈｅｎｅｕｒｏｎｓｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈＣＯＲＴ，ＲＵ３８４８６ａｎｄ５－ＨＭＦ畅Ｔｈｅｃｅｌｌｓｗｅｒｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｃｏｎｔｒｏｌ，ｍｏｄｅｌ（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ１０－４

ｍｏｌ／ＬＣＯＲＴ），

ＲＵ３８４８６（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ１０－４ｍｏｌ／ＬＣＯＲＴ＋３ｎｍｏｌ／ＬＲＵ３８４８６）ａｎｄ５－ＨＭＦ（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ１０－４

ｍｏｌ／ＬＣＯＲＴ＋０畅５ｍｇ／Ｌ５－ＨＭＦ）ｇｒｏｕｐｓ畅２４ｈｏｕｒｓｌａｔｅｒ，ＳＹＴＯ１３－ＰＩｄｏｕｂｌｅ－ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｔａｉｎｉｎｇ，ＭＴＴａｓｓａｙ，β－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅａｓｓａｙａｎｄＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｗｅｒｅｃａｒｒｉｅｄｏｕｔ畅Results Ｃｏｍ－ｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ｂｏｔｈｔｈｅｃｅｌｌｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅａｎｄｃｅｌｌｖｉａｂｉｌｉｔｙｗｅｒｅｄｅｃｒｅａｓｅｄｍａｒｋｅｄｌｙ（P ＜０畅０５），β－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｗａｓｉｎ－ｃｒｅａｓｅｄｍａｒｋｅｄｌｙ（P ＜０畅０５）ａｎｄＰ－ｓｙｎａｐｓｉｎⅠｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄｉｎｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ畅５－ＨＭＦｏｒＲＵ３８４８６ｃｏｕｌｄｉｎ－ｖｅｒｔａｂｏｖｅｃｈａｎｇｅｓ畅Conclusions ０畅５ｍｇ／Ｌ５－ＨＭＦｉｎＳＨＵＤＩｃｏｕｌｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｐｒｅｖｅｎｔｔｈｅｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓｎｅｕｒｏｎｆｒｏｍｉｎｊｕｒｙ畅５－ＨＭＦｃｏｕｌｄｃｈａｎｇｅＰ－ｓｙｎａｐｓｉｎⅠｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｉｎｊｕｒｅｄｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌｎｅｕｒｏｎｓｂｙｈｉｇｈｄｏｓｅｏｆＣＯＲＴｔｏｐｒｅｖｅｎｔａｎｄｔｒｅａｔｌｅａｒｎｉｎｇａｎｄｍｅｍｏ－ｒｙｉｍｐａｉｒｍｅｎｔｐｒｏｂａｂｌｙ畅

【Key words 】　５－ＨＭＦ；Ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌｎｅｕｒｏｎ；Ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅ（ＣＯＲＴ）；Ｐ－ｓｙｎａｐｓｉｎⅠ；ＳＨＵＤＩ基金项目：国家自然科学基金项目（Ｎｏ畅８１４０３２７９）；上海市教育委员会

重点学科建设项目（Ｎｏ畅Ｊ５０３０１）；上海市卫生局青年科研项目（Ｎｏ畅２０１２４Ｙ０２５）

１　十堰市第十六中学　２　上海中医药大学教学实验中心

第一作者：张丽娜（１９８０－），女，在读博士，讲师，主要从事中西医结合基

础（生化）研究。

补肾滋阴药能有效改善老年学习记忆减退〔１〕

。如以熟地

为主药的左归丸、六味地黄丸等补肾复方均可以改善学习记忆

功能

〔２，３〕

。大量实验也提示熟地本身也具有抗衰老及改善学习

记忆的作用〔４，５〕

。熟地即经过炮制加工后的地黄，在加工过程

中５－羟甲基糠醛（５－ＨＭＦ）含量比炮制前增加２０倍左右，是熟地质量控制选择的量化指标之一

〔６〕

。大脑边缘系统———海马

区域是糖皮质激素受体（ＧＣＲ）密度最高的脑区，所以最容易受到高皮质酮血症的毒性影响，而海马又与学习记忆密切相关，故认为海马的皮质酮毒性可能是老年学习记忆退化的重要起始原因之一。本研究旨在探讨熟地改善老年学习记忆退化的分子机制及发挥作用的活性成分。

1　材料与方法

1畅1　实验动物及主要试剂　清洁级出生２４ｈ内的ＳＤ大鼠，由上海中医药大学实验动物中心提供。ＤＭＥＭ高糖培养液（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、胎牛血清（杭州四季青公司）、０畅２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ、Ｎｅｕ－ｒｏｂａｓａｌ培养基及Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ）、皮质酮（ＵＳＢｉｏｌ）、ＲＵ３８４８６、５－ＨＭＦ（纯度≥９９％）及ＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ）、ＤＭＳＯ（Ａｍｒｅｓｃｏ）、ＳＹＴＯ１３染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＰＩ（碘化丙锭）染料、免疫组化ＳＰ通用试剂盒（上海长岛生物），兔抗鼠ＮＳＥ多克隆抗体、Ｐ－ｓｙｎａｐｓｉｎＩ兔抗大鼠多克隆抗体、羊抗小鼠（兔）ＩｇＧ－ＨＲＰ二抗（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）。1畅2　主要仪器　Ｂ５０６０ＥＫＣＯ２培养箱（Ｈｅｒａｅｕｓ，德国），Ｂｉｏ－ｈａｚａｒｄ垂直式无菌无尘操作台（造鑫企业有限公司，上海），ＴＨ－３５６０灭菌锅（造鑫企业有限公司，台湾），ＸＤＳ－１Ｂ荧光倒置相差显微镜（Ｏｌｙｍｐｕｓ，日本），ＪＡ１００３型电子分析天平（上海天平仪器厂），ＦＲ－２００凝胶扫描分析系统（上海复日科技有限公司）1畅3　海马神经细胞原代培养　取新生２４ｈ的ＳＤ大鼠５只，７５％酒精消毒，断颈取头，置于无菌培养皿中，迅速用眼科剪剪开头部皮肤及颅骨，取出两侧大脑半球，用眼科剪小心分离出

?

