毕赤酵母高密度发酵工艺的研究_林俊涵

中国生物工程杂志　China B i otechnol ogy,2009,29(5):120～125

毕赤酵母高密度发酵工艺的研究

林俊涵

3

(福建生物工程职业技术学院　福州　350002)

摘要　高密度发酵是毕赤酵母提高蛋白表达量的一种重要策略,发酵工艺是高密度发酵的一个重要因素。采用下列措施均可以有效地提高表达水平:调节基础培养基,采用变pH 和变温发酵,提高DO ,选择最适的诱导前菌体密度和比生长速率并降低甘油初始浓度和采用分段式指数流加进行调控。选择合适的甲醇补料策略:甲醇限制补料(MLF B )、氧气限制补料(OLF B )、甲醇不限制补料(MNLF B )和温度限制补料(T LF B )。采用两种方式调控补料:诱导阶段菌体生长时,甲醇

比消耗速率(q M eOH )为0.02-0.03gg -1h -1

,而菌体不生长时,q M eOH 采用较高值。

关键词　毕赤酵母　高密度发酵　发酵工艺

中图分类号　Q815

收稿日期:2008209216 修回日期:2008210217

3电子信箱:ljh047@https://www.wendangku.net/doc/f114098900.html,

巴斯德毕赤酵母(P ichia pastoris )是一种能高效表达外源蛋白的表达系统,具有遗传稳定、表达水平高、蛋白可翻译后加工、产物可分泌、可高密度发酵等许多优点

[1]

,应用十分广泛,已有数百种外源蛋白在该系统

中获得表达。

高密度发酵是基因工程菌提高外源蛋白表达水平的一种重要策略,迄今,已有许多蛋白通过高密度发酵获得高表达量,如巴西三叶胶腈水解酶的表达量高达

22g/L

[2]

,植酸酶表达量达12.2g/L

[3]

,S AM 表达量达

11.63g/L

[4]

,1,321,42β2D 2葡聚糖酶表达量达3g/L

[5]

等。但是,不同外源蛋白的表达水平相差很大,引起这种差异的重要因素有二:一是重组菌本身特性,如基因本身特性、基因拷贝数、密码子使用频率等,二是发酵工艺。目前,针对甲醇毕赤酵母高密度发酵,业界已建立起较为成熟的补料分批发酵和连续发酵两种方式,主要针对补料分批发酵工艺的影响和调控进行阐述。

1　培养基组成的优化及调控

培养基是高密度发酵的基础,直接影响菌体生长和诱导表达,现在大多采用Invitrogen 公司提供的复合培养基如BMGY /BMMY 、BMG/BMM 、MGY/MMY 和基础盐培养基BS M ,后者较便宜,一般用于发酵罐发酵,

同时补加PT M1微量盐溶液。许多外源蛋白通过BS M 获得有效表达,但有些蛋白则效果不好,甚至不表达,因此,在表达不同蛋白时,需对BS M 进行优化。

1.1　碳源的优化

甘油是菌体生长阶段普遍采用的碳源,通过补料加入培养基,其浓度过低或过高会限制或抑制菌体生长,因此,需要优化初始甘油浓度,选择有效的补料方式。葡萄糖也可作为碳源,虽效果不如甘油,但性价比却优于甘油,以葡萄糖代替甘油将有利于工业化生产

[6]

。

甲醇是诱导表达阶段的碳源,其浓度(C M eOH )和补料方式是关键。C M e OH 过低,会限制菌体生长和诱导强度;C M eOH 过高,则对菌体产生毒性。甲醇最佳浓度一般

在0.5%～3%(v/v ),但有些蛋白高于3%[7]

,因此,不

同蛋白的最佳浓度不同,需通过实验并结合补料策略确定。C M e OH 通过补料调节并保持恒定,其检测控制方法有溶氧反馈控制、甲醇离线控制和在线控制,而甲醇在线控制最优

[8]

。

1.2　氮源的优化

氨水常作为氮源,并用于调节pH,其释放的NH 4

+

浓度对菌体生长、蛋白表达和降解有重要影响。浓度过低,限制菌体生长,并增加蛋白的降解;浓度过高,虽可减少蛋白降解,却会抑制菌体生长和蛋白表达。因此,NH 4+

浓度需要优化,并采用恒浓度或变浓度法调

2009,29(5)林俊涵:毕赤酵母高密度发酵工艺的研究

控。谢静莉等[9]在发酵后期添加(NH

4)

2

S O4,使NH4+

浓度维持在150mmol/L以上,蛋白表达量提高58.8%。Zhang等[4]将NH4+浓度维持在0.45mol/L时,菌体生

长不受影响,S AM表达量最高,诱导时间比之前报导的缩短43h。Yang等[10]研究表明:NH

4

+初始浓度为0.4mol/L时,水蛭素表达量最高;在0.6mol/L时,降解

程度最低,但抑制菌体生长;采用变浓度法调控NH

4

+浓度后,即当菌体进入生长期时浓度由初始的0.025mol/L提高至0.6mol/L,蛋白表达量与初始浓度为0.4mol/L的相近,降解程度则与0.6mol/L的相近,既促进菌体生长,提高表达量,又降低蛋白酶降解。

1.3　基础盐和PT M1微量盐的优化

在表达分泌蛋白时,需降低基础盐浓度。基础盐浓度过高,会导致菌体死亡,并增加蛋白酶释放,增加蛋白降解。Surribas等[11]以电导率反映基础盐浓度,将初始电导率降为30%,并在诱导过程维持在20%后,菌体死亡率下降。Zhao等[12]将基础盐浓度降为1/4时,诱导前后菌体死亡率分别降低83.3%和48.6%～59.2%,菌体密度增加25%,HAS2I FN2α2b表达量提高92.0%,并保持恒定。

PT M1微量盐溶液成分过于复杂,不能高温灭菌,易形成沉淀且价格较高,不利于大规模发酵,可用低浓度的酵母抽提物来替代PT M1微量盐,简化工艺,也可用麦芽汁来替代,性价比可大幅提高,即简化工艺又降低成本,有利于工业化生产[13]。

1.4　添加其它物质,降低蛋白酶降解

在培养基中添加V it C、V itE可以减少菌体死亡,减少蛋白酶的分泌;添加蛋白胨或酪蛋白水解物等底物,竞争性抑制蛋白酶活性;添加蛋白酶抑制剂或EDT A,抑制蛋白酶活性,它们都能降低蛋白酶降解。Xiao 等[14]添加V it C并维持在4～10mmol/L后,菌体死亡率降低65.4%,水蛭素降解程度降低30.2%,完整蛋白的表达量提高56.8%。Zhao等[12]在诱导前添加2%大豆胨后,HAS2I FN2α2b只有极轻微的降解。Ayed等[15]添加酪蛋白水解物并维持在0.1%或EDT A并维持在10mmol/L后,均能阻止h IFNα2b的降解,前者使产物保持恒定,后者使表达量提高65%。

2　pH的影响及调控

pH对菌体生长和诱导表达都会产生影响,尤其是诱导时的pH,不仅会影响蛋白表达量和活性,而且会通过影响蛋白酶活性,来改变蛋白的降解程度。如当pH由3升至7时,r HS A的降解逐渐减少[16]。因此,必须选择合适的pH,一般在3.0～7.0,而且在不同阶段,应选择不同pH,采用变pH发酵。在表达猪胰岛素前体时,菌体生长和诱导表达的最适pH分别为 5.5和4.0,表达量比pH6.0提高1.2倍[17]。pH一般是通过补加氨水来调节,若NH

