近红外荧光探针天青A检测DNA

近红外荧光探针天青A 检测DNA

胡敏

1,2　张镇西31　沈国励3　刘娅莉31(西安交通大学生命学院,生物医学信息工程教育部重点实验室,生物医学工程研究所,西安710049)2

(西安交通大学理学院应用化学系,西安710049)3(湖南大学化学化工学院,化学生物传感器与计量学国家重点实验室,长沙410082)

摘　要　近红外荧光探针天青A (AZ )可与DNA 结合,结合常数为K =5.90×105L /mol,结合位点数n =0194

碱基对。利用在pH =8.0的tris 2HCl 缓冲体系中,DNA 浓度与天青A 的荧光强度呈线性关系,在近红外区建立测定核酸的方法。其检测下限为01064mg/L;线性范围为01064～26mg/L (r =019942)。本方法具有测试简单、背景干扰小、灵敏度高等优点。

关键词　天青A,近红外荧光探针,脱氧核糖核酸

　2006210218收稿;2006212220接受

本文系国家自然科学基金(No .20205005,20205004)和西安交通大学自然科学基金资助项目

3E 2mail:zxzhang@mail .xjtu .edu .cn 1　引　言

荧光探针是一种利用荧光分子光学特征,在分子水平上研究一些体系物理、化学过程和检测某种特殊环境材料的结构及物理性质的方法。它具有灵敏度高和动态响应范围宽等特点,因而在生物大分子中应用广泛[1～3]。在近红外区生物分子自身荧光弱,背景干扰小,在此区域进行检测可获得较高灵敏

度。因此,近红外荧光探针的研究成为近年来的研究热点[4]。

DNA 为一种遗传物质,可与许多化合物如有机小分子、金属离子和蛋白质等[5]发生相互作用。用

荧光法研究DNA 时,由于DNA 的天然荧光较弱,须借助荧光探针。天青A (AZ )是一种吩噻嗪类染料,其最大吸收波长620nm ,荧光最大发射波长650n m ,摩尔吸光系数高,为一种近红外荧光探针。吩噻嗪类染料具有刚性的平面结构,可与DNA 相互作用[6]。Pasternack 等[7]报道,AZ 分子带正电荷可与DNA

带负电荷的磷酸骨架作用,同时其发色基团与DNA 的碱基耦合。李园芳等[8]用共振光散色技术建立了

RLS 法AZ 测定DNA 的新方法;訾言勤等[9]也用分子吸收光谱法研究AZ 与RNA 的作用方式。而利用

AZ 为近红外荧光探针建立DNA 的检测方法未见报道。

本研究利用天青A (AZ )可与DNA 发生相互作用,且DNA 浓度对天青A 的荧光猝灭呈线性关系,建立了以天青A 为近红外荧光探针,在近红外区测定脱氧核糖核酸的方法并取得满意效果。2　实验部分

2.1　仪器与试剂

M850型荧光分光光度计(日本);UV 21100紫外2可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)。小牛

胸腺DNA (ct D NA )(华美生物工程公司)用10-2mol/L NaCl 溶液配制成1g/L 的水溶液,于0～4℃下保

存,UV 光谱测定A 2/A 1>1.8;天青A (上海试剂三厂)配制成1×10-4mol/L 的水溶液避光保存;溴化乙

锭(EB )(华美生物工程公司)配制成1×10-4

mol/L 水溶液。缓冲液为pH =8.0的tris 2HCl 。其它试剂均为分析纯。实验用水为二次蒸馏水。

2.2　实验方法

2.2.1　吸收光谱　于10mL 比色管中加入1.0mL pH 8.0的tris 2HCl 缓冲溶液、一定量AZ 和ct D NA ,稀释至刻度,摇匀。以相应试剂空白作参比,在UV 21100紫外可见分光光度计上测其吸收光值。

2.2.2　荧光实验　于10mL 比色管中加入1.0mL 不同pH 的tris 2HCl 缓冲溶液、一定量AZ 和ct D NA 第35卷2007年6月 分析化学(FE NX I HUAXUE )　研究简报Chinese Journal of Analytical Che m istry

第6期890～892

稀释至刻度(或再加入其它试剂),摇匀,测量荧光强度

。

　图1　天青A 吸收光谱Fig .1　Abs or p ti on of Azure A (AZ )AZ:10-5mol/L,DNA: 1.0mg/L;

2.15mg/L;

3.45mg/L.

3　结果与讨论

3.1　D NA 对AZ 吸收光谱的影响

在中性条件下,AZ 的最大吸收峰为620nm 。随着DNA 浓度

的增加,AZ 的特征吸收强度不断减小。DNA 对AZ 的吸收光谱

产生了明显的减色效应,吸收峰发生红移。DNA 碱基与嵌入的有

机小分子产生电子相互作用,产生减色效应,减色程度与小分子

距DNA 碱基对间的距离的的3次方成反比[10]

。即AZ 与DNA 碱基对距离很近,可能嵌入到DNA 的碱基对中,引起DNA 的碱基对与嵌入的AZ 分子间产生较强的电子相互作用(见图1)。3.2　D NA 对AZ 的荧光猝灭AZ 的最大激发和发射波长分别为620nm 和650n m 。在

AZ

　图2　NaCl 对AZ 2DNA 复合物荧光强度的影响

Fig .2　Effect of NaCl on the fluorescence intensity of AZ 2DNA comp lex

AZ:3×l0-6mol/L;DNA:10mg/L.的最大激发波长光照射下,AZ 的I 0/I 值随着ct D NA 的不断加入

逐渐增大,这说明DNA 分子与AZ 发生了作用,引起AZ 的荧光猝

灭。I 0/I 与DNA 的浓度呈直线关系,由此AZ 可作为检测DNA

的荧光探针。同时说明AZ 对DNA 的荧光猝灭符合经典猝灭理

论[11],且AZ 的吸收光谱发生红移,因此,AZ 对DNA 的荧光猝灭

方式为静态猝灭即DNA 与AZ 的基态分子结合。

3.3　最佳pH 值选择

固定AZ 、DNA 的浓度,体系荧光强度受B ritt onRobins on 广泛缓冲介质pH 值影响,在pH =4～9时,DNA 对AZ 的荧光猝灭变化率保持不变。磷酸缓冲液含有与DNA 链相同的磷酸根,因此,实验选择pH =8.0的tris 2HCl 缓冲体系。3.4　离子强度以强电解质NaCl 溶液研究离子强度对测量的影响(图2)。

