紫外线诱变育种
紫外线诱变选育α-淀粉高产菌株
一、实验目的
1.学习菌种的物理因素诱变育种基本技术。
2.通过诱变技术筛选出高产ɑ-淀粉酶的菌株。
二、实验原理
紫外线是一种最常用有效的物理诱变因素，其诱变效应主要是由于它引起DNA结构的改变而形成突变型。紫外线诱变，一般采用15W或30W紫外线灯，照射距离为20-30cm，照射时间依菌种而异，一般为1-3min，死亡率控制在50％-80％为宜。被照射处理的细胞，必须呈均匀分散的单细胞悬浮液状态，以利于均匀接触诱变剂，并可减少不纯种的出现。同时，对于细菌细胞的生理状态则要求培养至对数期为最好。本实验以紫外线处理产淀粉酶的枯草杆菌，通过透明圈法初筛，选择淀粉酶活力高的生产菌株。
三、实验材料
1.菌种产淀粉酶枯草芽孢杆菌
2.器材装有15W或30W紫外灯的超净工作台、电磁力搅拌器（含转子）、低速离心机、培养皿、涂布器、10m L离心管、（1、5、10m L）吸管、250m L三角瓶、恒温摇床、培养箱、直尺、棉签、橡皮手套、洗耳球
3.培养基和试剂
①无菌水、75%酒精
②0.5％碘液碘片1g、碘化钾2g、蒸馏水200m L，先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘片全部溶解后，加足水即可。
③选择培养基可溶性淀粉2g，牛肉膏1g，N a C l0.5g，琼脂2g，蒸馏水100m L，p H6.8～
7.0，121℃灭菌20m i n。
④肉汤培养基牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，N a C l0.5g，蒸馏水100m L，p H7.2～7.4，121℃灭菌20m i n。
四、实验步骤
1.菌体培养取枯草芽孢杆菌一环接种于盛有20m L肉汤培养基的250m L三角瓶中，于37℃振荡培养12h，即为对数期的菌种。
2.菌悬液的制备取5m L发酵液于10m L离心管中，以3000r/m i n离心10m i n，弃去上清液。加入无菌水9m L，振荡洗涤，离心10m i n，弃去上清液。加入无菌水9m L，振荡均匀。
3.诱变处理将菌悬液倾于无菌培养皿中（内放一个磁力搅拌棒），置电磁力搅拌器上于超净工作台紫外灯下（距离30c m）照射0.5-1m i n。
4.取0.1-0.2m L诱变后菌悬液于选择培养基平板上，用涂布器涂匀。置37℃暗箱培养48h。
5.在长出菌落的周围滴加碘液，观察并测定透明圈直径（C）和菌落直径（H），挑选C/H
值最大者接入斜面保藏。
五、注意事项
1.紫外线对人体的细胞，尤其是人的眼睛和皮肤有伤害，长时间与紫外线接触会造成灼伤。故操作时要戴防护眼镜，操作尽量控制在防护罩内。
2.空气在紫外灯照射下，会产生臭氧，臭氧也有杀菌作用。臭氧过高，会引起人不舒服，同时也会影响菌体的成活率。臭氧在空气中的含量不能超过0.1％-1％。
六、结果与讨论
1.利用紫外诱变育种，应注意哪些因素?
2.为什么诱变育种后要挑选C/H值最大者接入斜面保藏?
发酵工业是利用某种特定的微生物在一定的环境中进行新陈代谢，从而获得某种产品。现代发酵工业要求纯种培养，不仅斜面、种子和培养基以及发酵罐、管道等须经严格灭菌除去各种杂菌，而且在需氧发酵中通入的空气也需经过除菌处理。只有这样，才能确保生产不受杂菌污染，从而保证生产菌的旺盛生长。染菌的结果，轻者影响产量或产品质量，重者导致倒罐，甚至停产。工业发酵中污染杂菌造成的损失是十分惊人的，所以必须认真对待除菌。
发酵时感染杂菌，可引起下列后果：
1) 产生菌和杂菌同时在培养基中生长，结果丧失了生产能力；
2) 在连续发酵过程中，杂菌的生长速度有时会比产生菌生长得更快，结果使发酵罐中以杂菌为主了；
3) 杂菌会污染最终产品，如生产单细胞蛋白时，从发酵液中分离出的细胞夹杂有杂菌；
4) 杂菌所产生的物质，使目的产物的提取发生困难；
5) 杂菌降解了所需要的产物；
6) 发酵时如污染噬菌体，可使产生菌发生溶菌现象。
二染菌的检查、原因分析和防治措施
1 染菌的检查与判断
1) 显微镜检查：通常用革兰氏染色法。先用低倍镜观察生产菌的特征，然后再用高倍镜观察是否有杂菌存在。根据生产均与杂菌的特征区别，判断是否染菌。必要时，可进行芽孢染色和鞭毛染色。
2) 平板划线培养或斜面培养检查法
3) 肉汤培养检查法：此法常用于检查培养基和无菌空气是否带菌，也可用于噬菌体检查，此时使用生产菌作为指示菌。
此外，还可以从发酵过程的异常现象来判断是否染菌，如溶解氧、pH值、排气中CO2含量和菌体酶活力等变化来判断。
2 发酵染菌率和染菌原因分析
发酵染菌率：指一年内发酵染菌的批数与总投料发酵批数之比。发酵染菌率是在发酵罐中发生的染菌率，种子罐培养时发生的染菌若不接入发酵罐、不导致发酵染菌的不在计算之列。
由于各种发酵的菌种、培养基、产品性质、发酵周期、生产环境条件、设备和管理技术水平等不同，染菌率有很大差别。
3 杂菌污染途径及预防
杂菌污染途径及预防
1) 种子带菌。原因主要有：培养基及用具灭菌不彻底；菌种在移接过程中受污染；菌种在培养或保藏过程中受污染等。
2) 无菌空气带菌。杜绝无菌空气带菌，必须从空气净化流程和设备的设计、过滤介质的选用和装填、过滤介质的灭菌和管理等方面完善空气净化系统。
3) 培养基和设备灭菌不彻底导致染菌。原因主要有：原料性状影响灭菌效果；实罐灭菌时未能充分排出罐内空气；培养基连续灭菌时，蒸汽压力波动大，培养基未达到灭菌温度，导致灭菌不彻底而污染；设备、管道存在“死角”。
4) 设备渗漏引起染菌。发酵设备、管道、阀门、的长期使用，由于腐蚀、磨擦和振动等原因，往往造成渗漏。
5) 操作失误和技术管理不善也会引起染菌。如移种时或发酵过程罐内压力跌零，使外界空气进入而染菌；泡沫顶盖而造成污染；压缩空气压力突然下降，使发酵液倒流入空气过滤器而造成污染等等。
对噬菌体的防治措施
1) 定期检查噬菌体并采取有效措施消灭噬菌体。当发酵生产中已经发现了噬菌体的危害后，应立即在车间的各个工段及发酵罐的空气过滤系统、发酵液和排气口、污水排放处以及车间周围的环境中进行取样检测，从中找出噬菌体较集中的地方继而采取相应的措施。如对种子室和摇床间可采用甲醛熏蒸及紫外线处理的方法消灭噬菌体和杂菌。对常用器皿及发酵罐体表面，可采用新洁而灭及石炭酸溶液喷雾或擦洗。发酵系统则可采取改进空气过滤装置和蒸汽灭菌的方法。
2) 检查生产系统，消除各种不安全因素。在发酵生产中，当连续发生噬菌体污染后，往往在空气过滤装置及发酵罐底部、内壁、夹层以及管道和阀门接口等处容易存在蒸汽不能直接进入灭菌的死角，必须及早查出隐患，定期更换空气过滤器中过滤材料并改进工艺和设备，杜绝发酵液中的活菌和可能存在的噬菌体向周围的环境排放，彻底消除各种不安全因素，保证生产的正常进行。
3) 选育抗噬菌体菌株和轮换使用生产菌株。选育抗噬菌体菌株是一种有效的手段，所获得的抗性菌株既要有较全面的抗性，并能保持原有的生产能力。对有的菌种在选育中很难做到既有抗性又能保持原有的生产能力。在可能情况下，针对噬菌体对侵染寄主具有专一性的特点，采用轮换使用生产菌株的方法，也可防止噬菌体的蔓延和危害，使生产得以正常进行。
4) 应急的挽救措施。在发酵生产中发现了噬菌体污染时，首先必须取样检查，并根据各种异常现象作出正确的判断，尽可能快地采取相应的挽救措施。常用的应急方法有以下几种：
①加入少量药物用以阻止噬菌体吸附或抑制噬菌体蛋白质的合成及增殖。前者多系螯合剂如草酸及柠檬酸等；后者是一些抗生素，仅适用于耐药的生产菌株，由于成本较高，无法在较大的发酵罐中使用。
②当生产进行中污染了噬菌体时，可补入适量的新鲜发酵培养基或促使菌种生长的生长因子（如玉米浆、酵母膏等），有利于菌种生长，抑制噬菌体的增殖，使发酵得以顺利进行。
③大量补接种子液或重新接种抗性菌种培养液，以便继续发酵制终点，防止倒灌，尽可能地减少因噬菌体污染所造成的损失。在补种之前也可对已感染了噬菌体的的发酵液低温灭菌。
第十一章工业发酵染菌的防治
第一节发酵染菌的危害
发酵染菌能给生产带来严重危害，防止杂菌污染是任何发酵工厂的一项重要工作内容。尤其是无菌程度要求高的液体深层发酵，污染防止工作的重要性更为突出。
所谓“杂菌”，是指在发酵培养中侵入了有碍生产的其他微生物。
几乎所有的发酵工业，都有可能遭受杂菌的污染。染菌的结果，轻者影响产量或产品质量，重者可能导致倒罐，甚至停产。
一，染菌对不同品种发酵的影响
青霉素
疫苗
柠檬酸
谷氨酸
肌苷、肌苷酸
酶制剂
二，不同种类的杂菌对发酵的影响
青霉素发酵：污染细短产气杆菌比粗大杆菌的危害大
链霉素发酵：污染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌比粗大杆菌的危害大四环素发酵：污染双球菌、芽孢杆菌和夹膜杆菌的危害较大
柠檬酸发酵：最怕污染青霉菌
肌苷、肌苷酸发酵：污染芽孢杆菌的危害最大
谷氨酸发酵：最怕污染噬菌体
高温淀粉酶发酵：污染芽孢杆菌和噬菌体的危害较大
三，不同染菌时间对发酵的影响
1，种子培养期染菌
菌体浓度低、培养基营养丰富
2，发酵前期染菌
杂菌与生产菌争夺营养成分，干扰生产菌的繁殖和产物的形成
3，发酵中期染菌
严重干扰生产菌的繁殖和产物的生成
4，发酵后期染菌
如杂菌量不大，可继续发酵。如污染严重，可采取措施提前放罐
四，不同染菌途径对发酵的影响
种子带菌：种子带菌可使发酵染菌具有延续性
空气带菌：空气带菌也使发酵染菌具有延续性，导致染菌范围扩大至所有发酵罐
培养基或设备灭菌不彻底：一般为孤立事件，不具有延续性
设备渗漏：这种途径造成染菌的危害性较大
五，染菌对产物提取和产品质量的影响
1，对过滤的影响
发酵液的粘度加大；菌体大多自溶；由于发酵不彻底，基质的残留浓度加度。造成过滤时间拉长，影响设备的周转使用，破坏生产平衡；大幅度降低过滤收率。
2，对提取的影响
（1）有机溶剂萃取工艺：染菌的发酵液含有更多的水溶性蛋白质，易发生乳化，使水相和溶剂相难以分开
（2）离子交换工艺：杂菌易粘附在离子交换树脂表面或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交换量
