west-blotting 超详细步骤
Western印迹法
这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。Western使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。
仪器：高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、—20℃低温冰箱、垂直板电泳转移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。
试剂：单去污剂裂解液、0.01mol/L PBS (pH7.3)、10％分离胶、4％浓缩校、G250考马斯亮蓝溶液、0.15mol/L NaCl 溶液、2X（5X）SDS上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、10X丽春红染液、封闭液、TBST、TBS、洗脱抗体缓冲液、显影液、定影液、抗体、化学发光试剂。
杂品与耗材：各种规格的吸头、离心管和加样器；各种规格的烧杯、量筒和平皿等玻璃器材；硝酸纤维素膜，乳胶手套，保鲜膜，搪瓷盘（>20×20cm），X-光片夹，X-光片，玻棒长短各一根，计时器，吸水纸，
试剂配制：
（一）母液
1.0mol/L Tris·HCl
Tris (MW121.14) 30.29g
蒸馏水200ml
溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
PH HCl
7.4 约17ml
7.5 约16m
7.6 约15ml
8.0约10ml
1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF
PMSF 0.174g
异丙醇100ml
溶解后，分装于1.5ml离心管中，－20℃保存。
0.2mol/L NaH2PO4
NaH2PO4（MW119.98）12g
蒸馏水至500ml
溶解后，高压灭菌，室温保存。
0.2mol/LNa2HPO4
Na2HPO4·12H2O（MW 358.14）71.6g
蒸馏水至1000ml
溶解后，高压灭菌，室温保存。
10％SDS
SDS 10g
蒸馏水至100ml
50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
10％过硫酸胺（AP）
过硫酸胺0.1g
超纯水 1.0ml
溶解后，4℃保存，保存时间为1周。
1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8）
Tris (MW121.14) 45.43g
超纯水200ml
溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
0.5mol/L Tris·HCl（pH6.8）
Tris (MW121.14) 15.14g
超纯水200ml
溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
40％Acr/Bic（37.5：1）
丙稀酰胺（Acr）37.5g
甲叉双丙稀酰胺（Bic）1g
超纯水至100ml
37℃下溶解后，4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。
20％Tween20
Tween20 20ml
蒸馏水至100ml
混匀后4℃保存。
（二）使用液
单去污剂裂解液（50mmol/L Tris·HCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1％TritonX－100，100μg/ml PMSF）：
1mol/L Tris·HCl（pH8.0） 2.5ml
NaCl 0.438g
TritonX－100 0.5ml
蒸馏水至50ml
混匀后，4℃保存。使用时，加入PMSF至终浓度为100μg/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50μl）。
0.01mol/L PBS（ pH 7.2-7.4）
0.2 mol/L NaH2PO4 19ml
0.2 mol/L Na2HPO4 81ml
NaCl 17g
蒸馏水至2000ml
G250考马斯亮蓝溶液（测蛋白含量专用）
考马斯亮蓝G250：100mg
95％乙醇：50ml
磷酸：100ml
蒸馏水至1000ml
配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存。
0.15 mol/L NaCl
NaCl（MW58.44）0.877g
蒸馏水至100 ml
高温灭菌后，室温保存。
100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）
BSA 0.1g
0.15 mol/L NaCl 1ml
溶解后，－20℃保存。制作蛋白标准曲线时，用0.15 mol/L NaCl进行100倍稀释成1mg/ml，－20℃保存。
10％分离胶和4％浓缩校
10％分离胶（两块胶，10ml）4％浓缩胶（两块胶，5ml）超纯水 4.85ml 3.16ml
40％Acr/Bic（37.5：1） 2.5ml 0.5ml
1.5 mol/L Tris·HCl（pH8.8）
2.5ml －
0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8）－ 1.26ml
10％SDS 100 μl 50 μl
10%AP（过硫酸胺）50 μl 25 μl
TEMED 5 μl 5 μl
加TEMED后，立即混匀即可灌胶。
还原型5XSDS上样缓冲液（0.25mol/L Tris·HCl pH6.8，0.5mol/L二硫叔糖醇，10％SDS，0.5％溴酚蓝，50％甘油）
0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8） 2.5ml
二硫叔糖醇（DTT，MW154.5）0.39g
SDS 0.5g
溴酚蓝0.025
甘油 2.5ml
混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存。
电泳液缓冲液（25mmol/L Tris，0.25mol/L甘氨酸，0.1％SDS）
Tris（MW121.14） 3.03g
甘氨酸（MW75.07）18.77g
SDS 1g
蒸馏水至1000ml
溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次。
转移缓冲液（48mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，0.037％SDS，20％甲醇）
甘氨酸（MW75.07） 2.9g
Tris（MW121.14） 5.8g
SDS 0.37g
甲醇200ml
蒸馏水至1000ml
溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次。
10X丽春红染液
丽春红S 2g
三氯乙酸30g
磺基水杨酸30g
蒸馏水至100ml
使用时将其稀释10倍。
TBS缓冲液（100mmol/ L Tris·HCl pH7.5,150mmol/L NaCl）
1 mol/ LTris·HCl（pH7.5）10ml
NaCl 8.8g
蒸馏水至1000ml
TBST缓冲液（含0.05％Tween20的TBS缓冲液）
20％Tween20 1.65ml
TBS 700ml
混匀后即可使用，最好现用现配。
1*TBST 1L
Tris base 2.422g (MW121.4)
Nacl 8.775g
Tween20 0.5ml
封闭液（含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液）
脱脂奶粉（国产，安怡牌）5g
TBST 100ml
溶解后4℃保存。使用时，恢复室温，用量以盖过膜面即可，一次性使用。
洗脱抗体缓冲液（100mmol/L 2-Mercaptoethanol，2％SDS，62.5m mol/L Tris·HCl pH6.8）
14.4 mol/L 2- Mercaptoethanol(β-巯基乙醇) 700 l（通风厨里加）
SDS 2g
0.5mol/L Tris·HCl（pH6.8）12.5ml
超纯水至100ml
配制时，在通风厨内进行。4℃保存。可重复使用1次。
显影液（5X）
自来水（加热至50℃）375ml （以下药品加到温水中）
米吐尔 1.55g
亚硫酸钠（无水）22.5g
碳酸钠（无水）33.75g
溴化钾20.95g
补水至500ml
配制时，上述药品应逐一加入，待一种试剂溶解后，再加入后一种试剂。4℃保存。使用时用自来水稀释至1倍。
定影液
自来水（50～60℃）700ml （以下药品按顺序加入前者溶解后再加后者）硫代硫酸钠240g
亚硫酸钠（无水）15g
冰乙酸12.6ml
硼酸7.5g
钾明矾15g（水温冷至30℃以下时再加入）
加水定容至1000ml，室温保存
抗体
用TBST稀释至一定浓度使用，每张膜需0.5ml
化学发光试剂
购自北京中山公司，为Santa Cruz产品，分A和B两种试剂。
操作步骤：
（一）蛋白样品制备
（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：
1、倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一
会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
2、每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1min洗涤
细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS
弃净后把培养瓶置于冰上。
3、按1ml裂解液加10 μl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结
晶时才可与裂解液混合。）
4、每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解
培养瓶要经常来回摇动。
5、裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将
细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）
6、于4℃下12000rpm离心5min。（提前开离心机预冷）
7、将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于－20℃保存。
（2）组织中总蛋白的提取：
1、将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪
碎。
2、加400 μl单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰
上。
3、几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。
4、裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下
12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。
（3）加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：
由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液
中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取：
1、将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min。
2、弃上清，加入4ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上
清后用PBS重复洗涤一次。
3、用枪洗干上清后，加100 μl裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中
要经常弹一弹以使细胞充分裂解。
4、将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm离心5min，取上清分装
于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。
（二）蛋白含量的测定
（1）制作标准曲线
1、从－20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。
2、取18个1.5ml离心管，3个一组，分别标记为0μg，2.5μg，5.0μg ，10.0μg ，
20.0μg ，40.0μg。
4、混匀后，室温放置2min。在生物分光光度计（Bio－Photometer，Eppentoff）
上比色分析。
5、
（2）检测样品蛋白含量
1、取足量的1.5ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1ml。室温放置
30min后即可用于测蛋白。
2、取一管考马斯亮蓝加0.15mol/L NaCl溶液100 μl，混匀放置2分钟可做为空白
样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。