５０３２?张丽娜等　５－羟甲基糠醛对皮质酮损伤型海马神经元Ｐ－ｓｙｎａｐｓｉｎⅠ蛋白表达的影响　第９期

两侧海马，置入少量无血清高糖ＤＭＥＭ培养液中，剪成约１～２ｍｍ３的小块后，加入０畅２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ０畅０２％ＥＤＴＡ５ｍｌ，把胰酶及组织块一并吸入１５ｍｌ离心管中。细胞培养箱中孵育３０ｍｉｎ，期间每１０ｍｉｎ轻轻摇晃１次。取出，吸弃上清液，加入５ｍｌ种植液（含２０％ＢＳＡ的高糖ＤＭＥＭ）静置３ｍｉｎ以终止胰酶的消化。吸弃上清，再加入５ｍｌ种植液，反复轻轻吹打２５次，静置３ｍｉｎ，吸取并保留上清细胞悬液于５０ｍｌ离心管中（置于冰上）。沉淀中再次加入５～６ｍｌ种植液，步骤同上。反复３～４次，直至组织块基本消失，合并每次细胞悬液至前一５０ｍｌ离心管中。细胞计数，种植液调整细胞浓度为０畅５～１×１０７个／ｍｌ，接终于培养板中，９６孔板１２０μｌ，２４孔板１ｍｌ，６孔板３ｍｌ。ＣＯ２细胞培养箱中培养。待细胞贴壁后，全量改培养液为

ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ＋Ｂ２７（体积比为４９∶１），以后每２～３天半量换液，培养至第８天，进行ＮＳＥ免疫细胞化学染色和分组用药处理。

1畅4　海马神经细胞的鉴定　ＮＳＥ特异的免疫细胞化学染色法。细胞接种于６孔板，孔数n＝６。用ＮＳＥ多克隆抗体，依据免疫组织化学ＳＰ通用试剂盒方法鉴定神经元。

1畅5　５－ＨＭＦ作用于模型细胞的量效观察　在以往工作的基础上〔７〕（采用浓度为１０－４ｍｏｌ／Ｌ皮质酮作用海马神经元制备皮质酮损伤型海马神经细胞模型；用３ｎｍｏｌ／Ｌ皮质酮受体拮抗剂ＲＵ３８４８６作用该模型可成功拮抗皮质酮对海马神经元的损伤；各用药组用药２４ｈ，差异最显著），采用ＭＴＴ法进行量效实验，确定用药组５－ＨＭＦ（０畅０５，０畅５，５，５０ｍｇ／Ｌ）最佳作用浓度。

1畅6　实验分组　将培养至第８天的生长良好的海马神经元分组用药处理，共分为４组。用ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ＋Ｂ２７（体积比为４９∶１）培养基培养细胞，每２～３天换液｀次。培养至第８天，弃去培养基，给贴壁细胞用药。第１组用前述培养基继续培养，即正常组；第２组用含终浓度为１０－４ｍｏｌ／Ｌ皮质酮的培养基继续培养，即模型组；第３组用含终浓度为３ｎｍｏｌ／Ｌ皮质酮受体拮抗剂ＲＵ３８４８６和终浓度为１０－４ｍｏｌ／Ｌ皮质酮的培养基继续培养，即拮抗剂组；第４组含终浓度为０畅５ｍｇ／Ｌ５－ＨＭＦ和终浓度为１０－４ｍｏｌ／Ｌ皮质酮的培养基继续培养，即５－ＨＭＦ组。

1畅7　ＳＹＴＯ１３－ＰＩ双荧光染色观察海马神经元形态及细胞存活率　细胞接种于９６孔板，每组细胞孔数n＝６。每孔细胞加入２畅５μｍｏｌ／ＬＳＹＴＯ－１３染液２μｌ，用铝箔遮盖避光，室温放置１５ｍｉｎ；再向每孔培养细胞中加入２μｌＰＩ染液，用铝箔遮盖避光，室温放置１５ｍｉｎ。小心吸弃上清液，用ＨＥＰＥＳ缓冲液轻轻洗涤２次，荧光显微镜下观察和拍照。

1畅8　ＭＴＴ法测定细胞的活力　细胞培养于９６孔培养板，每组细胞孔数n＝１０。每孔细胞加入ＭＴＴ试剂（５ｍｇ／ｍｌ）２０μｌ，继续培养４ｈ，弃上清，加入１５０μｌＤＭＳＯ，振荡１０ｍｉｎ，酶标仪测定５７０ｎｍ的吸光度（ＯＤ）值。

1畅9　β－半乳糖苷酶活性测定　细胞培养于９６孔培养板，每组孔数n＝１０。按照β－半乳糖苷酶测定试剂盒进行测定。文献报道，随着细胞老化，在ｐＨ６畅０的条件下，细胞内增高的β－半乳糖苷酶可降解其底物Ｘ－半乳糖，产生的蓝色产物随之增多。

1畅10　Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法测定学习记忆信号转导通路相关分子Ｐ－ｓｙｎａｐｓｉｎⅠ蛋白表达　细胞接种于６孔板，每组细胞孔数n＝６。参照ＤＢＩ公司的动物细胞总蛋白抽提试剂盒和ＢＣＡ蛋白定量试剂盒的方法抽提和定量细胞总蛋白。根据求出样品的实际蛋白含量，求得在２０μｌ总上样体积中的样品体积，保证每个样品上样量为３０μｇ。加入上样缓冲液，沸水浴中煮１０ｍｉｎ。

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳，转膜，５％的脱脂奶粉封闭１ｈ，加入一抗，４℃过夜，ＰＢＳＴ洗膜，加入二抗，３７℃条件孵育４５ｍｉｎ，ＰＢＳＴ洗膜。ＥＣＬ显色，图像分析仪进行光密度积分扫描，做定量分析。

1畅11　统计学方法　采用ＳＰＳＳ１１畅０软件处理，数据以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析（ＯｎｅｗａｙＡＮＯＶＡ）。

2　结　果

2畅1　神经元鉴定结果　经过ＮＳＥ特异的免疫细胞技术染色后，细胞的胞质和突起均被染成棕黄色（如图１）。清晰可见神经元的胞体、树突和轴突，表明海马神经细胞生长状态及纯度

较好。

图1　NSE染色实验中培养第8天的海马神经元（×200）

2畅2　５－ＨＭＦ作用模型细胞的量效结果　与正常组相比，１０－４ｍｏｌ／Ｌ皮质酮处理的模型组细胞的活力显著下降（０畅５２９±０畅０２２ｖｓ０畅７２２±０畅０１５，P＜０畅０５）。与模型组相比，５ｍｇ／Ｌ５－ＨＭＦ与５０ｍｇ／Ｌ５－ＨＭＦ组的细胞活力显著下降（０畅３５４±０畅０１７，０畅２９６±０畅０１３，P＜０畅０５），说明了此两种浓度的５－ＨＭＦ对海马神经元具有损伤作用，而与模型组相比，０畅５ｍｇ／Ｌ５－ＨＭＦ组的细胞活力显著升高（０畅６３７±０畅０１０，P＜０畅０５），０畅０５ｍｇ／Ｌ５－ＨＭＦ组与模型组无差异（０畅５２４±０畅０２２，P＞０畅０５）。