4

+浓度过高,则改为补加碱来调节。

3　温度的影响及调控

温度升高,有利于生长代谢和蛋白表达,但温度过高反而会使菌体过早衰老,发酵周期缩短,降低蛋白表达量和活性。因此,必须选择合适的温度,而且在不同阶段,应选择不同的温度,采用变温发酵。菌体生长最适温度为30℃,诱导表达的最适温度应降低,常为202 28℃,尤其是分泌蛋白,低温更有利于表达。

低温可以降低折叠压力,有利于新生肽链的正确折叠[1];降低菌体死亡率,减少蛋白酶分泌,降低蛋白酶活性;提高AOX酶活性和转录水平,还可以提高蛋白稳定性。c IF N在20℃诱导的单体量和活性分别比30℃的提高7.2倍和38.7倍,无活性聚合体量明显降低,表明低温更有利于新生多肽链的正确折叠[18]。HAS2I FN2α2b在20℃诱导的表达量比30℃提高2.16倍,菌体死亡率降低44.4%以上[12]。融合南极假丝酵母脂肪酶B在12℃诱导的表达量比30℃提高1倍,蛋白无任何降解,菌体死亡率降低66.7%,蛋白酶分泌减少,AOX酶活性提高2.5倍[19]。瑞普酶在20℃诱导的表达量比30℃提高35%,菌体死亡率可降低50.1%,总蛋白酶活性可降低10.4%,AOX酶活性可提高 1.4倍,并且提高蛋白稳定性[20]。

4　溶氧浓度(DO)的影响及调控

4.1　DO的影响

高密度发酵需要消耗大量的氧气,尤其是在甲醇诱导阶段,供氧往往成为限制性因子。若供氧不足,不仅会抑制菌体呼吸作用,限制菌体生长繁殖,而且会积累甲醇及其代谢产物甲醛和过氧化氢,对菌体产生毒害[21],降低蛋白表达量。因此,必须保证足够的供氧,一般DO≥20%～30%,DO也不能太高,超过60%,细胞就会发生氧中毒。

4.2　DO的调控

DO的提高,主要是通过提高搅拌转速、通气量、罐压、调节甲醇补料速率、降低温度、降低发酵液粘度等

121

中国生物工程杂志China B i otechnol ogy Vol .29No .52009

方式实现,必要时采用纯氧与空气混合通气或富氧通气,甚至通入纯氧,但要避免局部氧中毒。此外,还可采取其它措施,如在培养基中加入过氧化氢或血红蛋白,提高含氧量;在工程菌中引入透明颤菌血红蛋白

(VHb )基因共表达,VHb 能提高氧利用率,促进ATP 合

成速率,增强甲醇代谢活性

[22]

。

5　诱导前菌体密度(CW PT I )与比生长速率

(μPT I )的影响及调控

5.1　CW PT I 与μPT I 的影响

C W PTI 和μPTI 分别反映菌体生物量和生理状态,提高C W PTI 和μPTI 均能有效提高蛋白表达量。提高C W PTI 可以提高诱导阶段的生物量,并使更多的甲醇转向蛋白合成

[23]

,从而提高表达量;提高μPTI 可以增强菌体翻

译效率,转入诱导时,可迅速合成酶系代谢甲醇,快速表达出蛋白,提高比生产速率和表达量[24]

。W ang

等

[23]

将C W PTI 提至122g/L (干重)后,PG L 活性比

62.5g/L 提高1倍;W ei 等[24]

将C W PTI 提至320g/L (湿

重)后,rljGH 表达量比160g/L 提高84.0%;μPTI 提至

0.16/h 时,表达量比0.05/h 提高50.2%。

但是,C W PTI 和μPTI 都存在最适值。在表达S AM

时,最适C W PTI 为100g/L (干重)[25]

;在表达r BoNTE

(Hc )时,最适C W PTI 为200g/L (湿重)

[26]

;在表达hG 2

CSF 时,C W PTI 超过40g/L (干重),表达量出现下降;最

适μPTI 为0.18/h

[27]

。过高的C W PTI 和μPTI 将引起供氧

限制:使甘油出现积累,转入诱导时对AOX1产生阻遏作用;而在诱导时,减少甲醇消耗量,减少蛋白合成。因此,需同时优化C W PTI 和μPTI 。

5.2　CW PT I 与μPT I 的调控

甘油初始浓度和补料方式直接决定菌体生长,可以通过调整它们尤其是后者来调控μPTI 和C W PTI 。

5.2.1　降低甘油初始浓度　低浓度的甘油有利于菌

体生长,降低甘油初始浓度(至5g/L ),可使补料时间提前,缩短发酵时间,提高C W PTI

[28]

。5.2.2　甘油补料采用改良型指数流加　甘油补料可采用恒速流加、变速流加、指数流加和溶氧反馈控制等方式,指数流加方式是最有效的补料方式。它是根据

指数方程由设定的μPTI (常采用0.16～0.18h 21

)计算出

的流速来流加甘油,菌体以μPTI 呈指数生长。由于流速是由μPTI 和补料时间决定,因此,指数流加能有效地调控μPTI ,进而调控C W PTI ,C W PTI 可快速地达到目标值或

获得更高值,如以μPTI =0.176/h 指数流加,仅34h,

C W PTI 就达140g/L (干重),是DO 2stat 法的3.4倍

[23]

。

指数流加仍存在甘油积累,有时可达相当高的浓度

[23]

,会对AOX1产生阻遏作用,推迟蛋白表达,因此,

需对指数流加方式进行改良,可采用分段式流加。

W ang 等

[23]

采用先以μPTI =0.176/h 的指数流加10h,

后由98m l/h 逐渐降至45m l/h 的方式补料,补料后甘油积累较低;Bahram i 等

[27]

采用两阶段式指数流加方式,

当甘油浓度达5～10g/L 时,μPTI 由起始的0.21/h 降至

0.15/h 指数流加,甘油浓度迅速降为0,hG 2CSF 比单阶

段式提高28%。

6　甲醇补料方式

6.1　单一甲醇补料方式

6.1.1　甲醇补料策略　甲醇补料方式有许多种,如恒

速流速、变速流加、指数流加、溶氧反馈控制、甲醇反馈控制等,但归结起来主要有两种策略:甲醇限制补料

(methanol 2li m ited feeding batch,MLFB )和氧气限制补

料(oxygen 2li m ited feeding batch,OLFB )以及对它们的修改策略温度限制补料(temperature 2li m ited feeding

batch,T LF B )和甲醇不限制补料(methanol 2unli m ited feeding batch,MNLFB )

[11,12,19,21]

。

MLFB 限制甲醇的补料速率,维持较高的DO 和较低的C M eOH ,避免菌体的甲醇积累和毒害,蛋白表达量由甲醇消耗量所决定,是广泛采用的补料策略,许多蛋白通过MLFB 获得高水平的表达。

OLFB 不限制甲醇补料速率,DO 处于限制状态且极低,具有较高的C M eOH 但不影响菌体生存能力,甲醇消耗量由设备供氧能力决定并保持恒定,因此蛋白表达量取决于供氧能力。对于分泌蛋白,OLFB 也可获得很好的效果,甚至高于MLFB 。如采用OLFB 表达β2葡糖苷酶时,活性比MLFB 高16.1%,且蛋白纯度提高,便于纯化

[21]

;表达scF V 时,表达量与MLFB 相近,生产速

率虽低,却减少纯氧消耗[29]