3、弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5ml），再用无菌水洗一次。
4、取一管考马斯亮蓝加95 μl 0.15mol/L NaCl NaCl溶液和5μl待测蛋白样品，混
匀后静置2min，倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。
注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2次，无菌水洗一次。可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。测得的结果是5 μl样
品含的蛋白量。
（三）SDS－PAGE电泳
（1）清洗玻璃板：
一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
（2）灌胶与上样
1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要
使两玻璃对齐，以免漏胶。）
2、按前面方法配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，
可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面
快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才
不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）
3、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固
就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
4、按前面方法配4％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空
间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以
免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收
缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经
常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻
轻将其拔出。
5、用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板
面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向
外。）
6、测完蛋白含量后，计算含50μg蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样
品至0.5ml离心管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。（上样总
体积一般不超过15μl，加样孔的最大限度可加20μl样品。）上样前要将样
品于沸水中煮5min使蛋白变性。
7、加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）
用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插
至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也
可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤
3次，以免交叉污染。
（3）电泳
电泳时间一般4～5 h，电压为40V较好，也可用60V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。
（四）转膜
（1）转一张膜需准备6张7.0～8.3cm的滤纸和1张7.3～8.6cm的硝酸纤维素膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的硝酸纤维素膜
置于水上浸2 h才可使用。（用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，
要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。
若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水。
（2）在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。
（3）将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）在垫子上垫
三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去
其中的气泡。
（4）要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。
撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，玻板很易裂。）
除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。
小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。
将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖3
张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作
在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会
发生短路。（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。）（5）将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用60V转移2 h或40V转移
3 h。
（6）转完后将膜用1×丽春红染液染5min（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。将膜晾干备用。
（五）免疫反应
（1）将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。
（2）将一抗用TBST稀释至适当浓度（在1.5ml离心管中）；撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到
保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗
体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡；室温下孵育1～2h后，用TBST在室
温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。
（3）同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min，进行化学发光
反应。
（六）化学发光，显影，定影
（1）将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触；1min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-
光片夹中。
（2）在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X－光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）；打开X-光片夹，把X－
光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号
的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min，也可选择不同时间多次压片，
以达最佳效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中
显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为1～2min（20～25℃），
温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X-光片浸
入定影液中，定影时间一般为5～10min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留
的定影液后，室温下晾干。
应注意的是：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。
（七）凝胶图象分析
将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。
Western blot analysis-1 Cells were cultured in 199 medium with 10% fetal bovine serum. After digestion with 0.25%trypsin and 0.2%EDTA, the cells were collected and were washed three times with ice-cold PBS, then were lysed in buffer(50mM Tris-HCl, pH8.0,150mM NaCl, 100μg/ml PMSF, 1%TritonX-100) for 30 min at ice. After removal of cell debris by centrifugation(12,000g,5 min), the protein concentration of lysates was meatured by Bradford method. 50μg proteins of different groups boiled for 5 min in sample buffer and were separated in 10% SDS-PAGE and transferred onto nitrocellulose membrane (Bio-Rad). Nonspecific reactivity was blocked by incubation overnight at 4℃in buffer(10mM Tris-HCl, pH7.5,150mM NaCl, 2%Tween-20, 4% bovine sreum albumin).The membrane was then incubated with primary antibody. The secondary antibody was used to detected bound primary antibody. Reactive protein was detected by ECL chemiluminescence system (Amersham pharmacia biotech).
Western blot analysis-2 The protein expression ezrin was detected by Western blot method. Confluent 150 cm2flasks of cells were washed three times with ice-cold PBS, then lysed in buffer(50mM Tris-HCl, pH8.0,150mM NaCl, 100μg/ml PMSF, 1%TritonX-100) for 30 min at ice. After removal of cell debris by centrifugation(12,000g,5 min), 50μg of each lysate sample was boiled for 5 min in sample buffer and were separated by 10% SDS-PAGE and transferred onto nitrocellulose membrane (Pall Corporation). Nonspecific reactivity was blocked in 5% nonfat dry milk in TBST(10mM Tris-HCl, pH7.5,150mM NaCl, 0.05%Tween-20) for 1h at room temperature. The membrane was then incubated with monoclonal antibody of mouse anti human ezrin p81(Maixin-Bio) followed by reaction with anti-mouse IgG-HRP antibody. Reactive protein was detected by ECL chemiluminescence system (Santa Cruz).