3，对产品质量的影响
（1）对内在质量的影响：染菌的发酵液含有较多的蛋白质和其它杂质。对产品的纯度有较大影响。
（2）对产品外观的影响：一些染菌的发酵液经处理过滤后得到澄清的发酵液，放置后会出现混浊，影响产品的外观。
六，染菌对三废处理的影响
使过滤后的废菌体无法利用，发酵染菌的废液，生物需氧量（BOD）增高，增加三废治理费用和时间。
七，发酵染菌的危害
1，直接经济损失
2，间接经济损失
第二节发酵过程中染菌的检查判断
一，杂菌的检查方法
借助适当的方法，才能正确而及时地发现发酵过过程是否污染杂菌和染菌的原因与途径。检查杂菌的方法，要求淮确可靠和快速，这样才能在短时间内获得效果。
目前生产上常用的检查方法有：①显微镜检查；②平板划线检查；③肉汤培养检查。
判断发酵是否染菌应以无菌试验结果为根据。
无菌试验的目的：
（1）监测培养基、发酵罐及附属设备灭菌是否彻底
（2）监测发酵过程中是否有杂菌从外界侵入
（3）了解整个生产过程中是否存在染菌的隐患和死角
二，各种检查方法的比较
3种方法各有优缺点，显微镜检查方法简便、快速，能及时发现杂菌，但由于镜捡取样少，视野的观察面也小，因此不易捡出早期杂菌。平板划线法的缺点是需经较长时间培养(一般要过夜)才能判断结果，且操作较繁琐，但它要比显微镜能捡出更少的杂菌。
三，杂菌检查中的问题
1，检查结果应以平板划线和肉汤培养结果为主要根据
2，平板划线和肉汤培养应做三个平行样
3，要定期取样
4，酚红肉汤和平板划线培养样品应保存至放罐后12小时，确定为无菌时方可弃去
5，取样时防止外界杂菌混入的措施
四，检查的工序和时间
选择那些生产工序和时间的样品检查也是十分重要的问题。科学合理的选择检查工序和时间，对于除去已污染杂菌的物料，避免下道工序再遭染菌，有着直接的指导意义。有时即使由于检查时间较长，未能及时据导本批生产，但对于找出造成染菌事故的环节，分析染菌原因，杜绝染菌漏洞也是不可缺少的。
由于生产菌种相产品的不同，检查的时间也不完全一样：但总的原则是一致的，即每个工序或经一定时间都应进行取样检查。
检查的一般时间或工序见下表。
发酵过程的杂菌检查
除了以上的方法外，在实际生产中还可以根据pH值、尾气中CO2含量和溶解氧等参数的异常变化来判断是否染菌。
第三节发酵染菌率和染菌原因的分析
发酵染菌能给生成带来严重危害，防止杂菌污染是任何发酵工厂的一项重要工作内容。尤其是无菌程度要求高的液体深层发酵，污染防止工作的重要性更为突出。发酵设备、空气除菌系统和培养基灭菌系统等的有关设备以及管道的配置都必须严格符合无菌要求。如果设备结构和管道配置不合理，制造、安装不注意或在发酵过程中操作不慎就会使发酵液污染杂菌，导致产量下降甚至得不到产品。在发酵前期或中期染菌，杂菌会很快消耗掉营养物质，使生产菌无法正常生长而引起倒罐。在发酵后期染菌，虽然没有早期或中期染菌的影响大，一般会使产率下降并影响产物的提取，但如核苷酸等某些产品的发酵即使在后期染菌，也会使发酵产物被所染杂菌迅速消耗掉而得不到产品。因此，染菌问题是影响产率和后工序操作的主要因素之一，必须予以重视。认为染菌是不可避免的，这是一种错误看法。“决定的因素是人不是物”。只要我们思想上重视，对各个因素和环节周密考虑、严格掌握，是完全可以避免和减少污染的。
本节将根据以往工厂中发生染菌事故的经验教训来分析发酵系统中染菌的原因，来认识整个发酵过程中可能造成污染的各种途径并提出相应的防治措施。由于发酵生产的连贯性强，在整个生产过程中各个环节的污染问题都不能忽视，所以本章除了着重讨论发酵设备方面的污染防止问题外，对于培养种子设备的要求和有关操作方法也作一般介绍。
一、发酵染菌率
1，总染菌率：指一年内发酵染菌的批次与总投料批次数之比乘以100得到的百分率。
2，设备染菌率：统计发酵罐或其他设备的染菌率，有利于查找因设备缺陷而造成的染菌原因。
3，不同品种发酵的染菌率：统计不同品种发酵的染菌率，有助于查找不同品种发酵染菌的原因。
4，不同发酵阶段的染菌率：将整个发酵周期分成前期、中期和后期三个阶段，分别统计其染菌率。有助于查找染菌的原因。
5，季节染菌率：统计不同季节的染菌率，可以采取相应的措施制服染菌。
6，操作染菌率：统计操作工的染菌率，一方面可以分析染菌原因，另一方面可以考核操作工的灭菌操作技术水平。
二、染菌原因的分析
避免在发酵生产中污染杂菌应以预防为主。“防重于治”，事前防止胜于事后
挽救。如果一旦发生染菌现象就要尽快找出原因及时纠正、堵塞漏洞才能减少损失，并从中吸取经验教训，避免以后有类似情况发生，保持生产的正常进行。但在发酵生产中，往往因为生产过程的环节很多，同时各工厂的生产设备、产品种类和管理措施不尽相同，引起染菌的原因比较复杂，有时不能及时找出而耽误了生产。如果原因一经查出，解决的办法还是比较容易和迅速的。所以，我们必须善于透过现象看本质，对染菌的情况作具体分析，不致盲目寻找而耽误了时间，也不致于将染菌的真正原因遗漏而造成连续染菌事故。下面根据发酵工厂的生产经验，从一般染菌的现象来分析引起染菌的可能原因。
1，国外一抗生素发酵染菌原因的分析
染菌原因百分率（%）染菌原因百分率（%）
种子带菌
接种时罐压跌零培养基灭菌不透空气系统带菌搅拌轴密封泄漏泡沫冒顶
夹套穿孔
9.64
0.19
0.79
19.96
2.09
0.48
12.36
蛇管穿孔
接种管穿孔
阀门泄漏
罐盖漏
其他设备漏
操作问题
原因不明
5.89
0.39
1.45
1.54
10.13
10.15
24.91
2，国内一制药厂发酵染菌原因的分析
染菌原因百分率（%）
外界带入杂菌（取样、补料带入）设备穿孔
空气系统带菌
停电罐压跌零
接种
蒸汽压力不够或蒸汽量不足
管理问题
操作违反规程
种子带菌
原因不明
8.20 7.60 26.00 1.60 11.00 0.60 7.09 1.60 0.60 35.00
上述资料是国内外抗菌素生产中统计了多年生产中发生染菌现象的各种原因所占的百分比，今列出以供参考。从发酵工厂的生产经验来看，染菌原因是以设备渗漏和空气系统的染菌为主，其他则次之。
3，从染菌的规模来分析染菌原因
（1）大批发酵罐染菌
整个工厂中各个产品的发酵罐都出现染菌现象而且染的是同一种菌，一般来说，这种情况是由使用的统一空气系统中空气过滤器失效或效率下降使带菌的空气进入发酵罐而造成的。大批发酵罐染菌的现象较少但危害极大。所以对于空气系统必须定期经常检查。
（2）分发酵罐(或罐组)染菌
生产同一产品的几个发酵罐都发生染菌，这种染菌如果出现在发酵前期可能是种子带杂菌，如果发生在中后期则可能是中间补料系统或油管路系统发生问题所造成的。通常同一产品的几个发酵罐其补料系统往往是共用的，倘若补料灭菌不彻底或管路渗漏，就有可能造成这些罐同时发生染菌现象。另外，采用培养基连续灭菌系统时，那些用连续灭菌进料的发酵罐都出现染菌，可能是连消系统灭菌不彻底所造成的。
（3）个别发酵罐连续染菌和偶然染菌
个别发酵罐连续染菌大多是由设备问题造成的，如阀门的渗漏或罐体腐蚀磨损，特别是冷却管的不易觉察的穿孔等。设备的腐蚀磨损所引起的染菌会出现每批发酵的染菌时间向前推移的现象，即第二批的染菌时间比第一批提早，第三批又比第二批提早。至于个别发酵罐的偶然染菌其原因比较复杂，因为各种染菌途径都可能引起。
4，从染菌的时间来分析
发酵早期染菌，一般认为除了种子带菌外，还有培养液灭菌或设备灭菌不彻底所致，而中、后期染菌则与这些原因的关系较少，而与中间补料、设备渗漏以及操作不合理等有关。
5，从染菌的类型来分析
所染杂菌的类型也是判断染菌原因的重要依据之一。一般认为，污染耐热性芽抱杆菌多数是由于设备存在死角或培养液灭菌不彻底所致。污染球菌、酵母等可能是从蒸汽的冷凝水或空气中带来的。在检查时如平板上出现的是浅绿色菌落(革兰氏阴性杆菌)，由于这种菌主要生存在水中，所以发酵罐的冷却管或夹套渗漏所引起的可能性较大。污染霉菌大多是灭菌不彻底或无菌操作不严格所致。
综上所述，引起染菌的原因很多。“世界上的事情是复杂的，是由各方面的因素决定的。”我们不能机械地认为某种染菌现象必然是从某一途径引起的，应该把染菌的位置、时间和杂菌的类型等各种现象加以综合分析，才能正确判断从而采取相应的对策和措施。
第四节发酵染菌的防止
一、种子带菌的原因及防止
1，带菌的原因
（1）无菌室的无菌条件不符合要求；
（2）培养基灭菌不彻底；
（3）操作不当。
2，种子带菌的防止
种子带杂菌是发酵前期染菌的原因之一。在每次接种后应留取少量的种子悬浮液进行平板、肉汤培养，借以说明是否是种子中带杂菌。种子培养的设备和装置有无菌室、灭菌锅和摇瓶机等。
（1）无菌室
接种、移种等无菌操作需要在无菌室内进行。无菌室面积不宜过大，一般约4~6米2高约2.6米。为了减少外界空气的侵入，无菌室要有1~3个套间(缓冲过道)(参照下图)。无菌室内部的墙壁、天花板要涂白漆或采用磨光石子，要求无裂缝，墙角最好做成圆弧形，便于揩擦清洗以减少空气中微生物的潜伏场所，室内布置应尽量简单，最好能安装空气调节装置，通入无菌空气并调节室内的温湿度。无菌室的每个套间一般都用紫外线灭菌。通常用30瓦紫外线灭菌灯照射20~30分钟即可。紫外线杀菌的效率还与室内空气的性质有关；空气温度高杀菌效率高，空气中灰尘多杀调效率低，而相对湿度高则紫外线灯的使用寿命长。紫外线能穿过石英但不能透过玻璃。
无菌室的立视图
配合使用的化学灭菌药剂有：用作喷洒或揩擦的(以揩擦为主)有75%酒精、0.25%新洁而灭(季胺盐)、0.6~1%漂白粉、0.5%石炭酸、0.5%过氧乙酸、1%煤酚皂(来苏尔)、0.5%高锰酸钾、300单位/毫升土霉素、50单位/毫升制霉菌素等；用作熏蒸的有甲醛(每立方米空间约用10毫升)或硫磺(每立方米空间约用2~3克)。要根据不同情况采用不同的灭菌剂。如检查出无菌室中潜伏的微生物中细菌较多，用石炭酸、土霉素等灭菌较好；如无菌室中霉菌多可以采用制霉菌素；如有噬菌体则用甲醛、双氧水或高锰酸钾等较好。
无菌室内无菌度的要求是：把无菌培养皿平板打开盖子在无菌室内放置30
