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细胞培养传代标准操作规程

细胞培养传代标准操作规程

1、目的:建立Vero细胞培养传代标准操作规程,确保检验操作标准化、规范化。为了保证培养细胞的正常生长,实验技术人员必须明确并正确执行细胞培养传代的基本操作步骤,特制订实验室细胞培养传代操作流程。

2、范围:适用于Vero细胞培养传代实验人员。

3、编制依据

《企业注册标准WS4-(S-009-2)-2003Z》。

4、Vero细胞培养传代操作规程

4.1试药与试液

1、细胞:Vero细胞。

2、液体:0.25%胰蛋白酶溶液;7.5%碳酸氢钠溶液;小牛血清;PBS缓冲液;10×199培养液、灭菌注射用水、EDTA溶液。

4.2仪器与用具

1、恒温培养箱;

2、倒置生物显微镜。

4.3操作方法

4.3.1细胞培养、传代

1、准备好细胞培养传代所需物品,紫外线照台30min。

2、挑选细胞形态佳、无污染的Vero细胞,弃旧生长液。

3、细胞面经少量EDTA溶液洗涤后,加入胰蛋白酶等消化液适量(胰酶铺平培养瓶底为佳),倒置显微镜下观察培养瓶内细胞,一旦发现大量细胞胞质回缩,细胞间隙增大,但未脱离培养瓶底,立刻用吸细胞液的滴管吸出胰酶弃去,

4、把细胞培养瓶置37.0℃±0.5℃孵育让残存的胰酶继续消化,(在37℃胰

酶消化效果最佳),每1min把培养瓶拿到倒置显微镜下观察,当观察到细胞变圆,透亮,细胞间隙明显增大时,加入先配好的完全培养基适量终止消化,用吸管轻柔吹打分散细胞,制备成均一的细胞悬液。

5、取一滴细胞悬液进行计数(此步骤是为了积累培养细胞的经验,观察多少密度的细胞具体几天可以长满,待有经验后此步骤可以省略。)

6、传代:不同细胞根据细胞数量、生长快慢、难易等,一般按照1:3-1:5比例进行传代。先用滴管吹打混匀细胞悬液,平均分配细胞悬液到各个培养瓶中,补足完全培养基使液体总体积达到40ml左右,平放到培养箱中继续培养。

7、收拾所用物品、用75%酒精喷洒操作台,擦台,保持台面整洁。

4.3.2填写记录:

1、随试验进程做好试验记录(按实验记录规范要求),包括试剂的厂家、批号、效期, 试验时间,试验结果。签字

2、填写仪器使用登记。

4.4复核人复核

复核人复核、签字。

4.5结果与判定

每天用显微镜观察细胞形态。