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Schindler ICC Lobby Vision

Titel Slide Schindler Technologies.

Schindler Lobby Vision

Supervisory Panel.

Overview.

Application.

–Lobby Vision facilitates building operations

management tasks, in particular the supervision

of elevators and escalators as well as the status

display of other building systems.

–Target group: Building Manager/Supervisor

Features and Benefits.

Wide range of control and information facilities.

–Lobby Vision displays the operational status of elevator

groups and single elevators, escalators and other building

systems.

–Optional elevator/escalator functions or services can be

switched on and off through the Lobby Vision PC.

–Lobby Vision records and consolidates operating,

performance and event data for providing meaningful

analysis on demand.

–Every operator is authorized by the building management

to have access to his own specific range of service

switching facilities.

Worldwide.

–Actual Release: 5.51

–1’700 installations worldwide since 1997

Scope of Interfaces.

Elevator Systems:

–Miconic V

–Miconic SX, TX, TX-GC, 10-GC, DD

–Miconic 10 Overlay, Schindler ID

–Miconic MC-GC

–Third party on request

Escalator Systems:

–Miconic F via CD901 or PEM

Free Input/Output:

–Multi I/O card

BMS

–TCP/IP BMS Schindler protocol, standardized DA server

Remote Access

–Standard Windows application

Building Map:

–Building layout with elevator and escalator

groups.

–Operational status

on/off.

Display of building map.

Building:

–Main floor

–Blind zones –Served floors

Display of vertical Building Overview. Elevator:

–Groups

–Position

Escalator:

–Direction

Elevator:

–Groups

–Position

–Direction

–Door

–Service

–Traffic mode

–Error

Display of Building Status Overview.

Escalator:

–Groups

–Direction

–Status

–Error

Free Input/Output:

–Groups

Status

Elevator:

–Name

–Position

–Direction

–Load

–Drive

–Door

–Operation hours

–Car calls

–Service

–Error

Display of Elevator Group Details.

Free Input/Output:

–Floor name

–Served floors

–Main floor

–Allocation

–Service

Traffic mode

Direct Commands:–Car calls –Floor

calls –Miconic 10 calls

Direct Commands.

Elevator Group:

–Traffic mode

–Block operation

–VIP travel

–more on commission

Elevator Service Switching.

Elevator:

–Emergency travel

–Independent service

–Lock car call

–Lock floor call

–Priority travel

–Switch off

–VIP travel

–more on commission Escalator:

–Automatic operation up/dn –Continuous operation up/dn Free inputs:

Switch on/off

Features:

–Name

–Timed

–Hot key

Scheduled Actions.

Actions:

–Set elevator service

–Set escalator service

–Set free input

–Set floor lock mask

–Run statistics

–Run management

Summary

Statistics Data:

–Group availability –Service availability –Run time

–Number of trips

–Number of errors –Door movement per floor

–Door nudging

per floor

Elevator Statistics.

Statistics Data:

–Car call statistics

–Floor call statistics

–Passenger distribution (Schindler Miconic 10)

Traffic Statistics.

Performance Statistics.

Statistics Data:

–Waiting time statistics (mean, distribution, longest)–Travel time statistics (Schindler Miconic 10)

–Destination time statistics (Schindler Miconic 10)

Statistics Data:

–History of elevators, escalators and free inputs for 24 hours.

–Status & command logging on file or printer output for max. 30 days

Event Logging and Playback.

Playback:

Replay of lift events (fast, real-time, slow, goto..)

User Management:

–User level 0-4

–Access rights for services and

commands

Lobby Vision Customizing.

Settings:

–Overview screens (names, colors).

–Corrective actions text

–Statistic settings

–Event recorder settings

Thank you for your attention.

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intellectual property.

It may not be copied

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manufacturing, nor commu-

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免疫组化原理和步骤

免疫组化原理及步骤 免疫组化操作规程 一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学,是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应,对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来,借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用,在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。 二、实验器材微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器和通风橱等。 三、试剂配制 1. 0.01 M PBS(pH 7.34 ):9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB 加双蒸水至1000 ml ; 1000 ml 0.2M PB (pH 7.4)=5.93 g NaH 2 PO 4 2·H 2 O +58.02 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O in 1000 ml 双蒸水或=190 ml A + 810 ml B (A. 0.2 M NaH 2 PO 4 2·H 2 O :15.6 g in 500 ml ddH 2 O ; B. 0.2 M Na 2 HPO 4 ·12H 2 O :71.632 g in 1000 ml dH 2 O )。 2. Citrate Buffered Saline (0.01 M 柠檬酸缓冲液, PH6.0 ):28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH 2 O (A.Citrate acid

(柠檬酸):10.5 g

加双蒸水至 1000 ml ; B.Citrate sodium (柠檬酸钠): 29.41 g 加 双蒸水至 1000 ml )。 3. 细胞通透液:由终浓度分别为 0.3% 双氧水和 0.5%Triton X-100 混合而成。配制方法是先用微波加热的 36 ml PBS ,再接着 加 120 ul TritonX-100, 并加热一儿,冷却至临用前加 0.4 ml 30 % H 2 O 2 。 4. 5%羊血清或封闭血清,用 PBS 稀释。 5. 含 0.03 % H 2 O 2 的 0.05 %DAB (避光) :用 20×DAB (1%, 10 mg/ml )5 ul +0.1 ul 30% H 2 O 2 +95 ul PBS 。 6. 一抗、二抗均用 PBS 稀释。 7. Xylene 、梯度 Ethanol (100 %×2、95%、80%、70%、50%)、 双蒸水、中性树胶(封裱剂)。 8. 苏木精染液: 四、操作步骤 1 、脱蜡、水化 60 ℃× 20 min →Xylene 2 × 10 minut ;es 80% ethanol 2 minutes ; 70% ethanol 2 minutes ; distilled water:5 min ; PBS 洗 3 次×3 min 。 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) 100% absolute ethanol :2 ×5 minutes ; 95% ethanol 2 minutes ;