结合形态学观察，５ｍｇ／Ｌ５－ＨＭＦ与５０ｍｇ／Ｌ５－ＨＭＦ组的绝大部分细胞消失，仅存的细胞也变小变圆，皱缩变形，细胞间连接完全消失；而０畅５ｍｇ／Ｌ５－ＨＭＦ组细胞形态与正常组相比并无显著区别，胞核及核仁、细胞突起均清晰可见，树突与轴突相连成神经网络结构；０畅０５ｍｇ／Ｌ５－ＨＭＦ组细胞形态与模型组相比无显著差异，细胞突起及神经网络结构较正常组减少。

2畅3　ＳＹＴＯ１３－ＰＩ双重荧光染色法观察各处理组海马神经细胞的存活情况　ＰＩ染料可使死细胞染成红色，ＳＹＴＯ１３可使活细胞染成绿色。与正常组比较，模型组红染细胞明显增多，绿染细胞减少，与模型组比较，加入５－ＨＭＦ与拮抗剂处理后，均可以明显降低细胞死亡数量。拮抗剂ＲＵ３８４８６对模型细胞存活率的改变证明了该损伤作用由皮质酮受体介导。见图２。

2畅4　ＭＴＴ法检测细胞的活性　与正常组细胞比较，模型组细胞活力明显下降（P＜０畅０５）。皮质酮受体拮抗剂ＲＵ３８４８６组和５－ＨＭＦ组细胞活力较模型组明显升高（P＜０畅０５）。见表１。

?６０３２

?中国老年学杂志２０１５年５月第３５卷

2畅5　各组细胞β－半乳糖苷酶活性　与正常组细胞相比较，模型组细胞内β－半乳糖苷酶活性明显增高（P ＜０畅０５）。拮抗剂组、５－ＨＭＦ组细胞内β－半乳糖苷酶活性明显较模型组下降（P ＜０畅０５）。见表１。

2畅6　Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法检测各组细胞Ｐ－ｓｙｎａｐｓｉｎⅠ蛋白表达　与正常组相比，模型组细胞Ｐ－ｓｙｎａｐｓｉｎⅠ蛋白相对表达量显著性降低（P ＜０畅０５）。拮抗剂组、５－ＨＭＦ组Ｐ－ｓｙｎａｐｓｉｎⅠ蛋白相对表达量较模型组均显著性升高（P ＜０畅０５）。见表１，图３。

表1　用药24h 各组细胞活力、β－半乳糖苷酶活性及

P －synapsin Ⅰ蛋白表达比较（x ±s ，n ＝10）

组别细胞活力５７０ｎｍ

β－半服糖苷酶活性５０５ｎｍ

Ｐ－ｓｙｎａｐｓｉｎⅠ正常组０畅７４８±０畅０２３０畅３２７±０畅０９００畅９２７±０畅０６５模型组０畅５３８±０畅０５１１）０畅４６４±０畅０４４１）０畅０８２±０畅０５７

１）

拮抗剂组０畅６５８±０畅０４０２）０畅３５４±０畅０３３２）０畅６０５±０畅０３１２）５－ＨＭＦ组

０畅６１５±０畅０３６２）

０畅３５３±０畅０６０２）

０畅７０４±０畅０４９２）

　与正常组比较：１）P ＜０畅０５；与模型组比较：２）

P ＜０畅０５

图2　用药24h 后的各用药组海马神经元SYTO1313－PI 双重荧光染色（×200

）

图3　药物处理24h 各组细胞P －synapsin Ⅰ蛋白表达3　讨　论

ＳｙｎａｐｓｉｎⅠ是神经元特异性突触前囊泡膜磷酸蛋白，是突触蛋白家族的第１个成员，被称为突触素Ⅰ或突触蛋白１

〔８〕

。

突触蛋白磷酸化状态及其ｍＲＮＡ水平的改变可能引发多种神经疾病，因此突触素常被运用于神经系统疾病的研究中。Ｓｙｎ－ａｐｓｉｎⅠ具有多种蛋白激酶磷酸化的多个位点，尤其是ＰＫＡ、Ｃａ２＋

／ＣａＭＫⅡ和ＭＡＰＫ的主要底物。当ＳｙｎａｐｓｉｎⅠ处于非磷酸

化状态时，可将储存库中的囊泡固定在细胞骨架上，使其准备随时进入囊泡循环；当突触前膜去极化，胞质内Ｃａ２＋

浓度升高，激活ＰＫＡ、Ｃａ２＋

／ＣａＭＫⅡ或通过ＢＤＮＦ－ＴｒｋＢ－ＭＡＰＫ通路磷酸化ｓｙｎａｐｓｉｎⅠ，囊泡即可从细胞骨架上释放出来，进入突触前膜的激活区，再进一步释放神经递质

〔９〕

。因此ＳｙｎａｐｓｉｎⅠ的磷酸化

水平可间接反映递质（如谷氨酸）的释放和突触的传递功能，参与学习记忆及ＬＴＰ（突触传递功能长时程增强）诱导

〔１０，１１〕

。

本研究说明ＧＣＲ是皮质酮损伤海马神经元活力和Ｐ－ｓｙｎ－ａｐｓｉｎⅠ蛋白表达的重要中间环节。ＧＣＲ属于细胞内受体，在海马细胞等最为丰富。５－ＨＦＭ可以保护大鼠海马神经细胞免遭高浓度皮质酮的损伤，可能通过调节学习记忆信号转导途径中重要蛋白ｓｙｎａｐｓｉｎⅠ的磷酸化，在延缓学习记忆功能退化中发挥作用。

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〔２０１３－１２－３０修回〕

（编辑　赵慧玲／曹梦园）

?

