pIEx-Bac-3昆虫表达载体说明
pIEx/Bac-3
编号 载体名称
北京华越洋生物KCVECT135 pIEx/Bac--‐3
pIEx-Bac-3载体基本信息
载体名称: pIEx/Bac-3
质粒类型: 昆虫细胞表达载体；蛋白纯化
高拷贝/低拷贝: 高拷贝
启动子: IE-1
克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶
载体大小: 6802 bp
5' 测序引物及序列: --
3' 测序引物及序列: --
载体标签: N-His tag, C-Strep tagII
载体抗性: 氨苄青霉素（Ampicillin）
筛选标记: --
备注: 具有两套标签，可以采用两套纯化方案进行蛋白纯化。
稳定性: --
组成型: --
病毒/非病毒: 杆状病毒
pIEx-Bac-3载体质粒图谱和多克隆位点信息
pIEx--‐Bac--‐3载体简介
The pIEx/Bac--‐3 vectors are dual--‐purpose vectors that offer unique flexibility for cloning and expression of proteins in Spodoptera--‐derived insect cells. These vectors contain the Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) enhancer/immediate early promoter combination (hr5/ie1) for plasmid--‐mediated and early baculovirus expression, and the AcNPV p10 very late promoter for robust baculovirus--‐mediated expression. All pIEx/Bac plasmids carry AcNPV--‐derived virus regions to mediate recombination at the polh l ocus. T he p IEx/Bac--‐3 v ector c ontains a n N--‐terminal H is?Tag? c oding s equence w ith 10 histidines followed by an HRV 3C protease cleavage site and a multiple cloning site, with the option to include a C--‐terminal thrombin protease cleavage site and 8 aa Strep?Tag? II coding sequence. pIEx/Bac--‐3 is also available as a 3C/LIC vector. The 3C/LIC vector is prepared for rapid directional cloning of PCR--‐amplified DNA. Using specifically designed primers for amplification, inserts can be efficiently cloned without the n eed f or r estriction e nzyme d igestion o r l igation.
pIEx--‐Bac--‐3载体序列
ORIGIN
1 GGAACGGCTC CGCCCACTAT TAATGAAATT AAAAATTCCA ATTTTAAAAA ACGCAGCAAG 61 AGAAACATTT GTATGAAAGA ATGCGTAGAA GGAAAGAAAA ATGTCGTCGA CATGCTGAAC 121 AACAAGATTA ATATGCCTCC GTGTATAAAA AAAATATTGA ACGATTTGAA AGAAAACAAT 181 GTACCGCGCG GCGGTATGTA CAGGAAGAGG TTTATACTAA ACTGTTACAT TGCAAACGTG 241 GTTTCGTGTG CCAAGTGTGA AAACCGATGT TTAATCAAGG CTCTGACGCA TTTCTACAAC 301 CACGACTCCA AGTGTGTGGG TGAAGTCATG CATCTTTTAA TCAAATCCCA AGATGTGTAT 361 AAACCACCAA ACTGCCAAAA AATGAAAACT GTCGACAAGC TCTGTCCGTT TGCTGGCAAC 421 TGCAAGGGTC TCAATCCTAT TTGTAATTAT TGAATAATAA AACAATTATA AATGCTAAAT 481 TTGTTTTTTA TTAACGATAC AAACCAAACG CAACAAGAAC ATTTGTAGTA TTATCTATAA 541 TTGAAAACGC GTAGTTATAA TCGCTGAGGT AATATTTAAA ATCATTTTCA AATGATTCAC 601 AGTTAATTTG CGACAATATA ATTTTATTTT CACATAAACT AGACGCCTTG TCGTCTTCTT 661 CTTCGTATTC CTTCTCTTTT TCATTTTTCT CTTCATAAAA ATTAACATAG TTATTATCGT 721 ATCCATATAT GTATCTATCG TATAGAGTAA ATTTTTTGTT GTCATAAATA TATATGTCTT 781 TTTTAATGGG GTGTATAGTA CCGCTGCGCA TAGTTTTTCT GTAATTTACA ACAGTGCTAT 841 TTTCTGGTAG TTCTTCGGAG TGTGTTGCTT TAATTATTAA ATTTATATAA TCAATGAATT