。

MNLFB 是对OLF B 的修改策略,具有更高的DO ,与MLFB 混合使用,可获得较好效果。T LFB 将温度与

MLFB 相结合,以25%DO 控制温度,并调节补料速率

保持恒定C M eOH ,常用于低温诱导,但单独使用时,效果并不理想,菌体生长相当缓慢,蛋白表达量低,可与

MNLFB 或MLFB 混合使用,如采用T LF B +MLFB ,可促

进菌体生长

[19]

;Surribas 等

[11]

采用MNLFB +T LF B 并结

2

21

2009,29(5)

林俊涵:毕赤酵母高密度发酵工艺的研究

合低盐培养基,ROL 活性比T LFB 提高33.5%,生产速率虽低于MNLF B +MLFB ,但纯度提高。

6.1.2　甲醇补料调控　补料速率是补料调控的重要

指标,它可以调节C M eOH 和甲醇消耗量,从而调节菌体生长、维持代谢和蛋白合成,常以甲醇比消耗速率(q M eOH )来反馈调控。根据诱导期间菌体比生长速率(μI nd )是否为0,可采用两种q M eOH 来调控。

(1)当μI nd >0时,q M e OH ≈0.02～0.03gg 21h 21

。当

q M eOH ≈0.02～0.03gg 21

h 21

时,蛋白表达效果最优

[30]

,可以减少菌体生长及其所耗甲醇量或比例,提高表达量或达到相同表达量但减少甲醇用量。

在MLFB 中,可通过μI nd 来调整q M eOH (μI nd =Yx/s ?q M eOH ,Yx/s ≈1g ?g

21[29,30]

),以μI nd =0.02～0.03h

21

指数流加甲醇。Sinha 等

[26]

研究表明:表达r BoNTE

(Hc )的最适μI nd 为0.0267/h,每克湿菌体产量可达1.

93mg 。Trinh

[31]

等以μI nd =0.02/h 指数流加甲醇,鼠内

皮抑制素表达量与反馈控制补料相同,但减少甲醇用量和菌体生成量,单位甲醇和菌体的产量均提高1倍。 在OLFB 中,可通过提高C M eOH 和C W PTI ,限制通气量,将q M eOH 迅速下调至0.02gg 21

h 21

。Khatri 等

[29,30]

研

究表明:在高C M e OH 时,q M eOH 由0.05gg 21

h 21

迅速降至0.

02gg 21

h 21

,减少菌体生长,使甲醇转向scF V 合成,3%C M eOH 的表达量最高;随后采用延长甘油补料提高C W PTI (245g/L (干重))和指数通气(μI nd =0.03/h )来优化q M eOH 的调节,表达量分别提高6.1倍和9倍。

(2)当μI nd ≈0时,提高q M eOH 。当采用较高的

C W PTI ,保持菌体不生长时,甲醇主要用于蛋白合成,提

高C M eOH ,可提高q M eOH ,增加甲醇总消耗量,将获得更高的表达量,但是,要保证足够的供氧,因而它较适用于

MLFB 。此时,C M eOH /C W PTI 可作为更直观的指标。W ang

等优化表明:最适C M eOH /C W PTI 为0.1645gg 21

;当C W PTI 提至140g/L,并使C M e OH /C W PTI 处于0.163gg 21

～

0.171gg 21(q M eOH ≈0.045gg 21h 21

)时,PG L 活性是常规补

料的3.2倍。Zhang 等[25]

优化表明:当C M eOH 为0.6%,

C W PTI 提至100g/L (干重)时,q M e OH ≈0.038gg 21

h 21

,S AM 表达量最高。

6.2　甲醇混合补料方式

甲醇还可与甘油和山梨醇或甘露醇混合补料,增加碳源和能量供应,提高菌体密度,从而提高表达量;并能降低产热和耗氧速率,有利于高密度发酵。甘油对AOX1启动子有阻遏作用,需限制流速,维持“0”浓

度,可用溶氧反馈控制或指数流加;山梨醇或甘露醇效果更好,不仅没有阻遏作用,而且产热和耗氧速率更低。

混合补料的关键在于两者的比例、浓度和补料方式。Hu 等

[32]

将诱导过程10等分,每次10h,前6h 补甲

醇,后4h 补甘油,以DO (30%～35%)控制甲醇和甘油浓度,分别维持在0.5%～0.6%和0.06%～0.1%,诱导后,菌体密度和S AM 表达量分别提高12.3%和

34.3%;W ei 等

[24]

按77:23(v/v )混合甲醇和甘油,以

μI nd =0.035/h 指数流加,菌体密度和rljGH 表达量迅速达到单一甲醇补料的最高值,诱导时间缩短6h;

Jungo 等

[33,34]

研究表明:在连续发酵中,甲醇和甘油、甲

醇和山梨醇混合比例分别为60∶40(C 2mol/C 2mol )和43∶57(C 2mol/C 2mol )(最佳)时,分别以0.06/h 和0.03/h 指数流加,甲醇、甘油和山梨醇浓度都接近0,抗生物素蛋白比生产速率与单一甲醇补料一样,但菌体密度提高,表达量分别提高10%和30%,产热和耗氧速率分别降低28%和38%。在补料分批发酵中,甲醇和甘油、甲醇和山梨醇按相近或相同比例混合补料,也能获得相同的效果。进一步研究表明:以μI nd =0.05/h 指数流加甲醇和山梨醇时,山梨醇虽出现积累,但比生产速率不变,对AOX1无阻遏作用。

7　总　结

毕赤酵母高密度发酵表达外源蛋白是工业化生产重组蛋白的重要途径,不同外源蛋白要求不同的发酵工艺条件,可以从基础培养基、补料、溶氧、菌体密度、甲醇补料等多个方面针对特异外源蛋白的发酵工艺进行优化,目前的研究结果主要归结在如下几方面。 基础培养基:优化甘油、甲醇和NH 4+

浓度,降低基础盐浓度,寻找PT M1替代物简化工艺,添加其它成分以降低蛋白酶降解。pH 调控:变pH 发酵。温度调控:变温发酵,低温诱导对分泌蛋白表达更有利。溶氧调控:DO ≥20%～30%,采用提高搅拌转速、通气量、罐压、调节甲醇补料速率、降低温度、降低发酵液粘度等措施提高DO 。诱导前菌体密度与比生长速率调控:优化C W PTI 和μPTI ,并降低甘油初始浓度和采用分段式指数流加调控。甲醇补料调控:可采用MLFB 和OLF B 及它们的修改策略T LF B 和MNLF B ,也可将它们混合使用,补料调控有两种方式:(1)当μI nd >0时,在MLFB 中以μI nd =0.02～0.03/h 指数流加,在OLFB 中提高

3

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中国生物工程杂志China B i otechnol ogy Vol.29No.52009

C M eOH和C W PTI,限制通气量,使q M e OH≈0.0220.03gg21h21,以减少菌体生长及其所耗甲醇量或比例,提高表达量

或减少甲醇用量;(2)当μ

I nd

≈0时,在MLFB中,采用

较高的C W

PTI

,提高C M eOH以提高q M e OH,增加甲醇总消耗量,提高表达量。甲醇还可与甘油和山梨醇或甘露醇混合补料,提高表达量,降低产热和耗氧速率,而山梨醇或甘露醇效果更优。

通过上述几个方面的调控可以使外源蛋白的表达量提高10%至9倍。可见,对发酵工艺的优化调控是提高毕赤酵母外源蛋白表达量的重要手段。

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H i gh D en sity Fer m en t a ti on Con trol of P ich ia pastoris

L I N Jun2han

(Fujian Vocati onal Technol ogical College of B i o2Engineering,Fuzhou　350002,China)

Abstract　One of the i m portant strategies for i m p r oving recombinant p r otein exp ressi on in P ichia pastoris is op ti m izing contr ol during the high density fer mentati on p r ocess.Some fer mentati on contr ol has been used and got obvi ously higher exp ressi on level:op ti m izati on of basal salt mediu m compositi on;using t w o stage pH and t w o stage te mperature contr ol during cell gr owth and inducti on stage;app r op riately increasing diss olved oxygen; selecting op ti m al cell density p ri or t o inducti on(C W PTI)and s pecific gr owth rate p ri or t o inducti on(μPTI),using li m it a mount of initial glycer olin the basic media and feeding it during the fer mentati on with exponential fed2batch Model,selecting app r op riate methanol feeding strategy by methanol2li m ited feeding batch(MLF B),oxygen2 li m ited feeding batch(OLF B),methanol2unli m ited feeding batch(MNLF B)or te mperature2li m ited feeding batch(T LF B).Some research suggested that the exp ressi on level of the recombinant p r otein increase9ti m es after op ti m izing the fer mentati on contr ol.