实验结果表明,较高离子强度对AZ 的荧光强度基本没有影响。在天青2DNA 体系中,离子强度较低时,荧光强度增加较大。而达到一定浓度后,荧光强度变化小。由于离子强度对体系荧光强度有影响,

因　图3　Scatchard 图

Fig .3　Scatchard p l ot

r :C B /[ct 2DNA ];C B :键合的荧光探针浓度(concen 2trati on of bonded fluoresent p r ob );C F :游离的荧光探针浓度(concentrati on of free fluoresent p r ob );

AZ:3×10-6mol/L 。此,测量时需要严格控制离子强度。

3.5　AZ 与ct 2D NA 的结合常数及结合位点数的计算

AZ 与ct 2DNA 的结合常数K 及结合位点数n 按下列公

式计算[12]:

C B =C T -C F C F =C T (I /I 0-P )/(1-P )

其中,C F 为游离的荧光探针的浓度,C T 为所加的荧光

探针的浓度。I 与I 0分别为体系中存在DNA 和不存在

DNA 时的荧光强度。P 为体系中键合与未键合荧光探针的

荧光量子产率之比,即为I /I 0对l /[DNA ]作图,所得直线与

Y 轴的截距。C B 为键合的荧光探针的浓度。以r/C F 对r 作图得Scatchard p l ot (图3),其中r =C B /[ct 2DNA ],并按McGhee 和VonH i ppel 所给出的修正的Scatchard 方程[12]:

r/C F =K (1-n r ){(1-n r )/[1-(n -r )]}

n -1式中K 和n 是固定的内在结合常数和结合位点数。对此方程进行拟合,得K =5.90×105L /mol,n =0194。

198第6期胡　敏等:近红外荧光探针天青A 检测DNA

表1　样品测试结果(n =5)

Table 1　Deter m inati on results f or DNA (n =5)

DNA 样品Sa mp le

DNA 浓度Concentrati on of DNA (mg/L )测定值Found (mg/L )回收率Recovery (%)1

4.013 3.98697.52 3.003 3.030102.23:溴乙锭法测定(ethidium br om ide detecti on method )。3.6　分析应用以AZ 的最大激发波长620n m 激发波长,并且在最大发射波长处测量。选用pH =8.0的tris 2HCl 缓冲体系,且保持一定的离子强度,温育3m in 后,对DNA 的试样进行检测。线性区间为

0.06～26mg/L,线性相关系数r =019942。2.0

mg/L DNA 连续测定6次的RS D 为3.7%。样品检测结果见表1。以天青A 为荧光探针,在近红外区测定核酸得满意效果。

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Near 2I nfrared Fluoresen t Probe of Azure A for

D eterm i n a ti on of D eoxyr i bonucle i c Ac i d

Hu M in

1,2,Zhang Zhen 2Xi 31,Shen Guo 2L i 3,L iu Ya 2L i 31(The Key L aboratory of B io m edical Infor m ation Engineering of M inistry of Education,

Institute of B io m edical Engineering,X i ′an J iaotong U niversity,X i ′an 710049)

2

(D epart m ent of A pplied Che m istry,School of Science,X i ′an J iaotong U niversity,X i ′an 710049)

3(S tate Key L aboratory for Che m o /B iosensing Technology and Che m o m etrics,College of Che m istry and

Che m ical Engineering,Hunan U niversity,Changsha 410082)Abstract A method with near 2I R as fluorensent p r obe of Azure A was devel oped f or the deter m inati on of DNA.The study results indicate that the DNA quenched the fluorescence of Azure A t o p r oduce the Azure A 2DNA comp lex .The binding constant of the interacti on bet w een the Azure A and DNA is,K =5190×105L /mol,and the binding site nu mbers n =0194base pairs .The detecti on li m it is 01064mg/L,and the linear range is 01064-26mg/L f or the deter m inati on of DNA.

Keywords Azure A ,near 2infrared fluoresent p r ob,doxyribonucleic acid

(Received 18Oct ober 2006;accep ted 20December 2006)298 分析化学

第35卷

用于小分子和生物酶响应的反应型近红外荧光探针

用于小分子和生物酶响应的反应型近红外荧光探针近红外荧光探针具有长波长激发、生物体损伤及背景干扰较小等优点,对人类认识生物体内离子、小分子及生物酶等的生理过程具有重要意义。反应型荧光探针因其具有识别不可逆性及较高的检测灵敏度受到广泛关注。 目前已有一些反应型近红外荧光探针的报道,而将其应用于肼、多硫化氢(H2Sn)及人源羧酸酯酶2(CES2)荧光识别及成像方面的报道较少并存在一些局限。因此,设计和合成用于肼、H2Sn及CES2响应的反应型近红外荧光探针对揭示它们的生理功能具有重要意义。 肼具有较严重的生理毒性,将乙酰基团引入至苯并吡喃腈类荧光团DCPO骨架当中合成了探针BI-E,它是一例识别肼的反应型近红外双光子荧光探针,绝对荧光量子产率为0.002。BI-E识别肼后能够生成DCPO,最大发射波长为680nm,响应时间为1 min,最低检测限为5.7 × 10-8 M,绝对荧光量子产率为0.011,在830 nm处具有最大双光子吸收截面30GM。 孵育24h的MCF-7细胞存活率大于90%,表明BI-E具有较低的细胞毒性。成像研究表明,该探针可实现对活细胞内胼的单、双光子近红外荧光成像。 H2Sn是细胞内一种潜在的信号传导分子,Cy-Sn是一例用于H2Sn响应的反应型近红外荧光探针。它是以氧杂蒽类半菁荧光染料Cy-OH为母体、2-氟-5-硝基苯甲酰基为识别基团,与H2Sn反应后溶液的最大发射波长为720 nm,响应时间为5 min,检测限为2.2 × 10-8 M。 Cy-Sn孵育24 h后,RAW 264.7细胞存活率大于90%,表明该探针具有较低的细胞毒性。荧光成像研究表明,该探针不仅可实现对活细胞内H2Sn的荧光成像,而且借助于Cy-Sn观察到细胞在经历炎症及抗炎响应过程后H2Sn的浓度变化。