901 TGGGATCGTC GGTTTTGTAC AATATGTTGC CGGCATAGTA CGCAGCTTCT TCTAGTTCAA 961 TTACACCATT TTTTAGCAGC ACCGGATTAA CATAACTTTC CAAAATGTTG TACGAACCGT 1021 TAAACAAAAA CAGTTCACCT CCCTTTTCTA TACTATTGTC TGCGAGCAGT TGTTTGTTGT 1081 TAAAAATAAC AGCCATTGTA ATGAGACGCA CAAACTAATA TCACAAACTG GAAATGTCTA 1141 TCAATATATA GTTGCTGATC AGATCTGATC ATGGAGATAA TTAAAATGAT AAGGGCGCGT 1201 AAAACACAAT CAAGTATGAG TCATAAGCTG ATGTCATGTT TTGCACACGG CTCATAACCG 1261 AACTGGCTTT ACGAGTAGAA TTCTACTTGT AACGCACGAT CAGTGGATGA TGTCATTTGT 1321 TTTTCAAATC GAGATGATGT CATGTTTTGC ACACGGCTCA TAAACTCGCT TTACGAGTAG 1381 AATTCTACGT GTAACGCACG ATCGATTGAT GAGTCATTTG TTTTGCAATA TGATATCATA 1441 CAATATGACT CATTTGTTTT TCAAAACCGA ACTTGATTTA CGGGTAGAAT TCTACTTGTA 1501 AAGCACAATC AAAAAGATGA TGTCATTTGT TTTTCAAAAC TGAACTCGCT TTACGAGTAG 1561 AATTCTACGT GTAAAACACA ATCAAGAAAT GATGTCATTT GTTATAAAAA TAAAAGCTGA 1621 TGTCATGTTT TGCACATGGC TCATAACTAA ACTCGCTTTA CGGGTAGAAT TCTACGCGCG 1681 TCGATGTCTT TGTGATGCGC GCGACATTTT TGTAGGTTAT TGATAAAATG AACGGATACG 1741 TTGCCCGACA TTATCATTAA ATCCTTGGCG TAGAATTTGT CGGGTCCATT GTCCGTGTGC 1801 GCTAGCATGC CCGTAACGGA CCTCGTACTT TTGGCTTCAA AGGTTTTGCG CACAGACAAA 1861 ATGTGCCACA CTTGCAGCTC TGCATGTGTG CGCGTTACCA CAAATCCCAA CGGCGCAGTG 1921 TACTTGTTGT ATGCAAATAA ATCTCGATAA AGGCGCGGCG CGCGAATGCA GCTGATCACG 1981 TACGTCCCTC GTGTTCCGTT CAAGGACGGT GTTATCGACC TCAGATTAAT GTTTATCGGC 2041 CGACTGTTTT CGTATCCGCT CACCAAACGC GTTTTTGCAT TAACATTGTA TGTCGGCGGA 2101 TGTTCTATAT CTAATTTGAA TAAATAAACG ATAACCGCGT TGGTTTTAGA GGGCATAATA 2161 AAAGAAATAT TGTTATCGTG TTCGCCATTA GGGCAGTATA AATTGACGTT CATGTTGGAT 2221 ATTGTTTCAG TTGCAAGTTG ACACTGGCGG CGACAAGATC GTGAACAACC AAGTGACTCC 2281 GGGACCTTTA ATTCAACCCA ACACAATATA TTATAGTTAA ATAAGAATTA TTATCAAATC 2341 ATTTGTATAT TAATTAAAAT ACTATACTGT AAATTACATT TTATTTACAA TCCATGGCAC 2401 ATCACCACCA TCATCACCAT CACCACCACG GTGCACTTGA AGTCCTCTTT CAGGGACCCG 2461 GGTACCAGGA TCCTGTACAA GTCGACGCGG CCGCAGAGCT CGCTCTGGTG CCACGCGGTA 2521 GTTCCGCTTG GAGCCACCCG CAGTTCGAAA AGTAAGTGAT TAACCTCAGG TTATACATAT 2581 ATTTTGAATT TAATTAATTA TACATATATT TTATATTATT TTTGTCTTTT ATTATCGAGG 2641 GGCCGTTGTT GGTGTGGGGT TTTGCATAGA AATAACAATG GGAGTTGGCG ACGTTGCTGC 2701 GCCAACACCA CCTCCCTTCC CTCCTTTCAT CATGTATCTG TAGATAAAAT AAAATATTAA 2761 ACCTAAAAAC AAGACCGCGC CTATCAACAA AATGATAGGC ATTAACTTGC CGCTGACGCT 