流式细胞仪补偿设置20030420

流式细胞仪补偿设置

众所周知通过荧光将488nm 或其他波长的光转变为另一波长的光并由计算机统计处理变为可读数据

激发波长发射波长

FITC 488nm 525nm

PE 488nm 575nm

PE-TR 488nm 615nm

PE-Cy5.5 488nm 667nm

PE-Cy7 488nm 767nm

Cytomation,Moflo

机型上使用

现在商业提供的荧光直标抗体上所结合的FITC??·￠é?1aμ?1a?×·?2?ò2ê?·??è?¨?éò?í???3???è?????ó?1aì?2a?÷μ?D?o???±?ì?2a?÷D?o?μ?°ù·?±è?????ú?á?ú????ì?2a?÷?D??è￥?ù?Yμ?±?ì?2a?÷μ?D?o?3?ò?°ù·?±èoóμ?êy?μ

其他荧光的补偿调节原理也同上图ＰＥ

调节的补偿有ＰＥ－％ＦＩＴＣＰＥ－Ｃｙ５－％ＰＥ

ＰＥ－％　ＰＥ－Ｃｙ５六组补偿

由于在进行补偿之前的信号都已经过放大电路处理

同时又因为补偿电路在放大电路的后面

原荧光探测器的信号与漏进其他探测器的信号

漏进其他探测器的信号-原荧光探测器的信号x N%=0

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Dè??ó?ò?é?μ÷?ú213￥μ??ù±??-àí2￠?áo?ì??¨μ?±ê±?à′êμ??PE双色分析

A通过调节电压在

进行调补偿时

阴性对照在此处的作用是调节各荧光探测器合适的放大倍数荧光阴性对照实际为没有特异性的由于化学键

这些蛋白会与标本中的细胞结合当荧光特异性抗体与标本结合时非特异信号

所以我们只认为大于阴性对照的信号才是由特异结合而引起的信号并将其归入统计范围

　ＦＩＴＣ

上图为未调补偿的双参数直方图没有荧光干扰因为检测管中只

含有PE标记的IgG阴性对照但实际情况并不如此这个信号就是由于FITC荧光漏入PE探测器中而引起的

绝对不可变动

通过调节补偿参数可通过FastCompD??óμ??é??PE的信号降低只能通过数字直接调节补偿百分比如下图

打个比方ＰＥ的荧光信号设为零

FITC信号假设为1000在补偿调节1号位时通过计算得出PE信号此时1号位的补偿不足

此时PE信号为补偿仍显不足ＰＥ信号为补偿调节良好ＰＥ信号为

此时补偿调节过头补偿调节不足或过头都会造成不准确的结果

当将FITC漏入PE的信号恰好全部减除时此时的补偿便时正确的

对于FITC阳性细胞由上图可知即通过A管调节电压确定阴性范围在检测FITC标记管中只有这样才能有本底参照将PE 的信号降至与本底一至而不会过多或过少地调节补偿

如检测C管可将PE漏入FITC中荧光去除

在流式细胞上

补偿便调节完毕

必须做荧之间的补偿先准备各种标记的荧光阴性对照

逐管加入各种荧光标记的特异性抗体与其他荧光的对照

在日常工作中或CD3/CD4/CD8多色抗体来调节荧光补偿

在人外周血中Ｂ当加入CD3PE-Cy5/CD4FITC/CD8PE三色荧光抗体时

CD3-/CD4-/CD8-细胞群

如NK细胞

CD3+/CD4+/CD8-细胞群

如杀伤型T细胞

由上可知这就满足了调节补偿的基本要求又已知PE-Cy5对于PE和FITC的干扰很小ＣＤ８ＰＥ荧光的干扰

在许多实验中此时最终观察的单参数结果而非双参数在这种情况下调节补偿的方法又略有不同只要清楚地理解补偿的形成及调节原理详细的方法见有关章节涉及设门的实验方案