Key words　P ichia pastoris　H igh density fer mentati on　Fer mentati on p r ocess

521

毕赤酵母实验操作技巧介绍材料

毕赤酵母表达实验手册 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。 与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、繁殖快、易于工业化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵体变性、复性等等间题［1］。 与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制

发酵工业中常用常见的酵母菌

发酵工业中常用常见的酵母菌 （一）酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 这是发酵工业上最常用的菌种之一（图2-84）。按细胞长与宽的比例可将其分为三组。 1）细胞多为圆形或卵形，长与宽之比为1～2。这类酵母除了用于酿造饮料酒和制作面包外，还用于乙醇发酵。其中德国2号和12号（RasseII和RasseXII）最有名，但因其不能耐高浓度盐类，故只适用于以糖化的淀粉质为原料生产乙醇和白酒。 2）细胞形状以卵形和长卵形为主，也有些圆形或短卵形细胞，长与宽之比通常为2。常形成假菌丝，但不发达也不典型。这类酵母主要用于酿造葡萄酒和果酒，也可用于酿造啤酒、蒸馏酒和酵母生产。葡萄酒酿造业称此为葡萄酒酵母（Sac．ellisoideus）。 3）大部分细胞长宽之比大于2，它以俗名为台湾396号酵母为代表。我国南方常将其用于糖蜜原料生产乙醇。其特点为耐高渗压，可忍受高浓度盐类。该酵母原称魏氏酵母（Sac．willanus）。 在啤酒酿造中最早采用的酵母是卡尔斯伯啤酒厂的E．C．Hansen（1842～1909年）在1883年分离的卡尔斯伯酵母（Saccharomyces carlsbergensis），这是一种底面发酵酵母。酿酒酵母也可用于啤酒酿造，但属上面发酵酵母，这两种酵母发酵的过程和啤酒风味都有所不同。 目前在分类上皆采用酿酒酵母的学名。 底面发酵酵母其细胞为圆形或卵圆形，直径为5～10μm。它与酿酒酵母在外形上的区别是，卡氏酵母部分细胞的细胞壁有一平端。另外，温度对这两类酵母的影响也不同。在高温时，酿酒酵母比卡氏酵母生长得更快，但在低温时卡氏酵母生长较快。酿酒酵母繁殖速度最高时的温度为33℃，而卡氏酵母需在36℃。但在8℃时卡氏酵母较酿酒酵母繁殖速度几乎快一倍。

产蛋白酶K毕赤酵母重组菌株高密度发酵

产蛋白酶K毕赤酵母重组菌株高密度发酵 及酶学性质分析 姓名：李善军 学号：2015304120225 院系：华中农业大学生科院

摘要蛋白酶 K 具有极高的酶活性和广泛的底物特异性, 在核酸纯化、丝绸、医药、食品和酿造等领域蛋白酶K 都有着重要的应用。毕赤酵母是近十几年来发展起来的真核表达体系，将蛋白酶 K在毕赤酵母中重组表达将是突破其高效表达的一个重要步骤。本实验利用产蛋白酶K的毕赤酵母基因工程菌进行高密度的液体发酵，掌握毕赤酵母菌全自动液体发酵工艺，同时对的到产物酶酶学性质进行分析。经实验结果得知，毕赤酵母基因工程菌发酵最高密度达到湿重283.97g/L，得到的蛋白酶K最大酶活为29000U，蛋白酶K的分子质量为31ku,最适温度为65度，最适PH为8，Na+、K+、Ca+和Mg+对蛋白酶K酶活有促进作用，而Ni+和Zn+对酶活反应则是抑制作用。 关键词：蛋白酶K、毕赤酵母菌、高密度发酵、酶学分析

本实验的蛋白酶 K 属丝氨酸蛋白酶类，它是林伯氏白色念球产生的一类主要蛋白酶。因能合成该种蛋白酶的微生物能在以角蛋白为唯一碳氮源的环境中生长，故将其称作蛋白酶 K。蛋白酶 K 具有极高的酶活性和广泛的底物特异性，能优先分与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸 C 末端邻接的酯键和肽键，常被用于降解蛋白生产短肽。利用其这个特性，在核酸纯化、丝绸、医药、食品和酿造等领域蛋白酶K 都有着重要的应用。由于林伯氏白色念球菌生长缓慢难以达到高密度培养的目标，而且菌体在产生蛋白酶 K 的同时还会分泌表达其他蛋白酶，加之对林伯氏白色念球菌的基因操作比大肠杆菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌等常用基因工程菌困难许多，这些都给蛋白酶K的高效大规模生产带来困难。 毕赤酵母是近十年来发展起来的真核表达体系,它的生长环境除了包括十分环保而廉价的无机盐，微量元素和必须的碳氮源外，还要添加生物素，甲醇能够作为它的唯一碳源保证其生长。将蛋白酶 K在毕赤酵母中重组表达将是突破其高效表达的一个重要步骤。本实验对产蛋白酶K的毕赤酵母基因工程菌高密度液体发酵工艺进行探讨，并对产物酶蛋白酶K的酶学性质进行分析，使对产蛋白酶K 的毕赤酵母基因工程菌及其产物有一个较为深刻的理解。 1、产蛋白酶K的毕赤酵母基因工程菌高密度液体发酵 1.1种子液培养 1.1.1种子培养基 YPD培养基：酵母粉1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%（琼脂1.5%） YPG培养基：酵母粉1%、蛋白胨2%、甘油2% 1.1.2培养温度与菌龄 挑取YPD平板上的单菌落（生科院发酵实验室）到8瓶100/500 mLYPG 培养基中，30℃，250 r/min 摇床培养28h。 1.2发酵罐培养 1.2.1菌体培养 清洗干净发酵罐，校正pH、DO电极后插入发酵罐，加入20LBSM（配方见下

毕赤酵母发酵手册

毕赤酵母发酵手册 总览 简介： 毕赤酵母和酿酒酵母很相似，都非常适合发酵生长。毕赤酵母在有可能提高总体的蛋白质产量的发酵中能够达到非常高的细胞浓度， 我们建议只有那些有过发酵经验或者能得到有经验的人的指导的人参与发酵。因为发酵的类型很多，所以我们很难为您的个人案例提高详细的过程。下面所给出的指导是基于Mut+和Mut s两种基因型的毕赤酵母菌株在15L的台式玻璃发酵罐中发酵而成。请在您的发酵开始前先阅读操作员手册。下面所给出的表就 发酵参数： 在整个发酵过程中监测和调控下列参数非常重要。下面的表格描述了这些参