荧光探针设计原理

荧光化学传感器是建立在光谱化学和化学波导与量测技术基础上的将分析对象的化学信息以荧光信号表达的传感装置。其主要组成部件有三个(图 1.1)：1．识别结合基团(R),能选择性地与被分析物结合,并使传感器所处的化学环境发生改变。这种结合可以通过配位键，氢键等作用实现。２．信号报告基团(发色团, F），把识别基团与被分析物结合引起的化学环境变化转变为容易观察到的输出信号。信号报告基团起到了信息传输的作用，它把分子水平上发生的化学信息转换成能够为人感知(颜色变化)或仪器检测的信号（荧光等)。3.连接基团(S),将信号报告基团和识别结合基团连接起来,根据设计的不同连接基团可有多种选择，一般用做连接基团的是亚甲基等短链烷基。连接基团的合适与否将直接影响是否有输出信号的产生。信号表达可以是荧光的增强或减弱、光谱的移动、荧光寿命的变化等。 图1．1 荧光探针的结构 1.1.1 荧光探针的一般设计原理 (1) 结合型荧光探针[２1］ +

Analyte Signalling subunit Space Binding subunit Output signal 图1．２ 共价连接型荧光探针 结合型荧光探针是利用化学共价键将识别基团和荧光基团连接起来的一类荧光探针,是比较常见的一类荧光探针。该类探针通过对比加入分析物前后荧光强度的变化、光谱位置的移动或荧光寿命的改变等实现对分析物的检测。在该类荧光化学传感器的设计中,必须充分考虑下列三个方面的因素。(ａ） 受体分子的荧光基团设计、合成:考虑到用于复杂环境体系的荧光检测，要求荧光基团要有强的荧光（高荧光量子产率，有利于提高检测的灵敏性）,Ｓｔｏｋｅs 位移要大（可有效消除常规荧光化合物如荧光素等具有的自猝灭现象)，荧光发射最好要在长波长区(最好位于5０0 nm 以上，可避免复杂体系的常位于短波长区的背景荧光的干扰,另外由于长波长区发射的荧光能量的降低可减少荧光漂白现象的发生而延长传感器的使用寿命）。(b) 受体分子的识别基团：受体分子的识别基团设计以软硬酸碱理论、配位作用以及超分子作用力(如氢键、范德华力等）作为理论指导,多选择含氮、硫、磷杂环化合物作为识别分子。(ｃ) 荧光超分子受体的组装:组装荧光超分子受体就是利用一个连接基将识别基团和荧光基团通过共价键连接在一起,要充分考虑到识别基团和荧光

荧光上上转换纳米粒子做近红外荧光探针

荧光上上转换纳米粒子做近红外荧光探针 由于在生物医学研究和临床治疗上的需求，光学成像技术在生物成像的应用方面发展迅猛，各种新手段、新材料、新方法不断涌现。近年来，随着各种功能强大的荧光探针的快速发展（如半导体纳米粒子、荧光蛋白、荧光有机分子等），光学成像技术已经越来越广泛的应用于生物体内成像研究。但是，由于需要光作为成像的信息源，生物组织对光的高散射和高吸收成为制约光学成像技术在生物体内成像的主要障碍。一般来讲，生物组织对可见区（350-700nm）和红外区（>1000nm）具有最强的吸收。相反，生物组织对近红外区（650-1000nm）光的吸收最少，因此近红外光可以穿透生物组织的距离最大。采用近红外荧光探针可以对深层的组织和器官进行探测和成像，这是可见区荧光探针所不能比拟的。我们在设计新一代荧光探针时必须考虑如何将探针的激发光和发射光调控到近红外区。 迄今为止，近红外荧光探针的种类非常有限，几乎全部属于有机荧光染料，而有机荧光染料作为生物体内荧光探针有很多缺点：第一，有机荧光染料容易被光漂白，不能长时间使用；第二，有机染料不适合同时多色成像，大多数染料只能被特定的波长有效激发，需要多个激发光源才能实现多色显示；第三，激发和发射波长不够稳定，容易随周围环境（如PH、温度等）而变化。为了克服这些缺点，人们正在发展用无机荧光纳米半导体粒子（量子点）来作为新一代荧光探针。与有机荧光染料相比，量子点具有很多优势：首先，量子点具有宽带吸收峰和很窄的发射峰，通过控制粒径可以得到从紫光到近红外的各种发光；其次，具有很高的荧光量子产率，发光稳定，不易被光漂白；并且，量子点容易实现修饰，可以在表面修饰各种有机分子和生物分子，进行生物检测和成像，一个量子点还可以修饰很多靶向分子。目前，发射近红外光的CdTe， CdS，HgS和CdSe 量子点已经作为近红外荧光探针应用在近红外生物细胞和组织成像研究上。然而，目前采用的这些量子点在生物成像中仍然存在一些问题。最主要的问题就是量子点的毒性，如量子点中含有的Cd, P和Hg等均对生物体有很大伤害。此外，量子点需要高能量的紫外或近紫外光激发，在采集荧光探针信号的同时，生物组织在高能量光源的激发下的产生自身荧光也会极大干扰荧光探针的信号，造成信噪比变差，从而不能检测深层生物组织的信号。长时间暴露在高能光源下还会造成生物组织的光损伤、蛋白质破坏和细胞死亡等。因此，开发新一代近红外荧光纳米粒子必须满足以下几个条件： 1.制备方法简便，绿色无污染，原料成本低。 2.发光稳定，不会被光漂白。 3.荧光量子产率高。