2821 GTCACTAACG TTGGACGATT TGCCGACTAA ACCTTCATCG CCCAGTAACC AATCTAGGTA 2881 GCTGAGCGCA TGCAAGCTGA TCCGGGTTAT TAGTACATTT ATTAAGCGCT AGATTCTGTG 2941 CGTTGTTGAT TTACAGACAA TTGTTGTACG TATTTTAATA ATTCATTAAA TTTATAATCT 3001 TTAGGGTGGT ATGTTAGAGC GAAAATCAAA TGATTTTCAG CGTCTTTATA TCTGAATTTA 3061 AATATTAAAT CCTCAATAGA TTTGTAAAAT AGGTTTCGAT TAGTTTCAAA CAAGGGTTGT 3121 TTTTCCGAAC CGATGGCTGG ACTATCTAAT GGATTTTCGC TCAACGCCAC AAAACTTGCC 3181 AAATCTTGTA GCAGCAATCT AGCTTTGTCG ATATTCGTTT GTGTTTTGTT TTGTAATAAA 3241 GGTTCGACGT CGTTCAAAAT ATTATGCGCT TTTGTATTTC TTTCATCACT GTCGTTAGTG 3301 TACAATTGAC TCGACGTAAA CACGTTAAAT AGAGCTTGGA CATATTTAAC ATCGGGCGTG 3361 TTAGCTTTAT TAGGCCGATT ATCGTCGTCG TCCCAACCCT CGTCGTTAGA AGTTGCTTCC 3421 GAAGACGATT TTGCCATAGC CACACGACGC CTATTAATTG TGTCGGCTAA CACGTCCGCG 3481 ATCAAATTTG TAGTTGAGCT TTTTGGAATT ATTTCTGATT GCGGGCGTTT TTGGGCGGGT
3541 TTCAATCTAA CTGTGCCCGA TTTTAATTCA GACAACACGT TAGAAAGCGA TGGTGCAGGC 3601 GGTGGTAACA TTTCAGACGG CAAATCTACT AATGGCGGCG GTGGTGGAGC TGATGATAAA 3661 TCTACCATCG GTGGAGGCGC AGGCGGGGCT GGCGGCGGAG GCGGAGGCGG AGGTGGTGGC 3721 GGTGATGCAG ACGGCGGTTT AGGCTCAAAT GTCTCTTTAG GCAACACAGT CGGCACCTCA 3781 ACTATTGTAC TGGTTTCGGG CGCCGTTTTT GGTTTGACCG GTCTGAGACG AGTGCGATTT 3841 TTTTCGTTTC TAATAGCTTC CAACAATTGT TGTCTGTCGT CTAAAGGTGC AGCGGGTTGA 3901 GGTTCCGTCG GCATTGGTGG AGCGGGCGGC AATTCAGACA TCGATGGTGG TGGTGGTGGT 3961 GGAGGCGCTG GAATGTTAGG CACGGGAGAA GGTGGTGGCG GCGGTGCCGC CGGTATAATT 4021 TGTTCTGGTT TAGTTTGTTC GCGCACGATT GTGGGCACCG GCGCAGGCGC CGCTGGCTGC 4081 ACAACGGAAG GTCGTCTGCT TCGAGGCAGC GCTTGGGGTG GTGGCAATTC AATATTATAA 4141 TTGGAATACA AATCGTAAAA ATCTGCTATA AGCATTGTAA TTTCGCTATC GTTTACCGTG 4201 CCGATATTTA ACAACCGCTC AATGTAAGCA ATTGTATTGT AAAGAGATTG TCTCAAGCTC 4261 GGATCGATCC CGCACGCCGA TAACAAGCCT TTTCATTTTT ACTACAGCAT TGTAGTGGCG 4321 AGACACTTCG CTGTCGTCGA GGTTTAAACG CTTCCTCGCT CACTGACTCG CTGCGCTCGG 4381 TCGTTCGGCT GCGGCGAGCG GTATCAGCTC ACTCAAAGGC GGTAATACGG TTATCCACAG 4441 AATCAGGGGA TAACGCAGGA AAGAACATGT GAGCAAAAGG CCAGCAAAAG GCCAGGAACC 4501 GTAAAAAGGC CGCGTTGCTG GCGTTTTTCC ATAGGCTCCG CCCCCCTGAC GAGCATCACA 4561 AAAATCGACG CTCAAGTCAG AGGTGGCGAA ACCCGACAGG ACTATAAAGA TACCAGGCGT 4621 TTCCCCCTGG AAGCTCCCTC GTGCGCTCTC CTGTTCCGAC CCTGCCGCTT ACCGGATACC 4681 TGTCCGCCTT TCTCCCTTCG GGAAGCGTGG CGCTTTCTCA TAGCTCACGC TGTAGGTATC 4741 TCAGTTCGGT GTAGGTCGTT CGCTCCAAGC TGGGCTGTGT GCACGAACCC CCCGTTCAGC 4801 CCGACCGCTG CGCCTTATCC GGTAACTATC GTCTTGAGTC CAACCCGGTA AGACACGACT 4861 TATCGCCACT GGCAGCAGCC