ezrin蛋白表达通过Western blot进行检测。已达融合生长的单层细胞用冷PBS洗三次后，加入裂解液(50mM Tris-HCl, pH8.0,150mM NaCl, 100μg/ml PMSF, 1%TritonX-100)冰上裂解30min，12,000g,5 min离心去除细胞碎片后，取50μg样品与上样缓冲液混合，煮沸5min，进行10% SDS-PAGE电泳，转硝酸纤维素膜(Pall Corporation)。将膜在含5%脱脂奶粉的TBST(10mM Tris-HCl, pH7.5,150mM NaCl, 0.05%Tween-20)中室温下封闭1h，随后加入鼠抗人ezrin一抗(Maixin-Bio)，抗鼠IgG-HRP二抗，ECL化学发光试剂检测(Santa Cruz)。
免疫组化操作步骤
免疫组化操作步骤集团标准化工作小组 #Q8QGGQT-GX8G08Q8-GNQGJ8-MHHGN#
免疫组化操作流程 试剂准备 1. PBS缓冲液（～）： NaCl 137mmol/L，KCl L，Na2HPO4 L， KH2PO4 L。 2. L柠檬酸盐缓冲液（CB，，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸。即抗原修复液 : PBS+吐温-20（1000:1）洗液可全部运用PBST 4. 3% 甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。 5. 封片剂：中性树脂+二甲苯。 操作流程 免疫组织化学染色 SP法： 1. 脱蜡、水化： 脱蜡前，应将切片在60℃恒温箱中烘烤60~120分钟，观察石蜡应溶解。 从烤箱拿出切片后尽快置于二甲苯中浸泡30分钟，更换二甲苯后再浸泡30分钟； 无水乙醇中浸泡3分钟； 95%乙醇中浸泡3分钟； 70%乙醇中浸泡3分钟（我用80%）； 50%乙醇中浸泡3分钟； 自来水中浸泡3分钟；
梯度脱蜡 2. 抗原修复：（用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片） 高压热修复高压锅里放少许水，用一量杯或容器（大小能容纳玻片架为宜）装抗原修复液放入高压锅里一起煮沸，再放入玻片架，盖上不锈钢高压锅的盖子，将排气阀门套上，待听到阀门冒气时，即可倒计时2min，之后将玻片杯一起放入凉水中，静置15min，平衡至室温。电磁炉1000W 2min。 3.丢弃抗原修复液，将玻片浸泡在去离子水中（时间不限）可省略 4.用组织笔沿组织边缘画线（可与组织边缘留适当间隙），画完立即放入PBST溶液中浸泡3遍X3min（三个容器，每个容器3min，时间不限制）。 5. 3%H2O2滴加在切片上，室温静置15分钟(3%的H2O2用30%的 H2O2加双蒸水稀释10倍，现配现用。目的为阻断内源性过氧化物酶)； 6. PBST洗3次各3分钟(过三缸) 7. 滴加正常山羊血清封闭液,室温30分钟。用与一抗不同源的血清即可，本人用Western-blotting的含胎牛血清封闭液。 8. 甩去封闭液（注：不要冲洗），滴加一抗50ul（至少50ul否则易干片），4℃孵育过夜。4℃过夜后需在37℃复温45分钟（未验证：室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。）。 9. PBST洗3次各3分钟；
超净工作台确认方案
*********药业有限公司 确认方案 超净工作台 版本颁布日期版本描述002015-9-28原始版本
确认小组主要成员及职责 根据***规定，组织成立超净工作台再确认小组，小组成员及相应分工如下表：
方案会签及审批
目录 一、概述 5 二、验证目的 (5) 三、参考文献 (5) 四、风险分析 (5) 五、验证范围 (6) 本次验证包含超净工作台的运行确认、性能确认。运行确认是在设备运行状态下，检查控制开关、显示、运行的情况、照度、风速、过滤器检漏；性能确认主要对设备净化效果的确认。 (6) 六、培训 (6) 七、验证内容 (7) 八、漏项与偏差处理 (12) 九、再确认计划 (13) 十、确立文件 (13) 十一、附件13 附件1： (14) 培训记录 (14) 附件2： (17) 验证记录 (17)
一、概述 1.超净工作台介绍 超净工作台是造就局部高洁净空气环境的设备，为单人单面、垂直层流式净化效率为100级、由高效过滤器部分、照明部分、紫外消毒部分构成的可移动式框架净化区域。目前公司总共有四台超净工作台，其中生测室两台超净工作台、样品取样间一台于2012年12月购进，实验动物房超净工作台于2009年购进，现按**执行确认程序，完成OQ（运行确认）、PQ（性能确认）再确认项目。 2. 验证条件 本次验证所涉及到的主要检验仪器的校验工作均已完成，操作人员均已经过培训。 二、验证目的 通过验证保证生测室两台、取样间一台、实验动物房一台超净工作台的运行、性能可以满足净化级别及实验要求。 三、参考文献 为了编写本方案，参考了以下法规、指南和公司文件： 四、风险分析 1. 风险评估标准
超级说服力考试试题答案
学习课程：超级说服力 单选题 1.改变业务员因没有经过训练的用错误的方法得罪顾客，损失顾客的局面，就要回答：错误 1. A 纠正业务员的工作方法 2. B 端正业务员的工作态度 3. C 让业务员的说服有针对性 4. D 辞退素质不高的业务员 2.做好决策的最后一个步骤是回答：错误 1. A 现在有什么选择 2. B 什么比较重要 3. C 什么时候开始行动 4. D 还有没有其它选择 3.在与顾客沟通的过程中，要问其需求，是因为回答：正确 1. A 需求即是顾客对产品简单的看法，是赢得客户需要了解的最基础的层面 2. B 需求即是顾客对产品最直观的看法，是赢得客户需要了解的最高级的层面 3. C 需求即是顾客对产品最直观的看法，是赢得客户需要了解的最基础的层面 4. D 需求即是顾客对价格最直观的看法，是赢得客户需要了解的最基础的层面 4.能不能在顾客面前批评你的竞争对手的产品回答：正确 1. A 能 2. B 不能 3. C 无所谓 4. D 尽量不做 5.说服过程中，要“问决策者”的原因是回答：正确
1. A 把时间用在一个非决策者身上，是一种风险 2. B 非决策者永远不能解决你的问题 3. C 只有决策者才能够接受你的说服，当场解决你的问题 4. D 把时间用在一个决策者身上，是一种投资 6.顾客购买产品时，不会考虑的是回答：正确 1. A 价格 2. B 效果 3. C 服务 4. D 以上答案都不对 7.不停地讲解自己的产品有多好的负面影响不包括回答：正确 1. A 如果讲的东西不是顾客想要的，顾客根本就听不进去 2. B 销售人员沟通很久很辛苦，却没有任何结果 3. C 说得太多，没有针对顾客需求就是废话 4. D 是急于推销，降低产品层次的表现 8.下面属于说服模式的是回答：正确 1. A 完善型 2. B 配合型 3. C 分散型 4. D 集散型 9.说服拆散型的顾客时，正确的做法是回答：正确 1. A 用同中求异的方式 2. B 用顺从的方式
免疫组化基本步骤