７０３２?张丽娜等　５－羟甲基糠醛对皮质酮损伤型海马神经元Ｐ－ｓｙｎａｐｓｉｎⅠ蛋白表达的影响　第９期

5-羟甲基糠醛对皮质酮损伤型海马神经元P-synapsin Ⅰ蛋白表

达的影响

作者：张丽娜， 张天良， 金国琴， 戴薇薇， 林梅

作者单位：张丽娜,金国琴,戴薇薇(上海中医药大学基础医学院生化教研室,上海,201203)， 张天良(上海中医药大学基础医学院生化教研室，上海 201203; 十堰市第十六中学)， 林梅(上海中医药大

学基础医学院生化教研室，上海 201203; 上海中医药大学教学实验中心)

刊名：

中国老年学杂志

英文刊名：Chinese Journal of Gerontology

年，卷(期)：2015(9)

引用本文格式：张丽娜.张天良.金国琴.戴薇薇.林梅5-羟甲基糠醛对皮质酮损伤型海马神经元P-synapsin Ⅰ蛋白表达的影响[期刊论文]-中国老年学杂志 2015(9)

5-羟甲基糠醛的相关研究报告

5-羟甲基糠醛的相关研究 摘要 5-羟甲基糠醛(5-HMF)具有高活性的呋喃环、芳醇、芳醛结构，其衍生物被广泛的用作真菌剂、腐蚀抑制剂、香料，也可以代替由石油加工得到的苯系化合物作为合成高分子材料的原料；因而，以生物质资源的糖类化合物为原料合成精细化工产品5-HMF的研究备受关注。 本课题主要从5-羟甲基糠醛(5-HMF)的性质、制备、用途、检测等方面，展示近年来对5-羟甲基糠醛(5-HMF)的研究成果。 关键词：5-羟甲基糠醛(5-HMF) 果糖葡萄糖紫外-分光光度法（UV） 1、5-羟甲基糠醛的性质 5-羟甲基糠醛(又名5-羟甲基-2糠醛，羟甲基糠醛，5-羟甲基呋喃甲醛或5-羟甲基-2-呋喃甲醛)，英文名5-hydroxymethyl-2-furfural，可简写为5-HMF。它是一种暗黄色针状结晶，具有甘菊花味，有吸湿性，易液化，需避光低温密封保存。其物化性质如下[1]。 分子式: C6H6O3 分子量: 126.116 英文简写：5-HMF 结构式：[2] 5-HMF不能与强碱、强氧化剂、强还原剂共存。加热时放出干燥刺激性的

烟雾，燃烧和分解时释放一氧化碳和二氧化碳。5-HMF易溶于水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、甲基异丁基甲酮、二甲基甲酰胺等，可溶于乙醚、苯、氯仿等，微溶于四氯化物，难溶于石油醚。 5-HMF是一种重要的化工原料，它的分子中含有一个醛基和一个羟甲基，可以通过加氢，氧化脱氢，酯化，卤化，聚合，水解以及其它化学反应，用于合成许多有用化合物和新型高分子材料，包括医药，树脂类塑料，柴油燃料添加物等。 5-HMF本身具有药物活性，是很多中药中的有效成分，由5-HMF出发制备的一系列呋喃衍生物也具有不同的功能，包括合成医药和农药方面的先导化合物；作为单体合成具有光学活性、可生物降解等特性的高分子材料，还可以合成具有强配位能力的大环化合物。 2、5-羟甲基糠醛的制备 5-HMF可由六碳糖、低聚糖、高聚糖甚至可以是一些由工业废料转化而来 的碳水化合物为原料，在酸性催化剂的作用下脱水而得。通常是以六碳糖为原料，期间会产生甲酸和乙酰丙酸等副产物，其原理如下。 2.1 果糖降解生成5-HMF的机理 VanDam、Kuster、Antal提出果糖脱水生成5-HMF有两种可能的反应机理i 和ii。其中路线i中包括一个环状化合物而路线ii没有经历环状化合物直接脱水得到5-HMF。 Antal通过实验进一步证明了5-HMF的生成要经历一个环状中间体。其根据如下： (1)果糖比蔗糖易于发生该反应。 (2)当果糖在氘代的水溶液中反应时，产物中不含有C-D键。如果化合物a在反应中生成，那么由于烯醇互变异构会在产物中生成C-D键。 因此，该反应应按路线i进行。

5羟甲基糠醛产品

5羟甲基糠醛产品 2021-2026年中国5羟甲基糠醛产品行业投资前景咨询报告 【报告编号】CB16679 5羟甲基糠醛产品行业专项报告,包括5羟甲基糠醛产品行业发展趋势,5羟甲基糠醛产品前景预测,5羟甲基糠醛产品市场规模,5羟甲基糠醛产品全球,5羟甲基糠醛产品品牌,5羟甲基糠醛产品细分,5羟甲基糠醛产品产业链,5羟甲基糠醛产品政策,5羟甲基糠醛产品机遇和挑战,5羟甲基糠醛产品竞争格局,5羟甲基糠醛产品重点企业,5羟甲基糠醛产品集中度,全球5羟甲基糠醛产品,5羟甲基糠醛产品价格,5羟甲基糠醛产品进出口,5羟甲基糠醛产品区域结构等 第一章宏观经济环境分析 第一节全球宏观经济分析 一、2016-2020年全球宏观经济运行概况 二、2021-2026年全球宏观经济趋势预测 第二节中国宏观经济环境分析 一、2016-2020年中国宏观经济运行概况 二、2021-2026年中国宏观经济趋势预测 第三节5羟甲基糠醛产品行业社会环境分析 第四节5羟甲基糠醛产品行业政治法律环境分析 一、行业管理体制分析 二、行业相关发展规划 三、主要产业政策解读 第五节5羟甲基糠醛产品行业技术环境分析

一、技术发展水平分析 二、技术革新趋势分析 第二章国际5羟甲基糠醛产品行业发展分析 第一节国际5羟甲基糠醛产品行业发展现状分析 一、国际5羟甲基糠醛产品行业发展概况 二、主要国家5羟甲基糠醛产品行业的经济效益分析 三、2021-2026年国际5羟甲基糠醛产品行业的发展趋势分析 第二节主要国家及地区5羟甲基糠醛产品行业发展状况及经验借鉴 一、美国5羟甲基糠醛产品行业发展分析 1、2016-2020年行业规模情况 2、2021-2026年行业前景展望 二、欧洲5羟甲基糠醛产品行业发展分析 1、2016-2020年行业规模情况 2、2021-2026年行业前景展望 三、日韩5羟甲基糠醛产品行业发展分析 1、2016-2020年行业规模情况 2、2021-2026年行业前景展望 四、2016-2020年其他国家及地区5羟甲基糠醛产品行业发展分析 五、国外5羟甲基糠醛产品行业发展经验总结 第三章2016-2020年中国5羟甲基糠醛产品市场供需分析 第一节2016-2020年5羟甲基糠醛产品产能分析

