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五种植物内生真菌的分离及其次级代谢产物生物活性研究

摘要......................................................................................................................................... I Abstract .................................................................................................................................... III 第1章绪论 (1)

1.1植物内生真菌的研究现状 (1)

1.1.1植物内生真菌的定义 (1)

1.1.2植物内生真菌的分布 (1)

1.1.3内生真菌的生物学作用 (1)

1.1.4植物内生真菌的多样性 (2)

1.1.5植物内生真菌次级代谢产物生物活性研究概况 (2)

1.1.5.1抗肿瘤活性 (3)

1.1.5.2 抗菌活性 (4)

1.1.5.3抗炎活性 (4)

1.1.5.4抗氧化活性 (4)

1.1.5.5调节植物生长 (5)

1.1.5.6 其他生物活性 (5)

1.1.6 药用植物内生真菌的分离与鉴定 (5)

1.1.6.1内生真菌的分离 (5)

1.1.6.2内生真菌的鉴定 (5)

1.2本论文研究的五种植物的研究现状 (6)

1.2.1露蕊乌头 (6)

1.2.2高乌头 (6)

1.2.3甘青乌头 (6)

1.2.4翠雀 (7)

1.2.5 紫堇 (7)

第2章五种植物内生真菌的分离纯化 (8)

2.1引言 (8)

2.2实验材料和仪器 (8)

2.2.1实验植物样品 (8)

2.2.2实验仪器 (8)

2.2.3药品与试剂 (8)

2.2.4 培养基 (8)

2.3实验方法 (9)

2.3.1内生真菌的分离纯化 (9)

2.3.2内生真菌的形态学观察 (9)

2.4实验结果与讨论 (9)

2.4.1实验结果 (9)

2.4.1.1 分离纯化得到的内生真菌 (9)

2.4.1.2 5种植物分离得到内生真菌的形态学特征 (10)

2.4.2实验讨论 (12)

第3章五种植物内生真菌次级代谢产物粗提物的生物活性研究 (14)

3.1引言 (14)

3.2实验材料 (14)

3.2.1实验菌株 (14)

3.2.2培养基 (14)

3.2.3实验材料 (15)

3.2.3.1 试剂及药品 (15)

3.2.3.2仪器 (15)

3.2.3.3实验动物 (15)

3.3实验方法 (15)

3.3.1内生真菌的发酵及待测样品的制备 (15)

3.3.2 90种粗提物抗单胺氧化酶（MAO）活性测定 (16)

3.3.3 90种粗提物抗乙酰胆碱酯酶活性测定 (17)

3.4实验结果与讨论 (19)

3.4.1结果 (19)

3.4.1.1粗提物抗单胺氧化酶活性 (19)

备注：待测样品抑制率浓度是1mg?mL-1。 (21)

3.4.1.2粗提物抗乙酰胆碱酯酶活性 (21)

3.4.2讨论 (23)

第4章六株内生真菌代谢产物化学成分初探 (24)

4.1引言 (24)

4.2材料及仪器 (24)

4.2.1 实验菌株 (24)

4.2.2培养基 (24)

4.2.3实验材料及仪器 (24)

4.2.3.1仪器 (24)

4.2.3.2试剂 (25)

4.2.3.3显色剂的配制方法 (25)

4.3实验方法 (25)

4.3.1菌株LRWT-26-1化学成分的初步研究 (25)

4.3.1.1菌株LRWT-26-1的发酵 (25)

4.3.1.2菌株LRWT-26-1次级代谢产物的提取 (25)

4.3.1.3 菌株LRWT-26-1菌液粗提物化学成分的分离纯化 (25)

4.3.2菌株GWT-7化学成分的初步研究 (26)

4.3.2.1菌株GWT-7的发酵 (26)

4.3.2.2菌株GWT-7次级代谢产物的提取 (26)

4.3.2.3 菌株GWT-7菌液粗提物化学成分的分离纯化 (26)

4.3.3菌株LRWT-39化学成分的初步研究 (26)

4.3.3.1菌株LRWT-39的发酵 (26)

4.3.3.2菌株LRWT-39次级代谢产物的提取 (26)

4.3.3.3菌株LRWT-39菌液粗提物化学成分的分离纯化 (26)

4.3.4菌株GWT-8化学成分的初步研究 (27)

4.3.4.1菌株GWT-8的发酵 (27)

4.3.4.2菌株GWT-8次级代谢产物的提取 (27)

4.3.4.3菌株GWT-8菌液粗提物化学成分的分离纯化 (27)

4.3.5菌株CQ-17化学成分的初步研究 (27)

4.3.5.1菌株CQ-17的发酵 (27)

4.3.5.2菌株CQ-17次级代谢产物的提取 (27)

4.3.5.3菌株CQ-17菌液粗提物化学成分的分离纯化 (27)

4.3.6菌株HY-9化学成分的初步研究 (28)

4.3.6.1菌株HY-9的发酵 (28)

4.3.6.2菌株HY-9次级代谢产物的提取 (28)

4.3.6.3菌株HY-9菌液粗提物化学成分的分离纯化 (28)

4.3.7单体化合物抗单胺氧化酶活性测定 (28)

4.3.7.1样品的配制 (28)

4.3.7.2抗单胺氧化酶活性测定 (28)

4.3.8单体化合物抗乙酰胆碱酯酶活性测定 (28)

4.3.8.1样品的制备 (28)

