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?综述?
肠源性内毒素血症与非酒精性脂肪性肝病关系的研究进展福建医科大学省立临床医学院福建省立医院消化内科（福州３５０００１）张奕秉１综述林志辉审校
【关键词】肠源性内毒素；脂肪肝；非酒精性
【中图分类号】Ｒ５７５．５【文献标识码】Ａ【文章编号】１００２—２６００（２０１０）０１—００９０—０３
非酒精性脂肪性肝病（ＮＡＦＬＤ）是指除外过量饮酒和其他明确的损肝因素所致的，以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变为主要特征的临床病理综合征。病理上包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬化和肝细胞癌…。其发病机制较复杂，目前尚未完全阐明。其中肠源性内毒素血症（ＩＥＴＭ）可能与其发病机制有关。本文就ＮＡＦＬＤ形成过程中ＩＥＴＭ形成机制的研究进展作一综述。
１ＩＥＴＭ与ＮＡＦＩ。Ｄ的关系
１．１内毒素与Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞：肝脏是清除肠源性细菌及其内毒素脂多糖（ＬＰＳ）的重要场所。肝脏的内毒素脂多糖反应性十分复杂，涉及到肝细胞和Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞间的相互作用：Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞被ＬＰＳ活化后释放大量炎症细胞因子，激活肝细胞，进而扩大炎症反应的范围和程度；肝细胞也表达ＴＬＲ４受体［２］，并在ＬＰＳ的作用下被激活而释放炎症细胞因子，促进肝脏Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞活化。Ｓｃｏｔｔ等［３］也发现肝细胞有促进Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞的ＬＰＳ反应性和分泌脂多糖结合蛋白（Ｉ，ＢＰ），表达ＴＬＲ４／ＣＤｌ４以及加强肝细胞与Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞间相互作用的功能。这些都是影响Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞分泌细胞炎症因子的关键因素。多项研究显示，脂肪肝时肝脏对ＬＰＳ敏感性增加，徐正婕等…给肥胖脂肪性肝炎模型大鼠腹腔内注射小剂量内毒素，发现大鼠肝小叶内炎症加重并出现明显坏死，而对照组正常，提示，伴肥胖脂肪性肝炎大鼠肝脏对内毒素的耐受力明显降低。
１．２内毒素与自然杀伤细胞：活化的自然杀伤细胞可合成和分泌多种细胞因子，发挥调节免疫以及直接杀伤靶细胞的作用。在肥胖、瘦素缺乏的ｏｂ／ｏｂ小鼠中，高脂饮食可引起肝脏免疫系统失衡，肝脏自然杀伤细胞减少。Ｌｉ等［５３研究提示，瘦素缺陷一低肾上腺紊一肝脏自然杀伤Ｔ淋巴细胞减少一促炎细胞因子／抗炎细胞因子失平衡可能是ｏｂ／ｏｂ小鼠内毒素肝毒性增加的原因。研究证实，ＣＤｌｄ缺乏的小鼠对ＬＰＳ的肝毒性非常敏感。ＮＫ细胞减少，促进肝脏Ｔｈ—ｌ细胞因子产物增加，在接受Ｉ。ＰＳ刺激后其增加更明显，加重了肝脏炎症［６］，因此，推断ＬＰＳ可能是ＮＫ细胞减少的原因之一。
１．３细胞因子和炎症介质：内毒素不仅对肝细胞有直接损害作用，还可通过激活Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞，促进ＴＮＦ－ａ等细胞因子和炎性介质的释放，从而使内毒素的作用逐渐放大。Ｙｅｅ等［７］证实，ＴＮＦ＿ａ释放、中性粒细胞浸润和凝血系统活化是内毒索性肝损伤的关键因素。Ｈｉｇｕｃｈｉ等【８］发现，在ＬＰＳ诱导的肝损伤中Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞活化及其释放的ＴＮＦ－ａ是介导