ACTGGTAACA GGATTAGCAG AGCGAGGTAT GTAGGCGGTG 4921 CTACAGAGTT CTTGAAGTGG TGGCCTAACT ACGGCTACAC TAGAAGGACA GTATTTGGTA 4981 TCTGCGCTCT GCTGAAGCCA GTTACCTTCG GAAAAAGAGT TGGTAGCTCT TGATCCGGCA 5041 AACAAACCAC CGCTGGTAGC GGTGGTTTTT TTGTTTGCAA GCAGCAGATT ACGCGCAGAA 5101 AAAAAGGATC TCAAGAAGAT CCTTTGATCT TTTCTACGGG GTCTGACGCT CAGTGGAACG 5161 AAAACTCACG TTAAGGGATT TTGGTCATGA GATTATCAAA AAGGATCTTC ACCTAGATCC 5221 TTTTAAATTA AAAATGAAGT TTTAAATCAA TCTAAAGTAT ATATGAGTAA ACTTGGTCTG 5281 ACAGTTACCA ATGCTTAATC AGTGAGGCAC CTATCTCAGC GATCTGTCTA TTTCGTTCAT 5341 CCATAGTTGC CTGACTCCCC GTCGTGTAGA TAACTACGAT ACGGGAGGGC TTACCATCTG 5401 GCCCCAGTGC TGCAATGATA CCGCGAGACC CACGCTCACC GGCTCCAGAT TTATCAGCAA 5461 TAAACCAGCC AGCCGGAAGG GCCGAGCGCA GAAGTGGTCC TGCAACTTTA TCCGCCTCCA 5521 TCCAGTCTAT TAATTGTTGC CGGGAAGCTA GAGTAAGTAG TTCGCCAGTT AATAGTTTGC 5581 GCAACGTTGT TGCCATTGCT ACAGGCATCG TGGTGTCACG CTCGTCGTTT GGTATGGCTT 5641 CATTCAGCTC CGGTTCCCAA CGATCAAGGC GAGTTACATG ATCCCCCATG TTGTGCAAAA 5701 AAGCGGTTAG CTCCTTCGGT CCTCCGATCG TTGTCAGAAG TAAGTTGGCC GCAGTGTTAT 5761 CACTCATGGT TATGGCAGCA CTGCATAATT CTCTTACTGT CATGCCATCC GTAAGATGCT 5821 TTTCTGTGAC TGGTGAGTAC TCAACCAAGT CATTCTGAGA ATAGTGTATG CGGCGACCGA 5881 GTTGCTCTTG CCCGGCGTCA ATACGGGATA ATACCGCGCC ACATAGCAGA ACTTTAAAAG 5941 TGCTCATCAT TGGAAAACGT TCTTCGGGGC GAAAACTCTC AAGGATCTTA CCGCTGTTGA 6001 GATCCAGTTC GATGTAACCC ACTCGTGCAC CCAACTGATC TTCAGCATCT TTTACTTTCA 6061 CCAGCGTTTC TGGGTGAGCA AAAACAGGAA GGCAAAATGC CGCAAAAAAG GGAATAAGGG 6121 CGACACGGAA ATGTTGAATA CTCATACTCT TCCTTTTTCA ATATTATTGA AGCATTTATC
6181 AGGGTTATTG TCTCATGAGC GGATACATAT TTGAATGTAT TTAGAAAAAT AAACAAATAG 6241 GGGTTCCGCG CACATTTCCC CGAAAAGTGC CACCTGACGC GCCCTGTAGC GGCGCATTAA 6301 GCGCGGCGGG TGTGGTGGTT ACGCGCAGCG TGACCGCTAC ACTTGCCAGC GCCCTAGCGC 6361 CCGCTCCTTT CGCTTTCTTC CCTTCCTTTC TCGCCACGTT CGCCGGCTTT CCCCGTCAAG 6421 CTCTAAATCG GGGGCTCCCT TTAGGGTTCC GATTTAGTGC TTTACGGCAC CTCGACCCCA 6481 AAAAACTTGA TTAGGGTGAT GGTTCACGTA GTGGGCCATC GCCCTGATAG ACGGTTTTTC 6541 GCCCTTTGAC GTTGGAGTCC ACGTTCTTTA ATAGTGGACT CTTGTTCCAA ACTGGAACAA 6601 CACTCAACCC TATCTCGGTC TATTCTTTTG ATTTATAAGG GATTTTGCCG ATTTCGGCCT 6661 ATTGGTTAAA AAATGAGCTG ATTTAACAAA AATTTAACGC GAATTTTAAC AAAATATTAA 6721 CGTTTACAAT TTCCCATTCG CCATTCAGGC TGCGCAACTG TTGGGAAGGG CGATCGGTGC 6781 GGGCCTCTTC GCTATTACGC CA
//
pIEx--‐Bac--‐3其他昆虫表达载体：
pMT/BioEase-DEST pVL1392 pVL1393 pXINSECT-DEST39 pXINSECT-DEST38 pBacPAK9 pBacPAK8 pIB/V5-His-TOPO
pIEX/Bac-1 pFastBacHT B pFastBacHT A pFastBac1