设备推荐： 下面是所推荐设备的清单： ·发酵罐的夹套需要在发酵过程中给酵母菌降温，尤其是在甲醇流加过程中。你需要一个固定的来源来提供冷却水（5-10℃）。这可能意味着你需要一个冷冻装置来保持水的冷却。 ·一个泡沫探针就像消泡剂一样不可或缺。 ·一个氧气的来源——空气（不锈钢的发酵罐需要1-2vvm）或者纯氧（玻璃发酵罐需要0.1-0.3vvm）。 ·添加甘油和甲醇的补料泵。 ·pH的自动控制。 培养基的准备： 你需要准确配置下列溶液： ·发酵所需的基本盐类（第11页） ·PTM1补充盐类（第11页） ·75ml的50％的甘油每升初始发酵液，12ml的PTM1补充盐每升甘油。 ·740ml的100％的甲醇每升初始发酵液，12ml的PTM1补充盐每升甲醇。毕赤酵母生长的测定： 在不同的时间点通过测OD600的吸光值和湿细胞的重量来检测毕赤酵母的生长。培养的代谢速率通过通过观察溶氧浓度对应于有效碳源来测定。

溶氧的测定： 简介： 溶解氧的浓度时指氧气在培养基中的相关比例，溶氧100％是指培养基中氧达到饱和。毕赤酵母的生长需要消耗氧气，减少溶解氧的满度。毕赤酵母在生长时会消耗氧气，减少溶氧的程度。然而，因为代谢甲醇的最初阶段需要氧气，所以将溶氧浓度维持在一个适当的水平（＞20％）来确保毕赤酵母在甲醇上的生长就至关重要。准确测定和监测培养中的溶氧浓度将会为您提供关于培养状态和健康程度之类的重要信息。因此，精确校正您的发酵设备非常重要，请查阅您的操作手册。 溶氧浓度的维持： 1、很难依靠发酵罐的氧气转换速率（OTR）将溶氧浓度维持在20％，特别是在 小型的玻璃罐中。在玻璃发酵罐中，通气一般约为0.1-0.3vvm（1L发酵液每分钟1L氧气）来提供氧气使DO保持在20％。氧气消耗的变化依赖于所添加的甲醇的总量和蛋白质的表达。 2、在通气为0.1-0.3vvm时，氧气可达到足够的水平，这在许多玻璃发酵罐中可 以通过通入无菌空气来实现。在不锈钢发酵罐中，压力可增加OTR（与K L a 有关）。 3、如果一个发酵罐不能提供足够水平的氧气，甲醇的添加需要因此适当降低。 请注意降低甲醇的总量可能导致蛋白质表达水平的降低。 4、为了使蛋白质表达水平达到最大，发酵时间应被分割来以较低的流加速度添 加相似水平的甲醇。对许多重组蛋白质来说，可以观察到甲醇消耗的总量和蛋白质产生的总量有直接的关系。 DO测量的用处： 在毕赤酵母生长阶段，消耗氧气而使DO浓度维持在较低水平。请注意不管是在甘油或甲醇中生长，都要消耗氧气。DO浓度可用来衡量代谢速率和碳源是否受抑制，代谢速率则是培养健康程度的一个指标。如果你希望能够完全的诱导AOX1启动子，确定碳源是否受抑制就非常重要。例如：DO浓度的改变可让你确定是否在添加甲醇前所有的甘油都已耗尽，其次还可以确定甲醇流加的速率是否超过消耗的速率。过多的甲醇（＞1-2％vvm）可能会产生毒害。 DO的调控： 如果碳源受到抑制，关闭碳源的添加将会导致培养理工甲醇的速率降低，DO值会上升。终止碳源的添加，观察在碳源的流加关闭后需要多长时间来使DO值上升10％。如果延迟时间很短（＜1min），说明碳源受抑制。

重组巴斯德毕赤酵母高密度培养中铵离子浓度的影响

V o l .30N o.62004212 华　东　理　工　大　学　学　报 Journal of East Ch ina U niversity of Science and T echno logy 基金项目:教育部科学技术研究重点项目(99166);上海市重点学科基金 E -ma il :qye @ecust .edu .cn 收稿日期:2003212208 作者简介:谢静莉(19742),女,江苏南京人,博士研究生,研究方向为 发酵工程。 研究简报 文章编号:100623080(2004)0620723204 重组巴斯德毕赤酵母高密度培养中铵离子浓度的影响 谢静莉1,　周庆玮2,　杜　鹏2,　甘人宝2,　叶　勤13 (1.华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海200237; 2.中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所,上海200031) 摘要:采用M u t S 表型的重组毕赤酵母生产血管生长抑制素,表达阶段流加甘油2甲醇混合碳源以提高菌体密度和血管生长抑制素的表达水平,菌体密度可达174g L ,约是表达阶段采用甲醇为单一碳源的发酵过程的3倍。菌体密度的提高导致表达阶段发酵液中铵离子浓度下降很快,当发酵液中的铵离子浓度低至40mm o l L 时,影响了血管生长抑制素的表达。改变pH 调节方式并在发酵后期添加25mm o l L (N H 4)2SO 4使发酵液中铵离子浓度维持在150mm o l L 以上,血管生长抑制素的表达产量达到108m g L 。 关键词:巴斯德毕赤酵母;血管生长抑制素;发酵;铵离子浓度中图分类号:TQ 920.6文献标识码:A Effect of Amm on iu m Concen tration on the Expression of Ang iostati n i n H igh Cell D en sity Culture of Recom bi nan t P ich ia p astoris X IE J ing 2li 1 ,　ZH OU Q ing 2w ei 2 ,　DU P eng 2 ,　GA N R en 2bao 2 ,　Y E Q in 13 (1.S ta te K ey L abora tory of B ioreactor E ng ineering ECU S T ,S hang ha i 200237,Ch ina ;2.Institu te of B ioche m istry and Cell B iology ,S hang ha i Institu te of B iolog ica l S cience , Ch inese A cad e m y of S cience ,S hang ha i 200031,Ch ina ) Abstract :In fed 2batch cu ltivati on of recom b inan t P ich ia p astoris (M u t S pheno type ),feeding w ith glycero l and m ethano l w as conducted du ring the exp ressi on phase to enhance the cell grow th and angi o 2statin exp ressi on .T he cell den sity reached 174g L at the end of fer m en tati on ,w h ich w as abou t 3fo ld of that ob tained w ith m ethano l as the so le carbon sou rce in the inducti on phase .H igh cell den sity resu lted in a qu ick drop of amm on ium concen trati on in the fer m en tati on b ro th ,and w hen the amm on ium concen trati on w as below 40mm o l L ,the p roducti on of angi o statin also decreased .T he change of pH con tro l strategy and additi on of 25mm o l L (N H 4)2SO 4w ere app lied to release the effect cau sed by low amm on ium concen 2trati on .T he amm on ium concen trati on w as m ain tained above 150mm o l L in the inducti on p hase ,and 108m g L angi o statin w as ach ieved at the end of fer m en tati on . Key words :P ich ia p astoris ;angi o statin ;fer m en tati on ;amm on ium concen trati on 3 27