荧光探针汇总

1.Fluo-3 AM （钙离子荧光探针） 原理Fluo-3 AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fluo-3 AM的荧光非常弱，进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3，从而被滞留在细胞内，和细胞内游离 的钙离子结合，结合钙离子后可以产生较强的荧光。 生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果，因此此探针能表征细胞损伤程度 激发波长506nm 发射波长526nm （绿色） 备注推荐使用 2.Mag-fura-2 AM（钙离子荧光探针） 原理Fura-2 AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fura-2 AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fura-2，从而被滞留在细胞内。Fura-2可以和钙离子结合，结合 钙离子后在330-350nm激发光下可以产生较强的荧光，而在380nm激发光下则会 导致荧光减弱。这样就可以使用340nm和380nm这两个荧光的比值来检测细胞内 的钙离子浓度，可以消除不同细胞样品间荧光探针装载效率的差异，荧光探针的渗 漏，细胞厚度差异等一些误差因素。 生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果，因此此探针能表征细胞损伤程度 激发波长为340nm和380nm 发射波长510nm （蓝色） 备注仪器滤光片不适用 3Fluo-4-AM （钙离子荧光探针） 原理Fluo 4 是一种将Fluo 3结构中的Cl替换成F的钙荧光探针。由于将Cl替换成了电子吸引力更强的F，它的最大激发波长会向短波长处偏离10 nm左右。所以用氩 激光器激发时，Fluo 4的荧光强度比Fluo 3强1倍。由于Fluo 4与钙离子的亲和力 和Fluo 3近似，所以使用上和Fluo 3也基本相同 生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果，因此此探针能表征细胞损伤程度 激发波长494nm 发射波长516nm （绿色） 备注用激光器激发时荧光强度强，因此不推荐 4.DCFH-DA （活性氧荧光探针） 原理DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。 生理意义检测细胞内活性氧表征细胞损伤程度 激发波长485nm 发射波长520nm （绿色） 备注推荐使用 5.DHR 123 （活性氧荧光探针） 原理本身无荧光, 在超氧化酶存在时可被过氧化氢(H2O2)氧化, 转变成发射绿色荧光的罗丹明123 (Rhodamine 123), 因此广泛应用于检测细胞内活性氧(ROS), 如过氧化物, 次氯酸和过氧亚硝基阴离子等。 生理意义检测细胞内活性氧表征细胞损伤程度 激发波长507nm 发射波长529nm （绿色） 备注氧化后成罗丹明123，荧光强度可能受到线粒体膜电位的影响 6.RhodamineI23 （线粒体膜电位荧光探针） 原理细胞膜通透的阴离子绿色荧光染料, 能够迅速被活线粒体摄取, 而无细胞毒性。 生理意义标记线粒体膜电位 激发波长488nm 发射波长515 ~ 575nm （绿色） 生理意义检测线粒体膜电位

近红外荧光探针及其在生物分析中的应用进展

收稿日期:2007207211 基金项目:国家自然科学基金(No.20575047,39970206,29575206,20775058) 3通讯联系人:张华山,男,教授,博士生导师,研究方向:分子探针与检测试剂,现代分离. 第24卷第2期 Vol.24　No.2分析科学学报J OU RNAL OF ANAL YTICAL SCIENCE 2008年4月Apr.2008文章编号:100626144(2008)022******* 近红外荧光探针及其在生物分析中的应用进展 傅妮娜1,2,王　红1,张华山31 (1.武汉大学化学与分子科学学院,武汉430072; 2.南京邮电大学公共基础课学部,南京210003) 摘　要:本文评述了自1999年以来近红外荧光探针和标记试剂及其在生物分析中的应 用进展。包括:菁染料、噻嗪和噁嗪染料、含四吡咯基团染料(酞菁和卟啉)、罗丹明类、 BODIP Y 、稀土离子配合物和量子点等。描述了它们在荧光测定和毛细管分离荧光检 测以及免疫荧光分析方面的应用。引用文献75篇。 关键词:近红外荧光探针;荧光检测;生物分析 中图分类号:O657.33 文献标识码:A 1　前言 荧光光谱法由于其灵敏度高、选择性好,获得的信息直观、准确,能科学表达解释复杂样品的结构、分布、含量及生理功能等诸多问题,所以在生物分析及造影方面应用广泛。荧光染料或荧光试剂作为分子探针在生命科学领域备受瞩目。许多生物体及其组织在可见光的激发下自身会发射荧光,严重干扰生物样品的荧光检测和造影,如血浆中血清蛋白的荧光波长范围为325～350nm ,还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酶(NADP H )和胆红素的荧光波长范围为430～470nm ,故使得可见光区荧光分析的灵敏度和准确性受到了很大的影响。近红外荧光探针的最大吸收波长和发射波长为600～900nm ,可避免背景干扰。所以,近红外荧光检测在生物样品分析中有明显的优越性。 二极管激光器的问世,打破了由于传统的激发光源无法在近红外区激发而使近红外荧光染料的应用长期以来一直受到的限制。以此为基础发展起来的新的、近红外荧光试剂及检测技术广泛地应用于核酸、蛋白质、生物造影、免疫分析等领域,在生物分析中显示出巨大的潜力。当然,近红外荧光染料也存在着不足之处,如染料种类不多,合成困难,染料的光、热、化学性质不稳定等。对此文献[1]曾作过评述。本文主要对1999年以来近红外荧光探针及其应用进展进行评述。 2　菁染料(Cyanine) 近红外区的菁染料一般都是指五甲川和七甲川菁染料。另一方面,菁染料光稳定性较差,易发生光氧化漂白。菁染料的光氧化具有以下特点:(1)在溶液中的光氧化反应符合一级反应动力学过程;(2)菁染料中甲川链结构相同时,杂环母核上取代杂原子增大,稳定性降低,即吲哚>噁唑>噻唑>硒唑;(3)当杂环母核结构相同时,甲川链越长,光稳定性越差。这些对于设计光稳定较好的近红外菁染料具有非常重要的指导意义。 菁染料标记生物样品主要有静电/疏水作用非共价、共价形式以及通过活性基团与一些生物分子形成生物结合物(Bioconjugate ),用于标记核酸、蛋白质、免疫分析和造影等。 用于DNA 分析的近红外菁染料中最重要的就是噻唑橙及噁唑橙二聚体和单聚体。二聚体叫TO TO 3 32