pMT/V5-His-TOPO pMT/BiP/V5-His A pCoHygro pAc5.1/V5-His C
pAc5.1-V5-His A pAc5/V5-HisA pAc5-V5-HisB pAc5-V5-HisC
pCoBlast pAc5.1/V5-His B pIZ/V5-His pIB/V5-His
pIZT/V5-His pMIB/V5-His C pMIB/V5-His A pMT/BiP/V5-His C
pMT/BiP/V5-His B pIEx/Bac-4 pIEx/Bac-3 pIEXBac-c-EGFP-3
pIEXBac-c-EGFP-1 pIEXBac-c-EGFP-4 pAc5.1B-EGFP pBlueBacHis2 A pBlueBacHis2 C pBlueBacHis2 B pFastBacHT C pMT-Bip-V5-HisA
pFBDM pUCDM pFastBac Dual pMIB/V5-His B
pMT/V5-His C pMT/V5-His B pMT/V5-His A pAcGP67A
pAc5.1b pAc5.1a pVL1392-XyIE control vector pFastBac-c-His-TEV pFastBac-N-GST-TEV pFastBacI-Gus pFastBacHT-CAT pBADZ-His6Cre
昆虫sf9细胞培养
Sf9培养要点： 温度：27-28摄氏度 pH：，sf9最适的pH6.2，随培养时间的延长，Ph值会增加 传代时间：72h（三天左右） 细胞来源：Sf9（货号B825-01）和Sf21（货号B821-01）细胞系是传统的用于杆状病毒表达的细胞系，源于美国农业部昆虫病理实验室。此细胞系适用于InsectSelect系统。这两株细 （以上来自invitrogen）胞衍生于IPLBSF-21细胞系，来源于秋蝇蠕虫（草地夜蛾）蛹的卵巢组织。 细胞特点：规则的带有颗粒球形。贴壁紧。 标准条件的定义： 培养最低密度：0.6×106/ml（健康对数生长期细胞活率至少应不低于90％。活率低于90％细胞不是在最佳条件下培养不能用于实验）1×106/mL将出现对数生长状态 传代培养：传代培养需将细胞调整到维持对数生长状态和最大活率。 贴壁培养: 贴壁细胞传代需在细胞长成单层（如下定义）然后1：5（细胞体积：最后培养基体积）稀释维持对数生长。形成单层细胞可以传代培养 悬浮培养：在细胞密度达到2.0×106-2.5×106细胞/mL后将密度调整至0.7×106-1.0×106细胞/mL进行悬浮传代。确保传代细胞密度不高于4×106个/mL或保持密度高于1×106个/mL以达到对数生长状态。 Sf9悬浮培养所需要的细胞数 培养基：sf-900 ⅢSFM（添加2%的血清减小感染过程中蛋白水解量） 培养瓶与培养体积： 冻存：一旦细胞系建立且倍增规律则可以进行冻存。细胞需达到90％活率和80-90％融合的要求（如：低代次）推荐冻存几管。当融解细胞，它将会达到最佳使用状态。
1. 用细胞计数板计数细胞。需要足够的如上表所示密度的细胞冻存2-4管。细胞可是悬浮或贴壁培养； 2. 将无菌冻存管立于冰上，做好标记； 3. 室温400-600×g离心10min。移除上清。 4. 以给定的密度在冻存液中重悬细胞； 5. 移取1mL细胞悬液置于无菌冻存管中； 6. 置于-20℃1h，然后移至-80℃24-48h； 7. 储存于液氮中。 转染的细胞：需要的是对数期的细胞＞95%发育能力，可以完成成功的转染。 载氧：对于最优生长条件和蛋白的表达，昆虫细胞要求被动的通氧。积极的通氧系统要求溶氧饱和在10%-50% Sf900II和sf900Ⅲ的区别：一般推荐Sf900II来大量表达蛋白 Sf900II含有表面活性剂（剪切力保护剂（保护细胞在转瓶中培养时不会受到剪切力伤害）） 当设计纯化多聚组氨酸标签蛋白的计划时，注意无血清培养基不能直接用于螯合树脂，因为培养基的成分会除去树脂中的镍离子。
细胞培养基本方法
1.操作台基本要求： 2.随着传代次数的增加，连续培养细胞系遗传物质不稳定，不得将细胞存放于-20℃或-80℃冰柜中，因为细胞存在次低温条件下活力迅速降低。 3.细胞污染： （1）细菌污染
（2）酵母污染 （3）霉菌污染 初期PH值维持稳定，污染严重后PH值迅速升高，导致培养基浑浊。 （4）病毒污染 一般不会对与其宿主物种不同的细胞培养物造成不良影响，通过电子显微镜检查、一组抗体的免疫染色，ELISA实验或者采用适当病毒引物的PCR技术可以检测出细胞为病毒污染。 （5）支原体污染 唯一检测支原体污染的方法是采用荧光染色、ELISE、PCR、免疫染色、放射自显影 4.抗生素只能作为对付污染的最后手段而且只能短期使用，并应尽快撤出 5．适合贴壁的细胞和悬浮的细胞
6.基础培养基，减血清培养基，无血清培养基 7.PH值：大多数正常哺乳动物细胞系PH为7.4； 成纤维细胞系适合轻度偏碱（pH7.4-7.7） Sf9和sf21等昆虫细胞系最适合在PH值为6.2的环境中生长8.温度：大多数人和哺乳动物细胞系在36℃至37℃最佳 昆虫细胞在27℃为最佳 禽类细胞在38.5℃最佳 冷血动物（15℃-26℃） 9.动物细胞形态划分： ●成纤维细胞，贴附生长 ●上皮样细胞呈多角形，贴附 ●淋巴母细胞样细胞呈球形，不贴附 ●特殊形态： ?I型有长突触 ?Ⅱ型没有轴突 10.细胞增长模式
11.何时传代？ ●哺乳动物：生长的PH值通常表示乳酸储积，且有毒性，当PH迅速降低（） 0.1-0.2PH单位），同时细胞浓度增大，则应对细胞进行传代。 ●昆虫细胞PH值会上升但不超过6.4 12．贴壁细胞的解离
pBacPAK8昆虫表达载体说明