１福建医科大学２００７级硕士研究生ＬＰＳ性肝损伤的重要媒介。ＴＮＦ＿ａ诱导中性粒细胞在肝内聚集，一方面导致肝脏炎性损害；另一方面又促进肝内凝血系统活化，迸一步加重肝脏损害。ＮＡＦＩ。Ｄ肥胖患者外周血ＴＮＦ—ａ、ＩＬ一１与肝组织学改变严重程度有关，肝脏和血清中的ＴＮＦ－ａ均有很大程度增加［９］。
２ＩＥＴＭ在ＮＡＦＬＤ发展过程中的形成机制
２．１小肠细菌过度生长：肝脏作为门静脉的首过器官，其与肠道微生态不仅在解剖上，而且在功能上都有着密切的联系。Ｓａｌｖａｌａｇｇｉｏ等［１０］研究发现，细菌过度生长是肠梗阻细菌移位的主要原因。肠道运动障碍是肠道细菌过度生长的前提条件。近年来研究认为，肠道微生态改变也在原发性ＮＡＦＬＤ的发病中起重要作用。Ｌｉ等［１１］研究表明，衰老的ｏｂ／ｏｂ小鼠存在肠道淤滞和细菌过度繁殖，肠道细菌产生的乙醇和其他产物增多，口服益生菌可使ｏｂ／ｏｂ小鼠脂肪性肝炎得到明显改善。其增多原因目前尚不清楚，可能与神经～体液因素改变和相关的炎症介质如Ｎ０、血小板活化因子（ＰＡＦ）、ＩＬ等抑制胃肠道平滑肌收缩，引起胃肠运动功能明显减弱、排空不畅，导致小肠内容物淤滞时间过长，促进肠道细菌过度生长有关。肝细胞脂肪变性和脂肪性肝炎的潜在性危险冈素是细菌过度生长，这可能促使ＮＡＳＨ患者内源性乙醇产物和炎症因子增加，导致肝脏氧化应激的发生‘１“。
２．２肠道黏膜通透性增高：
２．２．１内毒素：内毒素激活肠黏膜上腺苷环酶，可损伤上皮细胞线粒体和溶酶体。导致肠绒毛顶部细胞坏死和上皮细胞自溶；还可激活补体系统、血液凝固系统，以及激活巨噬细胞的ＩＬ等直接或间接的导致肠黏膜屏障功能损伤。Ｍａｒ－ｋｅｌ等［１３］研究表明，细菌产物ＬＰＳ，主要通过抑制新生肠上皮细胞的迁移和减弱细胞修复因子修复作用，使局部肠黏膜破损。导致内毒素入侵。触发炎症瀑布反应链发生，最终使局部缺血坏死以及肠屏障损坏。
２．２．２缺血缺氧：在非酒精性脂肪性肝炎等病理情况下，肠绒毛顶端易发生缺血性损害，通过形成具有毒性的活性氧代谢产物，包括超氧阳离子、过氧化氢、羟自由基等，使得肠黏膜上皮水肿，细胞间连接断裂，细胞坏死、导致肠通透性增加，细菌移位发生。Ｌｉｕ等［１．］研究表明：肠道发生炎症时，肠壁充血和肠管扩张，造成肠黏膜局部缺血缺氧以及线粒体结构破坏，使肠黏膜和小肠绒毛坏死、脱落，局部肠壁通透性增加，肠腔内细菌、内毒素通过增宽的肠壁渗透到血液循环，进入肝脏。肠上皮细胞缺氧时，为保持足够的能量
万方数据
水平供应。细胞无氧代谢逐渐增加，ＡＴＰ耗竭造成细胞酸中毒。酸中毒通过抑制谷胱甘肽还原酶和谷胱甘肽过氧化物酶。促进脂质过氧化物及氧化剂介导的细胞损伤来提高上皮细胞的通透性。此外，酸中毒时由于细胞内Ｈ＋浓度增加，引起Ｃａ２＋一Ｈ＋离子交换及激活Ｐ浆膜钙离子通道。细胞内Ｃａ２＋浓度增加，可松解紧密连接以及提高肠上皮通透性。
２．２．３细胞因子：在ＮＡＳＨ时，大量的促炎性细胞因子如ＴＮＦ－ａ、ＮＯ、ＰＡＦ、ＩＬ、ＩＦＮ等产生并相互作用，造成肠黏膜屏障损伤，可增加动物模型肠上皮细胞的通透性。研究表明，ＰＡＦ在肠屏障损伤和菌群移位的病理变化中起重要作用，也是发生全身炎性反应综合征的关键性因子。实验表明，ＴＮＦ－ａ通过改变肠细胞的形态和功能，还影响黏附因子以及肌动蛋白而增加肠黏膜通透性。Ｎ０可形成亚硝酰基复合物，可致细胞呼吸抑制，肠黏膜脂质过氧化损伤和肠上皮细胞凋亡。
２．２．４细胞凋亡：肠黏膜上皮细胞凋亡和有丝分裂处于动态平衡状态，可预防肠源性内毒素侵入，保持组织内环境稳定。肠缺血再灌注等可导致肠黏膜上皮细胞ｂａｘ上调、ｂｃｌ一２下调，从而使相关蛋白发生变化，导致细胞凋亡增加；肠黏膜上皮细胞过度凋亡可导致肠黏膜屏障的破坏，通透性增加，肠道细菌易位增加。Ｊｏｎｅｓ等［１ｓ］研究发现，随肠上皮细胞向上移行至绒毛顶端，其凋亡诱导基因ｂａｘ表达也相应增高，提示细胞凋亡参与了肠绒毛顶细胞的脱落，进而推测凋亡过度则不利于肠黏膜上皮的再生与修复，引起肠屏障功能障碍。