毕赤酵母手册

毕赤酵母表达实验手册 作者：Jnuxz 来源：丁香园时间：2007-9-5 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。［1］。 同时与大肠杆菌相比，作为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力。酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因----干扰素基因［2］，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达［3、4、5、6］。干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。原因是培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失［7、8］，质粒变得不稳定，拷贝数下降。拷贝数是高效表达的必备因素，因此拷贝数下降，也直接导致外源基因表达量的下降。同时，实验室用培养基成分复杂且昂贵，当采用工业规模能够接受的培养基时，导致了产量的下降［9］。为克服酿酒酵母的局限，1983年美国Wegner等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统［10］。 甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等．以Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主

毕赤酵母表达手册(详细)

毕赤酵母表达（pichia pastoris expression ）实验手册 2010-07-15 10:54:56| 分类：毕赤酵母| 标签：|字号大中小订阅 一．毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制二．毕赤酵母表达的培养基配制 三．主要试验环节的操作 3.1 酵母菌株的分离纯化 3.2 pP ICZαA原核宿主菌TOP10F’的活化培养 3.3毕赤酵母表达的试验方法 3.4 毕赤酵母电转化方法 3.5 P ichia酵母表达直接P CR鉴定重组子的方法 3.6 毕赤酵母基因组提取方法 3.7 Mut+表型重组酵母的诱导表达实验 关键词：酵母实验毕赤酵母表达 pichia pastoris expression 毕赤酵母酵母菌株 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。［1］。 同时与大肠杆菌相比，作为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力。酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因----干扰素基因［2］，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达［3、4、5、6］。干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。原因是培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失［7、8］，质粒变得不稳定，拷贝数下降。拷贝数是高效表达的必备因素，因此拷贝数下降，也直接导致外源基因表达量的下降。同时，实验室用培养基成分复杂且昂贵，当采用工业规模能够接受的培养基时，导致了产量的下降［9］。为克服酿酒酵母的局限，1983年美国Wegner等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统［10］。 甲基营养型酵母包括：P ichia、Candida等．以P ichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛。毕赤酵母系统的广泛应用，原因在于该系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还有以下几个优点［1、9、11］； ⑴具有醇氧化酶AOX1基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子之一。 ⑵表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合。 ⑶菌株易于进行高密度发酵，外源蛋白表达量高。 ⑷毕赤酵母中存在过氧化物酶体，表达的蛋白贮存其中，可免受蛋白酶的降解，而且减少对细胞的毒害作用。 P ichia.pastoris基因表达系统经过近十年发展，已基本成为较完善的外源基因表达系统，具有易于高密度发酵，表达基因稳定整合在宿主基因组中，能使产物有效分泌并适当糖基化，培养方便经济等特点。利用强效可调控启动子AOX1，已高效表达了HBsAg、TNF、E GF、破伤风毒素C片段、基因工程抗体等多种外源基因［11、12、13］，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜扩大为工业规模［14］。目前美国FDA已能评价来自该系统的基因工程产品，最近来自该系统的Cephelon制剂已获得FDA批准，

毕赤酵母表达经验总结

毕赤酵母表达经验总结 甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题，生物通编者特地收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。 甲基酵母部分优点与其他真核表达系统比较与原核表达系统比较 1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达优点-+ 2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，可以达到每升数克表达产物的水平++++ 3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系统简单，非常适合大规模工业化生产。+++= 4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化。=+ 5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以甲醇等工业产物替代葡萄糖作为碳源，生产成本低++++ + 表示优胜于；- 表示不如；= 表示差不多 EasySelect Pichia Expression System 产品性能： 优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化 缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题 全面产品报告及心得体会： 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。 毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以增加表达，并且在表达后α-factor 可以自动被切除。在进行克隆的时候，如果你选择的是EcoRI，那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列选用的是Zeocin抗生素作为筛选标记，而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG便宜。 第一步——构建载体 Xiang Yang：pPICZ系列有许多克隆位点可供选择，同时也有三种读码框以便不用的用户需要。 红叶山庄：有关是选择pPIC9K还是pPICZ系列？pPIC9K属于穿梭质粒，也可以在原核表达，而pPICZ系列比较容易操作，大肠和毕赤酵母均用 抗Zeocin筛选（PIC9K操作麻烦一点，大肠用amp抗性，而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆，在利用G418筛选多拷贝），而且对于大小合适（30—50KD）的蛋白在产量上是pPIC9K无法比拟的。leslie：要做毕赤酵母表达实验，首先当然就要了解这个可爱的酵母了（椭圆形，肥嘟嘟的，十分可爱），她和大肠杆菌长得有较大区别（大肠杆菌是杆状的），因此在培养的过程中要区别这两种菌体，除了气味，浓度，颜色以外，也可以取样到显微镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧，表达过程中染菌（我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌，那真是一段可怕的经历），如果在不知情的情况下继续做下去，那可以就是浪费大把的时间了。 基本熟悉了毕赤酵母，了解了她生长的喜好（多糖偏酸环境），生长的周期等等情况后，当然更多的精力还是应该花在表达的目的蛋白上，我的表达蛋白有些恐怖，有100KD，本来当然应该放在大肠杆菌中表达，但是为了分泌表达（其实后来发现大肠杆菌pET系列分泌表达系列也不错）和糖基化修饰（主要是这个方面，因为我的蛋白是人源的，表达出来用于酵母双杂，因此需要有完备的糖基化修饰）。这样我的DNA片段由于较长，所以在做克隆的时候也要非常小心，需要注意的是： ①酶切位点不能出现在目的DNA片段中——如果片段长无法避免，可以采用平末端连接； ②虽然α-factor可以自动切除，但是在设计表达的时候，如果在N端不能出现任何多余的aa（比如药物蛋白表达），需要特别留意（说明书上有详细说明：P13）； ③有三种不同的读码框（对于pPICZα系列来说就是对上α-factor序列），在设计克隆的时候要反复确