5-羟甲基糠醛的检查方法及限度要求初探

发布日期20050622 栏目化药药物评价>>化药质量控制 标题5-羟甲基糠醛的检查方法及限度要求初探 作者邓海星蒋煜 部门 正文内容 审评三部邓海星蒋煜 摘要：5-羟甲基糠醛是含葡萄糖等单糖的注射剂中重要的有关物质。本文就5-羟甲基糠醛的来源、影响其产生的因素、检测方法及限度等进行了阐述。 并提请申请人注意在制剂工艺筛选过程、以及质量研究过程中注意控制该杂 质。 关键词：5-羟甲基糠醛检查方法限度 一、概述 5-羟甲基糠醛（5-Hydroxymethyl furfural，简称5-HMF）是葡萄糖等单糖化合物在高温或弱酸等条件下脱水产生的一个醛类化合物，该化合物稳定 性不好，容易分解成乙酰丙酸和甲酸，或发生聚合反应。一方面，5-HMF对

人体横纹肌和内脏有损害，另一方面，葡萄糖注射液在高温情况下颜色容易变黄，虽然5-HMF本身无色，但由于5-HMF可发生聚合而由聚合物导致变色，且葡萄糖注射液颜色的深浅与5-HMF产生的量成正比，因此5-HMF的量可指代产品中葡萄糖的分解程度。由于5-HMF的毒性及对产品质量情况的指示作用，在含葡萄糖或其它单糖的制剂中应作为一个重要的有关物质加以控制。 影响5-HMF产生量的因素有溶液的pH值、灭菌的温度及灭菌的时间等。葡萄糖在碱性溶液中极不稳定，易脱水分解，而在酸性溶液中相对稳定，其中以pH3.0时分解最少，中国药典规定葡萄糖注射液的pH值应在3.2～5.5。葡萄糖注射液在高温加热灭菌时易产生5-HMF，其量的增加与灭菌温度、时间成正比，在工艺筛选过程中选择考察指标时，需注意纳入5-HMF检查项。另外在贮藏过程中，5-HMF也会增加，所以应尽量缩短葡萄糖注射液的贮藏时间。此外，有文献报道，不同方法制备的注射用水配制的葡萄糖注射液经灭菌处理后，5-HMF的量有显著性差异，四级截留法制备的注射用水较重蒸馏法、蒸馏法制备的注射用水更好。另据文献报道，亚硫酸盐在溶液中能与葡萄糖生成葡萄糖羟基亚硫酸，使葡萄糖分解成5-HMF的反应延迟。 二、检查方法 5-羟甲基糠醛的检查方法通常有以下几种：控制溶液的颜色、紫外法、双波长法、杂质对照法等。 由于葡萄糖注射液颜色的深浅与5-HMF产生的量成正比，可通过控制溶

028为什么要控制药品中的5-羟甲基糠醛

发布日期20040304 栏目化药药物评价>>化药质量控制 标题为什么要控制药品中的5-羟甲基糠醛 作者张哲峰 部门 正文内容为什么要控制药品中的5-羟甲基糠醛 有关5－HMF的小常识 审评三部张哲峰 随着以葡萄糖注射液为载体的各种输液剂的不断出现，产品中5-羟甲基糠醛（简称 5-HMF）的控制应引起足够关注，现介绍有关5-HMF的几点常识，以期引起大家的重视。 1.什么是5-HMF？5-HMF是葡萄糖等单糖化合物在高温或弱酸等条件下脱水产生的 一个醛类化合物。该化合物对人体横纹肌和内脏有损害。 2.5-HMF与葡萄糖输液剂的稳定性有何关系？5-HMF稳定性欠佳，可进一步分解为 乙酰丙酸和甲酸或聚合，5-HMF本身无色，其聚合物为有色物质，导致葡萄糖注射液 变色，色泽深浅与5-HMF的生成量成正比，故5-HMF量可指代产品中葡萄糖分解程度。 3.哪类药品要控制5-HMF？一般有哪些检测方法？对于葡萄糖注射液和葡萄糖氯化 钠注射液，ChP(2000)、BP(1998)和USP(24)均采用284nm测定吸收度的方法控制产 品中5-HMF量，浓度不同，吸收度的限度不同；国外有些企业标准对用到葡萄糖等单糖的口服制剂也进行了5-HMF的限度控制，我国药典对蜂蜜及某些含蜂蜜制剂也进行 5-HMF的限度控制。足见5-HMF的控制是很重要的质量指标，故研制以葡萄糖注射液为载体的输液剂均应规定5-HMF的控制限度；研制以葡萄糖为主要辅料，且制备工艺中有酸性溶液环境及较长时间高温过程的口服制剂时，建议进行产品中5-HMF的含量考察。 常见的5-HMF检测方法有UV法（284nm吸收度或衍生化后284nm与336nm的吸收度差值法）和HPLC法。 4.检测5-HMF时应注意哪些问题？开发以葡萄糖为载体的输液剂，5-HMF的限度控制是必不可少的检测项目，UV吸收度法（284nm）因简单、通用、不需对照品，可作为首选方法；若主药等干扰检测时，可采用HPLC外标法，但限度要求应不低于药典 中葡萄糖注射液或葡萄糖氯化钠注射液限度，需用对照品进行限度的等量转换试验， 以确定合适的限度。如使用HPLC－归一法，同样需要限度等量转换，并作峰位确认。亚铁氰化钾、醋酸锌衍生化后以284nm与336nm的吸收度差值法是中国药典一部检 测蜂蜜中5-HMF含量的方法，进行灵敏度和限度的对比研究后，合适时也可采用。 类别:审评三部 备注