pBacPAK8 编号 载体名称 北京华越洋生物KCVECT129 pBacPAK8 pBacPAK8载体基本信息 载体名称: pBacPAK8 质粒类型: 昆虫表达载体；杆状病毒表达载体 克隆方法: 限制酶，多克隆位点 启动子: Polyhedrin 载体大小: 5538 bp 5' 测序引物及序列: Bac1 Forward 3' 测序引物及序列: Bac2 Reverse 载体标签: 无标签 载体抗性: 氨苄青霉素 真核筛选标记: 无 克隆菌株: TOP10 宿主细胞（系）: 果蝇细胞系 IPLB-Sf21 备注: -- 瞬表达/稳表达: 稳表达 组成型/诱导型: 组成型 病毒/非病毒: 杆状病毒 pBacPAK8载体质粒图谱和多克隆位点信息
pBacPAK8载体描述: Available as part of the BacPAK Baculovirus Expression System (Cat. No. 631402). pBacPAK8 is a transfer vector designed for high--‐level expression of a cloned gene driven by the strong AcMNPV polyhedrin promoter. Flanking AcMNPV sequences allow recombination with viral DNA to transfer the expression cassette to the polyhedrin locus of the viral DNA. The polyhedrin coding sequences have been replaced by a multiple cloning s ite w ith 18 u nique s ites t hat f acilitate t he i nsertion o f f oreign g enes i n t he c orrect orientation for expression. The Pac I site at the end of the MCS region provides translational s top c odons i n a ll t hree r eading f rames f or e xpression o f t runcated p roteins. pBacPAK8 has a pUC origin of replication, an M13 origin for single--‐stranded DNA production, a nd a n a mpicillin r esistance g ene f or s election i n E. c oli. 1.杆状病毒表达系统简介 Baculovirus gene expression is a popular method for producing large quantities of recombinant proteins in insect host cells. In most cases, posttranslational processing of eukaryotic proteins expressed in insect cells is similar to protein processing in mammalian cells. As a result, insect cell--‐processed proteins have comparable biological activities and immunological reactivities to proteins expressed in mammalian cells. Protein y ields f rom b aculovirus s ystems a re h igher, a nd c osts a re s ignificantly l ower t han in m ammalian e xpression s ystems. T he b aculovirus e xpression s ystem c an e xpress g enes from b acteria, v iruses, p lants, a nd m ammals a t l evels f rom 1–500 m g/liter; m ost p roteins are e xpressed i n t he 10–100 m g/liter r ange, a lthough m aking p redictions i s d ifficult. The baculovirus most commonly used to express foreign proteins is Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV). AcMNPV can be propagated in certain insect cell lines; the virus enters the cells and replication begins approximately 6 hours post--‐infection (h.p.i.). At approximately 20–48 h.p.i., transcription of nearly all genes ceases. The viral polyhedrin and p10 genes, however, are transcribed at high rates. The polyhedrin p rotein i s e ssential f or p ropagation o f t he v irus i n i ts n atural h abitat; h owever, in cell culture, polyhedrin is not needed, and its coding sequence can be replaced with a sequence for a target protein. Hence, the powerful polyhedrin promoter can drive