免疫组织化学(傅琦博)-免疫组织化学

免疫组织化学 傅琦博 引言 酶工程是生物工程的重要组成部分,近几十年来,随着研究手段的更新和技术水平的提高,产生了一门以研究酶在细胞内的存在及其动态,以阐明组织细胞的结构和功能为主要内容的科学——酶组织化学。酶组织化学是利用酶化学反应的产物可在光学显微镜或电子显微镜下被识别的特性,借以从形态学角度判定酶在组织细胞内的存在的部位的一门技术,其基础是组织化学。它具有将形态学、生物化学和生理学联系起来的特点,在生物学、生物化学、医学生物领域内日益发挥着重要的作用。研究组织细胞内特定酶分布的酶组织化学方法大致分为:(1)利用酶的活性反映的方法;(2)利用抗原抗体反应(免疫应答)证实酶的存在部位的方法。后者也被称之为免疫组织化学。 免疫组织化学概述 免疫组织化学简称免疫组化,是应用免疫学及组织化学原理,对组织切片或细胞标本中的某些化学成分,进行原位的定性、定位或定量的研究。这种技术称为免疫组织化学技术。免疫组化是利用抗体与抗原的结合具有高度特异性的特点,采用一直的抗体检测组织或细胞的抗原物质,以期确定组织或细胞是否存在未知抗原,并进行定性、定位或定量的研究。抗原与抗体结合形成的免疫复合物是无色的,故必须借助组织化学方法,将抗体抗原反应部位显示出来。它的主要研究方法是免疫组织染色法(简称免疫染色法),食用该方法检测细胞内物质,必须具备两个条件:①作为检测对象的物质须具有抗原性,能制作出与之相应的特异、高效价的抗体;②在免疫反应发生之前,目标物质要保持抗原性,同时还要保持在组织细胞内的稳定状态。要检测抗原,就要用与之相应的抗体进行免疫反应,同时要用可视的标记标出抗原或抗体,采用这种方法的免疫染色法称为标识抗体法或标识抗原法,常用的表示抗体法有直接法、间接法、补体结合法以及多重染色法等。直接法是标识要检出的抗原的抗体,然后进行反应的方法,其特异性高,但检出的敏感度不如间接法,标识抗体的食用范围手局限。间接法是以未标识的第一抗体进行反应,接着标识以第一抗体为抗原所制作的抗体(即第二抗体)进行重叠反应,间接的证明抗原,这种方法的缺点是容易出现非特异性反应,但敏感度较高,标识抗体的用途也广;补体结合法是将间接法中的第二抗体作为标识抗补体抗体食用;多重染色法则是在同一标本上检出多种抗原物质的方法,可以用反复进行的重复标记的直接法,也可以用酶标记的重复进行的间接法。此外,还有后标识抗体的免疫染色法,此法先采用未标识的抗体进行反应,反应结束后,通过免疫化学反应或其他化学反应,用适当的标记物质来识别已与组织细胞内抗原发生结合的抗体。 免疫组织化学技术的发展 免疫组织化学技术是形态学研究领域一门新兴方法学。自它问世以来发展迅猛,用“日新月异”一词形容它毫不过分。酶标免疫组织化学技术是由Nakane 等人于60 年代末期创立的最早的免疫酶组织化学技术,之后Sternberger 等人于70 年代初期便在此基础上建立了非标记抗体酶法(又称间接法) 和PAP 法(过氧化酶抗过氧化酶法) 。80 年代初期美籍华人Hsu 又建立了卵白素生物素复合物法(ABC法) ,自此之后,免疫金银染色法、免疫电镜等技术相继问世。80 年代末期人们又发现链霉菌抗生物素蛋白(或译成链霉菌亲合素,St reptavidin) 与生物素结合力极强,遂用它标记过氧化酶建立起了SP 法,或称LSAB 法(链霉菌亲合素生物素过氧化酶法) 。由于链霉菌亲合素不与人组织中的内源性生物素起非特异性结合反应,故背景染色更加清晰,且敏感性比ABC 法高4~8 倍,比PAP 法高8~16 倍。进入90 年代,免疫组织化学又向基因水平深入发展,与分子生物学技术的结合日益紧密。如原位杂交后信 号的放大与显示便是采用了免疫组织化学显色技术,因而又可称之为原位杂交免疫组织化学技术。而图象分析、流式细胞仪的运用,是免疫细胞化学定量分析技术提高到更精确的水平。现就该技术的发展及其应用作一概述。 1利用免疫荧光标记技术可以分辨出标记抗原抗体所在的位置及其性质, 并可利用荧光定量技术计算抗原(或抗体) 的含量, 以达到对定性、定位、定量测定的目的[2 ]。如黄祥瑞等人(1999) 利用免疫荧光细胞化学技术研究西藏环状病毒细胞生物学特性和敏感细胞范围(CPE) , 成功地观察到该病毒的细胞病变效应特异荧光发生的部位、细胞数量和病毒的形态发生。辛德毕斯热是由辛德毕斯病毒Sindbis V irus (SiN ) 引起的人兽共患虫媒病毒病, 1974 年南非发生辛德毕斯热大流行。1991年梁国栋等通