荧光探针汇总

精心整理 1. Fluo-3AM （钙离子荧光探针） 原理Fluo-3AM 是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fluo-3AM 的荧光非常弱，进入细胞后可以 被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3，从而被滞留在细胞内，和细胞内游离的钙离子结合，结合钙离子后可以产生较强的荧光。 生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果，因此此探针能表征细胞损伤程度 激发波长506nm 发射波长526nm （绿色） 备注推荐使用 2. Mag-fura-2AM （钙离子荧光探针） 原理Fura-2AM 是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fura-2 AM 进入细胞后可以被细胞内的酯 3 4. 成5. 原理本身无荧光,在超氧化酶存在时可被过氧化氢(H2O2)氧化,转变成发射绿色荧光的罗丹明 123(Rhodamine123),因此广泛应用于检测细胞内活性氧(ROS),如过氧化物,次氯酸和过氧亚硝基阴离子等。 生理意义检测细胞内活性氧表征细胞损伤程度 激发波长507nm 发射波长529nm （绿色） 备注氧化后成罗丹明123，荧光强度可能受到线粒体膜电位的影响 6. RhodamineI23（线粒体膜电位荧光探针） 原理细胞膜通透的阴离子绿色荧光染料,能够迅速被活线粒体摄取,而无细胞毒性。 生理意义标记线粒体膜电位 激发波长488nm 发射波长515~575nm （绿色） 生理意义检测线粒体膜电位

备注正在使用 7.Hoechst33342（DNA荧光探针） 原理Hoechst33342是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测。Hoechst 染料可透过细胞膜在聚AT序列的富集区域的小沟处与DNA结合并对DNA染色而发出强 烈的蓝色荧光。 生理意义标记双链DNA 激发波长355nm发射波长465nm（蓝色） 备注正在使用 8.FDA 原理FDA可透过细胞膜并作为荧光素积蓄在活细胞内。 生理意义反映细胞膜完整性和细胞活力 9.PI（ 倍。 10.EB 11.DAPI 20 12.CalceinAM 原理Calcein-AM由于在Calcein(钙黄绿素)的基础上加强了疏水性，因此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到细胞质后，酯酶会将其水解为Calcein(钙黄绿素)留在细胞内,发出强绿色 荧光，且细胞毒性很低，适合用于活细胞染色。 生理意义检测细胞膜完整性 激发波长494nm发射波长517nm（绿色） 备注跟FDA功能类似，细胞毒性很低，可以长时间标记细胞，但价格比较贵 13.BCECF-AM(pH荧光探针) 原理BCECF-AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料，BCECF-AM没有荧光，进入细胞后被细胞内的酯酶水解成BCECF，从而被滞留在细胞内。BCECF在适当的pH值情况下可以被激发 形成绿色荧光。 生理意义检测细胞内pH

近红外荧光探针基于结构的设计策略与最新进展

近红外荧光探针基于结构的设计策略与最新进展 摘要近红外荧光探针以其优秀的灵敏度和抗干扰性能在生物检测中被广泛应用。近红外荧光探针也成为荧光探针领域的研究热点之一。本文从近红外荧光探针的 结构出发，概述了近年来对于近红外荧光探针基于结构的设计策略，以及这些荧 光探针的机理及特点。 Abstract: Near-infrared fluorescent probes are widely used in biological detection due to their excellent sensitivity and anti-interference performance. Near-infrared fluorescent probes have also become one of the research hotspots in the field of fluorescent probes. In this paper, based on the structure of NIR fluorescent probes, the structure-based design strategy of NIR fluorescent probes in recent years, as well as the mechanism and characteristics of these fluorescent probes are summarized. 1.前言 荧光染料和荧光团是一类能够被光激发而产生荧光的物质，基于他们而设计 的分子探针在生物分析等领域发挥了重要作用。近红外光波段与生物荧光本底值 之间存在200nm以上的距离，对干扰信号具有较好的屏蔽作用。这使得利用近红外荧光探针来检测分析生物样品具有显著的优越性。构建对不同样品有高区分度，对微量样品有较低检测限，对生物体无不良作用，生物可耐受的近红外荧光探针 是荧光探针研究领域的重要课题。本文主要对近年来近红外荧光探针的设计与应 用进展进行概述。 2基于结构的设计策略 2.1基于香豆素结构的设计 香豆素及其衍生物作为天然产物，在植物界中大量存在。香豆素类化合物的 内酯结构可以与苯环产生共轭，共轭体系对荧光量子产率有提升作用，体系能量 降低可以增大Stokes位移[1]。通过合理设计，可以控制香豆素的光学性质，这使 得这类化合物能够成为优秀荧光母核之一。简单香豆素受自身分子性质的限制， 荧光强度和波长不能达到要求，但在香豆素的苯环上引入推电子或电荷密度大的 基团，会有效提高分子内电荷密度，从而明显提高荧光强度。香豆素的3-位具有 易于衍生和调控波长的特点，因此3-位是香豆素分子修饰常用位点，通过延长分 子共轭实现分子合理改造。 Wang Kai等人在7-羟基香豆素的3位引入苯并噻唑结构，通过C-C单键连接，增大原有共轭体系而得到新型近红外荧光分子[2]。通过甲酰化和随后与NBD-NHNH2的缩合，进一步得到可有效检测环境中Ni2+的荧光探针。该探针可以与 Ni2+形成螯合物而失去荧光性能，再利用CN-与Ni2+的配位反应，将Ni2+从螯合 物中解离出来而恢复荧光。Feng Shumin等人通过用2,4-二苯并磺酰磺酰基基团保护氢喹喔啉亚氨基香豆素的亚氨在生理pH条件下，该探针可高度区分H2S与其 他含硫物质，对低浓度的H2S能有效检测，并能以较大的斯托克斯位移发射荧光。该荧光分子具有低细胞毒性，可用在活细胞和动物中对H2S成像。Huang Yongfei 等人通过异佛尔酮与香豆素的反应，在香豆素3-位引入吸电子长共轭体系，成功 设计出对HOCl具有响应快、检测限低特性的近红外比率式荧光探针。通过对细 胞进行成像，该探针可以成功识别内源性的ClO-，对外源性的ClO-也能做出响应，提示有可能应用于早期临床诊断[3]。 2.2基于花菁染料结构的设计 花菁染料的典型结构是由奇数个碳原子形成的共轭链和其两端连接的两个含