分钟，根据一般工厂的经验，长出的菌落在3个以下为好。
在种子的无菌条件不要求很高的情况下，可以不采用无菌室而直接用无菌箱进行操作，但无菌要求很高的情况下，即使在无菌室内还要用无菌箱操作。
无菌室的利用次数要恰当，每次使用时间也不宜过长。用具要经蒸汽灭菌或用灭菌剂揩擦后才能带入使用。
（2）灭菌锅
灭菌锅是一种压力容器，作为培养种子及小型试验用具的灭菌之用，有立式和卧式两种。灭菌操作时需要注意排气管是否畅通，因为灭菌锅的排气管较小，易被铁锈或瓶子破碎后的培养基等所堵塞。如果排气管不道，锅内空气排不出去形成气团，蒸汽就不易渗入，从而使灭菌不彻底。用某种较耐热的芽抱杆菌进行试验证明：在排气不通畅的情况下，以1公斤/厘米2的蒸汽压力经30分钟灭菌后进行检查，发现某些部位的三角瓶中，灭菌前放入的芽抱杆菌没有被杀死。如果不是采用蒸汽而是用锅内烧水的办法进行灭菌，那末排气的时间更要长一些，不然水蒸汽来不及驱出空气而使被灭菌的瓶中的冷空气排不尽。
通入蒸汽后使瓶内培养基温度达到121oC所需的时间与瓶内培养基的体积有关，其试验结果见下表。
通入表压为1公斤／厘米2的蒸汽时，三角瓶中培养基的体积与升温时间的关系
实际上，使用蒸汽的压力一般大于1公斤/厘米2，所以上表的数据仅供对照参考，但根据上表的试验结果可以说明培养基体积与升温时间的关系。
（3）摇瓶机
摇瓶机(亦称摇床)是培养好气菌的小型试验设备或作为种子扩大培养之用，常用的摇瓶机有往复式(图7-2)和旋转式(图7-4)两种。往复式摇瓶机的往复频率一般在80~140次／分，冲程一般为6~14厘米，如频率过快、冲程过大或瓶内液体装料过多，在摇动时液体要溅到包瓶口的纱布上易引起染菌，特别是启动时更易发生这种情况。
旋转式摇瓶机的偏心距一般在3~6厘米之间，旋转次数为60~300转／分。
放在摇瓶机上培养瓶中发酵液所需的氧是由室内空气经瓶口包扎的纱布(一般是八层)或棉塞通入的，所以氧的传递与瓶口的大小，瓶口的几何形状和棉塞或纱布层的厚度和密度有关。在通常情况下，摇瓶的氧吸收系数(亚硫酸氧化值)K d取决于摇瓶机的特性和三角瓶的装料量，见表7-2。
往复式摇瓶机(图7-2)是利用曲柄原理带动摇床作往复运动，机身为铁制或木制的长方形框子，有一层至三层托盘，托盘上开有圆孔备放培养瓶，孔中凸出一
三角形橡皮，用以固定培养瓶并减少瓶的震动，传动机构一般采用二级皮带轮减速，调换调速皮带轮可改变往复频率。偏心轮上开有不同的偏心孔，以便调节偏心距。往复式摇瓶机的频率和偏心距的大小
对氧的吸收有明显的影响。据有关文献报导，当冲程为10厘米、往复频率为200次/分，K d值可达2.41毫克分子氧/升，分，大气压；当冲程为5厘米、往复频率240次/分时，K d值可达1.25毫克分子氧/升，分，大气压。
根据支承装置结构不同，往复式摇瓶机分为滚轮式和悬挂式两种。滚轮式摇瓶机是将摇床置于四个滚轮上，悬挂式摇瓶机(图7-3)是用四条吊杆将摇床吊在机架上，结构较为简单，托盘可装至三层以上，能放5~10升甚至更大的瓶，动力消耗较少。但悬挂式摇瓶机如为多层时，每层的冲程不一样，越是上层冲程越小。故使用多层悬挂式摇瓶机时应予注意。
旋转式摇瓶机是利用旋转的偏心轴使托盘摆动，托盘有一层或两层，可用不锈钢板、铜板、塑料板或木板制造。托盘由三根呈等边三角形分布的偏心轴支承，也有用滚动轴承作支承的。在三个偏心轴上装有螺栓可调节上下，使托盘保持水平。此种摇瓶机结构比较复杂，加工安装要求比往复式高，造价也较贵。其优点是氧的传递较好，功率消耗小，培养基不会溅到瓶口的纱布上。
有关文献报导，采用旋转式摇瓶机，对于300毫升或600毫升的三角瓶，当转数在500转/分和具有各种挡板条件下，与实装培养液10升具有六叶涡轮搅拌器的实验型发酵罐（通风率0.6米vvm；1000转/分)的K d值一样。所以摇瓶机将成为放大发酵试验过程中的一种更有效的工具。
二、发酵设备、管件的渗漏与配置
设备和管件的渗漏一般是指设备和管件由于腐蚀、内应力或其他原因形成微小漏孔所发生的渗漏现象。这些漏孔很小，特别是不锈钢材料形成的漏孔更小，有时肉眼不能直接觉察，需要通过一定的试漏方法才能发现。
（一）发酵罐的渗漏
1，冷却管的渗漏
由于发酵液具有一定的酸度和含有某些腐蚀性强的物质(如亚硫酸盐、硫酸铵等)冷却钢管很易受到腐蚀。发酵液中含有固体物料时，固体物料因搅拌桨的搅动与冷却管摩擦而引起管外壁磨损。管内冷却介质一般为井水或自来水，因水的化学成分和流动时的冲击以及加热时蒸汽冲击的影响，管内壁也会引起腐蚀及磨损。所以冷却管是发酵罐中最容易渗漏的部件之一。而最易穿孔的部分是冷却列管的弯曲处，原因是弯曲处外壁减薄和加热煨弯时使材料的性质有所改变所致。冷却水的压力通常大于罐压，如果有微孔，冷却水就会进入发酵液而引起染菌。
检查列管有否渗漏，在漏孔极其微小时是不易发现的。需要将管外壁的污垢铲除后，将管子烘干，管内加水压，才能发现渗漏的部位。管子与罐体的连接方式有两种：法兰联接和焊接。法兰虽然易于拆卸更换，但联接处有垫片易渗漏，而焊接则无此种现象。为了及早发现漏孔予以排除，冷却管要定期检查作渗漏试验。
试漏方法有两种：气压试验和水压试验。水压试验是用手动泵或试压齿轮泵
将水逐渐压入冷却管，泵到一定压力时，观察管子有否渗漏现象。气压法是先在发酵罐内放满清水，用压缩空气通入管子，观察水面有无气泡产生以确定管子有否渗漏和渗漏的部位。气压法快速方便，但管子下部弯曲处积水不易排尽，有漏孔时不产生气泡就难以发现。采用不锈钢制造的冷却管，耐腐蚀情况比普通钢管要好得多，产生漏孔的机会也比普通钢管少。但如加工时不符合不锈钢材料加工的技术要求(如热处理，焊条牌号的选择及焊接工艺等)，就会改变不锈钢材的结晶组织，发生危害较严重的晶间腐蚀现象。
2，罐体的穿孔
浸没在液体中的罐体部分都有可能发生腐蚀穿孔，特别是罐底，由于管口向下的空气管喷出的压缩空气的冲击力以及发酵液中的固体物料在被搅动时对罐底发生摩擦，罐底极易磨损引起渗漏，这种磨损形式是钢板产生麻点般的斑痕，称为麻蚀。每年大修时需检查钢板减簿的程度。有夹套的发酵罐可在夹套内用水压或气压的试验方法检查罐壁有无渗漏。
有保温层的发酵罐，如果水经常渗入保温层并积聚在里面，罐外壁就产生不均匀的腐蚀现象，所以当保温层有裂缝和损坏时，应及时修补。
（二）管件的渗漏
与发酵罐相连接的管路很多，有空气、蒸汽、水、物料、排气、排污等管路，管路多，相应的管件和阀门也多。管道的连接方式、按装方法以及选用的阀门形式对防止污染有很大的关系。所以，与发酵有关的管路不能同一般化工厂的化工管路完全一样，而有其特殊的要求。
1，阀
据统计，因阀的渗漏引起的染菌占染菌率的比例很大，值得引起重视。与发酵罐直接连通的管道更应选用密封性较高的阀门。目前使用的大小阀门大多采用截止阀和橡胶隔膜阀。
（1）截止阀(图7-6)
阀体为横放的S形，阀座与阀心的接触面小，污物不易附在上面，但构造比较复杂，流体阻力较大。由于截止阀能很方便地调节流量，小型发酵罐上大多采用这种阀门。平面形紧密面的垫料采用橡胶或聚四氟乙烯，关闭后垫料与阀座紧紧地吻合，达到不漏的目的。阀心垫料需定期检查，损坏后立即调换。截止阀在使用中经常发生以下两个问题：
①阀心轧坏。物料中的硬质物或焊接施工后的焊渣以及螺钉零件等被带到阀内，当关闭时，阀心与阀座被上述坚硬物轧住，能将紧密面轧成凹凸不平的痕迹，就关不严密。
②填料的渗漏。操作时用扳手过分关紧，会使阀杆弯曲，弯曲后的阀杆不仅启动费力，并且使填料部分不紧密而引起渗漏，操作中需要注意。阀门在使用一
定时间后，阀杆磨损或填料损坏也会引起渗漏，就需要将填料压盖适当拧紧或更换填料。
（2）隔膜阀
隔膜阀的结构见图7-6。阀体内装有橡皮隔膜，用螺钉与阀芯连接，当阀杆作上下运动时就带动隔膜上升或下降。隔膜阀的制造要求不高，关键在于膜的性能，如采用橡皮隔膜阀，在一般情况下，对橡胶隔膜的要求是耐压4公斤/厘米2以上，耐温160℃以上，在压紧和放松时不变形。隔膜阀有以下优点：
1)严密不漏。2)无填料。3)阀结构为流线型，流量大，阻力小，无死角，无堆积物，在关闭时不会使紧密面轧坏。4)检修方便。但须定期检查隔膜有否老化及脱落。
2，管路的连接
管子的连接有螺纹连接、法兰连接和焊接三种。
(1)螺纹连接
螺纹连接需在管端铰出管螺纹，安装时在螺纹上涂以白漆并加麻丝(也有用聚四氟乙烯薄膜)作为填料，如密封要求高的可用石墨粉加少许机油作为填料，或用氧化铅甘油胶合剂更好。螺纹连接简单，但装拆较麻烦，为了便于装拆，要在管路上适当位置安装活接头(亦称“由宁”)，接头平面用石棉橡胶板或橡皮等作垫圈。由于管路受冷热和震动的影响，活接头的接口易松动，使密封面不能严密而造成渗漏。如在接种输液时，因液体快速流动造成局部真空，在渗漏处将外界空气吸入、空气中的菌就被带入发酵罐中而造成危害。所以，重要的管路连接大多采用法兰连接。
（2）法兰连接
法兰连接密封可靠，压力、温度和管径的适用范围大，但费用较高。
（3）焊接
焊接的方法比其他方法简便，而且密封可靠。所以空气灭菌系统、培养液灭菌系统和其他物料管路以焊接连接为好。但需经常拆卸的管路则不宜用焊接连接。
管路、管件的试漏一般在管路中通入压缩空气并在焊缝和连接处涂以肥皂水，如有肥皂泡发生，则表示此处有泄漏，需重新焊接或安装。
（三）管路的配置
1，排气管与下水管
发酵厂中若干发酵罐的排气管路大多汇集在一条总的管路上，以节约管材，
下水管亦然。但在使用中有相互串通，相互干扰的弊病，一只罐染菌往往会影响其他罐。排气管路的串通连接尤其不利于污染的防止。故对于排气和下水管路要考虑发酵的特点进行配置，对于容易染菌的场合还是以每台发酵罐具有独立的排气、下水管路为宜。倘若使用一根总的排气管时，必须选择较大直径的管子，保证排气下水通畅不致倒回到发酵罐内。
2，发酵罐的管路
图7-7表示发酵罐(带空气分过滤器)的水、蒸汽和物料管路的配置。如有自控和测量仪表，那末还应包括这些仪表所需的有关管路(图中末包括)。由于罐体和有关管路均需用蒸汽进行灭菌，所以要保证蒸汽能够达到所有需要灭菌的地区，对于某些蒸汽可能达不到的死角(如阀)要装设与大气相通的旁路(图中的小阀门)。在灭菌操作时，将旁路阀门打开，使蒸汽自由通过。接种、取样和加油等管路要配置单独的灭菌系统，使能在发酵罐灭菌后或在发酵过程中单独进行灭菌。