5-羟甲基糠醛的制备及应用研究

万方数据

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5-羟甲基糠醛的制备及应用研究 作者：李凤， 荣先国， 黄玉玲， LI Feng， RONG Xian-guo， HUANG Yu-ling 作者单位：滨州医学院烟台校区,山东,烟台,264003 刊名： 甘肃科学学报 英文刊名：JOURNAL OF GANSU SCIENCES 年，卷(期)：2010,22(4) 参考文献(12条) 1.Frieder W Lichtenthaler;Siegfried Peters Carbohydrates as Green Raw Materials for the Chemical Industry[外文期刊] 2004(02) 2.Haibo Z;Johnathan E H;Z.Conrad Z Metal Chlorides in Ionic Liquid Solvents Convert Sugars to 5-Hydroxymctllyl Rurfftral 2007 3.Conier L;Descolcs G;Neyrel C Pyrolysis of Carbohydrates.Analysis of Industrial Caramelvapors 1989 4.Yuriy R;Uben N C;James A D Phase Modifiers Promote Efficient Production of Hydroxyl Methyl furfuraI from fructose 2006(30) 5.Yuriy R;Christopher J B;James A D Production of Dimethylfuran for Liquid Fuels from Biomass-derived Carbohydrates 2007 6.Hawonb W N;Jones W G M Conversion of Sucrose Into Furancompounds.5-Hydroxymethylfurfuraldehyde and Some Derivatives 1944(11) 7.Kei-ichi Seri;Yoshihisa Inoue;Hitoshi Ishida Catalytic Activity of Lanthanide(Ⅲ) Ions for the Dehydration of Hexose to 5-hydroxymethyl-2-furaldehyde in Water[外文期刊] 2001(06) 8.Mercadier D;Gaset A;Rigal L Synthesis of 5-hydroxymethyl-2-furancarboxy-aldehyde catalysed by cationic exchange resins[外文期刊] 1981 9.Quanxi B;Kun Q;Daisuke Tomida Preparation of 5hydroymethylfurural by Dehydration of Fructose in the Presence of Acidic Ionic Liquid 2008(06) 10.贾天柱;陈焕亮;解世全狗脊升华物中5-羟甲基糠醛的分析[期刊论文]-中成药 2002(10) 11.普文英5-羟甲基糠醛用于神经系统药物的研究 2005(10) 12.Smay G L The Characteristics of High-temperature Resistant Organic Polymers and the Feasibility of Their Use as Glass Coating Materials[外文期刊] 1985(04) 本文读者也读过(9条) 1.傅紫琴.王明艳.蔡宝昌.FU Zi-qin.WANG Ming-yan.CAI Bao-chang5-羟甲基糠醛(5-HMF)在中药中的研究现状探讨[期刊论文]-中华中医药学刊2008,26(3) 2.仝新利.李梦然.TONG Xin-li.LI Meng-ran果糖和蔗糖转化合成5-羟甲基糠醛的研究[期刊论文]-广州化工2010,38(9) 3.林鹿.陈天明.Lin Lu.Chen Tian-ming阳离子交换树脂和Al2O3 催化葡萄糖制取5-羟甲基糠醛[期刊论文]-华南理工大学学报（自然科学版）2010,38(11) 4.董喜恩.蒋锋.罗根祥.Dong Xien.Jiang Feng.Luo Genxiang糖类脱水生成5-羟甲基糠醛的研究进展[期刊论文]-化工中间体2010,06(2) 5.卢奎多5-羟甲基糠醛生成量与高压灭菌的关系[期刊论文]-中外医疗2010,29(12) 6.王军.张春鹏.欧阳平凯.WANG Jun.ZHANG Chunpeng.OUYANG Pingkai5-羟甲基糠醛制备及应用的研究进展[期刊

5-羟甲基糠醛(5-HMF)的检测方法

羟甲基糠醛的检测方法 （IFU） 1 适用范围 本标准适用于果汁加工中半成品、成品的羟甲基糠醛的测定。 2 仪器及试剂 2.1仪器 2.1.1 722S分光光度计：检测波长550nm； 2.1.2 比色管：10ml带有塞子的比色管。 2.2试剂 2.2.1 巴比妥酸溶液：500mg巴比妥酸在温水浴中溶解，冷却后在容量瓶中定容至100ml。最好在冰箱中保存，保存期为一个月。 2.2.2 对甲苯胺溶液：10.0g的对甲苯胺用10.0ml的冰醋酸溶解，转移至100ml 装有50ml异丙醇的容量瓶中，最后用异丙醇定容至刻度。最好在冰箱中用棕色瓶保存，保存期为一个月。 3. 检测步骤 3.1浓缩苹果清汁稀释至11.5°Brix，两根25ml比色管中各移取2ml，用新制备的蒸馏水定容至10ml并充分的混合。在定容后的溶液中加入5ml对甲苯胺，摇匀。其中一根加入1.0ml的水（空白），另一根试管中加入1.0ml的巴比妥酸溶液，摇匀。 3.2 以空白作为对照，用分光光度计在550nm下用1cm比色皿检测并读取吸光度值。巴比妥酸添加以后，吸光度通常很快的下降，反应在3-4分钟达到最大值，用最大值计算。 3.3 实验的准备 空白检测 果汁（11.5°Brix） 2.0ml 2.0ml 对甲苯胺 5.0ml 5.0ml 巴比妥酸 - 1.0ml 水 1.0ml -

4.计算 HMF= （ P*V）/（ v*E） P标准曲线上读取的HMFmg/L V原被稀释溶液的体积 v被用于显色反应检测的稀释部分的体积 E原始果汁的体积 参考文献：本标准依据IFU检测HMF的方法编制

棒曲霉素、羟甲基糠醛含量的检测方法 (液相色谱法) 1. 适用范围 本标准适用于果汁加工中半成品、成品的棒曲霉素、羟甲基糠醛的测定。 2. 仪器及试剂 除另有规定外,试剂均为分析纯,水为二次蒸馏水。所用流动相需用0.45μm 水系滤膜过滤。 2.1试剂 2.1.1冰醋酸（分析纯）； 2.1.2乙酸乙酯（分析纯）; 2.1.3乙腈：色谱纯一级品含量>99.9%； 2.1.4棒曲霉素标准品：纯度>99%； 2.1.5醋酸溶液：c（CH3COOH）= 0.2mol/L； 2.1.6醋酸钠溶液：c（CH3COONa）= 0.2mol/L； 2.1.7醋酸盐缓冲溶液（pH=4.00）：醋酸水溶液:醋酸钠水溶液=164:36（v/v）； 2.1.8无水碳酸钠溶液：c（Na 2CO 3 ）=14g/L ； 2.1.9流动相: 乙腈：水=10：90（v/v）； 2.2仪器 2.2.1高效液相色谱仪：型号LC2010A、配有紫外检测器； 2.2.2色谱柱：250mm×4.6mm（id）ODS反相不锈钢柱； 2.2.3旋转蒸发器：型号RE52－A 2.2.4 分析检测条件： 流动相：乙腈：水=10：90（v/v）； 流速： 1.0ml/min； 柱温：35℃； 检测波长： 276nm；