昆虫细胞表达系统
昆虫细胞表达系统 昆虫细胞表达系统是四大表达系统（昆虫细胞、细菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统）之一。昆虫细胞表达系统原理是通过转座作用将转移载体中的表达组件定点转座到能在大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体（Bacmid）上，通过抗性和蓝白斑筛选到重组穿梭质粒，提取穿梭质粒DNA转染昆虫细胞后，得到的子代病毒即为重组病毒。将病毒上清浸染昆虫细胞，获得表达的重组蛋白。 杆状病毒是一类闭合环状双链病毒，病毒粒子呈杆状，以昆虫为主要宿主。杆状病毒还是一种出芽型分泌性病毒粒子，在感染细胞后能迅速在培养细胞中水平传播而保持细胞在相当长的时间内不裂解，从而最大限度地保持了外源蛋白的稳定，昆虫细胞表达系统又被称为昆虫杆状病毒系统。昆虫细胞表达系统本身是一个蛋白裂解性系统，在杆状病毒感染昆虫细胞的过程中，杆状病毒可以编码一些蛋白酶如木瓜蛋白酶等导致蛋白的降解。因此，收集细胞后，在裂解细胞之前要加入蛋白酶抑制剂防止蛋白的降解。 昆虫细胞表达系统属于真核细胞表达系统，但又不同于酵母及哺乳动物细胞表达系统，酵母表达的蛋白易纯化但也易降解，而哺乳动物细胞表达系统表达的蛋白具有生物活性但成本高。细菌表达系统属于原核表达系统，操作简单、周期短收益大、表达产物稳定，但是表达基因的相对分子量有限，且不能对表达产物进行翻译后加工修饰。而昆虫细胞表达系统具有很多优点： (1)具有糖基化作用、乙酰化作用、磷酸化作用等一系列蛋白质翻译加工修饰系统； (2)正确的蛋白折叠、二硫键形成，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白，有利于表达产物形成天然的高级结构； (3)具有对重组蛋白进行定位的功能，如将核蛋白转送到细胞核上，膜蛋白则定位在膜上，分泌蛋白则可分泌到细胞外等；
细胞培养与病毒培养实验步骤..
实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养 一、实验目的 了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。 二、常用细胞的种类 BHK-21：仓鼠肾传代细胞 PK-15：猪肾传代细胞 IBRS-2：猪肾传代细胞 Hela：人的子宫瘤细胞 Vero：非洲绿猴肾细胞 Marc-145：来源于Vero细胞 TK-143：人的胸苷激酶阴性细胞 Sf9：昆虫细胞 三、材料 1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头 2、BHK-21（baby hamster kidney）细胞 3、0.25%胰酶 4、生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM 维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM
5、伪狂犬病病毒液（PRV） 四、传代细胞培养的条件要求 1）细胞密度：2-3×105个/ml 2）pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8 3）培养温度 哺乳动物细胞一般为37℃ 昆虫细胞28-30℃ 五、常用细胞分散剂与作用原理 1、胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解， 导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。 2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。 3、灰色链丝菌酶：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽 酶的混合物。 六、营养液 1、人工综合营养液 氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。 2、血清 1）血清的种类 胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。 2）血清的处理
鸡IgM μ 链在杆状病毒-昆虫细胞系统中的表达