细胞免疫组化染色步骤 1．细胞爬片，取出后，PBS洗三遍，每次3分钟。4℃冷丙酮固定10分钟，（或用4%多聚甲醛固定30分钟），干燥30分钟。 2. 用PBS洗三次，每次5分钟，加3%过氧化氢30μl，室温孵育10分钟，（以消除内源性过氧化物酶的活性）蒸馏水冲洗，PBS洗三次，每次5分钟。 3．加1%的Triton X-100 30μl，室温孵育10分钟，增加细胞膜的通透性。蒸馏水冲洗，PBS洗三次，每次5分钟。 4．滴加正常山羊血清30μl，封闭非特异性结合位点，以消除非特异性染色，室温孵育30分钟，倾去勿洗。 5．滴加适当稀释度的一抗，空白对照组以PBS代替一抗，4℃湿盒孵育过夜。PBS洗三次，每次5分钟。 6．滴加生物素标记的二抗工作液30μl，室温孵育30分钟。PBS洗三次，每次5分钟。 7．滴加辣根酶标记链酶卵白素30μl，室温孵育30分钟。PBS洗三次，每次5分钟。 8．滴加DAB显色剂30μl，显微镜下观察显色，自来水冲洗。 9. 将处理好的玻片细胞核衬染：浸入苏木精染液染色2min，自来水洗，迅速过盐酸酒精溶液，自来水洗，过氨水溶液，自来水洗。 10.梯度酒精脱水，过70%酒精1次，95%酒精2次，无水乙醇3次，每次1min 11.二甲苯透明，过二甲苯溶液3次，每次１min。 12.中性树胶封片将有细胞的一面向下，用中性树脂封片。 稀盐酸酒精溶液：用75%酒精配制1%盐酸。 淡氨水溶液：在400ml自来水中滴2滴浓氨水(使细胞核蓝化) 另外：需1%TritonX-100增加细胞膜通透性。苏木素复染时间和盐酸酒精脱色时间需自己摸索，我是染5-6秒脱色1-2秒。盐酸酒精还可用70%乙醇配制1%盐酸。我没用淡氨水溶液。若为悬浮细胞则需涂片，20μl即可。
免疫组化步骤
免疫组化实验步骤 细胞和组织的固定 （一）固定 为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构，防止组织自溶，有必要对细胞和组织进行固定。固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源性和内源性酶活性，更重要的是最大限度的保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。不同抗原，其稳定性也不相同，因而对固定剂的耐受性差异较大 （二）固定剂 用于免疫组织化学的固定剂种类较多，性能各异，在固定半稳定性抗原时，尤其重视固定剂的选择，介绍如下。 1．醛类固定剂双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联，保存抗原于原位，其特点是对组织穿透性强，收缩性小。有人认为它对IgM、IgA、J链、K 链和λ链的标记效果良好，背景清晰，是常用的固定剂。 1）4%多聚甲醛为我们常用固定剂 2）Bouin’s液 该固定液为组织学、病理学常用固定剂之一，对组织穿透力较强而收缩性较小，比单独醛类固定更适合免疫组化染色。Kayhko认为用于标记B细胞的J链较好，但Bullock则认为它可导致Igg γ重链变性，故必需加大第一抗体的浓度。 2．丙酮及醇类固定剂 系最初免疫细胞化学染色的固定剂，其作用是沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强，保存抗原的免疫活性较好。但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，解决的办法是和其它试剂混合使用，如加冰醋酸、乙醚、氯仿、甲醛等。 丙酮的组织穿透性和脱水性更强，常用于冰冻切片及细胞涂片的后固定，保存抗原性较好，平时4。C低温保存备用，临用时，只需将涂片或冰冻切片插入冷丙酮内5-10min，取出后自然干燥，贮存于低温冰箱备用。 以上介绍了免疫组织化学中常用的固定液，用于免疫组化的固定剂种类很多，不同的抗原和标本需经过反复试验，选用最佳固定液，迄今尚无一种标准固定液可以用于各种不同的抗原固定。而且同一固定液固定的组织，免疫组化染色标记
超级说服力十大步骤
超级说服力十大步骤DellAS-PE2950MLK 1、第一步骤：充分足够的准备 充分的准备包括四个方面的准备，首先是体力的准备。要想让自己体力好，就必须做一些体力上的训练。以我十几年来研究成功学的经验，总结出了一些行之有效的方法（见《自己就是一座宝藏》），现在介绍几个给大家。 一个是每天做一四二深呼吸，早、中、晚各10次，共30次；二是永远只吃七、八分饱；三是吃水果在饭前吃，不要在饭后吃；四是做运动要做有氧运动，比如散步、游泳、慢跑、骑自行车等。 第二是专业知识的准备。你必须对你的产品有非常足够的了解。第三是对顾客了解的准备。你必须非常了解你的顾客，了解他的兴趣、爱好，这样便于沟通，便于投其所好。第四是精神上的准备。在处理重要的事情之前，先静坐5分钟。 2、第二步骤：使自己的情绪达到巅峰状态（自我确认） 要想使自己达到巅峰状态，必须先让自己的肢体达到巅峰状态，因为动作创造情绪。同时对自己反复地做自我确认：我是最棒的！我是最优秀的！我是最好的！我喜欢我自己！我一定能成功！ 3、第三步骤：建立顾客信赖感 建立顾客的信赖感，首先是透过自己的形象！也就是——为成功而穿着！为什么这么说呢？因为一个人的第一印象非常非常地重要！一旦他第一
印象建立好了，那就成功了一半了。而第一印象就是通过你的形象表现的，所以一定一定要注重自己的穿着、举止、气质。 第二要学会倾听。永远站着或坐在顾客的左边，保持适度的距离，保持适度的目光接触，倾听不要打岔，不要发出声音，同时微笑点头即可。还要做好记录。顾客讲完后，要重复一次做确认。不要想即将说的话，要听出他真正的意思，用关心的角度跟他沟通 。 第三要模仿对方的谈话。模仿对方的文字、声音和肢体语言，与对方相似，引起共鸣。在模仿肢体语言的时候，要模仿对方的表情和语气，注意千万不要同步模仿。 第四是要使用顾客见证。顾客说一句话顶你一万句，每个推销员至少带5个顾客见证。 4、第四步骤：了解顾客的问题、需求和渴望 了解顾客先从聊天开始，聊天就是做生意。首先前20分钟要聊FORM，F代表家庭；O代表事业；R代表休闲；M代表财务。其次聊购买的价值观。所有的销售都是价值观的销售，彻底了解顾客的价值观。第三就是问问题。问NEADS，N代表现在；E代表满足；A代表更改；D代表决策；S代表解决方案。 5、第五步骤：提出解决方案并塑造产品的价值
免疫组化HE染色步骤
免疫组化H E染色步骤 The Standardization Office was revised on the afternoon of December 13, 2020
骨组织石蜡切片制作 步骤： 1.固定：切取骨缺损出的骨组织，用PBS冲洗，放入4%多聚甲醛缓冲 液内固定12—24h。 2.脱钙：将固定好的骨组织放入脱钙液中侵泡脱钙24h. 3.脱水：将固定好的骨组织用蒸馏水冲洗3次，再用50%的酒精冲洗2次，常规脱水，70%酒精（60min），80%酒精（40min）,95%酒精（30min）,100%酒精1（25min）,100%酒精II（25min）。 4.透明：二甲苯I(35min)，二甲苯II（35min）。 5.包埋：将透明处理后的骨组织依次侵入石蜡I1小时，石蜡II1小时。 6.切片：包埋后的组织块经修理后，用切片机切成4um的石蜡带，将组织石蜡块在50℃温水中展片，然后用干净的载玻片捞片。 7.烤片：将切好的组织片放入63℃恒温箱中烤片2小时。 免疫组化检测 步骤： 1.脱蜡：将组织切片放入62℃恒温箱中烘烤20min二甲苯1 （10min）二甲苯2（10min）。 2.水化：100%酒精1（2min）100%酒精（2min）95%酒精（2min） 80%酒精（2min）70%酒精(2min)。 冲洗3次，每次5min.。