5-羟甲基糠醛的检查方法及限度要求

5-羟甲基糠醛的检查方法及限度要求初探 审评三部邓海星蒋煜 摘要：5-羟甲基糠醛是含葡萄糖等单糖的注射剂中重要的有关物质。本文就5-羟甲基糠醛的来源、影响其产生的因素、检测方法及限度等进行了阐述。并提请申请人注意在制剂工艺筛选过程、以及质量研究过程中注意控制该杂质。 关键词：5-羟甲基糠醛检查方法限度 一、概述 5-羟甲基糠醛（5-Hydroxymethyl furfural，简称5-HMF）是葡萄糖等单糖化合物在高温或弱酸等条件下脱水产生的一个醛类化合物，该化合物稳定性不好，容易分解成乙酰丙酸和甲酸，或发生聚合反应。一方面，5-HMF对人体横纹肌和内脏有损害，另一方面，葡萄糖注射液在高温情况下颜色容易变黄，虽然 5-HMF本身无色，但由于5-HMF可发生聚合而由聚合物导致变色，且葡萄糖注射液颜色的深浅与5-HMF产生的量成正比，因此5-HMF的量可指代产品中葡萄糖的分解程度。由于5-HMF的毒性及对产品质量情况的指示作用，在含葡萄糖或其它单糖的制剂中应作为一个重要的有关物质加以控制。 影响5-HMF产生量的因素有溶液的pH值、灭菌的温度及灭菌的时间等。葡萄糖在碱性溶液中极不稳定，易脱水分解，而在酸性溶液中相对稳定，其中以pH3.0时分解最少，中国药典规定葡萄糖注射液的pH值应在3.2～5.5。葡萄糖注射液在高温加热灭菌时易产生5-HMF，其量的增加与灭菌温度、时间成正比，在工艺筛选过程中选择考察指标时，需注意纳入5-HMF检查项。另外在贮藏过程中，5-HMF也会增加，所以应尽量缩短葡萄糖注射液的贮藏时间。此外，有文献报道，不同方法制备的注射用水配制的葡萄糖注射液经灭菌处理后，5-HMF 的量有显著性差异，四级截留法制备的注射用水较重蒸馏法、蒸馏法制备的注射用水更好。另据文献报道，亚硫酸盐在溶液中能与葡萄糖生成葡萄糖羟基亚硫酸，使葡萄糖分解成5-HMF的反应延迟。 二、检查方法 5-羟甲基糠醛的检查方法通常有以下几种：控制溶液的颜色、紫外法、双波长法、杂质对照法等。 由于葡萄糖注射液颜色的深浅与5-HMF产生的量成正比，可通过控制溶液的颜色来控制5-HMF的量，但由于5-HMF并非葡萄糖注射液变色的唯一因素，该法专属性和准确性较差。

为什么要控制药品中的5-羟甲基糠醛

为什么要控制药品中的5-羟甲基糠醛 ――有关5－HMF的小常识 审评三部张哲峰 随着以葡萄糖注射液为载体的各种输液剂的不断出现，产品中5-羟甲基糠醛（简称5-HMF）的控制应引起足够关注，现介绍有关5-HMF的几点常识，以期引起大家的重视。 1.什么是5-HMF？5-HMF是葡萄糖等单糖化合物在高温或弱酸等条件下脱水产生的一个 醛类化合物。该化合物对人体横纹肌和内脏有损害。 2.5-HMF与葡萄糖输液剂的稳定性有何关系？5-HMF稳定性欠佳，可进一步分解为乙酰 丙酸和甲酸或聚合，5-HMF本身无色，其聚合物为有色物质，导致葡萄糖注射 液变色，色泽深浅与5-HMF的生成量成正比，故5-HMF量可指代产品中葡萄糖分解程度。 3.哪类药品要控制5-HMF？一般有哪些检测方法？对于葡萄糖注射液和葡萄糖氯化钠注 射液，ChP(2000)、BP(1998)和USP(24)均采用 284nm测定吸收度的方法控制产品中5-HMF量，浓度不同，吸收度的限度不同；国外有些企业标准对用到葡萄糖等单糖的口服制剂也进行了5-HMF的限度控制，我国药典对蜂蜜及某些含蜂蜜制剂也进行5-HMF的限度控制。足见5-HMF的控制是很重要的质量指标，故研制以葡萄糖注射液为载体的输液剂均应规定5-HMF的控制限度；研制以葡萄糖为主要辅料，且制备工艺中有酸性溶液环境及较长时间高温过程的口服制剂时，建议进行产品中5-HMF 的含量考察。常见的5-HMF检测方法有UV法（284nm吸收度或衍生化后284nm与336nm 的吸收度差值法）和HPLC法。 4.检测5-HMF时应注意哪些问题？开发以葡萄糖为载体的输液剂，5-HMF的限度控制是必 不可少的检测项目，UV吸收度法（284nm）因简单、通用、不需对照品，可作为首选方法；若主药等干扰检测时，可采用HPLC外标法，但限度要求应不低于药典中葡萄糖注射液或葡萄糖氯化钠注射液限度，需用对照品进行限度的等量转换试验，以确定合适的限度。如使用HPLC－归一法，同样需要限度等量转换，并作峰位确认。亚铁氰化钾、醋酸锌衍生化后以284nm与336nm的吸收度差值法是中国药典一部检测蜂蜜中5-HMF含量的方法，进行灵敏度和限度的对比研究后，合适时也可采用。