4.3.8.2抗乙酰胆碱酯酶活性测定 (29)

4.4实验结果与讨论 (29)

4.4.1单体化合物的结构鉴定 (29)

4.4.1.1 菌株LRWT-26-1中化合物的鉴定 (29)

4.4.1.2菌株GWT-7中化合物的鉴定 (30)

4.4.1.3 菌株LRWT-39中化合物的鉴定 (30)

4.4.1.4 菌株GWT-8中化合物的鉴定 (30)

4.4.1.5 菌株CQ-17中化合物的鉴定 (30)

4.4.1.6 菌株HY-9中化合物的鉴定 (30)

4.4.2化合物的抗单胺氧化酶活性 (31)

4.4.3化合物的抗乙酰胆碱酯酶活性 (32)

4.5讨论 (32)

第5章五株内生真菌的分子生物学鉴定 (34)

5.1引言 (34)

5.1.1待测菌种 (34)

5.1.2实验试剂 (34)

5.1.3试剂的配制方法 (34)

5.1.4实验仪器 (34)

5.1.4培养基 (35)

5.2实验方法 (35)

5.2.1菌种的活化 (35)

5.2.2菌丝体的扩大培养 (35)

5.2.3菌丝体DNA的提取 (35)

5.2.4 DNA纯度的检测 (35)

5.2.5 ITS-PCR扩增 (36)

5.2.5.1引物ITS序列 (36)

5.2.5.2扩增体系 (36)

5.2.5.3扩增条件 (36)

5.2.6扩增产物检测 (36)

5.2.7扩增产物的纯化及序列的测定 (36)

5.2.8扩增产物序列的分析 (36)

5.3实验结果 (36)

5.3.1菌株纯度检测 (36)

5.3.2菌株分子生物学鉴定 (37)

5.4实验讨论 (40)

结论 (42)

iii

参考文献 (43)

致谢 (51)

附录A（攻读硕士学位期间所发表的论文及成果） (52)

附录B 5种内生真菌的的DNA序列 (53)

摘要

内生真菌与宿主植物具有互利共生的关系，药用植物中蕴藏着丰富的内生真菌资源。研究表明，药用植物内生真菌能代谢产生诸如抗肿瘤、抗菌等与宿主相同或者相似的多种生物活性物质，这些活性物质可以直接作为药物的有效成分或者作为新药研发的先导化合物。为了从药用植物内生真菌中寻找有生物活性的先导化合物，本文主要选取5种药用植物作为材料，对其内生真菌进行分离纯化，研究了内生真菌发酵提取物的抗单胺氧化酶和乙酰胆碱酯酶的生物活性，并对有活性菌株的化学成分进行了初步研究。研究内容和结果如下：

1．药用植物内生真菌的分离：利用组织块法分离5种植物的内生真菌，共得到45株内生真菌，其中从露蕊乌头（Aconitum gymnandrum）中分离得到25株，甘青乌头（Aconitum tanguticum）中得到4株，高乌头（Aconitum sinomontanum）中得到5株，翠雀（Delphinium grandiflorum）中得到8株，紫堇（Corydalis edulis）中得到3株。

2．活性测定：对45株菌进行发酵，发酵液用乙酸乙酯萃取，菌丝体用甲醇提取，共得到90种粗提物。用酶标法对粗提物进行抗单胺氧化酶活性测定，结果显示，当初浓度为1mg?mL-1时，抑制率在70%以上的粗提物有16个，其中90%以上的有5个，80%以上的有7个，抑制率最高的是LRWT-39（露蕊乌头39）的乙酸乙酯提取物，抑制率达到99%；当初浓度为300μg?mL-1时，抑制率在70%以上的有5个，进一步测定IC50值，LRWT-39的值最低，达到38.82μg?mL-1。采用改进的Ellman方法测定了样品抗乙酰胆碱酯酶的活性，结果显示，当初浓度为1mg?mL-1时，粗提物抑制率最高的只能达到25%。

3．化学成分的初步探究：对5株次级代谢产物具有单胺氧化酶抑制活性的菌株L RWT-26-1（露蕊乌头26-1），GWT-7（高乌头7），LRWT-39，GWT-8（高乌头8），CQ-17（翠雀17）以及课题组前期从荷叶中发现的具有抗乙酰胆碱酯酶活性的菌株HY-9（荷叶9），进行了化学成分的初步研究。运用现代色谱技术（硅胶柱色谱，大孔树脂，薄层色谱，高效液相色谱等）进行化合物的分离纯化，借助1H-NMR、13C-NMR和已知文献比对，鉴定了7个化合物，分别是Pseurotin A1(1)、Alternarriol(2)、Ergosterolperoxide(3)、Bisdethiobis(methylthio)gliotoxin(4)、alternariol 4-methyl ether (5)、Brevianamide F(6)和fumitremorgin C(7)。通过酶标法检测所有化合物的抗单胺氧化酶和乙酰胆碱酯酶活性，结果显示化合物3（Ergosterolperoxide）和化合物4（Bisd -ethiobis(methylthio)gliotoxin）有一定程度单胺氧化酶抑制活性，初浓度为300μg?mL-1时，抑制率分别为53.82%和65.60% ，IC50值分别为142μg?mL-1和130μg?mL-1；但所有化合物对乙酰胆碱酯酶的抑制率都较低。

4．菌种鉴定：运用分子生物学手段，对菌株LRWT-39，GWT-7，GWT-8，