4.抗原修复：将组织片置的柠檬酸缓冲液（）中煮沸15min,自然冷 却至室温。 冲洗3次，每次5min。 6.阻断：3%去离子水37℃孵育10min,以灭活内源性过氧化物酶活 性。 冲洗3次，每次5min。 8.滴加1抗（GFP1：100稀释,4℃过夜） 冲洗3次，每次5min。 10.滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂1，37℃孵育,20min,PBS冲洗 3次，每次5min。 11.滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂2，37℃孵育,20min,PBS冲洗 3次，每次5min。 显色5min。 13.自来水冲洗10min。 14.苏木精复染2min,盐酸酒精分化。 15.自来水冲洗10min。 16.常规脱水，透明，封片，镜检。 组织切片HE染色 步骤 1、将烘烤后的组织切片依次侵入二甲苯1，二甲苯II进行脱蜡各 10min。 2、脱蜡后的组织切片依次浸入无水乙醇I、无水乙醇II、95%酒精、80%酒精、70%酒精中各2min，PBS冲洗2次，每次5min。
V3070系列超净工作台操作指南
1目的
PURPOSE 2 参考 REFERENCE 2.1 垂直流洁净工作台用户手册 3 职责 RESPONSIBILITIES 4 程序 PROCEDURE 4.1 介绍 4.1.1 技术参数 4.1.1.1 气流工作方式：气流70%循环，30%外排。 4.1.1.2 工作区域层流风风速：0.4m/s 4.1.1.3 前窗进气风速：>0.5m/s 4.1.1.4 工作区洁净等级：美联邦209E 标准，洁净度10级 4.1.2 控制面板 4.1.2.1 控制面板示意图 4.1.2.2 控制面板说明：1—风扇开关键；2—照明灯开关键；3—紫外1 2 3 4 7 8 9 10 12 11 5 6 13
灯开关键；4—预留开关键；5
—上翻键；6—下翻键；7—风扇状态显示灯；8—照明灯状态 显示灯；9—紫外灯状态显示灯；10—预留开关状态显示灯； 11—过滤器堵塞报警；12—紫外灯报警；13—显示屏。 4.2使用 4.2.1开机 4.2.1.1用无尘毛巾蘸消毒水（不可用含氯的消毒剂）擦拭洁净工作台 工作腔。 4.2.1.2连接好电源，打开电源开关。显示屏显示“VER 01B TELSTAR”。 “VENT/FAN:000000h，U.V.：000000h”。 4.2.2紫外灯计时器设置 4.2.2.1若紫外灯是开启状态，先按 4.2.2.2U.V.ON”。 4.2.2.31min到59min可调。除 另有规定外，时间设置为30min。 4.2.2.4按 4.2.3工作 4.2.3.1按控制面板上风扇开关 风扇状态显示灯亮，显示屏显示“FAN VEL. STD” 风速减小，显示屏显示“ALARM FAN VEL 1/2” 键，风速恢复到初始标准状态，显示屏显示“FAN VEL. STD”。
免疫组化超详细步骤
免疫组化超详细步骤 Prepared on 22 November 2020
免疫组化 一实验目的：分别用KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体检测肺癌组织中KRAS、NRAS、HRAS蛋白的表达情况 二实验原理:应用基本原理——抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使的（、酶、、）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和），对其进行定位、定性及定量的研究，称为或. 三实验试剂及耗材:经病理医生确认的肺癌组织切片、KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体、DAB显色试剂盒、抗原修复液、PBS、苏木素染料、1%盐酸酒精溶液、%氨水、二甲苯、等 四实验设备：切片机、4℃冰箱、显微镜、烤片机 五主要试剂配置: 缓冲液 应用液配成1000毫升溶液 应用液BNa2HPO4·配成1000毫升溶液 配制1000毫升PBS需要14毫升应用A液，36毫升应用B液，加。 枸橼酸钠抗原修复液 应用液A枸橼酸配成1000毫升溶液 应用液B柠檬酸三钠（三水合柠檬酸三钠）配成1000毫升溶液 配制500毫升抗原修复液需要9毫升应用A液，41毫升应用B液。 苏木素染液配方：苏木素2g,无水乙醇250毫升，硫酸铝蒸馏水750毫升，碘酸钠，冰醋酸20毫升。先将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝溶于蒸馏水水中。两液溶解后将其混合，加入碘酸钠，最后加入冰醋酸。 抗体说明书建议的抗体稀释度 N-Ras1:50-1:500 H-Ras1:50-1:500 K-Ras1:20-1:200 六实验步骤： 1组织常规石蜡切片厚度3-5um，防脱片捞片后晾干，放入72℃烤箱烤片2小时。 2切片脱蜡水化程序 ⑴二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各12分钟； ⑵无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各3分钟；（洗二甲苯） ⑶95%乙醇3分钟； ⑷85%乙醇3分钟； 3自来水漂洗3分钟，洗涤一定要充分。 4组织修复采用高温高压法：压力锅中加入，抗原修复液约1000ml，切片插入塑料架上，放入压力锅，盖上锅盖（此时不扣上压力阀）1600W预热至沸腾，扣上压力阀1300W，待高压锅阀门喷气开始计时，修复时间为2分钟。 5停止加热并用流水冲洗高压锅以降温，室温冷却。 6将抗原修复后切片置自来水中，浸泡2分钟。将样本置于内源性过氧化物酶阻断剂 3%H2O2，室温放置4分钟。（需要盖盖子）自来水洗2分钟，PBS缓冲液洗涤2分钟。
潘俊贤超级说服力的十大步骤
超级说服力的十大步骤 一、准备 没有准备，就是准备失败！ 积淀，一定要将过去的成功的经验、失败的教训都总结出来！ 一）体能上的准备：说服过程是一个信心上的传递，体能上的说服的过程。 1、运动：有氧、无氧 2、饮食：淀粉和脂肪最好不要混吃，牛肉，属金，可以发大财 3、听潜意识音乐：《健康与活力》、《成功与致富》、《自信与能量》 二）精神状态上的准备 成功者在拜访客户的时候，在洗手间内调整自己的最佳巅峰状态三）专业的准备 一定要对自己的产品和技术了如指掌，对竞争对手如数家珍四）对谈话结果的准备：整个谈话结果的准备 1、我要的结果是什么？ 2、对方要的结果是什么？ 3、我的底线是什么？ 4、顾客可能有什么样的抗拒？通常顾客的反对意见不超过7个 5、我该如何解除抗拒？ 6、我该如何成交？ 五）对顾客了解的准备 案例：日本的推销之神：原一平，人长得很丑，但是一见顾客，顺口就是幽默的销售来破冰，解除顾客的抗拒。他在拜访顾客前，做足了准备，包括车、服装、饮食、习惯。 全天下没有成交不了的顾客，只是你对他了解的还不够！ 二、调整精神状态达到巅峰状态：要成功先发疯，头脑简单往前冲！ 案例：微软巴尔默领导者都是激励者！ 一）如何瞬间提升精神状态： 1、透过想象力：想象成功的画面 成功是自我催眠的过程，如果只想到消极的画面，只会失败。