（四）发酵罐与管件的死角
所谓死角是指灭菌时因某些原因使灭菌温度达不到或不易达到的局部地区。发酵罐及其管路如有死角存在，则死角内潜伏的杂菌不易杀死，会造成连续染菌，影响生产的正常进行。现将经常出现死角的场合及形成死角的几种原因介绍如下：
1，法兰连接的死角
如果对染菌的概念了解不够，按照一般化工厂管路的常规加工方法来焊接和安装管道法兰就会造成死角。发酵工厂的有关管路要保持光滑、通畅、密封性好，以避免和减少管道染菌的机会。例如法兰与管子焊接时受热不匀使法兰翘曲密封面发生凹凸不平现象就会造成死角(图7-8c)。垫片的内圆比法兰内径大或比较小以及安装时没有对准中心也会造成死角(图7-8a、b)。
2，渣滓在罐底与用环式空气分布管所形成的死角
培养基中如果含有钙盐类及固形物，在发酵罐的搅拌功率较小和采用环式空气分布管的情况下，由于在灭菌时培养基得不到强有力的翻动，罐底会形成一层
1—2毫米甚至更厚的膜层(图7-9)。这种膜层具有一定程度的绝热作用，所以膜层下潜伏的耐热菌不易被杀死。对这种情况的发酵罐必须定期铲除罐底积垢。大的发酵罐，为了减少搅拌轴的摆动，罐底装有底轴承，轴承支架处也容易堆积菌体。如果在底轴承下增设一个小型搅拌桨就可以适当改善罐底积垢的情况(图7-10)。环式空气分布器在整个环管中空气的速度并不一致，靠近空气进口处流速最大，远离进口处的流速减小，当发酵液进入环管内，菌体和固形物就会逐渐堆积在远离进口处的部分形成死角，严重时甚至会堵塞喷孔(图7-11)。
发酵罐中除了上述容易造成死角的地区外，其他还有一些容易造成死角的地区，如挡板(或冷却列管)与罐身固定的支撑板周围和不能在灭菌时排气的百肠管，温度计接头等，对于这些地区每次放罐后的清洗工作应注意，经常检查。仔细清洗才能避免因死角而产生的污染事故。
3，不锈钢衬里的死角
某些有机酸的发酵对碳素钢有腐蚀时，小型发酵罐通常采用不锈钢制造。对于大型发酵罐，为了节约不锈钢材料起见，一般都采用不锈钢衬里的方法，即在碳钢制造的壳体内加衬一层薄的不锈钢板(厚约1~3毫米)。如果不锈钢衬里加工焊接不善，在钢板和焊缝处有裂缝，或在操作时不注意，使不锈钢皮鼓起后产生裂缝，发酵液就会通过裂缝进入衬里和钢板之间，窝藏在里面形成死角(图7~12)。不锈钢皮怎样会鼓起的呢？因为作为衬里的不锈钢皮较薄，在培养液分批灭菌或空罐灭菌时，发酵罐经加热后再行冷却，如果此时不及时通入无菌空气保持一定压力，那末会因蒸汽的突然冷凝体积减小而形成真空将衬里吸出，严重者造成破
微生物的诱变育种
微生物的诱变育种 作者：佚名来源：生物秀时间：2008-4-18 实验仪器大全实验试剂大全 一、实验目的和内容 目的：以紫外线诱变获得用于酱油生产的高产蛋白酶菌株为例，学习微生物诱变育种的基本操作方法。 内容：1．对米曲霉(Aspergills oryzae )出发菌株进行处理，制备孢子悬液。 2．用紫外线进行诱变处理。 3．用平板透明圈法进行两次初筛。 4．用摇瓶法进行复筛及酶活性测定。 二、实验材料和用具 米曲霉斜面菌种； 豆饼斜面培养基、酪素培养基、蒸馏水、0.5%酪蛋白； 三角瓶(300mL、500mL)、试管、培养皿(9cm)、恒温摇床、恒温培养箱、紫外照射箱、磁力搅拌器、脱脂棉、无菌漏斗、玻璃珠、移液管、涂布器、酒精灯。 三、操作步骤 (一)出发菌株的选择及菌悬液制备 1．出发菌株的选择可直接选用生产酱油的米曲霉菌株，或选用高产蛋白酶的米曲霉菌株。2. 菌悬液制备取出发菌株转接至豆饼斜面培养基中，30℃培养3～5d 活化。然后孢子洗至装有1mL 0.lmol/L pH6.0 的无菌磷酸缓冲液的三角瓶中(内装玻璃珠，装量以大致铺满瓶底为宜)，30℃振荡30min，用垫有脱脂棉的灭菌漏斗过滤，制成把子悬液，调其浓度为106～108 个/mL，冷冻保藏备用。 (二)诱变处理 用物理方法或化学方法，所用诱变剂种类及剂量的选择可视具体情况决定，有时还可采用复合处理，可获得更好的结果。本实验学习用紫外线照射的诱变方法。 1．紫外线处理打开紫外灯(30W)预热20min。取5mL 菌悬液放在无菌的培养皿(9cm)中，同时制作5 份。逐一操作，将培养皿平放在离紫外灯30cm(垂直距离)处的磁力搅拌器上，照射l min 后打开培养皿盖，开始照射，与照射处理开始的同时打开磁力搅拌器进行搅拌，即时计算时间，照射时间分别为15 s、30 s、l min、2 min、5 min。照射后，诱变菌液在黑暗冷冻中保存1～2h 然后在红灯下稀释涂菌进行初筛。 2．稀释菌悬液按10 倍稀释至10-6，从10-5和10-6中各取出0.lmL 加入到酪素培养基平板中(每个稀释度均做3 个重复)，然后涂菌并静置，待菌液渗入培养基后倒置，于30℃恒温培养2～3d。 (三)优良菌株的筛选 1. 初筛首先观察在菌落周围出现的透明圈大小，并测量其菌落直径与透明圈直径之比，选择其比值大且菌落直径也大的菌落40～50 个，作为复筛菌株。 2．平板复筛分别倒酪素培养基平板，在每个平皿的背面用红笔划线分区，从圆心划线至周边分成8 等份，1～7 份中点种初筛菌株，第8 份点种原始菌株，作为对照。培养48h 后即可见生长，若出现明显的透明圈，即可按初筛方法检测，获得数株二次优良菌株，进大摇瓶复筛阶段。3．摇瓶复筛将初筛出的菌株，接入米曲霉复筛培养基中进行培养，其方法是，称取麦秩85g，
诱变育种流程及紫外诱变育种的详细步骤
诱变育种流程及紫外诱变育 种的详细步骤 -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
诱变育种的一般步骤： 1.首先是天然菌种的选育： 调查研究及查阅充分的资料 ↓ 设计实验方案 ↓确定采集样品的生态环境 采样 ↓确定特定的增殖条件 增殖培养 确定特殊的选择培养基及可能的 定性或半定量快速检出法 平板分离 ↓ 原种斜面 ↓确定发酵培养基础条件 筛选 ↓ 初筛（1株1瓶） ↓ 复筛（1株3～5瓶） ↓结合初步工艺条件摸索 再复筛（1株3～5瓶） ↓ 3～5株 ↓ 单株纯种分离 生产性能试验 →毒性试验 菌种鉴定 2.诱变菌种：
出发菌株----菌种纯化(出发菌株性能测定)----制备斜面孢子----制备单孢子悬液(悬液进行活菌计数)----诱变剂处理(存活菌数的测定并计算存活率)----平板分离(测定变异率)----挑取变异菌落并移植至斜面上----初筛(初筛数据分析，生产性状的粗测)----斜面传代----复筛(复筛数据分析，精确测定生产性状)----变异菌株(菌株参数分析)----小型或中型投产试验----大型投产试验。 诱变育种应把握的主要原则有以下几点：1)选择简便有效的诱变剂。在选用理化因素作诱变剂时，在同样效果下，应选用最简便的因素；在同样简便的条件下，应选用最高效的因素。2)挑选优良的出发菌株。最好采用生产上已发生自变的菌株，选用对诱变剂敏感的菌株，选取有利于进一步研究或应用性状的菌株。4)处理单细胞或孢子悬液。单细胞悬液应均匀而分散，孢子、芽孢等应稍加萌发。5)选用合适的诱变剂量。一般正变较多出现在低剂量中，负变较多地出现在高剂量中。6)选用高效的筛选方法。 紫外线诱变育种： 紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为253- 265nm．灯与处理物的距离为30cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在70～80%为宜。 被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个/ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106～107个 /ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不
紫外线诱变育种
紫外线诱变选育α-淀粉高产菌株 一、实验目的 1.学习菌种的物理因素诱变育种基本技术。 2.通过诱变技术筛选出高产ɑ-淀粉酶的菌株。 二、实验原理 紫外线是一种最常用有效的物理诱变因素，其诱变效应主要是由于它引起DNA结构的改变而形成突变型。紫外线诱变，一般采用15W或30W紫外线灯，照射距离为20-30cm，照射时间依菌种而异，一般为1-3min，死亡率控制在50％-80％为宜。被照射处理的细胞，必须呈均匀分散的单细胞悬浮液状态，以利于均匀接触诱变剂，并可减少不纯种的出现。同时，对于细菌细胞的生理状态则要求培养至对数期为最好。本实验以紫外线处理产淀粉酶的枯草杆菌，通过透明圈法初筛，选择淀粉酶活力高的生产菌株。 三、实验材料 1.菌种产淀粉酶枯草芽孢杆菌 2.器材装有15W或30W紫外灯的超净工作台、电磁力搅拌器（含转子）、低速离心机、培养皿、涂布器、10m L离心管、（1、5、10m L）吸管、250m L三角瓶、恒温摇床、培养箱、直尺、棉签、橡皮手套、洗耳球 3.培养基和试剂 ①无菌水、75%酒精 ②0.5％碘液碘片1g、碘化钾2g、蒸馏水200m L，先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘片全部溶解后，加足水即可。 ③选择培养基可溶性淀粉2g，牛肉膏1g，N a C l0.5g，琼脂2g，蒸馏水100m L，p H6.8～ 7.0，121℃灭菌20m i n。 ④肉汤培养基牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，N a C l0.5g，蒸馏水100m L，p H7.2～7.4，121℃灭菌20m i n。 四、实验步骤 1.菌体培养取枯草芽孢杆菌一环接种于盛有20m L肉汤培养基的250m L三角瓶中，于37℃振荡培养12h，即为对数期的菌种。 2.菌悬液的制备取5m L发酵液于10m L离心管中，以3000r/m i n离心10m i n，弃去上清液。加入无菌水9m L，振荡洗涤，离心10m i n，弃去上清液。加入无菌水9m L，振荡均匀。 3.诱变处理将菌悬液倾于无菌培养皿中（内放一个磁力搅拌棒），置电磁力搅拌器上于超净工作台紫外灯下（距离30c m）照射0.5-1m i n。 4.取0.1-0.2m L诱变后菌悬液于选择培养基平板上，用涂布器涂匀。置37℃暗箱培养48h。 5.在长出菌落的周围滴加碘液，观察并测定透明圈直径（C）和菌落直径（H），挑选C/H 值最大者接入斜面保藏。 五、注意事项 1.紫外线对人体的细胞，尤其是人的眼睛和皮肤有伤害，长时间与紫外线接触会造成灼伤。故操作时要戴防护眼镜，操作尽量控制在防护罩内。 2.空气在紫外灯照射下，会产生臭氧，臭氧也有杀菌作用。臭氧过高，会引起人不舒服，同时也会影响菌体的成活率。臭氧在空气中的含量不能超过0.1％-1％。 六、结果与讨论 1.利用紫外诱变育种，应注意哪些因素?