免疫荧光细胞化学染色方法

免疫荧光细胞化学染色方法 一、标本制作 可制作涂片、印片、细胞单层培养物、组织切片,经适当固定或不固定,作免疫荧光染色用。 二、荧光抗体染色方法 (一)直接法 1.染色切片经固定后,滴加经稀释至染色效价如1:8或1:16的荧光抗体(如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体或兔抗人IgG或IgA荧光抗体等),在室温或37℃染色30min,切片置入能保持潮湿的染色盒内,防止干燥。 2.洗片倾去存留的荧光抗体,将切片浸入pH7.4或 pH7.2PBS中洗两次,搅拌,每次5min,再用蒸馏水洗1min,除去盐结晶。 3.用50%缓冲(0.5mol/L碳酸盐缓冲液pH9.0~9.5)甘油封固、镜检 4.对照染色 ①正常免荧光血清染色,如上法处理切片,结果应为阴性。 ②染色抑制试验(一步法):将荧光抗体和未标记的抗体球蛋白或血清(相同)等量混合,如上法处理切片。结果应为阴性。为证明此种染色抑制不是由于荧光抗体被稀释所致,可用盐水代替

未标记抗血清,染色结果应为阳性。此法结果较二步法稳定。③类属抗原染色试验,前面已作叙述。 直接法比较简单,适合做细菌、螺旋体、原虫、真菌及浓度较高的蛋白质抗原如肾、皮肤的检查和研究。此法每种荧光抗体只能检查一种相应的抗原,特异性高而敏感性较低。 (二)间接法 (1)切片固定后用毛细滴管吸取经适当稀释的免疫血清滴加在其上,置于染色盒中保持一定的湿度,37℃作用30min。然后用0.01mol/l pH7.2PBS洗两次,10min,用吸水吸去或吹干余留的液体。 (2)再滴加间接荧光抗体(如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体等),同上步骤,染色30min,37℃,缓冲盐水洗两次10min,搅拌,缓冲甘油封固,镜检。 对照染色:①抗体对照:用正常兔血清或人血清代替免疫血清,再用上法进行染色,结果应为阴性。②抗原对照:即类属抗原染色,亦应为阴性。③阳性对照。 间接法中上述方法称双层法(Double Layer Method)。另一种称夹心法,即用未标记的特异性抗原加在切片上先与组织中之相应抗体结合,再用该抗原之荧光抗体重叠结合其上,而间接地显示出组织和细胞中抗体的存在,方法步骤如下: ①切片或涂片固定后,置于染色湿盒内。 ②滴加未标记的特异性抗原作用切片于37℃,30min。

免疫细胞化学常用试剂介绍.

免疫细胞化学常用试剂介绍 一、固定剂 大多数神经激素、肽类物质为水溶性,在用于免疫细胞化学研究之前,常需固定。但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同,因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不尽相同。某些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。因此,在进行免疫细胞化学研究之前,很有必要了解所要研究的物质(蛋白质或肽类)的化学性质,并根据需要来选择适宜的固定剂(或固定方法)以及改进固定条件。 目前,免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂,其中以甲醛类和戊二醛最为常用。在此,简要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂,以供读者选用。 1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.3) 试剂:多聚甲醛40g 0.1mol/L磷酸缓冲液至1000ml 配制方法:称取40g多聚甲醛,置于三角烧瓶中,加入500~800ml 0.1mol/L磷酸缓冲液(Phosphate Buffer以下简称PB),加热至60℃左右,持续搅拌(或磁力搅拌)使粉末完全溶解,通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮,最后补足0.1mol/L的PB于1000ml,充分混匀。 该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究,最好是动物经灌注固定取材后,继续浸泡固定2~24h。另外,该固定剂较为温和,适于组织标本的较长期保存。 2.4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠 试剂:A液:多聚甲醛40g 蒸馏水400ml B液:Na2HPO4·2H2O16.88g 蒸馏水300ml C液:NaOH 3.86g 蒸馏水200m 配制方法:A液最好在500ml的三角烧瓶中配制(方法同前),至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。注意,在溶解多聚甲醛时,要尽量避免吸入气体或溅入眼内。B液和C液配制好后,将B液倒入C液中,混合后再加入A液,以1n NaOH或1N HCl 将pH调至7.2~7.4,最后,补充蒸馏水至1000ml充分混合,4℃冰箱保存备用。 该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究,用于免疫电镜时,最好加入少量新鲜配制的戊二醛,使其终浓度为0.5%~1%。该固定剂较温和,适于组织的长期保存。组织标本于该固定液中,4℃冰箱保存数月仍可获得满意的染色效果。 3.Bouin’s液及改良Bouin’s液 试剂:饱和苦味酸 40%甲醛250ml 冰醋酸50ml 配制方法:先将饱苦味酸过滤,加入甲醛(有沉淀者禁用),最后加入冰醋酸,混合后存于4℃冰箱中备用。冰醋酸最好在临用前加入。改良Bouin’s液即不加冰醋酸。