2、透过你的肢体动作 安东尼·罗宾：随时随地调整自己的精神状态，肢体动作会改变精神状态。 三、建立信任感 让顾客喜欢你，相信你！销售就是建立信任感的过程： 一）倾听：成为一个善于倾听的人 让顾客讲的越多，就越了解顾客让对方暴露缺点，听到说者想说，说到听者想听！雄辩是银，倾听是金，越会听，顾客越喜欢你，让对方倍感重视！ 如何听？ 1、让对方感觉你在用心听，让对方感觉受到尊重 2、让对方感觉你太对非常诚恳 3、倾听的时候要记笔记，记笔记的三大好处 a)让对方立刻有被尊重的感觉 b)记下重点，便于沟通 c)以免有重要的信息遗漏 4、重新确认，以免误差 5、不打断，不插嘴 a)让对方感觉良好 b)让对方多说 c)让对方说完整 6、要停顿3—5秒 a)让对方继续说下去 b)可以利用这点时间来组织你的语言 c)让对方感觉你所讲的话是经过脑子思考的，比较有可信度 7、不明白的地方要追问 8、听话的时候不要组织语言 9、点头微笑：起到鼓励、肯定的作用 10、不要发出声音，尤其是怪声：嗯哼～～ 11、眼睛要注视对方：看住前额和鼻梁，偶尔看下眼睛 12、坐定位：双方所坐的位置很关键的
销售过程中的客户说服技巧
第一讲客户说服的基础（上） 销售过程中的客户说服技巧本课题以神经语言程式学为理论架构基础。神经语言程式学简称NLP，它被认为是21世纪最先进的一门心理和行为科学。现在NLP的理念已经被推广到全世界60多个国家和地区，广泛应用于企业经营管理、价值观的统和、商业谈判、销售等领域。同时，在家庭、婚姻的沟通，亲子教育，人与人之间的互动、潜能激发等各个领域，NLP也发挥着越来越大的作用。 1.人们的生活与生命质量取决于自身的沟通力和影响力 说服客户的过程，同时也是发挥人的沟通力与影响力的过程。神经语言程式学的一个观点就是，人们的生活在一般情况下，人的沟通力和影响力并非与生俱来，它与其他的知识和技能一样，需要人们通过后天的努力培养取得。 NLP有一个理念：人的生活与生命的质量取决于人的沟通力和影响力。销售的过程就是沟通和说服他人的过程。沟通和说服的过程无处不在。 沟通力、表达力影响人们生活的各方面，例如，领导要说服员工用心工作，父母要通过沟通说服、教育子女，在就业面试的交流过程中，面试官不仅仅看重面试者的经历，更看重面试者通过交流表达出的个人综合素质。 2.过程重于结果 沟通力的获得不能一蹴而就。沟通是一个互动的过程。如何达到说服客户成交的目的，源于如何安排与客户沟通的全过程。从这个意义上说，过程比结果更重要。 3.什么叫做神经语言程式学 销售的过程就是沟通和说服他人的过程。 神经语言程式学是本课题的理论基础架构。它是一门关于人的心理和行为的科学，由美国加州大学两位教授理查班德勒博士和约翰格林德博士于1971年创建。 简而言之，神经语言程式学是一门结果学。 结果由行为而来 结果由什么而来？任何结果都是由人们所采取的行为而来的。例如，业务员的良好业绩来自于他每天在销售过程中的有效行动。 思维影响行动 人的行动受自身思想和思维的影响。例如，如果业务员在思想上形成了害怕被拒绝的障碍，那么即便他学习了再多的业务销售技巧的知识，也无法彻底运用于销售的行为中。 因此，NLP强调的重点之一，就在于帮助一个人达到结果突破，而不是强调学习更多的技巧。 【自检1-1】 沟通能力是如何影响人的生活质量的？ ____________________________________________ ____________________________________________ ____________________________________________ 见参考答案1-1 4.思维的影响因素 思维模式与信念相关 人的思维模式与人内心的信念相关。例如，被他人攻击，人的内心就会产生不被尊重的感受和信念。 思维模式与价值观体系相关 人的思维模式还受到价值观的影响。例如，如果人奉行“以牙还牙，以眼还眼”的价值观，在受到他人攻击、侮辱后，就会以相同方式进行回报。
免疫组化步骤
免疫组化：链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法 1)将石蜡切片置于烤片机烘烤２－３h,{因为做石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，所以应烤片2-3h,除非组织的抗原性较稳定，则时间可长一点}后可把烤好的组织切片，放在60℃烤箱中过夜，最佳时间控制在14-18h{乳腺病理处省略此步骤}。取组织切片于切片架，用吹风机吹至产生蜡液，不可靠太近，以免使组织切片局部温度过高，破坏组织切片。 2）常规脱蜡 ({二甲苯脱蜡，在夏天，室温较高，脱蜡试剂也新鲜，则脱蜡时间不需很多，3-5分钟就已足够。如果在冬天，室温较低，脱蜡试剂也较陈旧，则脱蜡时间需要延长，10-20分钟或更长}二甲苯I 20min →二甲苯II 20min→二甲苯Ⅲ20min →无水乙醇10min（清洗二甲苯）→无水乙醇10min→95%乙醇5min→80%乙醇5min) {梯度酒精用无水酒精与蒸馏水配置} 目的：把水渗入组织切片中，给细胞创造一个水溶性环境 <以下步骤是为细胞染色做准备> 3）捞出，放入铁缸内，用凉清水冲洗3次{如果组织容易脱片，就尽量泡一下，这样脱片可以减少很多}； 4）将配好的柠檬酸盐抗原修复液（抗原修复液的量为稍高于横向放倒的切片架的高度）{EDTA配制方法：EDTA修复液使用比例：EDTA:蒸馏水=1:49,每次最好配制1000ml。EDTA修复液重复使用最好不要超过5次，并且3次之后要测PH值，测PH是否为9.0，如偏离太大则弃用。枸橼酸修复液只能用一次。修复的原因：因为常规的石蜡切片标本均用甲醛固定，结果使得抗原性物质形成醛键，羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇。另外，蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。在染色时，要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态}{用EDTA修复比柠檬酸容易脱片，但是你要用到EDTA的时候也可，因其抗原修复效果比柠檬酸盐的好，可从另外的问题上着手}灌入高压锅中，不旋紧，盖上即可，210℃烧至沸腾后，把切片架放入横向放倒，旋紧锅盖，待喷气时，开始计时2min-2min30s,如果组织不易染色，可延长修复时间，但一般不超过3min，否则容易掉片。 5）到时间后，把高压锅放入水池中用凉水冲至气体放出完，旋下锅盖，自然冷却至室温，大于30min。 6）冷却后取出切片架用凉清水冲洗3次，放入3% H2O2 罐中10min，目的：封闭过氧化物酶。【每天用前新放入10ml H2O2 】【配制方法：1000ml 3%的过氧化氢=100ml 30%过氧化氢+900ml蒸馏水，（H2O2保存需避光）】 7）捞出后用凉清水冲洗多次，应注意H2O2 有腐蚀性，最后一次用PBS（磷酸盐缓冲液），PBS
免疫组化操作步骤
免疫组化操作步骤 This manuscript was revised by the office on December 10, 2020.