实验三 紫外线的诱变育种
实验三紫外线的诱变育种（学时：4） 一、目的要求 通过实验，观察紫外线对枯草芽孢杆菌的诱变效应，并学习物理因素诱变育种的方法。 二、基本原理 紫外线对微生物有诱变作用，主要引起的是DNA分子结构发生改变（同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体），从而引起菌体遗传性变异。 三、菌种与仪器 菌种：枯草芽孢杆菌； 仪器：血球计数板，显微镜，紫外线灯（15W），电磁搅拌器，离心机 四、操作步骤 1.菌悬液的制备 A、取培养48小时的枯草芽孢杆菌的斜面4—5支，用无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡30分钟，以打碎菌块。 B、将上述菌液离心（3000r/min，离心15分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2—3次，最后制成菌悬液。 C、用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升108个。 2.平板制作将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至55℃左右时倒平板，凝固后待用。 3.紫外线处理 A、将紫外线灯开关打开预热约20分钟。 B、取直径9cm无菌平皿2套，分别加入上述菌悬液5ml，并放入无菌搅拌棒于平皿中。 C、将盛有菌悬液的2平皿置于磁力搅拌器上，在距离为30cm，功率为15W的紫外线灯下分别搅拌照射1分钟及3分钟。 4.稀释在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以10倍稀释法稀释成10-1-10-6（具体可按估计的存活率进行稀释）。 5.涂平板取10-4、10-5、10-6三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板3只，每只平板加稀释菌液0.1ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。 6.培养 将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置37℃培养48小时。注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。 7.计数将培养48小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。同样计算出紫外线处理1分钟、3分钟后的存活细胞数及其致死率。 8.观察诱变效应
蛋白酶产生菌的紫外诱变育种
蛋白酶产生菌的紫外诱变育种 xxxx大学生命科学学院生物工程第一组 前言: 因为自发突变率小，以微生物的自然变易作为基础的筛选菌种的机率并不很高。为了加大突变频率，可采用物理或化学的因素进行诱发突变。物理因素中目前使用得最方便且十分有效是紫外，紫外诱变一般采用15w的紫外灭菌灯，其光谱比较集中在253.7nm处，这与DNA的吸收波长一致，可引起DNA分子结构发生变化，特别是嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，从而引起菌种的遗传特性发生变易。 本次实验通过比较对照组和紫外诱变1min、5min、10min的实验组菌落的生长情况和水解圈的情况，可以很好的了解紫外诱变的效果。初步的说明诱变育种为筛选高效，稳定的菌种提供了有效可能的方法。 1 实验材料与方法 1.1 材料 1.1.1样品：老师提供的生长较好的菌液 1.1.2培养基及其配制 1）液体培养基：牛肉膏0.3g，蛋白胨1.0g，NaCl 1.0g，pH7.0～7.5，H2O 定容至100ml。配好50ml/三角瓶，分装两瓶每瓶50ml.包扎112℃，灭菌30min。 2）固体培养基（300ml）:牛肉膏0.9g，蛋白胨3g，NaCl 3g，H2O 定容300ml，pH值7.0。配好后，按100ml/瓶分装三瓶, 分别称取1.5g琼脂条塞入三角瓶，包扎，112℃，灭菌30min。 取牛奶粉25g用250ml水溶解，包扎，116℃，灭菌15min。按10%分别加入上述3个三角瓶中，每个三角瓶10ml。混匀后，倒平板。 1.1.3生理盐水：取Nacl 1.8g 溶解在200ml的水中，即配制0.9%的生理盐水。 1）每支试管中加入4.5ml蒸馏水，塞上试管塞，22支试管分4组分别包扎； 2）剩下的生理盐水装入三角瓶包扎； 112℃灭菌30min。 1.1.4器材 血球计数板，显微镜，紫外诱变箱，红灯泡， 移液管，涂布棒，含有7颗玻璃珠的空三角瓶等，112℃灭菌30min。 1.2 方法 1.2.1 菌株的培养 从老师给的菌悬液各取50ul接入2个液体培养基，37°C，220rpm，震荡培养过夜。 1.2.2出发菌株菌悬液的制备 1）取出发酵培养基，从生长良好的一瓶取20ml倒入50ml离心管中5000转离心5分钟，弃上清，倒扣离心管于滤纸上吸干残留培养基； 2）加30ml无菌生理盐水，重新震荡悬浮菌体，再离心，弃去上清；重复一次； 3）重复上述步骤加入5ml生理盐水恢复成菌悬液，用血球计数板在显微镜下直接计数，逐步添加生理盐水调整细胞浓度为108/mL； 4) 将上述菌悬液倒入装有小玻璃珠的无菌三角瓶内，振荡10~20min，以打散细胞； 5）取0.5ml 菌悬液进行10-1——10-7稀释分离，取10-5、10-6、10-7三个稀释度，每一梯度取100ul
紫外线诱变育种高产纤维素菌实验方案
紫外线诱变育种高产纤维素菌 实验方案 诱变方案：纤维素酶活力较高菌株→紫外线诱变→初筛→复筛→稳定性试验. 实验目的：对有一定能力产纤维素酶的菌种进行紫外线诱变，诱变出高产纤维素酶的菌种。 实验原理：紫外线诱变处理的有效波长为200~300×10nm，最适为254nm(此为核酸的吸收高峰)。DNA和RNA的嘌呤和嘧啶吸收紫外光后，DNA分子形成嘧啶二聚体，即两个相邻的嘧啶共价连接，二聚体出现会减弱双键间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡.另外二聚体的形成，会妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录.总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失，即是所谓的诱变。 材料和器皿： （1）菌种：木霉单孢子 （2）培养基：牛肉膏蛋白胨培养基（液体和固体），生理盐水。 （3）器皿：无菌培养皿，无菌试管，无菌移液管（5ml,1ml）,150ml三角瓶（内装有玻璃珠），无菌离心管等。 （4）仪器：紫外灯（装在无菌操作箱内），磁力搅拌器等。 实验步骤： 紫外线诱变育种 单孢子悬液制备：用生理盐水洗下出发菌株的斜面孢子摇床上震荡分散30min，4 层无菌擦镜纸过滤，制备单孢子悬液。
稀释对照菌液（未照射菌液） 将未经照射的菌液稀释成10-1~10-6，然后从10-5,10-6两管中各吸取0.1ml菌液于牛肉膏蛋白胨平板上（每个稀释度做三个皿），用无菌涂布棒土布均匀后，倒置于32度条件下培养过夜，第二天取出，计算菌落数，将记得的结果记录于表格中。 UV 诱变：取单孢子悬液5mL 于直径9cm 的培养皿内， 同时放入无菌搅拌子，在磁力搅拌器 ．．．．．的搅拌下置于15W 紫外线灭菌灯下30cm 处分别处理0s.30s、1min、2min、3min、5min、7min、9min、11min。在红灯下稀释适当倍数，0.1mL 涂PDA 平板，30℃避光培养过夜。诱变致死率检测：分别取等量的不同诱变时间的菌液和未诱变菌液涂布于PDA 平板，30℃培养72h。以未诱变菌液培养后的菌落数为基准计算 不同诱变时间的致死率，选择致死率较高的诱变菌液继续检测其产纤维素酶的能力。致死率(％)=（对照皿的菌落总数-诱变处理后的菌落总数）／对照皿的菌落总数×100 筛选培养基的选择 ．．．．．．．．:．挑取孢子接种到PDA 斜面培养基上活化，28℃ 培养72h。通过点样法分别接种于平板筛选培养基1和培养基2 上，28℃培养72h。观察不同培养基上纤维素酶生产菌的透明圈大小，以确定合适的选择培养基，为进一步筛选做准备. 最佳筛选培养基的确定（对比） 经观察，如果发现平板筛选培养基1 中透明圈较小，平板筛选培养基2（改良培养基）中菌落周围透明圈较明显，因此选择平
大肠杆菌紫外诱变实验