免疫组化操作方法原理步骤以及常见问题处理大总结

免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结 1、方法操作不难,最大的难处是出现异常结果时如何解决?这就需要掌握免疫组化实验原理,每一步知道为什么这样做,这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间,这三者一般是相互成反比的(相对),其中浓度是最重要的先决条件,温度决定反应的速度、时间决定反应的量。就拿温度来说,可以有4度、室温、37度,我推荐4度最佳,反应最温和,背景较浅;而37度反应速度较快,时间较短;室温我不太提倡,除非你每次都把环境温度控制在一定的范围,否则,尽量选择前两者。 2、免疫组化最大的优势是定位和定性。相比于其他蛋白检测方法,免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确,是定位检测分析首选方法。尤其对于有些因子的转位研究十分有用。 3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。免疫组化结果也能定量分析,但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下,分析最为准确,这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。 4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做;阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应,其余步骤均一致。前者是排除方法和实验系统有无问题;后者是排除有无一抗外的非特异性染色。 5、免疫组化的应用广泛,是当前实验研究的最重要方法之一。如今发SCI论文时,明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难,加一些形态学数据或图片,老外十分欢迎,可能是怕你学术造假吧。当然也不能做假阳性或假阴性结果。 6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤,重复运用于同一性质的切片和同一种抗体,做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法,更换一种抗体后,居然连二抗的种属来源都拿错了。失败往往促进你去思考试验原理和过程,成功有时也加快你自傲。 7、实验方法需要动手+动脑。如今我还不敢说我在免疫组化什么都知道。我只所以今天敢在这里说这说那,这是因为我经过了反复的动手+动脑,把理论原理运用于实践,在把实践中发现的问题带到理论知识中去解决,最终把理论与实践融会贯通。 一、概念和常用方法介绍 1、定义用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究,这种技术称为免疫组织化学(immunohistochemistry)技术或免疫细胞化学(immunocytochemistry)技术。 2、原理根据抗原抗体反应和化学显色原理,组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合,再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应,前者再用标记辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AKP)等的抗生物素(如链霉亲和素等)结合,最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分,在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物,从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。 3、分类 1)按标记物质的种类,如荧光染料、放射性同位素、酶(主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)、铁蛋白、胶体金等,可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。2)按染色步骤可分为直接法(又称一步法)和间接法(二步、三步或多步法)。与直接法相比,间接法的灵敏度提高了许多。3)按结合方式可分为抗原-抗体结合,如过氧化物酶-抗过氧化物酶(PAP)法;亲和连接,如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结(SP)法等,其中SP法是比较

免疫细胞化学与图像分析

免疫细胞化学与图像分析 在细胞生物学中,一个常见的问题是如何获取与细胞功能相关的各种定量测量信息。在免疫细胞化学中也存在同样的问题。制作免疫细胞化学标本环节较多,只要有一个环节失误就会影响实验结果,除了需要精制的药品外,还需要熟练的技术。那么,做成了理想的标本后,如何进行观察,才能获得尽量多的的各种定量信息,而且使这些信息能较客观的反映出来,这就是本章的编写目的。 一、定量分析的重要性 目前有许多研究免疫细胞化学的文章,是做定性和定位研究的。如有文献中提到,P物质在脑组织中存在于30处以上,这只是解决了定性定位问题,这些部位含P物质的量是否相同?可否用快速简便的方法对细胞内免疫反应产物的量进行分析?从而可进行比较。所谓反应产物的“量”包括颜色深浅,其所占的长度或面积等,就要借助于图像分析仪(image analyzer)了。 以往我们对免疫细胞化学或一般组织化学光镜标本的观察,对反应产物的量常用“+”号表示,一般可分为0~+++,共五个等级,这种方法对差别较大的标本当然还是可以用的,但存在以下三方面的问题:①同一张标本,不同的观察者可以得到出不同的结论,因为这种分级没有明确的客观标准;②即使同一张标本同一个观察者,间隔若干天后进行再次观察时,可能结论也不一样的;③最后一点也是最重要的一点,人的视觉是有一定限制的,用一般观察法实际上已经丢失掉了许多可贵的信息,因为你察觉不到实际上存在的较小的差异。因此我们力求有一个客观的比较精密的标准。除了常用的仪器如显微分光光度计(microspe ctrophotometer)和显微密度计(microdensitometer)等以外,还可用图像分析仪进行测量。前二者已有许多有关著作中介绍过,就其精确与灵敏来说都是够的,但却不能同时测出标本中某些成分的面积、体积或长度等其他极有用的参数。图像分析仪的分析广度则要大得多,并能明显地提高工作效率,所得到的各种数据可通过分析仪上的计算机进行统计学处理,只要将各种统计学公式输入计算机,选择其中你所采用的公式,即可快速得出分析结果,告诉你有无显著性差异。 二、图像分析仪简介 图像分析仪又称图像分析系统(image analysis system),主要用来解决如何客观地较精确地用数字来表达存在于标本中的各种信息,可称为数学形态学。它已经成为一种公认的科学研究工具,并且逐渐展现出巨大的潜能。图像中包含着极其丰富的内容,是人们从客观世界中获得信息的重要手段,因此,正确地测量和处理图像已成为测量技术中的重要课题,并广泛应用于航空遥感测量、金属图像测量、微电子技术