生物化学与分子生物学进展(基础)期末考试总结

生物化学与分子生物学进展（基础） 概论、目的基因 分子克隆的载体 核酸序列分析 聚合酶链反应（自学） 分子克隆技术常用的工具酶（自学） 肿瘤转移的分子机制 新生血管研究与转化医学 细胞周期与细胞增殖 基因打靶的设计与实现 细胞分化的分子机制 医学系统生物学和蛋白质组学 细胞信号转导 一、1.操纵子那张图 以乳糖操纵子为例，其组成：大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵序列O，一个启动子P和一个调节基因I 存在诱导物（乳糖）时，mRNA得到转录；不存在诱导物时，mRNA无法转录。 （1）阻遏蛋白的负性调节：没有乳糖存在时，I基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列O处，乳糖操纵子处于阻遏状态，不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时，乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构，不能结合于操纵序列，乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。（2）CAP的正性调节：在启动子上游有CAP结合位点，当大肠杆菌从以葡萄糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境时，cAMP浓度升高，与CAP结合，使CAP发生变构，CAP结合于乳糖操纵子启动序列附近的CAP结合位点，激活RNA聚合酶活性，促进结构基因转录，调节蛋白结合于操纵子后促进结构基因的转录，对乳糖操纵子实行正调控，加速合成分解乳糖的三种酶。 2.概念 （1）基因诊断：利用分子生物学技术，通过检测基因及基因表达产物的存在状态，对人体疾病作出诊断的方法。基因诊断检测的目标分子是DNA、RNA，也可以是蛋白质或者多肽。（2）基因治疗：指将目的基因通过基因转移技术（病毒载体介导或者非病毒载体介导的基因转移技术）导入靶细胞内，目的基因表达产物对疾病起治疗作用。包括直接导入外源正常基因、采用适当的技术抑制细胞内过度表达的基因、将特定的基因导入非病变细胞等。（3）pBR322：大小为4.36kb的环状双链DNA，其碱基序列已经全部清楚，是最早应用于基因工程的大肠杆菌质粒载体之一，有过百个限制性内切酶切点，一种限制性内切酶只有单一切口的位点也多达数十个。 （4）pUC质粒系列：是在pBR322基础上改建成的。大小约2.69kb，去除了pBR322的抗四环素区段，含LacZ基因及其启动子的操纵基因、M13的多聚接头polylinker。含有易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZα，可利用α互补原理进行蓝白筛选。 3.分子医学的主要研究内容 分子医学是指从基因的角度重新认识疾病，运用基因技术预防、诊断和治疗疾病。研究内容主要包括疾病的分子机理、基因诊断、基因治疗和基因预防这四个方面。 （1）疾病的分子机理：探索疾病的原因，是有效治疗疾病的前提。基因科学的发展，为人类从细胞内部的微观生理学和分子生物学水平上寻找病因提供了新的思路。以尿黑酸症为例，

分子荧光的机理和荧光探针原理

1.3荧光分子探针识别机理 1.3.1光诱导电子转移[4,12](Photoinduced Electron Transfer,PET) 典型的PET体系是由包含电子给体的识别基团部分R(reseptor)，通过一间隔基S(space)和荧光团F(fluorophore)相连而构建。其中荧光团部分是光能吸收和荧光发射的场所，识别基团部分则用于结合客体，这两部分被间隔基隔开，又靠间隔基相连而成一个分子，构成了一个在选择性识别客体的同时又给出光信号变化的超分子体系。PET荧光探针中，荧光团与识别基团之间存在着光诱导电子转移，对荧光有非常强的淬灭作用，因此在未结合客体之前，探针分子不发射荧光，或荧光很弱，一旦识别基团与客体相结合，光诱导电子转移作用受到抑制，甚至被完全阻断，荧光团就会发射出强烈荧光（图1-1）。PET荧光探针作用机制可由前线轨道理论来说明（图1-2）。由于与客体结合前后，荧光强度差别非常大，呈明显的“关”、“开”状态，因此这类探针又被称做荧光分子开关。 图1-1 PET荧光探针的一般原理图LUMO 图1-2 PET荧光探针的前线轨道原理图 已报道的PET荧光分子探针中，多数都是以脂肪氨基或氮杂冠醚作为识别基团。de Silva 研究小组利用多种荧光团设计了大量该类PET探针用于氢质子、碱金属阳离子识别。化合物1是一个简单的PET荧光分子探针，在甲醇中和K+络合后，荧光量子产率从0.003增加至0.14。钱旭红等设计的PET荧光探针（化合物2），对氢质子有很好的识别作用，已被Molecular Probe公司推广为细胞内酸性内酯质探针。de Silva研究小组利用类似于EDTA

半胱氨酸荧光分子探针的研究进展要点

半胱氨酸荧光分子探针的研究进展 The research progress of fluorescent molecular probes for cysteine 摘要：近些年来，分子探针因其响应速度快、灵敏度高、使用方便、检测限低等优点应用于对多种分析物的检测。半胱氨酸在很多生理过程中有着重要的作用，因此科研者们制备了多种荧光分子探针来检测半胱氨酸。这篇综述分类总结了基于不同响应机理的半胱氨酸荧光分子探针的研究进展。 Abstract In recent years, while molecular probes have advantages of instantaneous response, high sensitivity, convenient operation and low detection limit, a large number of molecular probes have been developed for various analytes. Scientific researchers have developed a series of fluorescent molecular probes for cysteine homocysteine (Hcy)，because they play crucial roles in many physiological processes. This tutorial review will classify these probes based on different response mechanism. 引言氨基酸是构成蛋白质的基本物质，并且与生物的生命活动有着密切的联系[1,2]。半胱氨酸(Cysteine，Cys)和同型半胱氨酸(Homocysteine，Hey)是含有巯基（-SH）并且结构相差很小的两种氨基酸，在生理过程中有着重要的作用，医学研究表明他们与很多疾病有关，比如肾功能衰竭、老年痴呆症、帕金森疾病、心血管疾病、冠心病，它们在生物体内含量变化可以作为这些疾病诊断的依据[3-8]。因此，人们投注了很大的精力来研究快速灵敏并且有选择性的检测半胱氨酸和同型半胱氨酸的技术，目前已经应用的技术包括高效液相色谱法[9]、毛细管电泳法[10]、电化学检测[11]、光学分析[12,13]和质谱鉴定[14]，这些方法可以在体外监测半胱氨酸和同型半胱氨酸，不能在活细胞中的监测。荧光分子探针不仅灵敏度高选择性好，而且能够在活细胞中检测分析物，所以研究者们开始关注将荧光分子探针的这项技术应用于对体外或者细胞内的半胱氨酸和同型半胱氨酸进行监测或者细胞荧光成像[15]。目前已经报导了多种基于化学反应的该类探针，例如Michael 加成、醛环化反应和裂解反应。在这些方法中，在荧光子内引入荧光淬灭剂2,4-二硝基-苯磺酸盐或2,4-二硝基苯磺酰胺基团，导致荧光猝灭，在半胱氨酸和同型半胱氨酸诱导下发生的裂解，荧光得以恢复，这是一种特别有效的方法。这篇