免疫组化操作流程试剂准备 1. PBS缓冲液（pH7.2～7.4）： NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L。 2. 0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。即抗原修复液 3.PBST: PBS+吐温-20（1000:1）洗液可全部运用PBST 4. 3% 甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。 5. 封片剂：中性树脂+二甲苯。 操作流程 免疫组织化学染色 SP法： 1. 脱蜡、水化： 脱蜡前，应将切片在60℃恒温箱中烘烤60~120分钟，观察石蜡应溶解。 从烤箱拿出切片后尽快置于二甲苯中浸泡30分钟，更换二甲苯后再浸泡30分钟； 无水乙醇中浸泡3分钟； 95%乙醇中浸泡3分钟； 70%乙醇中浸泡3分钟（我用80%）； 50%乙醇中浸泡3分钟； 自来水中浸泡3分钟；
梯度脱蜡 2. 抗原修复：（用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片） 高压热修复高压锅里放少许水，用一量杯或容器（大小能容纳玻片架为宜）装抗原修复液放入高压锅里一起煮沸，再放入玻片架，盖上不锈钢高压锅的盖子，将排气阀门套上，待听到阀门冒气时，即可倒计时2min，之后将玻片杯一起放入凉水中，静置15min，平衡至室温。电磁炉1000W 2min。 3.丢弃抗原修复液，将玻片浸泡在去离子水中（时间不限）可省略 4.用组织笔沿组织边缘画线（可与组织边缘留适当间隙），画完立即放入PBST溶液中浸泡3遍X3min（三个容器，每个容器3min，时间不限制）。 5. 3%H2O2滴加在切片上，室温静置15分钟(3%的H2O2用30%的 H2O2加双蒸水稀释10倍，现配现用。目的为阻断内源性过氧化物酶)； 6. PBST洗3次各3分钟(过三缸) 7. 滴加正常山羊血清封闭液,室温30分钟。用与一抗不同源的血清即可，本人用Western-blotting的含胎牛血清封闭液。 8. 甩去封闭液（注：不要冲洗），滴加一抗50ul（至少50ul否则易干片），4℃孵育过夜。4℃过夜后需在37℃复温45分钟（未验证：室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。）。 9. PBST洗3次各3分钟；
最新说服力
__________________________________________________ 超级说服力 一、说服力的八大原理 1、喜欢原理：人们喜欢欣赏自己的人； 2、互惠原理：人们会以同样的方式给予回报； 3、社会认同原理：人们会仿效其相似的人的做法； 4、承诺原理：人们会兑现自己明确的承诺； 5、权威原理：人们愿意听从专家的意见； 6、稀有原理：东西越少，想要的人越多； 7、对比原理：同样东西给人不同的感觉； 8、因为原理：理由越充分，人们越容易行动。 二、说服力的九大工具 1、问题的使用：会问比会讲重要100倍； 2、建立信赖感：了解你、相信你、喜欢你； 3、建立神经链：带对方进入你描绘的蓝图； 4、打断惯性：语言、肢体与注意力的惯性； 5、框视的技巧：引导对方的注意力； 6、掌控时间：合理分配时间，给时间压力； 7、情绪的利用：喜、怒、哀、乐、忧、悲、恐； 8、一致性：表里如一，言行一致； 9、讲故事：将理论不如讲故事。 三、说服力的六大核心 1、自我介绍：建立信赖感与权威感； 2、产品理念：产品介绍前的思想铺垫； 3、产品介绍：对产品产生渴望； 4、公司介绍：更信赖，更有安全感； 5、客户见证：建立信赖，坚定信心； 6、成交方案：无法抗拒，立即行动。 四、说服力的十大步骤 1、充分准备：成交前的5项准备； 2、调整情绪：让情绪巅峰的3个方法； 3、建立信赖：让他人喜欢你的6个策略； 4、了解客户：了解问题、需求及渴望； 5、塑造价值：提供超值的解决方案； 6、分析对手：从3个角度做对手分析； 7、解除抗拒：用4个步骤解除一切抗拒； 8、达成成交：成交他人的10个方法； 9、要求介绍：转介绍的3个步骤； 10、客户服务：给其惊喜，让其感动； 收集于网络，如有侵权请联系管理员删除
超强说服力
第一集超级说服力（上） 明确你要说服的结果 很多人在和顾客沟通的过程中，当你想说服他一件事情的时候，由于你对结果不够明确，很多时候你在说服的过程中，你说服到一半，遇到任何问题的时候，你就开始有所转移了。所以说其实我们在说服的过程中，你的力量来自于哪里？力量来自于一个明确的目标。 案例1：乔丹成功的奥秘 乔丹高中的时候，当时他连校队都进不去，可是当时乔丹他有个非常明确的目标，他告诉他自己，他这一辈子他说一定要从事篮球行业，并且未来一定要进入NBA。 可是当时这个教练看完乔丹打篮球以后，他就跟乔丹说，乔丹，你这辈子应该不太可能了。乔丹说为什么，他说因为你有两点不太满足，第一个就是你球技实在太差，第二个就是你的身高不太高，只有一米七几。当时这个教练跟他讲完了以后，乔丹就跟他这样说，他说教练，请你一定要给我机会，假如说我今天篮球技术不够好，我一定努力的练球；假如说我今天身高不够高，我一定努力长高。教练跟他说，乔丹，据我了解你的矮是遗传的原因，你的父亲在你们家里面是最高的一个，只有一米八零。所以说要技术练的好呢，我可能还相信，可是努力长高，那你就慢慢长吧。 当时由于乔丹有非常明确的目标，他知道他要达到什么样的结果，所以他就跟教练说，教练请你一定要给我机会，我今天一定要进入校队，哪怕你不让我上场打球，只要让我有机会，帮我们的队员拎拎包，只要有机会擦擦地板，球掉线外我捡捡球就可以了。教练觉得这个小伙子既然决心这么强，所以当时就给了乔丹机会。 乔丹进入这个圈子以后，他真的练球非常努力，一天要投一千次以上。由于乔丹他明确他想要的结果，他不断地付出，导致后来乔丹终于成名了。乔丹成名了以后，有记者就问他父亲，乔丹今天为什么这么优秀，在这个篮球行业为什么能取得这么好的结果？他的父亲和这个记者说，实际上什么原因我也不知道，但是我只知道乔丹他每天都在想篮球，他每天都在思考，他一定要进入NBA，一定要成为最优秀，最顶尖的篮球选手。当他明确目标以后，他的这个动力非常的强，明确它就是力量。 点评：乔丹成功的奥秘并不在于它是一个天才，而是在于他有一个非常明确的目标并坚持执行。 所以很多时候我们在说服顾客的时候，说服你周围朋友的时候，你要说服他那个想法你自己是不是很坚定，这个很重要。 下面如何做好决策的一套系统和方法，做好决策通常有六个步骤，当你学会用这六个步骤来做你人生中的决策的时候你会发现，这个结果肯定就是你想要的了，它会坚定你想要这个结果，去达成你想要的说服力： 1.你要得到什么结果 2.我现在有什么选择 3.每个选择的结果是什么 4.什么比较重要 5.我还有没有其它选择 6.我什么时候开始行动 第二集超级说服力（中） 了解对方的问题、需求和渴望 其实在你和顾客说服沟通的时候，很多时候你讲的话对方听不懂。很多时候你跟你员工，跟你的顾客沟通，你讲你的东西有多么的好，你讲你自己有多么的优秀，可是由于这个东西和顾客没有太大的关系，所以他就听不懂。所以说我们在说服的过程中，去了解顾客的问题、需求和渴望就非常重要。
免疫组化技术(原理、分类、步骤及主要试剂、设备准备)
免疫组化技术 免疫组化技术
业精于勤而荒于嬉 行成于思而毁于随
免疫组化技术
原理
抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色 来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。 众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取 出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并 用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原 - 一抗 - 二抗复合物，将抗原放大，由于抗 体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂 DAB 显示 为棕黄色颗粒） 。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产 物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨 基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
分类（常用）
1、免疫荧光方法