免疫组化的原理和步骤

免疫组织化学的概念: 免疫组化是利用抗原与特异性结合的原理,通过化学反应使标记的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞抗原(多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究,称为免疫组织化学。 免疫组化实验所用的有哪些? 免疫组化实验中常用的抗体为单抗体和多抗体。单抗体是一个B淋巴细胞分泌的抗体,应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后,从动物血中所获得的免疫血清,是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。 免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些? 实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类,前者包括石蜡切片(病理大片和组织芯片)和冰冻切片,后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。 其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法,对于组织形态保存好,且能作连续切片,有利于各种染色对照观察;还能长期存档,供回顾性研究;石蜡切片制作过程对组织抗原暴露有一定的影响,但可进行抗原修复,是免疫组化中首选的组织标本制作方法。石蜡切片为什么要做抗原修复?有哪些方法? 石蜡切片标本均用甲醛固定,使得细胞抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇,同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行IHC染色时,需要先进行抗原修复或暴露,即将固定时分子之间所形成的交联破坏,而恢复抗原的原有空间形态。常用的抗原修复方法有微波修复法,高压加热法,酶消化法,水煮加热法等,常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。 免疫组化常用的染色方法有哪些? 根据标记物的不同分为免疫荧光法,免疫酶标法,亲和组织化学法,后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。这种方法敏感性更高,有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位,其中生物素——抗生物素染色法最常用。 抗体交叉反应的原因: 指抗体除与其相应的抗原发生特异性反应外还与其它抗原发生反应。产生的原因有以下几个方面: 1. 抗原特异性指用于免疫动物的抗原性物质中含有多种抗原分子,它引起动物产生针对多种抗原分子特异性的相应抗体。任何其它物质只要含有一种或多种与上述物质相同的抗原分子,必将与上述多特异性的抗血清发生交叉反应。 2. 共同决定簇即两种抗原分子中都含有相同的抗原决定簇。 3. 决定簇相似,两种不同的抗原决定簇,如果结构大致相同,由于空间构象关系,某一决定簇的相应抗体可以与大致相同的决定簇发生交叉反应。当然抗原一抗体之间构象相似时的结合力小于吻合时的结合力。 免疫细胞化学技术 一、免疫细胞化学技术的概述 *免疫细胞化学(immunocytochemistry, ICC) -是利用抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定细胞抗原的成分(主要是多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究,称为~。

免疫组织化学技术(ABC法)

免疫组织化学技术(ABCxx) 大鼠脊髓冰冻切片或细胞爬片依次入含3%Triton-x100 和 0.03%H 2O 2的 0.01%磷酸盐缓冲液(PBS, pH 7.4 ),室温30min ;含3%牛血清白蛋白(BSA, Sigma的PBS室温30 min; 豚鼠抗HAP1抗体(1:300), 4C孵育48h; PBS漂洗3次,每次10min;生物素化羊抗豚鼠IgG(1:200)室温2小时;PBS漂洗3次,每次10min; ABC复合物(1:100), 2小时;PBS漂洗3次,每次10min ;含 0.03%DAB 和 0.006%H 2O 2 的Tris 盐酸缓冲液(pH 7.6)室温13mi n;常规脱水、透明、树脂封片,显微镜观察、拍照。以上免疫染色以PBS缓冲液替代一抗作阴性对照。 鞘内注射HAP1-siRNA后大鼠脊髓HAP1表达水平的变化。A示对照组大鼠脊髓背角HAP1免疫反应性,B示RNAi组大鼠脊髓背角HAP1免疫反应性强度减弱。C示RNAi后大鼠脊髓HAP1表达水平的免疫印迹检测。D示RNAi后大鼠脊髓背角免疫反应强度变化的统计学分析, *示与对照组比较, P< 0.01。比例尺为100 am。E示RNAi后大鼠脊髓HAP1蛋白含量变化的统计学分析, ▲示与对照组比较, P< 0.01。 免疫荧光双标技术

脊髓切片或生长在盖玻片上的PC12细胞依次入含3%Triton-100的PBS室温30min,含2%正常羊血清(NGS和3%BSA的PBS室温30min,入豚鼠抗HAP1 抗体(1:3000)和兔抗NK1R(1:100) 4C 孵育48h; PBS漂洗 3 次,每次10 min,加入RodamineRed或FITC标记的驴抗豚鼠或兔IgG (1:500),室温闭光2h, PBS闭光漂洗3次,每次10min,含10%甘油的PBS封片。荧光显微镜观察,FITC用488nm 氩氪激光激发,用530-560nm滤光片检测;Rodamine Red用543nm 氩氪激光激发,用570nm 滤光片检测。 HAP1和NK1R在大鼠脊髓背角中的定位关系。A示荧光标记的脊髓灰质背角浅层表达的HAP1, B示荧光标记的脊髓灰质背角浅层表达的NK1R C示A和 B的重叠图像。箭头示HAP1和NK1R双标细胞。 比例尺为20 am。 细胞进行处理后,弃培养基,用 0.01MPBS漂洗3遍。加入4%多聚甲醛固定30min。PBS漂洗3遍。 加入3%Triton-x 100的PBS室温30 min;含2%正常驴血清(NGS和3%BSA 的PBS室温30 min;分别加入小鼠抗MAP2单克隆抗体(1:200, Neuro-Marker 公司)或兔抗mGluR5多克隆抗体(1:1000, sigma公司)或兔抗NSE多克隆抗体 (1: 100,北京中山生物技术公司)4C孵育48h; PBS漂洗3次,每次 10min;入Rodamine Red标记的驴抗兔/小鼠IgG (1:500, Jackson ImmunoResearch Laboratories,室温闭光3h; PBS闭光漂洗3 次,每次10 min;含10%甘油的PBS封片。激光共聚焦显微镜(Olympus FV500观察,EGFP用 488nm氩氪激光激发,用530-560nm滤光片检测;RodamineRed用543nm 氩氪激光激发,用570nm 滤光片检测。