大肠杆菌紫外诱变实验 【实验目的】初步掌握诱变方案的设计和紫外诱变的实验手段。理解自发突变和紫外诱变的机理，分析不同诱变目的、诱变手段和诱变筛选在诱变应用中的关系。了解诱变育种在微生物工业中的作用。 【实验原理】微生物菌种质量优劣对发酵工业具有至关重要的作用，由于自然界中的菌种一般在生产上都有不同程度的缺陷，而且自然突变频率低，突变幅度小，单纯依靠自然界中微生物群体来进行的自然选择有很大的局限性，往往不能满足实际生产的需要。因此现在的微生物发酵生产菌种绝大多数都是经过人工改造的，而菌种改造有诱变改造和基因改造两方面。虽然现在基因工程菌已经成为越来越重要的菌种改造方式，但通过物理化学诱变对菌种品质进行改造仍然是工业生产菌重要的来源。 诱变分为物理诱变和化学诱变。物理诱变采用紫外光、X射线、射线、射线、射线、快中子和超声波等，其中紫外光诱变因其效果好、实验设备简单等优点而成为应用最广泛的物理诱变剂。 而化学诱变则是采用一些可以和DNA起作用，改变其分子结构，最终引起遗传改变的化学物质对诱变对象进行处理，得到诱变菌种的方法。实验室中常用的有亚硝酸、硫酸二乙酯、亚硝酸胍等（这3种诱变剂诱变效果依次增加，毒性也依次增大）。 物理诱变往往被分为电离辐射和非电离辐射，常用的电离辐射有X射线、射线、射线、快中子等。电离辐射的特点是穿透力强，对生物作用分为直接作用和间接作用。辐射的直接作用是指辐射所产生的直接物理损伤，是由于能量量子直接与染色体作用而造成的原始损伤，是一种物理作用；而辐射的间接作用则是一种化学作用，是由于生物细胞中的水分子受到辐射作用产生各种自由基，这些自由基和溶质分子或直接和染色体发生作用产生遗传损伤。 由于不同作用的时效差别，辐射的作用过程大体可分为物理、物理化学、化学和生物学效应等4个阶段，时效发生可以从10-12s到几年。辐射中常采用的剂量单位为伦琴（R）。一个伦琴相当于在00C及101325Pa（760mmHg）下，每立方厘米干燥空气中能产生个离子对的电离剂量。 此外还有拉德（rad）、尔格（erg）、居里（Ci）等单位。其换算关系如下： 1rad=100erg/g=10- 次衰变/秒 非电离辐射最典型的就是紫外线，其电磁波谱位置为40~390nm。而由于DNA分子的紫外吸收峰位于260 nm。因而波长在200~300 nm之间的紫外线被用于紫外诱变。紫外诱变时的剂量与所用紫外灯管的功率以及照射距离和照射时间相关，实验中往往采用改变照射时间来改变照射剂量。由于照射致死率在95%~99%的时候回复突变株出现率最高，因而实践中多用70%~80%的致死率进行诱变。 化学诱变和物理诱变相比主要的差别是诱变的特异性强，往往专一作用于DNA分子的特定结构。化学诱变主要分为4大类：碱基类似物、烷化剂、移码突变剂和其他类。 由于不同的化学诱变剂性能差别很大，在使用前必须对影响其效果的温度、PH值、光照、溶剂等做清楚的分析，同时对其半衰期、毒性及防护也要充分了解，这样才能保证使用的有效性和人体安全性。化学诱变的剂量是由使用浓度和处理时间决定的，操作中可以根据需要选择高浓度短时间处理或是低浓度长时间处理。 在诱变中制定好诱变方案是很重要的，诱变育种包括诱变和筛选两步。首先制定一个明确的筛选目标，因为诱变是不定向的，我们必须采用定向的筛选方法将我们所需要的菌株从原始菌和突变株中分离出来，同时还应考虑选出的菌种在生长速度、温度适应、产孢子等方面不能产生过多不适应生产的变化。 在充分考虑了实验的工作量要求后结合本实验室的人力、物力和时间要求提出诱变和筛选方案。在筛选方法选择中要考虑到兼顾筛选色工作量和可信度。当筛选方法可信度高时，往往检测方法是比较繁琐的（尤其是涉及一些蛋白质或氨基酸含量变化的突变类型）。这时为了提高筛选工作量往往降低筛选的可信度，减少筛选的繁琐程度，而在复筛中进一步加以确定。根据筛选目的和实验室条件选用合适的诱变剂。筛选方案确定后，不要经常改变，保持工作的稳定性，这样有利于总结提高。 本实验以大肠杆菌为材料，选择紫外线为诱变剂，进行诱变处理：筛选青霉素抗性菌，绘制致死曲线并计算诱变率。
实验十一 紫外诱变技术及抗药性突变菌株的筛选
实验十一紫外诱变技术及抗药性突变菌株的筛选 Ⅰ、紫外诱变技术 一实验目的 以紫外线处理细菌细胞为例,学习微生物诱变育种的基本技术。了解紫外线对细菌细胞的作用。 二实验材料与用具 菌株:大肠杆菌(Escherichia coli) 培养基:营养肉汤(nutrient broth)固体与液体培养基 生理盐水等 器皿:10ml及1ml的移液管,无菌试管,无菌培养皿,无菌三角瓶(内有无菌的玻璃珠20~40粒),无菌漏斗(内有两层擦镜纸),无菌离心管,离心机,紫外诱变箱等。 三实验原理 以微生物的自然变易作为基础的筛选菌种的机率并不很高。因为自发突变率小,一个基因的自发突变率仅为10-6~10-10左右。为了加大突变频率,可采用物理或化学的因素进行诱发突变。物理因素中目前使用得最方便且十分有效就是UV,UV诱变一般采用15w的紫外灭菌灯,其光谱比较集中在253、7nm处,这与DNA的吸收波长一致,可引起DNA分子结构发生变化,特别就是嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体,从而引起菌种的遗传特性发生变易。在生产与科研中可利用此法获得突变株。 四实验内容 1、对出发菌株进行处理,制备单细胞悬液; 2、紫外线进行处理; 3、用平板菌落计数法测定致死率;
五 操作步骤 (一)出发菌株菌悬液的制备 1. 出发菌株移接新鲜斜面培养基,37℃培养16~24h; 2. 将活化后的菌株接种于液体培养基,37℃ 110rpm 振荡培养过夜(约16h),第二天,以 20~30%接种量转接新鲜的营养肉汤培养基,继续培养2~4h; 3. 取4ml 培养液与5ml 离心管中,10000rpm 离心3~5min,弃去上清液,加4ml 无菌生理 盐水,重新悬浮菌体,再离心,弃去上清,重复上述步骤用生理盐水恢复成菌悬液; 4. 将上述菌悬液倒入装有小玻璃珠的无菌三角瓶内,振荡20~30min,以打散细胞; 5. 取诱变前的0、5ml 菌悬液进行适当稀释分离,取三个合适的稀释度倾注肉汤平板, 每一梯度倾注两皿,每皿加1ml 菌液,37℃倒置培养24~36h,进行平板菌落计数。 (二)UV 诱变 1. 将紫外灯打开,预热30min; 2. 取直径6cm 的无菌培养皿(含转子),加入菌悬液5ml,控制细胞密度为107~108个/ml; 3. 将待处理的培养皿置于诱变箱内的磁力搅拌仪上,静止1分钟后开启磁力搅拌仪旋 纽进行搅拌,然后打开皿盖,分别处理5s 、10s 、15s 、30s 、45s,照射完毕后先盖上皿盖,再关闭搅拌与紫外灯; 4. 取0、5ml 处理后的菌液进行适当稀释分离,取三个合适的稀释度倾注肉汤平板进 行计数(避光培养)。 六 实验结果 对平板菌落进行计数,并计算死亡率。 %100///?-=ml ml ml 照射前活菌数照射后活菌数照射前活菌数死亡率
紫外线诱变改善酵母菌细胞表面性质研究【开题报告】
毕业论文开题报告 环境工程 紫外线诱变改善酵母菌细胞表面性质研究 一、选题的背景与意义 紫外线是常用的物理诱变因子, 是诱发微生物突变的一种非常有用的工具。DNA和RNA的嘌呤和嘧啶有很强的紫外光吸收能力,最大的吸收峰在260nm。紫外辐射能作用于DNA ,因此在260nm的紫外辐射是最有效的致死剂。对于紫外的作用已有多种解释,但研究的比较清楚的一个作用是使DNA分子形成嘧啶二聚体,即两个相邻的嘧啶共价连接[。二聚体出现会减弱双键间氢键的作用,并引起双链结构扭曲变形,阻碍碱基间的正常配对,从而有可能引起突变或死亡。二聚体的形成，会妨碍双链的解开,因而影响DNA的复制和转录。紫外辐射可以引起转换、颠换、移码突变或缺失等。 日本于20世纪70年代就有人进行了利用酵母茵处理废水的探索性研究。并于90年代成功地实现了酵母茵废水处理技术的工程应用。日本一制油厂利用酵母处理高含油废水，对于平均含油量达11900mg/L的废水，除油率可达99%。此外，通过在反应器中接入功能菌株能增加目标底物的降解，降低其毒性。同时也可以缩短降解时间，酵母已被成功应用于处理高浓度含油废水以及石油的脱蜡等。然而，在酵母菌处理废水的实际运行中，酵母菌对废水的处理效果往往受到其表面性质的影响而不够理想。因此，可利用紫外诱变得到疏水性好、乳化能力强、絮凝性好的酵母菌菌株，并进行连续培养得到遗传性状稳定的菌株。从而使酵母菌对废水中COD的去除率提高。 二、研究的基本内容与拟解决的主要问题： 基本内容： 1．综述紫外诱变育种（微生物）的方法和技术路线； 2．设计实验，诱变酵母菌细胞； 3．考察诱变后酵母细胞表面性质的变化；细胞表面性质：疏水性、絮凝性、乳化能力等； 4．筛选对于废水处理有益的诱变菌株，主要是COD降解能力高、絮凝性好等特点。 拟解决的主要问题: 通过紫外线照射酵母菌对其进行诱变，再以相应的分析方法分析诱变所得菌株的疏水性、絮凝性以及乳化能力，筛选出COD降解能力强、絮凝性好的对废水处理有益的酵母菌菌株。 三、研究的方法与技术路线： 1、技术路线： ①构建紫外诱变酵母菌实验台，对培养所得的酵母菌进行紫外诱变。 ②建立对诱变所得的酵母菌菌株进行表面性质的定性定量分析方法，主要分析酵母菌的疏水性、
紫外诱变技术及抗药性突变菌株的筛选