２．３肝脏Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞激活：Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞常受肠道细菌、微生物碎片和ＬＰＳ等因子刺激，释放细胞因子、类前列腺素、氧化亚氮和活性氧簇，这些因子一方面调控Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞自身的功能活性，介导炎症反应；另一方面又和临近细胞（肝细胞、星形细胞、内皮细胞等）产生交互调控［１“。在大量ＬＰＳ作用下，Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞ＬＰＳ信号转导系统被激活，释放大量促炎因子，介导肝脏炎症反应和病理损害。肝脏损害致解毒功能降低，继而循环中内毒素水平增高，其反过来又加重了肠黏膜屏障功能，形成瀑布反应。总之，在ＮＡＳＨ形成过程中，伴有小肠细菌过度生长、肠黏膜通透性增高、细菌移位等使循环中内毒素水平增高，并激活Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞，合成、释放大量细胞因子和炎症介质，加重肝损害，形成恶性循环，促进病变的发生与发展，最终可能发生肝纤维化、肝硬化。
３ＮＡＦＬＤ防治的新靶点
由于ＩＥＴＭ可能是ＮＡＦＬＤ和酒精性肝病共同的发病机制之一，从肠道人手治疗脂肪性肝病成为可能。采取治疗措施适当降低ＩＥＴＭ，将有助于预防脂肪肝的发生和发展。根据研究报道，肠道黏膜保护剂、促动力剂增强肠蠕动、减少肠源性内毒素吸收的抗生素、益生菌和乳果糖等药物均对ＮＡＦＬＤ有一定的治疗作用。
微生态调节剂包括医学益生菌等，有助于恢复肠道微生态平衡，修复肠道菌膜屏障。抑制潜在致病菌过度生长，故具有一定的避免肠源性内毒素增加的作用。乳果糖还可直接灭活内毒素，并通过其酸性代谢产物促进肠蠕动，加快肠道细菌及毒素的排出。范建高等ｆｌ７３研究发现，口服乳果糖能
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明显改善高脂饮食大鼠血清转氨酶和肝组织炎症坏死程度。全胃肠道促动力药物等可纠正胃肠动力障碍，减轻肠动力异常可能导致的小肠细菌过度生长。Ｆｕ等［１８］研究显示，ＮＡＦＬ患者口一盲肠通过时间要比健康人显著延长，服用西沙比利４周后。口一盲肠通过时间明显缩短，体内内毒素水平明显降低。提示，在肠运动功能紊乱和存在内毒素血症的ＮＡＦＬ患者中恢复肠运动功能的同时可改善内毒素血症。谷氨酰胺是肠黏膜最重要的能源。在维持肠的正常代谢、结构和功能等方面有重要作用。内毒素可使谷氨酰胺酶活性降低。致使肠利用符氨酰胺减少，造成肠能源不足，从而使肠黏膜受损，其通透性增加。此外，小肠从血中摄取谷氨酰胺减少，导致肠营养障碍加重肠黏膜屏障功能衰竭。
４小结
关于肠黏膜屏障及ＩＥＴＭ在ＮＡＦＬＤ发病中究竟起了什’么作用目前尚未完全阐明，ＩＥＴＭ发生的确切机制也并不完全清楚，脂肪肝时外周血循环中内毒素水平是否比正常人高还存在争议。设想的途径是ＮＡＦＩ，Ｄ病人由于伴有小肠细菌过度生长，当肠黏膜的屏障功能破坏，通透性增加，肠道内细菌及毒素进入血液循环及组织，引起不同程度的内毒素血症。内毒素血症又促进细胞因子和炎性介质的释放，减弱Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞对内毒索的清除作用，反过来加快肠黏膜屏障的损坏，形成恶性循环，进而加速脂肪肝的发展进程。研究ＩＥＴＭ在ＮＡＦＬＤ中的作用，将指导我们采取适当治疗措施降低ＩＥＴＭ，或保护肝细胞免受内毒素的损害，有助于预防脂肪肝的发生和发展。
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ｏｆＩＬ－ｌａｌｐｈａａｎｄＴＮＦ—ａｌｐｈａｉｎｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｅｃｈａｒｉｄｅ－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｂｌｏｏｄｆｒｏｍｏｂｅｓｅ
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用于树突状细胞治疗的单个核细胞分离与纯化技术研究现状福建省血液中心（福州３５０００４）曾嘉郭永建陈颖
【关键词】树突细胞；单个核细胞；细胞分离；【中图分类号１Ｒ３９２．３３【文献标识码】Ａ