免疫组织化学及其应用

免疫组织化学及其应用 浙江大学病理学与法医学研究所 周韧 1.免疫组织化学的历史、现状和发展 1.1.历史 ●人类的历史有多长,医学的历史也就有多长.医学的任何一个进步都是建立在当 时科学与技术发展的相应水平上的. ●医学的目的: 解除人体的病痛 ●核心: 诊断和治疗。 任何疾病的有效治疗均来源于正确的诊断。●疾病的诊断手段准确性,首推病理诊断准确性高,即病理组织学诊断。更准确、 更可信、更有权威性。 ●免疫组织化学(以下简称免疫组化)已成为病理诊断中的一种常用手段。 病理诊断发展过程的主要事件 年代作者事件 1632年 Severino 肿瘤切开后观察的书 1661年 Malpighi 放大镜观察后的报告 1761年 Morgagni 肿瘤与外科方面的书 1829年 Horner 首篇病理论文 1832年Hodgkin 报告7例尸检结果的论文 1858年Virchow 发表《细胞病理学》 1863年 Paget 发表《外科病理学》 1897年 Mallory和Wright 发表组织学技术的书 1914年 Mallory 发表《细胞组织学原则》 1919年 Ewing 发表《肿瘤病》 1924年 McFarland 发表《外科病理学》 1926年 Karsner 发表《人体病理学》 1928年 Papanicolaou 发表细胞学方面的书 1951年电镜应用于病理诊断 1974年免疫组化用于病理诊断 ●诊断病理学开始于19世纪 ●20世纪的第二个25年中达到光学显微镜诊断的辉煌。随之而起的电子显微镜 ●20世纪第三个25年中成为诊断病理的发展高峰。

●进入20世纪最后25年,取而代之的便是免疫组化了。 1.2.免疫组织化学的发展 1.2.1.免疫学的发展 1.2.2.单克隆技术的出现 ●病理诊断的确立:是找到“特征性”形态表现。 常规苏木素伊红(HE)染色 几百种的“特殊染色” ●免疫组织化学产生: 抗原抗体结合原理 ●从组织细胞水平进行抗原抗体反应,于是就了免疫组织化学技术。 主要的发展过程 年代研究者事件 1941年 Coons 实用免疫荧光技术 1948年 Fagraeus 进一步发展免疫荧光技术 1970年 Sternberger 抗体酶标记技术 1974年 Taylor 证实组织中的浆细胞免疫 1975年 Kohler和Milstein 单克隆抗体技术 1981年 Hsu ABC法 90年代以来 SP法,原位杂交及原位PCR免 疫组化法

免疫组织化学技术题库1-2-10

免疫组织化学技术题 库1-2-10

问题: [单选,A2型题,A1A2型题]免疫组化技术的优点不包括(). A.高特异性 B.高敏感性 C.形态学的直观性 D.精确定量分析 E.能对抗原表达情况进行分析 免疫组化技术重要的特点是形态学的直观性,用于抗原表达的定性分析,不能精确定量。

问题: [单选,A2型题,A1A2型题]免疫组织化学技术中,必须保证组织材料(). A.取材新鲜 B.形态保存良好 C.抗原物质的抗原性不被破坏 D.以上均包括 E.以上均不包括 取材必须新鲜、形态保存良好、抗原性不被破坏。

问题: [单选,A2型题,A1A2型题]免疫细胞组织化学技术包括(). A.酶免疫组织化学技术 B.荧光免疫组织化学技术 C.亲和素免疫细胞组织化学技术 D.以上均包括 E.以上均不包括 免疫细胞组织化学技术包括以上所有。 (NBA总冠军 https://www.wendangku.net/doc/f813780020.html,/)

问题: [单选,A2型题,A1A2型题]免疫标记电镜技术获得成功的关键是(). A.对细胞超微结构完好保存 B.保持被检细胞或其亚细胞结构的抗原性不受损失 C.选择的免疫试剂能顺利穿透组织细胞结构与抗原结合 D.以上叙述都正确 E.以上均不正确 上述均为免疫标记电镜的成功关键。

问题: [单选,A2型题,A1A2型题]胶体金是氯金酸在何者的作用下聚合成特定大小的金颗粒,并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态(). A.还原剂 B.氧化剂 C.变构剂 D.化学物质 E.以上都不对 氯金酸在还原剂如白磷、维生素C等的作用下还原为金颗粒。