荧光定量PCR的原理及使用

荧光定量PCR6勺原理及使用 荧光定量PCR 的原理及使用 荧光定量PCR(FQ-PCR) 是新近出现的一种定量PCR 检测方法。其基本特点是：1、用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量。2、荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA ，或双重标记的序列特异性荧光探针或能量信号转移探针等方法获得，大大提高了检测的灵敏度、特异性和精确性。3、动态实时连续荧光检测，免除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程，高效、快速。下面介绍常用的几种检测方法： 1、双链DNA 内插染料 某些染料如SYBR Green I能选择性地与双链DNA结合，同时产生强烈荧光。在PCR过程中SYBR Green I可与新合成的双链DNA结合，产生的荧光信号与双链DNA 成正比。 SYBR Green I 荧光染料技术原理SYBR Green I 是一种只与DNA 双链结合的荧光染料。当它与DNA 双链结合时，发出荧光；从DNA 双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA 分子的数量。SYBR Green 荧光染料法定量PCR 的基本过程是：1、开始反应，当SYBR Green

染料与DNA 双链结合时发出荧光。2、DNA 变性时，SYBR Green 染料释放出来，荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR 产物。4、聚合完成后，SYBR Green 染料与双链产物结合，定量PCR 系统检测到荧光的净增量加大。 SYBR Green I荧光染料与DNA双链的结合 SYBR Green I荧光染料能与所有的DNA双链相结合，对DNA模板没有选择性，所以特异性不如TaqMan探针。要想用荧光染料法得到比较好的定量结果，对PCR引物设计的特异性和PCR反应的质量要求就比较高。在此前提下，本法是一种成本低廉的选择。 2、TaqMan探针技术原理 TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的3'一5' 外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合， 所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5'端标记有报告基团(Reporter, R)，如FAM、

荧光探针

荧光探针的种类、研究热点与研究进展 19920102203495 宋菊平 【摘要】：荧光探针在化学传感、光学材料及生物检测和识别等领域得到了广泛的应用，并成为实现上述功能的一种主要的技术手段。最近，无机发光量子点、荧光聚合物纳米微球、复合荧光二氧化硅纳米粒子等荧光纳米探针的相继出现，为生物分析提供了新的发展领域，成为了近年来研究的热点。而一些传统的探针，也得到了一下新的改进与发展。荧光探针在生物医学光子学领域正呈现一片欣欣向荣的场面。 【关键词】：荧光探针；量子点荧光探针；纳米荧光探针；小分子荧光探针；双光子金属离子荧光探针；硫醇类探针； （一）荧光探针的种类 按照荧光探针制作方式，可分为化学荧光探针和基因荧光探针。其中化学荧光探针是由化学方法合成的，而基因荧光探针是由可遗传、由DNA编码、蛋白质组成的。按荧光波长可分为发射在紫外可见区的荧光探针和近红外区的荧光探针。按荧光探针用途不同可分为荧光标记试剂(fluorescent) 和荧光生成试剂(nuorlgenic)。按荧光探针物质本身的性质又可分为有机(包括稀土金属有机配合物) 荧光探针、量子点荧光探针、高分子荧光探针等按照荧光探针功能来分，可分为细胞活性探针；细胞器探针；膜荧光探针；核酸探针；Ph值探针；免疫荧光探针；钙离子探针；活性氧探针。细胞活性探针是标记活细胞；酯酶底物探针、过氧化物酶底物探针和离子泵活性指示探针识别死细胞，死细胞探针有膜不透性DNA探针和丹磺酰赖氨酸。而其优点是灵敏，安全。细胞器探针是与细胞器选择性结合的荧光染料。主要用途：研究胞内的氧化作用、有丝分裂、底物降解作用、解毒反应、细胞间的转运和细胞分拣等。膜探针是非极性探针、两性探针、膜流动性探针、荧光标记的磷脂、脂肪酸和固醇探针。用途：测量膜的扩散、监测病毒－细胞的融合、观察膜流动性和研究膜表面的分子组成。核酸是细胞生长、分化、遗传的重要物质。用途：测定DNA和RNA的形态和含量；研究细胞周期和肿瘤的诊断、治疗和预防。 （二）一些荧光探针热点的实例 1：小分子荧光探针 小分子荧光探针一般由两部分组成：荧光团以及与受体专一性高亲和力结合的配体。受体与目标蛋白质融合，通过受体与配体的相互作用来标记蛋白质。总体说来，小分子荧光探针应该可以穿过细胞膜并且无毒；能够与受体专一性稳定结合，使得其在进行监测的较长时间（几个小时）内保持稳定性；背景噪音水平尽可能的低；探针尽可能地设计成一定的模式，使得多种荧光团能够方便地结合。选择合适的受体可以实现对蛋白质位点专一性结合。对于受体的选择有以下两个要求：（1）受体与目标蛋白质融合后必须能够被基因表达；（2）受体应该尽可能小，以致不干扰目标蛋白质的正常生理功能，因此较理想的受体是一段短序列的肽链并且能够插入目标蛋白质的许多位点。而选择适合的受体-配体对可以实现对蛋白质高灵敏度高亲和力结合。一般说来，受体与配体的结合应当尽可能地快，有利于监测时间敏感

2荧光探针设计原理(优选.)