紫外诱变技术及抗药性突变菌株的筛选 姓名：张鑫淼班级：生工1301 一．实验目的 以紫外线处理细菌细胞为例，学习微生物诱变育种的基本技术。 了解细菌抗药性突变株的筛选方法 二．实验材料 菌株：大肠杆菌（Escherichia coli） 培养基：营养肉汤（nutrient broth）固体和液体培养基 试剂：2mg/ml链霉素，（Str）母液，无菌生理盐水。 仪器：1ml的移液管17个，10ml移液管11个，无菌试管9个，无菌培养皿15个，无菌三角瓶7个（其中一个内有无菌的玻璃珠20~40粒），无菌漏斗（内有两层擦镜纸），无菌离心管1个，离心机，紫外诱变箱等 营养肉汤蛋白胨10g牛肉膏3g氯化钠5g蒸馏水1000mLpH 7.4 营养琼脂蛋白胨10g牛肉膏3g氯化钠5g琼脂15～20g蒸馏水1000mL 三．实验原理 以微生物的自然变易作为基础的筛选菌种的机率并不很高。因为自发突变率小，一个基因的自发突变率仅为10-6~10-10左右。为了加大突变频率，可采用物理或化学的因素进行诱发突变。物理因素中目前使用得最方便且十分有效是UV，UV诱变一般采用15w 的紫外灭菌灯，其光谱比较集中在253.7nm处，这与DNA的吸收波长一致，可引起DNA 分子结构发生变化，特别是嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，从而引起菌种的遗传特性发生变易。在生产和科研中可利用此法获得突变株。 链霉素属氮基糖昔类抗生素，其杀菌机理是作用于核糖体小亚基，使其不能与大亚基结合组成有活性的核糖体，从而阻断细菌蛋白质的合成。细菌对链霉素产生抗药性的作用机理一般是由于编码核糖体蛋白S12的rpsL基因或其他基因发生突变，导致相应的核糖体蛋白发生改变，是蛋白质合成不再受链霉素抑制。 四．实验内容与操作步骤 （一）出发菌株菌悬液的制备 1. 出发菌株移接新鲜斜面培养基，37℃培养16~24h； 2. 将活化后的菌株接种于液体培养基，37℃ 110rpm振荡培养过夜（约16h），第二天，以20~30%接种量转接新鲜的营养肉汤培养基，继续培养2~4h； 3. 取1ml培养液与1.5ml离心管中，10000rpm离心3~5min，弃去上清液，加1ml无菌生理盐水，重新悬浮菌体，再离心，弃去上清，重复上述步骤用生理盐水恢复成菌悬液； 4. 将上述菌悬液倒入装有小玻璃珠的无菌三角瓶内（预先加入9ml无菌生理盐水），振荡20~30min，以打散细胞； 5. 取诱变前的0.5ml 菌悬液进行适当稀释分离，取三个合适的稀释度倾注营养琼脂平板，每一梯度倾注两皿，每皿加1ml菌液，37℃倒置培养24~36h，进行平板菌落计数。同时选取合适浓度的菌悬液0.1ml涂布营养琼脂+Str平板（Str终浓度8ug/ml），37℃倒置培养24~36h,进行诱变前抗药菌落计数。 （二）UV诱变 1. 将紫外灯打开，预热30min； 2. 取直径6cm的无菌培养皿（含转子），加入菌悬液5ml，控制细胞密度为107~108个/ml；
紫外线诱变育种综述
紫外线诱变育种 摘要：紫外线诱变操作简单、对实验设备要求低，是目前被广泛运用的一种物理诱变剂，人们利用紫外线诱变得到了大量的优秀菌种。本文论述了紫外线诱变的原理、操作流程、其适用范围及研究进展。 关键词：紫外线诱变育种微生物 目前微生物发酵技术被广泛的应用到许多生产行业，如生产啤酒、白酒、乳制品、酶制剂、抗生素等行业，同时微生物在解决人类的粮食能源、健康、资源和环境保护等问题中正显露出越来越重要且不可替代的独特作用[1]。但就目前被投入工业化使用的工业菌大多在生长周期、培养基、产率等方面不能满足工业生产的需求。理想的工业菌种必须具备: 遗传性状稳定、纯净无污染、能产生许多繁殖单位、生长迅速、能于短时间内生产所要的产物、可以长期保存等特性。诱变是最早在抗生素上应用的一种育种技术, 它通过物理、化学、生物因素作用于抗生菌, 人为的使其遗传物质发生变异, 从中选育高产菌株[2]。紫外线诱变属于一种物理诱变剂，它是在微生物发酵技术育种中最早使用的一种诱变方法。紫外线诱变可以用于大量不同的菌种育种中，如芽孢杆菌、链霉菌、镰刀菌等，通过紫外线对微生物进行诱变，得到了大量比较优秀的工业菌种。由于紫外线诱变育种简便易行、对条件和设备要求较低并能较好地提高代谢产物的产量，故在微生物育种中仍广泛应用［3］。本文对紫外线诱变的原理、操作流程、其适用范围、研究进展进行了概述。
一、紫外线诱变的原理 紫外线属于一种物理诱变剂，它能使被照射的物质的分子或原子中的内层电子提高能级。主要生化反应：1.DNA链和氢键的断裂 2.DNA分子间（内）的交联 3.嘧啶的水合作用 4.形成胸腺嘧啶二聚体 5.造成碱基对转换 6.修复后造成差错和缺失。 紫外线诱变处理的有效波长为200- 300×10nm，最适为254nm(此为核酸的吸收高峰)。DNA和 RNA的嘌呤和嘧啶吸收紫外光后，DNA 分子形成嘧啶二聚体，即两个相邻的嘧啶共价连接，二聚体出现会减弱双键间氢键的作用[4]，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡.另外二聚体的形成，会妨碍双链的解开，因而影响DNA 的复制和转录.总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失，即是所谓的诱变[5]，从而引起上述的生化反应。 二、紫外线诱变的操作流程 1、测定菌种的生长曲线 首先对需要进行诱变的实验菌种进行纯化，然后将菌种接到培养基中培养。在不同的时间取适量的培养液，用分光光度计检测其中菌体浓度的OD值，通常是每两个小时检测一次[6]。根据不同时间的OD值绘制实验菌种的生长曲线，找到其对数生长期。 2、对处于对数期的菌种进行诱变 将实验菌种接到培养基中，根据其生长曲线培养到对数期的中期。然后离心分离得到菌体，用生理盐水把菌体制成菌悬液，调节菌悬液使菌体浓度在108个/ml左右。各取5mL 菌悬液移入18 个无菌培养皿中，置于距30W 紫外灯30cm 处
基因突变和诱变育种
基因突变和诱变育种 1. 内容 1.基因突变 （1）基因突变的定义：一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变，包括一对或少数几对碱基的缺失、插入或置换，而导致的遗传变化称为基因突变(gene mutation)，其发生变化的范围很小，所以又称点突变(point mutati on)或狭义的突变。广义的突变又称染色体畸变(chromosomal aberration)，包括大段染色体的缺失、重复、倒位。 （2）基因突变的特点：自发性、不对应性、稀有性、独立性、可诱变性、稳定性 （3）基因突变的类型 ?按发生方式：自发、诱发； ?按突变表型：营养缺陷型、抗药性突变型、条件致死突变型、形态突变型； ?按遗传物质的结构改变：染色体畸变、基因突变； ?按碱基变化与遗传信息的改变：同义突变、错义突变、无义突变、移码突变。 （4）基因突变自发性和不对应性的证明实验：Luria的变量实验、Newcombe的涂布实验、Lederberg等的影印平板实验。 （5）紫外线对DNA损伤及修复 紫外线对DNA损伤：嘧啶对紫外线比嘌呤敏感得多，其光化学反应产物主要是嘧啶二聚体和水合物，相邻嘧啶形成二聚体后，造成局部DNA分子无法配对，从而引起微生物的死亡或突变。 紫外线对DNA损伤的修复：光复活作用、切除修复。 2.诱变育种 ?诱变育种原则：简便有效诱变剂、优良出发菌株、单孢处理、最适诱变量、利用复合处理的协同效应、注意形态生理和产量的相关指标、设计高产筛选方案、运用高效筛选方法。 突变株筛选方法：产量突变株筛选、抗药突变株筛选、营养缺陷型筛选。 2. 练习 一、选择 1. 已知DNA的碱基序列为CATCATCAT，什么类型的突变可产生如下碱基序列的改变： CACCATCAT？（） A.缺失 B.插入 C.颠换 D.转换 答案：D 2. 以下碱基序列中哪个最易受紫外线破坏？（） A.AGGCAA B.CTTTGA C.GUAAAU D.CGGAGA
诱变育种流程及紫外诱变育种的详细步骤
1.首先是天然菌种的选育： 调查研究及查阅充分的资料 ↓ 设计实验方案 ↓确定采集样品的生态环境 采样 ↓确定特定的增殖条件 增殖培养 确定特殊的选择培养基及可能的 定性或半定量快速检出法 平板分离 ↓ 原种斜面 ↓确定发酵培养基础条件 筛选 ↓ 初筛（1株1瓶） ↓ 复筛（1株3～5瓶） ↓结合初步工艺条件摸索 再复筛（1株3～5瓶） ↓ 3～5株 ↓ 单株纯种分离 生产性能试验 →毒性试验 菌种鉴定 2.诱变菌种： 出发菌株----菌种纯化(出发菌株性能测定)----制备斜面孢子
----制备单孢子悬液(悬液进行活菌计数)----诱变剂处理(存活菌数的测定并计算存活率)----平板分离(测定变异率)----挑取变异菌落并移植至斜面上----初筛(初筛数据分析，生产性状的粗测)----斜面传代----复筛(复筛数据分析，精确测定生产性状)----变异菌株(菌株参数分析)----小型或中型投产试验----大型投产试验。 诱变育种应把握的主要原则有以下几点：1)选择简便有效的诱变剂。在选用理化因素作诱变剂时，在同样效果下，应选用最简便的因素；在同样简便的条件下，应选用最高效的因素。2)挑选优良的出发菌株。最好采用生产上已发生自变的菌株，选用对诱变剂敏感的菌株，选取有利于进一步研究或应用性状的菌株。4)处理单细胞或孢子悬液。单细胞悬液应均匀而分散，孢子、芽孢等应稍加萌发。5)选用合适的诱变剂量。一般正变较多出现在低剂量中，负变较多地出现在高剂量中。6)选用高效的筛选方法。 紫外线诱变育种： 紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为253-265nm．灯与处理物的距离为30cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在70～80%为宜。 被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个/ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106～107个 /ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约～厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。
诱变