免疫组织化学(荧光)方法及问题详解

目录: 1.常用于免疫荧光组织化学染色的荧光素 (1) 2.免疫荧光组织化学基本原理及荧光抗体再染色 (2) 3.免疫荧光组织化学技术的荧光…………………………………….3,4 4.免疫组织化学染色结果评价 (4) 5.免疫组织化学对照实验 (5) 6.免疫组织化学技术应用的基本原则……………………………….5,6 7.SABC法与其他免疫组织化学染色方法比较…………………….6,7 8.免疫组织化学技术疑难问题剖析………………………………….7,8 9.免疫荧光组织化学基本原理及荧光抗体再染色…………………8,9 10.非特异性荧光染色的消除 (9) 11.荧光显微镜的基本操作及注意事项……………………………..9,10 12.补体法免疫荧光组织化学染色步骤……………………………11,12 13.双重染色法免疫荧光组织化学染色步骤 (11) 14.间接法免疫荧光组织化学染色步骤 (12) 15.双重免疫荧光标记法 (13) 16.免疫荧光组织化学直接法 (13) 17.免疫荧光组织化学间接法 (14)

1.常用于免疫荧光组织化学染色的荧光素 常用于免疫荧光组织化学染色的荧光素有:异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)、四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethyl rhodamine isothioeyanate,TRITC)、四乙基罗丹明(tetraethyl rhodamine B200,RB200)、得克萨斯红(Texas red)、藻红蛋白(phycoerythrin,PE)、花青类(cyanine,如Cy3、Cy5)等。此外还有一些新型荧光染料,如量子点。 (1)异硫氰酸荧光素(FITC):FITC性质稳定,易溶于水和乙醇,能与蛋白质结合,是检测组织细胞内蛋白质最常用的荧光探针。它还能标记抗体,可用于免疫组织化学单染或多重染色。缺点是在光照下易淬灭,易受自发荧光影响。最大激发光波长为490nm;最大发射光波长为525nm,呈现黄绿色荧光。 (2)四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC):该荧光素能与细胞内蛋白质结合,比FITC稳定性好,在生理条件下对pH值变化不敏感,荧光强度受自发荧光干扰小。最大激发光波长为550nm;最大发射光波长为 620nm,呈橙红色荧光,与FITC发出的黄绿色荧光对比鲜明,常用于免疫荧光组织化学双重染色。 (3)四乙基罗丹明(RB200):能与细胞内蛋白质结合,不溶于水,易溶于乙醇和丙酮,性质稳定,可长期保存,广泛应用于双标记示踪染色。最大激发光波长为570nm,最大发射光波长为595-600nm,呈橙红色荧光。 (4)花青类染料:常用的有Cy3、Cy5等,能与细胞内蛋白质结合。这类染料的荧光特性与传统荧光素 类似,但水溶性和对光稳定性较强,荧光量子产率较高,对pH等环境不敏感。常用于多重染色。Cy3最大激发光波长为570nm,最大发射光波长为650nm,呈绿色荧光。但是,在绿光光谱波长激发下,Cy3也可出现红色荧光。Cy5的最大激发光波长为649nm,最大发射光波长为680nm,呈红色荧光。由于Cy5的最大发射波长为680nm,很难用裸眼观察,而且不能使用高压汞灯作为理想的激发光源,因此,使用普通荧光显微镜时,不推荐使用Cy5。通常观察Cy5时需使用激光扫描共聚焦显微镜。 (5)乙酸甲酯:其本身不发荧光,但透膜进入细胞质后,在酯酶的作用下转变为具有荧光特性的乙酸甲酯。其激发光谱有pH依赖性,是使用最多的细胞内pH荧光指示剂。最大激发光波长为505nm,最大发射光波长为530nm,呈绿色荧光。 (6)Indo-1:是典型的双发射荧光探针。无钙时在485nm左右有发射峰,结合钙后,则在405nm处有发射峰,两者的比值与细胞内游离钙离子浓度成线性关系,将此比值与标准曲线相比即可得出细胞内游离钙浓度,因此,可利用此探针定量检测细胞内游离钙离子浓度。最大激发光波长为330/346nm,最大发射光波长为405/485nm,呈紫色(405nm)或青色(485nm)荧光。 (7)量子点(quantum dot):是近年来研制的一种新型荧光染料,又称半导体纳米晶体(semiconductor nanocrystal),是由几百或几千个纳米级颗粒构成的半导体材料,性质稳定,溶于水,细胞本身不能合成和组装。量子点具有荧光时间长、产生多种颜色、检测方便和应用范围广等优点。当某一波长的激发光对多种大小不同的量子点进行照射时,可以同时观察到多种颜色,因而可同时进行多个目标的观察和检测。量子点可与抗体、链霉亲和素等多种分子进行耦联,检测靶分子的分布和功能。