最新文件---------------- 仅供参考--------------------已改成-----------word文本 --------------------- 方便更改 赠人玫瑰，手留余香。 荧光化学传感器是建立在光谱化学和化学波导与量测技术基础上的将分析对象的化学信息以荧光信号表达的传感装置。其主要组成部件有三个(图1．1)：1．识别结合基团(R)，能选择性地与被分析物结合，并使传感器所处的化学环境发生改变。这种结合可以通过配位键，氢键等作用实现。2．信号报告基团(发色团, F)，把识别基团与被分析物结合引起的化学环境变化转变为容易观察到的输出信号。信号报告基团起到了信息传输的作用，它把分子水平上发生的化学信息转换成能够为人感知(颜色变化)或仪器检测的信号(荧光等)。3．连接基团(S)，将信号报告基团和识别结合基团连接起来，根据设计的不同连接基团可有多种选择，一般用做连接基团的是亚甲基等短链烷基。连接基团的合适与否将直接影响是否有输出信号的产生。信号表达可以是荧光的增强或减弱、光谱的移动、荧光寿命的变化等。 图1.1 荧光探针的结构 1.1.1 荧光探针的一般设计原理

(1) 结合型荧光探针[21] + Analyte Signalling subunit Space Binding subunit Output signal 图1.2 共价连接型荧光探针 结合型荧光探针是利用化学共价键将识别基团和荧光基团连接 起来的一类荧光探针，是比较常见的一类荧光探针。该类探针通过对比加入分析物前后荧光强度的变化、光谱位置的移动或荧光寿命的改变等实现对分析物的检测。在该类荧光化学传感器的设计中，必须充分考虑下列三个方面的因素。(a) 受体分子的荧光基团设计、合成：考虑到用于复杂环境体系的荧光检测，要求荧光基团要有强的荧光（高荧光量子产率，有利于提高检测的灵敏性），Stokes 位移要大（可有效消除常规荧光化合物如荧光素等具有的自猝灭现象），荧光发射最好要在长波长区（最好位于500 nm 以上，可避免复杂体系的常位于短波长区的背景荧光的干扰，另外由于长波长区发射的荧光能量的降低可减少荧光漂白现象的发生而延长传感器的使用寿命）。(b) 受体分子的识别基团：受体分子的识别基团设计以软硬酸碱理论、配位作用以及超分子作用力（如氢键、范德华力等）作为理论指导，多选择含氮、硫、磷杂环化合物作为识别分子。(c) 荧光超分子受体的组装：组装荧光超分子受体就是利用一个连接基将识

2荧光探针设计原理教学文案

2荧光探针设计原理

荧光化学传感器是建立在光谱化学和化学波导与量测技术基础上的将分析对象的化学信息以荧光信号表达的传感装置。其主要组成部件有三个(图1．1)：1．识别结合基团(R)，能选择性地与被分析物结合，并使传感器所处的化学环境发生改变。这种结合可以通过配位键，氢键等作用实现。2．信号报告基团(发色团, F)，把识别基团与被分析物结合引起的化学环境变化转变为容易观察到的输出信号。信号报告基团起到了信息传输的作用，它把分子水平上发生的化学信息转换成能够为人感知(颜色变化)或仪器检测的信号(荧光等)。3．连接基团(S)，将信号报告基团和识别结合基团连接起来，根据设计的不同连接基团可有多种选择，一般用做连接基团的是亚甲基等短链烷基。连接基团的合适与否将直接影响是否有输出信号的产生。信号表达可以是荧光的增强或减弱、光谱的移动、荧光寿命的变化等。 图1.1 荧光探针的结构 1.1.1 荧光探针的一般设计原理 (1) 结合型荧光探针[21]

+ Analyte Signalling subunit Space Binding subunit Output signal 图1.2 共价连接型荧光探针 结合型荧光探针是利用化学共价键将识别基团和荧光基团连接起来的一类荧光探针，是比较常见的一类荧光探针。该类探针通过对比加入分析物前后荧光强度的变化、光谱位置的移动或荧光寿命的改变等实现对分析物的检测。在该类荧光化学传感器的设计中，必须充分考虑下列三个方面的因素。(a) 受体分子的荧光基团设计、合成：考虑到用于复杂环境体系的荧光检测，要求荧光基团要有强的荧光（高荧光量子产率，有利于提高检测的灵敏性），Stokes 位移要大（可有效消除常规荧光化合物如荧光素等具有的自猝灭现 象），荧光发射最好要在长波长区（最好位于500 nm 以上，可避免复杂体系的常位于短波长区的背景荧光的干扰，另外由于长波长区发射的荧光能量的降低可减少荧光漂白现象的发生而延长传感器的使用寿命）。(b) 受体分子的识别基团：受体分子的识别基团设计以软硬酸碱理论、配位作用以及超分子作用力（如氢键、范德华力等）作为理论指导，多选择含氮、硫、磷杂环化合物作为识别分

荧光探针定量PCR技术原理及应用

荧光探针定量PCR技术原理及应用 PCR技术是通过对基因的选择性片段进行体外高效扩增，实现目的基因的检测。荧光探针定量PCR （FQ-PCR）是一种新的基因定量检测技术，国外文献多用“实时定量PCR（real time quantitative PCR）”或“TaqMan PCR(以美国PE公司商标命名) ”。该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针，巧妙地把核酸扩增（PCR）、杂交及光谱技术结合在一起，从而实现了对目的基因的准确定量检测，正发展成为临床实验诊断的常规技术。 1.原理 FQ-PCR的工作原理[1-3]是利用Taq酶的5’→ 3’外切酶活性，在PCR反应系统中加入一个荧光标记的探针。该探针可与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交，探针的5’端标以荧光报告基团FAM （6-羧基荧光素，荧光发射峰值在518mm处），靠近3’端标以荧光淬灭基团TAMRA(6-羧基四甲基诺丹明,荧光发射峰值在582nm处)，两者之间构成能量传递结构。当探针保持完整时，5’端荧光报告基团所激发出的荧光信号被3’端淬灭基因吸收或抑制，不出现荧光信号变化。当PCR反应体系中有目的基因存在，就会扩增出特异核酸片段，荧光探针即会根据碱基配对的原理与之杂交。当PCR进入延伸（复制）期，Tap 酶从引物3’端开始,随新链延伸沿DNA模板移动，当移动到探针结合的位置时，其5’→ 3’端外切酶活性作用，将探针切断（切口平移效应）。荧光报告基团和淬灭基团间的能量传递结构被破坏，淬灭基团的淬灭作用被解除，荧光报告基团的荧光信号释放出来（图1）。PCR反应每复制一个特异核酸片段，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PRC产物是一对一的关系，因此用荧光检测技术检测出的荧光信号有无或强弱，即代表扩增产物有无或多少。由于荧光信号是代表扩增产物的有效特异信号，无需进行有效和无效信号分离，实现了仪器实时检测(图2)，为新的PCR定量原理创造了条件。