2.3.3 单孢子悬液的制备用生理盐水从成熟的孢子斜面上洗下孢子，倒入装有玻璃珠的三角瓶中，置摇床上振荡打散30min，经四层无菌擦镜纸过滤，得单孢子悬液。 2.3.4 紫外诱变 取孢子悬浮液5ml，置于Φ90mm无菌平皿中，打开皿盖，在磁力搅拌状态下用紫外灯（波长253.7nm，功率20W，照射距离30cm）照射，时间分别为0 s、4 s、8 s、12 s、16 s和20s，取不同照射剂量的处理液0.1ml适当稀释涂皿，37℃避光培养5d，待菌落长出，进行活菌计数。以未经过诱变饱子悬浮液的活菌数为基准，然后以照射时间为横坐标，致死率为纵坐标，绘制致死率曲线。 按照与致死率测定相同的办法，将孢子悬液照射一定时间后，取0.1ml诱变处理液适当稀释涂皿，37℃避光培养5d。 2.4.3 紫外线对KN-16孢子的诱变 紫外线是一种使用最早沿用最久最广泛效果最明显的微生物诱变剂，其诱变频率高而且不易回复，紫外线可以引起微生物菌体的DNA突变，形成嘧啶二聚体。光照会断开嘧啶二聚体，所以紫外线诱变时要在避光条件下进行。以前认为致死率在90%～99.9%效果好。但是目前的报道认为致死率在70%～80%有利于正突变型的产生，且筛选的菌株遗传稳定性好。本实验对出发菌株KN-16进行紫外线照射0 s，4 s，8 s，12 s，16 s，20s结果如下： 2.4. 3.1 紫外线对出发菌株KN-16的致死曲线 KN-16菌株的孢子对紫外线的照射极其敏感（如图7所示），孢子致死率随照射时间的延长而增加，其中处理时间为4s时致死率为34.5%，8s时为73.4%，12s时为88.5%，16s时为93.4%，20s时为97.4%。8 s～20s 处理致死率上升缓慢。
诱变育种流程及紫外诱变育种的详细步骤
诱变育种的一般步骤： 1.首先是天然菌种的选育： 调查研究及查阅充分的资料 ↓ 设计实验方案 ↓确定采集样品的生态环境 采样 ↓确定特定的增殖条件 增殖培养 确定特殊的选择培养基及可能的 定性或半定量快速检出法平板分离 ↓ 原种斜面 ↓确定发酵培养基础条件 筛选 ↓ 初筛（1株1瓶） ↓ 复筛（1株3～5瓶） ↓结合初步工艺条件摸索 再复筛（1株3～5瓶） ↓ 3～5株 ↓ 单株纯种分离 生产性能试验 →毒性试验 菌种鉴定 2.诱变菌种：
出发菌株----菌种纯化(出发菌株性能测定)----制备斜面孢子----制备单孢子悬液(悬液进行活菌计数)----诱变剂处理(存活菌数的测定并计算存活率)----平板分离(测定变异率)----挑取变异菌落并移植至斜面上----初筛(初筛数据分析，生产性状的粗测)----斜面传代----复筛(复筛数据分析，精确测定生产性状)----变异菌株(菌株参数分析)----小型或中型投产试验----大型投产试验。 诱变育种应把握的主要原则有以下几点：1)选择简便有效的诱变剂。在选用理化因素作诱变剂时，在同样效果下，应选用最简便的因素；在同样简便的条件下，应选用最高效的因素。2)挑选优良的出发菌株。最好采用生产上已发生自变的菌株，选用对诱变剂敏感的菌株，选取有利于进一步研究或应用性状的菌株。4)处理单细胞或孢子悬液。单细胞悬液应均匀而分散，孢子、芽孢等应稍加萌发。5)选用合适的诱变剂量。一般正变较多出现在低剂量中，负变较多地出现在高剂量中。6)选用高效的筛选方法。 紫外线诱变育种： 紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为253-265nm．灯与处理物的距离为30cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在70～80%为宜。 被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个/ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106～107个/ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要
紫外诱变育种方案
紫外诱变大肠杆菌str(链霉素)抗性突变株的筛选 一、目的要求 1 、观察紫外线对链霉素产生抗性的诱变效应 2 、学习并掌握物理诱变育种的方法。 二、基本原理 紫外线的波长在200~380 nm 之间，但对诱变最有效的波长仅仅是在253~265 nm，一般紫外线杀菌灯所发射的紫外线大约有80%是254 nm。紫外线诱变的主要生物学效应是由于DNA 变化而造成的，DNA 对紫外线有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。紫外线引起DNA 结构变化的形式很多，如DNA 链的断裂、碱基破坏。但其最主要的作用是使同链DNA 的相邻嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，阻碍碱基间的正常配对，从而引起微生物突变或死亡。 经紫外线损伤的DNA，能被可见光复活，因此，经诱变处理后的微生物菌种要避免长波紫外线和可见光的照射，故经紫外线照射后样品需用黑纸或黑布包裹。另外，照射处理后的孢子悬液不要贮放太久，以免突变在黑暗中修复。三、实验材料 (一) 菌种 大肠杆菌 (二) 培养基（完全培养基） 1. 肉膏蛋白胨培养基 牛肉膏 0.5 g 蛋白胨 1.0 g NaCl 0.5 g 水 100 mL pH 7.2 100 KPa 、121℃高压蒸汽灭菌20min。 如配制固体培养基需加琼脂1.5%～2%。 如配制半固体培养基则加琼脂0.7%～0.8%。 (三) 主要药品 牛肉膏、蛋白胨、NaCl、可溶性淀粉、链霉素。
(四) 主要器皿 试管30支、移液管1mL10支、5mL3支、10mL1支、锥形瓶10个、量筒、烧杯、培养皿30个、离心管、20 W 紫外灯、磁力搅拌器、离心机、紫外诱变箱等。 四、实验内容 (一) 诱变 1. 菌悬液的制备 出发菌株移接新鲜斜面培养基，37℃培养16～24h。 取已培养20 h 的活化大肠杆菌斜面一支，用10 mL 生理盐水将菌苔洗下，取4mL 于5mL离心管中离心(3000 r/min)15min，弃上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2 次，最后制成菌悬液并倒入盛有玻璃珠的锥形瓶中，强烈振荡10 min，以打碎菌块制成单菌悬液，用血球计数板在显微镜下直接计数。调整细胞浓度为108/mL。 2. 平板制作 将肉膏蛋白胨培养基熔化后，冷至45℃左右倒平板。待平板完全冷却后，取0.1mL 链霉素用无菌棒涂布于平板上。其中留三块平板不涂布链霉素作为对照。 3. 诱变处理 (1) 预热正式照射前开启紫外灯预热30 min。 (2) 搅拌取制备好的菌悬液5 mL 移入6 cm 的无菌培养皿中，放入无菌磁力搅拌捧，置磁力搅拌器上，20 W 紫外灯下30 cm 处。 (3) 照射然后打开皿盖边搅拌边照射，剂量分别为5s，10s，15s。可以累积照射，照射完毕先关上皿盖再关闭搅拌和灯。所有操作必须在红灯下进行。 4. 稀释涂平板 在红灯下分别取未照射的菌悬液(作为对照)和照射过的菌悬液各0.5mL 进行适当稀释分离。取最后3 个稀释度的稀释液涂于肉膏蛋白胨平板上，每个稀释度涂3 个平板，每个平板加稀释液0.1 mL，用无菌玻璃刮棒涂匀，37℃培养48 h(用黑布包好平板)。注意在每个平板背后要标明处理时间、稀释度、组别。 (二) 计篡存活率及致死率 1. 存活率 将培养48 h 后的平板取出进行细胞计数。根据平板上菌落数，计算出对照样品1 mL 菌液中的活菌数。
紫外诱变方法
紫外诱变方法 宋炜等：高产脂肪酶酵母菌株的分离筛选及紫外诱变中南林业科技大学学报，2009，29(3)：55-64 1．2．4 紫外诱变 1．2．4．1 紫外诱变处理 取2 mL处于对数生长期的菌液于直径75 mm 的无菌培养皿中，置于30 w 紫外灯下30 cm处，分别照射处理：30 S、45 S、90 S、120 S、180 S、240 S、300 S，每个处理重复3次，用罗丹明B平板计算存活率，得出诱变致死曲线。每次紫外照射后在黑暗培养箱中静置30 min，然后在黑暗中稀释至1O-4、10-5倍，分别取0.1 mL涂于罗丹明B平板上，每级稀释液涂抹3个平板，以不进行照射作对照，紫外线照射以后的操作都在黑暗中进行，防止光修复。将涂匀的平板，用黑布裹好，置于28℃恒温培养箱中避光培养4 d。 1．2．4．2 突变菌株的初筛 将培养好的平板取出进行菌落计数，计算致死率。致死率(%)=100一(处理后每0.2 mL菌落数／对照每0.2 mL菌落数)×100。同时测量透明圈直径(D)和菌落直径(d)，用接种针挑取经不同剂量诱变的直径较大菌落，将相同处理剂量D／d比值大于对照D／d的菌落穿刺于同一个罗丹明B培养皿上，每皿点6个，黑暗条件下培养4 d。 1．2．4．3 突变菌株的摇瓶复筛 从相同处理时间的初筛平皿中选取D／d最大突变菌株，28℃摇瓶培养72 h，离心取上清液测酶活力． 孙同毅等：高产碱性蛋白酶菌株HAP26选育氨基酸和生物资源2007，29(2)：20～22 1．2．1诱变 (1)NTG诱变处理 将在10 g·L～N一甲基一硝基一N一亚硝基呱(NTG)溶液中浸泡过的滤纸片(‘p1．5 cm)放在涂满嗜碱芽孢杆菌HAP26的培养皿中央。 (2)N+离子注入条件 本试验采用由郑州大学提供的离子注入机。注入离子能量为30 Kev，单次脉冲时间为6 s，间隔时间为60 s，单次注入离子能量为×1014N+个数／cm2，真空度为5～6×10-3Kpa。每个无菌平板加入0.1 mL孢子悬液，涂布均匀，无菌风吹干(每一注入剂量做一个真空对照)，注入剂量分别为3、8、l0、30、50、80、100、200(离子束单位为×1014N+个数／cm2)。将诱变孢子适当稀释涂布于高氏培养基平板上，计数。 李祖明等高产碱性蛋白酶菌株的选育及其固态发酵条件的优化食品科技 2008,(4):5-8 1．3 诱变育种 将活化后的出发菌株接人固体斜面培养基中，30℃，培养一段时间后，用生理盐水将菌苔洗下，制备菌悬液，菌数约为lO8 cfu／mL。取菌悬液4 mL加入到直径6 cm培养皿内，以紫外灯(20 W，距离30cm)照射不同时间。菌液稀释后涂布于平板分离培养基上，30 ℃避光培养一段时间后，分别倒人适量10％三氯乙酸，静置l0 min，测定菌落周围出现的透明圈直径(d／cm)和菌落直径fd／cm)并计算比值(HC值)，与未处理的进行对照，选取HC值较大的单菌落编号并移接到斜面保藏培养基上，保存于4℃冰箱，待固态发酵复筛。 刘鑫等：高产酸性蛋白酶黑曲霉菌种选育四川大学学报(自然科学版) , 2005, Vo1.42 NO.1