免疫细胞化学 (abcam新版指南)ICC-IMMUNOCYTOCHEMISTRY

IMMUNOCYTOCHEMISTRY (ICC) General Procedure: i Coat coverslips with polyethylineimine or poly-L-lysine for 1 hr at room temperature. ii Rinse coverslips well with sterile H2O (3 times 5 min each). iii Allow coverslips to dry completely and sterilize them under UV light for at least 4 hrs. iv Grow cells on glass coverslips or prepare cytospin or smear preparation. v Rinse briefly in phosphate-buffered saline (PBS). Fixation: 1. Fix the samples either in ice-cold methanol, acetone (1-10 min) or in 3-4% paraformaldehyde in PBS pH 7.4 for 15 min at room temperature. 2. Wash the samples twice with ice cold PBS. Permeabilization: If the target protein is expressed intracellularly, it is very important to permeabilize the cells. Note: acetone fixed samples do not require permeabilization. 3. Incubate the samples for 10 min with PBS containing 0.25% Triton X-100 (or 100 μM digitonin or 0.5% saponin). Triton X-100 is the most popular detergent for improving the penetration of the antibody. However, it is not appropriate for the use of membrane-associated antigens since it destroys membranes. 4. Wash cells in PBS three times for 5 min. Blocking and Incubation: 5. Incubate cells with 1% BSA in PBST for 30 min to block unspecific binding of the antibodies (alternative blocking solutions are 1% gelatin or 10% serum from the species that the secondary antibody was raised in). 6. Incubate cells in the diluted antibody in 1% BSA in PBST in a humidified chamber for 1 hr at room temperature or overnight at 4°C. 7. Decant the solution and wash the cells three times in PBS, 5 min each wash. 8. Incubate cells with the secondary antibody in 1% BSA for 1 hr at room temperature in dark. 9. Decant the secondary antibody solution and wash three times with PBS for 5 min each in dark. Counter staining: 10. Incubate cells on 0.1-1 μg/ml Hoechst or DAPI (DNA stain) for 1 min. 11. Rinse with PBS. Mounting: 12. Mount coverslip with a drop of mounting medium.

免疫细胞化学技术

免疫细胞化学技术 一、免疫细胞化学技术的概述 *免疫细胞化学(immunocytochemistry, ICC) -是利用抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定细胞内抗原的成分(主要是多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究,称为~。 (一) 对抗原和抗体的要求 *具有特异性高和亲和力强的抗体是实验成功的首要条件。 -对抗体的要求:纯度高、比活性强; *高度特异性抗体的获得,取决于抗原的纯度。 -对抗原的要求:纯度高,免疫原性强,稳定无变化。 (二) 抗原(antigen, Ag) *抗原的概念:凡是在机体内引起体液免疫和(或)细胞免疫反应的物质,称为抗原。抗原具有两个方面的特性: -免疫原性:引起机体产生抗体和(或)致敏淋细胞的特性; -免疫反应性:抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特性。 *根据抗原是否显示免疫原性分为: -完全抗原:分子量较大,一般在10kDa以上,并具有较复杂的化学组成。 *免疫原性最强的是蛋白质抗原,多糖次之;脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。 -半抗原:又称为不完全抗原,分子量较小。例如:某些短肽、多糖、类脂和药物等。 *半抗原必需与载体结合,才能获得免疫原性。 载体 *通常是具有高度免疫原性的大分子物质,具有将免疫原性传递给耦联的半抗原能力。 -常用的载体有钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、卵白蛋白(Ovalbumin,OV A)等。 -用戊二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团-NH2、-COOH等将半抗原结合到载体上。结合比例为5kDa结合5~25个分子的小肽。 (三)抗体(antibody, Ab) 1、抗体的概念: *机体受到抗原刺激后,由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白,被称为抗体。 -抗体主要存在于血清内; -抗体都是免疫球蛋白,但免疫球蛋白并不一定都是抗体。 -免疫球蛋白根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种,既IgG、IgD、IgE、IgA、IgM。 2、免疫组化实验中常用的抗体:单克隆抗体和多克隆抗体。 *单克隆抗体:是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体,是应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备的。 -特异性强、抗体产量高。 *多克隆抗体:是将纯化后的抗原直接免疫动物后,从动物血中所获得的免疫血清,是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。 -特异性低,会产生抗体的交叉反应。

免疫细胞化学技术题库9-2-10

免疫细胞化学技术题 库9-2-10

问题: [单选,A1型题]应用尚无文献报道的抗血清或自己制备的抗血清进行免疫酶组织细胞化学染色时,必须设置的对照是() A.交叉实验 B.替代实验 C.吸收实验 D.置换实验 E.阳性对照

问题: [单选,A1型题]可引起免疫酶组织化学染色假阳性的是() A.组织内待检抗原过多 B.内源性过氧化物酶丰富 C.洗液用TBS缓冲液 D.抗体浓度过低 E.抗体特异性高

问题: [单选,A1型题]免疫酶组织化学染色中过氧化氢液的作用是() A.提高抗原抗体的识别能力 B.减少内源性过氧化酶的活性 C.修复抗原 D.提高敏感性 E.激活抗原 https://www.wendangku.net/doc/f813780020.html,/ 月子病

问题: [单选,A1型题]ABC法的基本原理是() A.利用抗卵白素分别连接卵白素标记的第二抗体和卵白素标记的酶来检测组织和细胞中的抗原 B.利用抗卵白素分别连接卵白素标记的第一抗体和卵白素标记的酶来检测组织和细胞中的抗原 C.利用抗生物素分别连接生物素标记的第二抗体和生物素标记的酶来检测组织和细胞中的抗原 D.利用抗生物素分别连接生物素标记的第一抗体和生物素标记的酶来检测组织和细胞中的抗原 E.利用抗地高辛分别连接生物素标记的第一抗体和生物素标记的酶来检测组织和细胞中的抗原

问题: [单选,A1型题]BRAB法的基本原理是() A.用生物素标记抗体,然后与生物素和酶形成复合物 B.用生物素分别标记抗体和酶,然后以抗生物素为桥,把两者连接起来 C.用卵白素标记抗体,然后与卵白素和酶形成复合物 D.用卵白素分别标记抗体和酶,然后以抗卵白素为桥,把两者连接起来 E.用亲和素分别标记抗体和酶,然后以抗亲和素为桥,把两者连接起来

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