5-羟甲基糠醛的检查方法及限度要求初探

5-羟甲基糠醛的检查方法及限度要求初探 摘要：5-羟甲基糠醛是含葡萄糖等单糖的注射剂中重要的有关物质。本文就5-羟甲基糠醛的来源、影响其产生的因素、检测方法及限度等进行了阐述。并提请申请人注意在制剂工艺筛选过程、以及质量研究过程中注意控制该杂质。 关键词：5-羟甲基糠醛检查方法限度 一、概述 5-羟甲基糠醛（5-Hydroxymethyl furfural，简称5-HMF）是葡萄糖等单糖化合物在高温或弱酸等条件下脱水产生的一个醛类化合物，该化合物稳定性不好，容易分解成乙酰丙酸和甲酸，或发生聚合反应。一方面，5-HMF对人体横纹肌和内脏有损害，另一方面，葡萄糖注射液在高温情况下颜色容易变黄，虽然5-HMF本身无色，但由于5-HMF可发生聚合而由聚合物导致变色，且葡萄糖注射液颜色的深浅与5-HMF产生的量成正比，因此5-HMF的量可指代产品中葡萄糖的分解程度。由于5-HMF的毒性及对产品质量情况的指示作用，在含葡萄糖或其它单糖的制剂中应作为一个重要的有关物质加以控制。 影响5-HMF产生量的因素有溶液的pH值、灭菌的温度及灭菌的时间等。葡萄糖在碱性溶液中极不稳定，易脱水分解，而在酸性溶液中相对稳定，其中以pH3.0时分解最少，中国药典规定葡萄糖注射液的pH值应在3.2～5.5。葡萄糖注射液在高温加热灭菌时易产生 5-HMF，其量的增加与灭菌温度、时间成正比，在工艺筛选过程中选择考察指标时，需注意纳入5-HMF检查项。另外在贮藏过程中，5-HMF也会增加，所以应尽量缩短葡萄糖注射液的贮藏时间。此外，有文献报道，不同方法制备的注射用水配制的葡萄糖注射液经灭菌处理后，5-HMF的量有显著性差异，四级截留法制备的注射用水较重蒸馏法、蒸馏法制备的注射用水更好。另据文献报道，亚硫酸盐在溶液中能与葡萄糖生成葡萄糖羟基亚硫酸，使葡萄糖分解成5-HMF的反应延迟。 二、检查方法 5-羟甲基糠醛的检查方法通常有以下几种：控制溶液的颜色、紫外法、双波长法、杂质对照法等。 由于葡萄糖注射液颜色的深浅与5-HMF产生的量成正比，可通过控制溶液的颜色来控制5-HMF的量，但由于5-HMF并非葡萄糖注射液变色的唯一因素，该法专属性和准确性较差。 5-HMF的最大吸收波长为284nm，该处干扰较少，UV法常可以作为5-HMF检查的首选方法。如中国药典2000、BP2000、USP27和日本药局方中纳入的葡萄糖注射液，均采用UV法控制5-羟甲基糠醛含量。如果制剂中的主药或辅料在284nm有明显的吸收，会干扰5-HMF 的检查，可采用HPLC法代替。 双波长法是通过试验找到与干扰组分在284nm波长处吸收度相同的等吸收波长，测定样品在这两个波长处吸收度的差值，以消除制剂中其它组分的干扰。如甲硝唑葡萄糖注射液，因甲硝唑在320nm 有最大吸收，在284nm、355nm 为等吸收波长,5%葡萄糖溶液在此两波长附近均无吸收，5-HMF在355nm 无吸收。因此,有生产单位选择284nm为测定波长,355nm 为参比波长,以两波长的吸收度差值(ΔA = A284 - A355) 为定量信息测定5-HMF的含量。需要注意的是，等吸收波长的准确性直接影响测定结果，因此需要进行完备的方法学验证，一般建议采用多个浓度进行试验。 采用HPLC－杂质对照法检查5-HMF，具有较强的专属性，一般采用的色谱条件为：ODS 柱，甲醇-水作流动相，也可加入适量的酸调节pH值，在284nm波长下进行限度检查。在研究过程中应注意进行方法学考察，确定5-HMF的色谱峰不受其它峰的干扰。

文献检索 5-羟甲基糠醛的测定

一、中文摘要、关键词(斜体字体部分有错) 5-羟甲基糠醛（HMF）的检测 摘要 本文建立了通过测定HMF的含量来监测热处理对乳制品质量影响的方法。考察了电泳缓冲液的总类、电泳缓冲液pH 值、添加剂浓度和分离电压等因素的影响。最终选定的分离条件为：pH 6.85，30 mmol/L 的磷酸电泳缓冲液以及80 mmol/L 的SDS添加剂，15 KV 工作电压，使用内径75 μm，总长58.5 cm，有效长度50 cm，的未涂层石英毛细管,检测波长214 nm （检测三聚氰胺）和280 nm（检测HMF）。在上述条件下，三聚氰胺和HMF能被有效地分离，HMF 的最低检出限为0.067 μg/mL；其峰面积的相对标准偏差：日内1.69%~3.53%，日间 4.23%~5.42%；并进一步将该方法用于奶制品的检测，平均回收率为80% 左右。本方法高效、简便、节能、经济环保，有望应用于对食品安全检测产生借鉴和启发作用。 关键词：5-羟甲基糠醛（HMF）；三聚氰胺；未涂层石英毛细管

二、英文摘要、关键词 Detection of 5 –HMF Abstract In this paper, a method has been developed for the determination of the influence to dairy products’ quality in heat treatment by the determination of HMF. The effects of several factors such as the concentration and pH of the running buffer solution, the concentration of the additive and the separation voltage were investigated. The optimum condition was as follows: phosphate running buffer solution which had pH value 6.85, 30 mmol/L and 80 mmol/L additive of SDS, 15 KV working voltage, a uncoated qu artz capillary with diameter, 75μm, overall length, 58.5 cm, effective length, 50 cm, the detection wavelength 214 nm (the determination of HMF) and 280 nm(the determination of melamine). In the above conditions, melamine and HMF could be effectively separated, the minimum value of LOD of HMF was 0.067 μg/mL; the repeatabilities of peak area were: 1.69%~3.53% interday, 4.23%~5.42% intraday; and the method was further applied in the determination of the dairy products, the average recovery was around 80%. This method is simple and effective, the energy conservation, economical and environmental protection, could be used for food safety testing produce reference and inspiration effect. Key words：5-hydroxymethyl-2-furaldehyde(HMF); melamine; uncoated quartz capillary

蜂蜜中5-羟甲基糠醛方法文件

5-羟甲基糠醛 【应用领域】 适用于蜂蜜中羟甲基糠醛（HMF）的快速定量检测 【技术指标】 测定范围：0.0mg/kg~150mg/kg 检测下限：5.0mg/kg 示值误差：10% 检测波长：540nm 检测通道：消解管通道 【试剂组成】 【试剂贮存、有效期及注意事项】 试剂有腐蚀性或毒性，检测人员在使用检测试剂时，须佩戴防护眼镜和手套，若试剂接触到眼睛、皮肤等部位，请立即用大量清水冲洗。 试剂常温避光条件下，保质期为12个月，请在有效期内使用。 【样品提取】 称取5.0g经混匀的样品，置于红盖提取瓶中，加入20.0ml的蒸馏水，摇匀（如蜂蜜结晶可40℃水浴加热溶解），加入0.5ml前处理试剂（一），摇匀，再加入0.5ml前处理试剂（二）。摇匀，将全部溶液，通过滤纸、漏斗过滤到另一个红盖提取瓶/烧杯中，为待检液。 【样品检测】 空白校正： 移取5ml待检液到10ml消解管中，加1ml羟甲基糠醛A检测试剂，拧紧盖子剧烈摇匀，静止5分钟，擦净消解管壁，放入消解管检测通道中，进行空白校正。（有超声波，检测前超声1秒除气泡，精度会更高。） 样品测定： 向上述的消解管中，再加0.2ml(200μl)羟甲基糠醛B试剂，拧紧盖子剧烈摇匀，静止5分钟，擦净消解管壁，放入消解管检测通道中，进行检测。（有超声波，检测前超声1秒除气泡，精度会更高。） 【结果判断】 若溶液显色为微红，红色越深，表示羟甲基糠醛越高。 参照GB/T18796-2005；GH/T18796-2012两份标准，蜂蜜中5羟甲基糠醛应≤40mg/kg。

1.蜂蜜中5-羟甲基糠醛试剂配方 一、试剂配制 二、试剂配制方法 三、【试剂组成】（50次）