毕赤酵母工程菌高密度发酵的研究进展_夏姗

毕赤酵母工程菌高密度发酵的研究进展 夏姗1,2，武福军2,3，赵洪亮2，薛冲2，刘志敏2 1.安徽大学生命科学学院，安徽合肥230039； 2.军事医学科学院生物工程研究所，北京100071； 3.山西康宝生物制品股份有限公司，山西长治046000 ［摘要］近年来毕赤酵母已成为一种优越的异源蛋白表达系统。而提高目的蛋白的表达水平，高密度发酵已成为关键技术环节之一。我们从毕赤酵母工程菌的选择、培养基的优化设计，以及发酵工程过程控制等方面简要阐述毕赤酵母的高密度发酵，并提出了工程菌在高密度发酵过程中存在的问题。［关键词］毕赤酵母工程菌；高密度发酵；培养基优化；发酵过程控制［中图分类号］Q78 ［文献标识码］A ［文章编号］1009-0002（2013）01-0109-04 Progess of Pichia pastoris Engineering Bacteria on High-Density Fer?mentation XIA Shan 1,2,WU Fu-Jun 2,3,ZHAO Hong-Liang 2,XUE Chong 2,LIU Zhi-Min 2* 1.School of Life Science,Anhui Uniservity,Hefei 230039; 2.Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100850; 3.Shanxi Kangbao Biological Product Co.Ltd,Changzhi 046000;China *Corresponding author,E-mail:liuzhm@https://www.wendangku.net/doc/f114098900.html, ［Abstract ］Pichia pastoris has been utilized widely as an excellent heterologous gene expression system recently. High-density fermentation has been a key technique tache to improve the expression level of the protein of inter ?est.In this paper,we expounded the choose of engineering bacteria,designation and optimization of culture medi ?um,and control of fermentation course to increase P.pastoris on high-density fermentation.Moreover,the questions existing in industry high-density fermentation were put forward.［Key words ］Pichia pastoris ;high-density fermentation;optimization of culture medium;control of fermentation course 综述 doi:10.3969/j.issn.1009-0002.2013.01.026 20世纪80年代以来，随着生物技术药物在人类 疾病治疗和预防中的广泛应用，大大加速了微生物细胞表达产品的产业化进程。近20年来，毕赤酵母 大规模培养已成为生物制药领域非常重要的关键技术之一，并不断推动生物技术产业的迅速发展。毕赤酵母表达系统在表达外源蛋白方面具有非常明显的优势，这是因为毕赤酵母本身为单细胞真核生物，易于分子遗传学操作，且外源基因可以整合到酵母的染色体上，随染色体一起复制和遗传，不易造成外源基因的丢失现象；具有强诱导性和强启动性的醇氧化酶基因启动子，适用于外源基因的高水平诱导表达；并且毕赤酵母在高水平表达外源蛋白的同时，自身背景蛋白分泌却很少，不需要破菌等复杂操作，有利于后续纯化；毕赤酵母发酵产物的积累不会对自身宿主菌产生大的毒副作用，这更有利于大规模 的高密度发酵。目前，越来越多的国内外研究者选择毕赤酵母作为外源蛋白的优先表达系统，表达产物包括干扰素、白介素2、抗体等[1-3]，且已有产品上市。尽管毕赤酵母有自身的优点，但对于不同的具体目标产品，表达水平参差不齐。如胞内分泌表达的巴西三叶胶腈水解酶的产量高达22g/L [4]，破伤风片段C 产量高达12g/L [5]，胞外分泌表达的明胶的产量达到14.8g/L [6]等，而最低的报道只有1mg/L ，其间相差可达10000倍。因此，要提高目的蛋白的表达水平，高密度发酵（high-density fermentation ）也成为一个关键技术环节。 1 毕赤酵母工程菌的选择和改良 1.1 工程菌的选择 目前毕赤酵母工程菌株常常呈现2种表型，分别为mut +和mut s ，aox1基因缺失的酵母在甲醇限制 性培养基上生长缓慢（methanol utilization slow ， mut s 或mut -），它们只能利用弱的aox2基因启动合成 收稿日期：2012-08-20基金项目：国家高技术研究发展计划（2009AA02Z108）作者简介：夏姗（1990-），女，硕士研究生通信作者：刘志敏，（E-mail ）liuzhm@https://www.wendangku.net/doc/f114098900.html,

毕赤酵母产木聚糖酶实验方案(最终)

重组毕赤酵母产木聚糖酶摇瓶培养实验 一、实验目的 1)熟练摇瓶发酵的操作流程和无菌操作技术。 2)掌握细胞浓度、产物浓度的表征和测定方法。 3)熟悉测定生长曲线和产物生成曲线的方法。 二、毕赤酵母简介 甲醇营养型毕赤酵母(Pichia pastoris) 表达系统是80年代初被开发和研制的一种新型酵母表达系统。40年前，Ogata等人首次发现有些酵母能够利用甲醇作为唯一的碳源和能源进行生长。随后，甲醇营养酵母作为潜在的单细胞蛋白(single cell protein, SCP) 来源立即引起广泛关注，最初将其作为高蛋白的动物饲料在市场上销售。在20世纪70年代，Phillips Petroleum公司开发出毕赤酵母利用甲醇生长的培养基、发酵操作手册和高密度连续培养生产工艺。70年代的石油危机导致了甲烷价格的急剧上升，与此同时，动物饲料蛋白的主要替代源——大豆价格的下降，导致利用甲醇生产SCP在经济上已不再合适。在以后的10年中，PhiLLips PetroLeum公司与SIBIA公司合作开发利用毕赤酵母作为生物体表达外源蛋白的研究，研究人员分离了醇氧化酶(alcohol oxidase, AOX) 的基因和启动子，构建了表达载体和菌株，开发了毕赤酵母基因操作相关技术。成熟的SCP发酵方法的开发，加上醇氧化酶强启动子的可调控表达特性，极大地影响着外源蛋白在毕赤酵母中的高水平表达。1993年，Phillips Petroleum公司委托Invitrogen公司代理毕赤酵母表达系统产品。 毕赤酵母能在以甲醇为唯一碳源的培养基中快速生长，其中醇氧化酶AOX——甲醇代谢途径的关键酶可达细胞可溶性蛋白的30％。而在葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源的培养细胞中则检测不到AOX。AOX的合成是在转录水平调控的。其基因启动子具有明显的调控功能，可用于调控外源基因的表达。此调控作用是由一般碳源抑制/解抑制及碳源特殊诱导机制控制的。外源基因在甲醇以外的碳源中处于非表达状态，而在培养液中加入甲醇后，外源基因即被诱导表达。巴斯德毕赤酵母中存在着一种称为微体的细胞器，其中大量合成过氧化物酶，因此也称为过氧化物酶体。

6毕赤酵母介绍

毕赤酵母及级胰岛素——优思灵巴斯德毕赤酵母(P／ch／a pastor／s)表达系统是目前最优秀、应用最广泛的外源基因表达系统之一，它不但克服了大肠杆菌表达系统不能表达结构复杂的蛋白质、表达的蛋白多形成不溶性包涵体、背景蛋白多、表达产量低等缺陷，弥补了哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统操作复杂、表达水平低、产业化生产造价昂贵的不足，还具有其他酵母表达系统无法比拟的优越之处。 酵母作为一种最简单的单细胞真核生物, 兼有原核生物和真核生物的某些优点。毕赤酵母生活史与酿酒酵母十分相似。这使得毕赤酵母的发酵工程部分可与酿酒酵母相同, 从而节省了重新购臵设备和进行新技术探索的巨额花费, 这是用其他方法进行大规模商品化的外源蛋白生产所不能比拟的优势。现将毕赤酵母表达系统优点概括如下: ①毕赤酵母更接近高等真核细胞, 不含内毒素和其他有害物质, 使用安全; ②同酿酒酵母一样, 繁殖速度快, 对培养条件要求低, 培养基价廉, 能进行高密度培养, 且能耐受较高的液体静压, 便于工业化生产; ②该系统的载体能与核基因组进行整合, 因此构建的菌株较稳定, 一般不会 在传代过程中出现丢失现象; ③在毕赤酵母中表达的蛋白既可存在于胞内, 又可在分泌信号作用下将蛋白 分泌至胞外; ⑤具有强有力的易控制的乙醇氧化酶基因(AOX1)或磷酸甘油酸脱氢酶( GAP) 基因启动子作为外源基因启动子, 可对外源蛋白的表达进行严格调控; ⑥作为真核表达系统, 可对表达的外源蛋白进行翻译后的加工和修饰, 即二硫键的形成、脂肪的酰化、蛋白磷酸化、折叠、信号序列加工、N糖基化、O糖基化, 从而使目的蛋白具有所应有的生物学活性; ⑦外源蛋白表达量高, 同时自身分泌的背景蛋白少, 表达产物易于纯化; ⑧和酿酒酵母相比, 毕赤酵母中加到翻译蛋白上的糖链长度平均每条侧链为8～14个甘露糖残基, 比酿酒酵母每条侧链平均50～150个甘露糖残基短得多。毕赤酵母极少出现过渡糖基化, 可避免外源蛋白生产过强的免疫原性或因糖链过长干扰外源蛋白正确折叠而影响其功能, 而且糖链中不含具有致敏作用的α21, 32甘露糖, 使其使用更加安全。