最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内 的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某 种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较 广。
2、免疫酶标方法
免疫酶标方法是继免疫荧光后， 60 年代发展起来的技术。 于 基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用， 然后加入酶的底物， 生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标 技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种 标记方法，目前在病理诊断中广为使用的当属 PAP 法（过氧化物酶-抗过氧化物酶） 、ABC 法（卵白素-生物素-过氧化物酶复合物） SP 、SP 、即用型二步法（聚合物链接）等。 法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶） 链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶）
3、免疫胶体金技术
免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白 的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌 A 蛋白)等作为 探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免 疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。如应用银 加强的免疫金银法则更便于光镜观察。
4、免疫铁蛋白法 5、放射免疫自显影法
标本
1、组织标本：石蜡切片 石蜡切片（病理切片和组织芯片） 、冰冻切片 石蜡切片 2、细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片
---------------------------------------------------------------------------------华中科技大学同济医学院
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杨涛鸣超级说服力课程笔记(完整版)
杨涛鸣超级说服力课程笔记（最新完整版） 1、第一步骤：充分足够的准备 充分的准备包括四个方面的准备， 首先是体力的准备。要想让自己体力好，就必须做一些体力上的训练。以我十几年来研究成功学的经验，总结出了一些行之有效的方法（见《自己就是一座宝藏》），现在介绍几个给大家。 一个是每天做一四二深呼吸，早、中、晚各10次，共30次；二是永远只吃七、八分饱；三是吃水果在饭前吃，不要在饭后吃；四是做运动要做有氧运动，比如散步、游泳、慢跑、骑自行车等。 第二是专业知识的准备。你必须对你的产品有非常足够的了解。 第三是对顾客了解的准备。你必须非常了解你的顾客，了解他的兴趣、爱好，这样便于沟通，便于投其所好。 第四是精神上的准备。在处理重要的事情之前，先静坐5分钟。 2、第二步骤：使自己的情绪达到巅峰状态（自我确认） 要想使自己达到巅峰状态，必须先让自己的肢体达到巅峰状态，因为动作创造情绪。同时对自己反复地做自我确认：我是最棒的！我是最优秀的！我是最好的！我喜欢我自己！我一定能成功！ 3、第三步骤：建立顾客信赖感 建立顾客的信赖感，首先是透过自己的形象！也就是——为成功而穿着！为什么这么说呢？因为一个人的第一印象非常非常地重要！一旦他第一印象建立好了，那就成功了一半了。而第一印象就是通过你的形象表现的，所以一定一定要注重自己的穿着、举止、气质。 第二要学会倾听。永远站着或坐在顾客的左边，保持适度的距离，保持适度的目光接触，倾听不要打岔，不要发出声音，同时微笑点头即可。还要做好记录。顾客讲完后，要重复一次做确认。不要想即将说的话，要听出他真正的意思，用关心的角度跟他沟通.（杨涛鸣课程报名/微信：186********黄老师） 。 第三要模仿对方的谈话。模仿对方的文字、声音和肢体语言，与对方相似，引起共鸣。在模仿肢体语言的时候，要模仿对方的表情和语气，注意千万不要同步模仿。 第四是要使用顾客见证。顾客说一句话顶你一万句，每个推销员至少带5个顾客见证。 4、第四步骤：了解顾客的问题、需求和渴望 了解顾客先从聊天开始，聊天就是做生意。首先前20分钟要聊FORM，F代表家庭；O代表事业；R代表休闲；M代表财务。其次聊购买的价值观。所有的销售都是价值观的销售，彻
培训体系超级说服力培训教程
（培训体系）超级说服力培 训教程
中外经典超级说服力培训教程 超级说服力目录概要： 壹、超级说服力的第壹步骤是准备 充分准备·观念准备·体能准备·形象准备·专业知识准备·成交准备 二、让你拥有超级说服力 怎样接近顾客 怎样消除顾客对我的防备 怎么说服客户款到发货呢 怎样才能消除初次见大客户的恐惧心理 如何快速建立信赖感 如何才能更有感染力和说服力 三、超级说服力秘诀/乔吉拉德 超级说服力的第壹步骤是准备 充分准备 成功的说服总是于见客户之前就做好了充分的准备工作，这些准备工作能够使你找到准客户，同时也保证你于说服的过程中信心百倍，谈笑之间化解各种可能出现的波折，壹步步走向成功。你千万不
要见轻了事前的准备，没有准备的说服如同瞎子摸象，其结果往往和预期的结果相反。 观念准备 有能力的人能说动别人跟着他走，没有能力的人只能听命于人。今天整个世界和讯息息息关联。从来没有像当下这么多的讯息，终日不歇地影响着我们，要我们喝可口可乐，穿旧牛仔裤，听摇滚歌曲，似乎整个世界均随着打转。当下让我们改变自己说服别人的观念，且且告诉你如何成为壹位有说服力的人。 说服力将使你迈向成功。于这充满说服方式的世界里，你能够去说服别人，也能够为别人所说服；你能够引导别人，也能够被别人引导。至于你要作哪壹种人，就见你有没有能力，有能力的人能说动别人跟着他走，没有能力的人只能听命于人。 说服力能帮助别人同时也帮助自己。做为推销员，应帮助客户认识他的价值观，且帮助他排列。调查生活中对他重要事物的排序，帮助他了解自己的真正需要，帮助他做出正确的选择、决定，帮助他改善生活的质量和生命的内涵，帮助他对自己所买的东西及对他本人均感满意。说服不是勉强他，真正的说服力是理解他、尊重他、欣赏他、成就他。比如你卖产品给某人，明明他有购买能力，而且很需要，可是就是由于观念上的守旧，相信了道听途说的谣言，偏信了个别的表面现象，而拒你于千里之外，那你怎样把对他有很重要的关系及对他
免疫组化操作方法原理步骤以及常见问题处理大总结
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结 1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。就拿温度来说，可以有4度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。 2、免疫组化最大的优势是定位和定性。相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。尤其对于有些因子的转位研究十分有用。 3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。 4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。 5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。当然也不能做假阳性或假阴性结果。 6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。失败往往促进你去思考试验原理和过程，成功有时也加快你自傲。 7、实验方法需要动手+动脑。如今我还不敢说我在免疫组化什么都知道。我只所以今天敢在这里说这说那，这是因为我经过了反复的动手+动脑，把理论原理运用于实践，在把实践中发现的问题带到理论知识中去解决，最终把理论与实践融会贯通。 一、概念和常用方法介绍 1、定义用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。 2、原理根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。 3、分类 1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是比较