免疫磁化分离
【文章编号１１００２—２６００（２０１０）０１—００９２—０２
树突状细胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌ，ＤＣ）是目前已知人体内功能最强大、唯一能激活静息期Ｔ细胞的专职抗原呈递细胞，具有强大的激活ＣＤ８＋细胞毒性Ｔ细胞（ＣＴＬ）及ＣＤ４＋辅助Ｔ细胞的能力。研究表明，以ＤＣ为基础的免疫疗法在当今肿瘤治疗中是最有价值也是最有前途的方法之一［１】。获取足够数量且特性满足要求的ＤＣ是实施这一可能手段的关键之一。由于人体血循环中可获得的ＤＣ数目非常有限，目前，临床研究及实验中常用的手段是通过先采集患者自身外周血的ＣＤｌ４‘单核细胞或ＣＤ３４＋造血干细胞，然后通过对这两种细胞进行体外培养分化进而得到ＤＣ。结果证明，这两类细胞均能经体外培养分化出生物学功能完好的ＤＣ［２１。与脐血、骨髓来源相比，成人外周血ＣＤｌ４＋单核细胞来源的ＤＣ培养方法除了取材容易外，还具有成熟阶段易于调控的优点。特别是对于肿瘤免疫的研究，外周血来源１３（３是目前公认获得成熟ＤＣ的最佳途径［３］。本文就近期外周血单个核细胞的分离和纯化技术作一介绍。
１外周血单个核细胞分离法
外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）包括淋巴细胞和单核细胞。由于外周血中各种细胞的比重不同，因此可以将外周血中的单个核细胞（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌ，ＭＮＣ）予以分离采集。１．１传统分离法：ＰＢＭＣ分离最传统的方法是采集一定量的抗凝全血，直接分离提取单核细胞。经典的Ｆｉｅｏｌｌ分离液法主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。Ｆｉｃｏｌｌ密度梯度常用于少量血液分离，而在血液较多时则必须分成许多离心管，重复地开放操作增加了污染机会。李建彬等［４１报道利用无菌塑料袋可以分离几毫升到上千毫升从供者身上采集的ＰＢＭＣ，解决了分离过程中的细菌污染问题。用羟乙基淀粉（ＨＥＳ）分离ＰＢＭＣ也可在无菌塑料袋巾进行，非开放性操作减少了污染机会，与Ｆｉｃｏｌｌ法相比，ＨＥＳ离心沉淀法除简化了操作外，也减少了耗材，降低了试验成本¨】。
然而现在以临床治疗为目的的ＤＣ，从原始细胞的采集纯化到后续的体外培养和分化均应符合现行药品生产管理规范（ＣｕｒｒｅｎｔＧｏｏｄＭａｎｕｆａｃｔｕｒｅＰｒａｃｔｉｃｅｓ，ｃＧＭＰ）指南的要求。且要求有足够数量的ＤＣ供临床多疗程治疗使用ｆ６。】。传统做法一次少量抽血能培养出的Ⅸ：数量有限，细胞分离过程麻烦，难以满足临床治疗的需求。阂此，成功地获取数量允足的ＭＮＣ并从中富集ＣＤｌ４＋单核细胞是实施ＤＣ治疗的关键之～。
１．２现代分离法：始于２０世纪初的现代血液分离采集技术为ＤＣ应用于临床治疗提供了口『能。自Ｄｒ．Ｃｏｈｎ在上世纪５０年代初开发出以自己名字命名的第一台封闭式血液分离机后，几乎同时，各种类型的血细胞分离机也悄然出现。当今，血细胞分离技术已相当成熟和完善。血液成分的分离采集已应用到临床各个领域。现常用血细胞分离机有ＣＳ－３０００、Ａｍｉｃｕｓ（Ｂａｘｔｅｒ）、ＳＰＥＣＴＯＲ（Ｇａｍｂｒｏ）、ＡＳ．ＴＥＣ２０４（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ）等。机内预设有多种针对不同细胞成分的采集程序。基于治疗的外周廊单个核细胞采集属于白细胞采集的一个子程序（ＡＵＴＯ－ＰＢＳＣ）。Ａｎｋｅ等［８３分别应用ＳＰＥＣＴＯＲ（Ｇａｍｂｒｏ）、ＡＳ．ＴＥＣ２０４（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ）血细胞分离机成功地对肿瘤患者和健康献血者进行ＭＮＣ采集，其中部分患者在继末次化疗４周后使用了粒细胞集落刺激因子（Ｃ－ＣＳＦ）动员剂（３００“ｇ／ｄ剂量），维持３天后开始采集，所有采集产物中ＭＮＣ的平均值为（１３．９士５．９）×１０９／Ｌ，
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