酵母菌

酵母菌 子囊菌、担子菌等几科单细胞真菌的通称。可用于酿造生产，有的为致病菌。是遗传工程和细胞周期研究的模式生物。 酵母菌是一些单细胞真菌，并非系统演化分类的单元。酵母菌是人类文明史中被应用得最早的微生物。可在缺氧环境中生存。目前已知有1000多种酵母，根据酵母菌产生孢子(子囊孢子和担孢子)的能力，可将酵母分成三类：形成孢子的株系属于子囊菌和担子菌。不形成孢子但主要通过出芽生殖来繁殖的称为不完全真菌，或者叫“假酵母”（类酵母）。目前已知大部分酵母被分类到子囊菌门。酵母菌在自然界分布广泛，主要生长在偏酸性的潮湿的含糖环境中。 生理 酵母营专性或兼性好氧生活，目前未知专性厌氧的酵母。在缺乏氧气时，发酵型的酵母通过将糖类转化成为二氧化碳和乙醇（俗称酒精）来获取能量。 在酿酒过程中，乙醇被保留下来；在烤面包或蒸馒头的过程中，二氧化碳将面团发起，而酒精则挥发。 在有氧气的环境中，酵母菌将葡萄糖转化为水和二氧化碳.无氧的条件下，将葡萄糖分解为二氧化碳和酒精. 在温度适合时，氧气和养料充足的条件下，以出芽方式迅速增殖。 化学元素组分 酵母的化学组成与培养基、培养条件和酵母本身所处的生理状态有关。 一般情况下： 酵母细胞的平均元素组成(%)如下：碳-47 氢-6.5 氧-31 氮-7.5~10 磷-1.6~3.5 其他元素的含量很少（%） 钙-0.3~0.8 钾-1.5-2.5 镁--0.1~0.4 钠-0.06-0.2 硫-0.2 在酵母中发现的微量元素（mg/kg) 铁--90-350 铜：20-135 锌：100-160 钴：15-65 特征 各种酵母菌的菌落 多数酵母可以分离于富含糖类的环境中，比如一些水果（葡萄、苹果、桃等）或者植物分泌物（如仙人掌的汁）。一些酵母在昆虫体内生活。酵母菌是单细胞真核微生物。酵母菌细胞的形态通常有球形、卵圆形、腊肠形、椭圆形、柠檬形或藕节形等。比细菌的单细胞个体要大得多，一般为1~5微米或5~20微米。酵母菌无鞭毛，不能游动。酵母菌具有典型的

毕赤酵母发酵罐发酵

微生物发酵罐发酵（毕赤酵母） 灭菌前： 室温下校准PH电极，先校6.86零点再4.0斜率（若的发酵pH很长时间是酸性的（如酵母发酵）用6.86校正零点，4.0校正斜率；若你的发酵pH很长时间是碱性的（如某些细菌发酵）用6.86校正零点，9.18校正斜率）； 室温下校准溶氧电极，1.0点在不接溶氧电极时候标定，100%点接上溶氧电极，放置在空气中较定；或2.0点在灭菌过程中，温度达到121度左右压力0.12mpa左右时候标定，100%在灭菌结束，降温至发酵温度并稳定，转速在发酵初始转速，通气量在发酵初始通气量时候标定 灭菌： 1.灭菌，先将各排气阀打开，将蒸汽引入夹套或蛇管进行预热，待罐温升至 80~90℃，将排气阀逐渐关小。接着将蒸汽从进气口、排料口、取样口直接通入罐中（如有冲视罐也同时进汽），使罐温上升到118~120℃，罐压维持在 0.09~0.1Mpa（表压），并保持30min左右。 2.保温结束后，依次关闭各排汽、进汽阀门，待罐内压力低于空气压力后，向罐内通入无菌空气，在夹套或蛇管中通冷却水降温，使培养基的温度降到所需的温度，进行下一步的发酵和培养。 （注意压力：灭菌时，总蒸汽管道压力要求不低于0.3~0.35Mpa，使用压力不低于0.2Mpa。） 灭菌后: A.消耗甘油阶段 1.灭菌后冷却30℃时： 2.冷却至30℃时，开启搅拌(转速最大)和通气(0.1-1.0vvm),接通28%氨水(未稀释)调PH5.0;每升加4.35ml的无菌PTM1基础盐； 3.从摇瓶中接种种子液，DO值为100%，开始培养后会消耗，导致DO值下降，通氧气以确保DO值超过20％，速率先为0.1vvm。 4. 发酵过夜甘油被完全消耗（18-24h），标志为DO值增加到100％。 【每天至少两次取样，测OD600，湿重，显微观察.将菌体和上清（离心后）在-80℃下保藏，用于后面的分析。】 5.这个阶段所期望达到的细胞产量为90-150g/L湿细胞。重组蛋白质不产生。 B.甘油补料阶段 1.将12ml/L PTM1加入50%VVM的甘油中，将补料速率设为18.15ml每小时每升初试发酵液体积。 2.甘油补料将进行约4h或更长。在本阶段完成后细胞产量应达到180-220g/L湿细胞，但是不会有重组蛋白质的产生。 【4％甘油的是所建议的在补料中的最大水平，更高的甘油浓度将会产生毒害问题。】 重要:如果溶氧低于20％，应该停止甘油或甲醇的补料并且不做任何提高溶氧的

酵母菌的高密度发酵

课程设计说明书 课程名称：发酵工程 设计题目：酵母菌的高密度发酵 院系：生物与食品工程学院 学生姓名：吴亚非 学号：201006040051 专业班级：10 生物技术 指导教师：马瑞霞 2013年5月26日

课程设计任务书设计题目酵母菌的高密度发酵 学生姓名吴亚非所在院系生物与食品工 程学院 专业、年级、班10级生物技术 设计要求： 1、设计题目选择要求紧扣发酵工程相关教学内容和生产实际。 2、要充分查阅相关背景资料，了解相关内容的前沿进展及存在问题。 3、设计说明书应字迹清楚文字通顺，并附有各项设计成果表，摘引其他书籍或杂志的材料必须注明出处。 4、实验方案要切合实际，严密合理 6、设计结束后，以个人为单位提交设计说明书一份（后附流程图）。 学生应完成的工作： 1、在老师的指导下确定设计题目。 2、学生查阅相关文献和资料制定实验路线，并有指导老师检查实验路线的合理性和可操作性。 3、学生在实验室完成既定方案。 4、完成课程设计说明书的初稿，经过指导老师的帮助修改，最后定稿。 参考文献阅读： [1]李寅等著，高细胞密度发酵技术[M]，化学工业出版社，2006-10-01，230-280 [2]陈思如，萧熙佩酵母生物化学[M]，济南：山东科学技术出版社，1990年 [ 3 ] ( 日) 山根恒夫( 周斌译) , 生化反应工程( 第二版)[M] , 西安: 西安大学出版社, 1992: 243 [4]Craig. T.B. and Trotter S G Intern. Symp. SCP. A lgiers A lgoria, O ct, 1983:17-20 [5]陈洪章，李佐虎，酵母菌的高密度发酵[J]，工业微生物，1998-28-1 工作计划： 2013.5.11分组并确认指导老师，在老师指导下查阅文献，确定题目。 2013.5.12----2013.5.13 进行理论试讲阶段，确定实验路线，然后确定实验方案。 2013.5.14----2013.5.17 进行实验操作和书写设计说明书。 2013.5.18----2013.5.22 修改说明书，和指导老师沟通。 2013.5.23—2013.5.26 上交课程设计说明书，并由指导老师填写评语和成绩。 任务下达日期：2013年5月13日 任务完成日期：2013年5月26日 指导教师（签名）：学生（签名）：