鸡IgM μ 链在杆状病毒-昆虫细胞系统中的表达 及其反应原性的测定 赵莉1，2，3，步志高2*，鲍恩东1* （1.南京农业大学动物医学院南京 210095；2.中国农科院哈尔滨兽医研究所国家重点实验室生物技术六室，哈尔滨 150001； 3.瑞普（天津）动物药业有限公司天津 300300） 摘要：本研究构建了表达鸡IgM μ链蛋白的重组杆状病毒rBac-c IgMμ。采用抗c IgM μ 链蛋白的多克隆抗体间接免疫荧光检测重组杆状病毒表达的c IgMμ 蛋白，显示出良好的特异免疫反应原性。以感染rBac-c IgMμ 的昆虫细胞裂解液上清包被96孔ELISA板，抗鸡IgM μ 链蛋白多克隆抗血清为一抗间接ELISA 检测，同样具有良好的敏感性和特异性。结果表明，重组杆状病毒能良好表达鸡IgM μ 链蛋白，且其表达产物具有良好的反应原性。 关键词：鸡IgM μ 链； 重组杆状病毒；反应原性 IgM是机体初次体液免疫应答中最早出现的免疫球蛋白，其在血清中的含量会在首次接触抗原的几天内达到高峰（杜念兴，1997），然后通过免疫球蛋白类转换作用转变为IgG而使其含量逐渐下降（Nossal et al, 1964；Coleclough et al, 1980; DePinho et al, 1984；Wabl et al, 1978；Yancopoulos et al, 1986；Burrows et al, 1983）。由于记忆B细胞并不大量分泌IgM，所以IgM的升高预示近期机体内有抗原出现，因此，IgM在动物疾病的早期诊断方面发挥着重要作用（杨汉春, 2003）。由于目前各类传染病危害严重，迫切需要一种有效的早期诊断试剂进行快速诊断以控制病情，淘汰感染畜禽，减少损失。本试验利用杆状病毒—昆虫细胞系统表达了鸡IgM μ 链蛋白，由于杆状病毒表达系统在外源基因的表达方面具有糖基化、磷酸化和蛋白切割加工修饰过程，表达产物的理化性质和生物学特性与天然蛋白相似（刘高强等，2004；王清华等，2006；董双林等，2006；李雪菲等，2005），因此用该蛋白包板建立的间接ELISA便于筛选出可以与天然IgM表位特异性反应的单抗，从而可为进一步建立快速灵敏的抗鸡IgM μ 链诊断试剂盒奠定基础。
哺乳动物细胞表达系统
哺乳动物细胞表达系统 按照宿主细胞的类型，可将基因表达系统大致分为原核、酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞表达系统。与其它系统相比，哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。从最开始以裸露DNA直接转染哺乳动物细胞至今的30余年间，哺乳动物细胞表达系统不仅已成为多种基因工程药物的生产平台，在新基因的发现、蛋白质的结构和功能研究中亦起了极为重要的作用。本文主要从表达系统及其两个组成部分——表达载体和宿主细胞等方面，简要介绍哺乳动物细胞表达系统和相关的研究进展。 研究现状 ①部分蛋白在哺乳动物细胞中的表达已从实验室研究迈向生产或中试生产阶段。 ②已有许多重要的蛋白及糖蛋白利用哺乳动物细胞系统表达和大量制备、生产。如人组织型血纤蛋白酶原激活因子、凝血因子Ⅷ、干扰素、乙肝表面抗原、红血球生成激素、人生长激素、人抗凝血素Ⅲ，集落刺激因子等。有些产品已投入临床应用或试用。 ③虽然经过多年努力，哺乳动物细胞表达系统的表达水平有大幅度增高，但从整个水平上看仍偏低，一般处在杂交瘤细胞单克隆抗体蛋白产率的下限，即1-30μg/l08细胞/24小时。有人认为其限速步骤可嚣是在工程细胞中(对于重组蛋白来讲，常是异源的)，重组蛋白的分泌效率较低。 1 表达载体 1．1 表达栽体的类型 哺乳动物细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转染和病毒载体的感染。利用质粒转染获得稳定的转染细胞需几周甚至几个月时间，而利用病毒表达系统则可快速感染细胞，在几天内使外源基因整合到病毒载体中，尤其适用于从大量表达产物中检测出目的蛋白。 根据进入宿主细胞的方式，可将表达载体分为病毒载体与质粒载体。病毒载体是以病毒颗粒的方式，通过病毒包膜蛋白与宿主细胞膜的相互作用使外源基因进入到细胞内。常用的病毒载体有腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、semliki森林病毒(sFv)载体等。另外，杆状病毒载体应用于哺乳动物细胞的表达在近几年颇受重视，这是因为它与其它病毒载体相比有特有优势，如可通过昆虫细胞大量制备病毒颗粒；可感染多种哺乳动物细胞，但在细胞内无复制能力，生物安全度高；可插入高达38 kb的外源基因等。 质粒载体则是借助于物理或化学的作用导人细胞内。依据质粒在宿主细胞内是否具有自我复制能力，可将质粒载体分为整合型和附加体型载体两类。整合型载体无复制能力，需整合于宿主细胞染色体内方能稳定存在，如SV40病毒载体、反转录病毒载体和游离型如痘苗病毒、腺病毒载体。利用Sindbis virus(SV)、Scmliki Forest virus(sFV) 和痘苗病毒载体感染哺乳动物细胞表达的蛋白在结构与功能上与天然哺乳动物来源的蛋白更相似。Liljestrom等利用SFV病毒载体感染哺乳动物细胞获得的外源蛋白占细胞总蛋白的；而附加体型载体则是在细胞内以染色体外可自我复制的附加体形式存在。整合型载体一般是随机整合入染色体，其外源基因的表达受插入位点的影响，同时还可能会改变宿主细胞的生长特性。相比之下，附加体型载体不存在这方面的问题，但载体DNA在复制中容易发生突变或重排。 附加体型载体在胞内的复制需要两种病毒成分：病毒DNA的复制起始点(ori)及复制相关蛋白。根据病毒成分的来源不同，附加体型表达载体主要分为4大类，表2对这几类附加体载体进行了简要的概括。 载体的选择取决于外源基因的导人方式和其调控元件是否有利于转录和翻译。真核
杆状病毒——昆虫细胞表达系统
实验材料： 1. 重组杆状病毒质粒：Bacmid/nsp-6及阳性对照Bacmid/CAT，已构建成功。 2. 昆虫细胞Sf9、High Five及其相关培养基、转染试剂均购自Invitrogen公司。抗His单克隆抗体购自Oncogene公司，CAT-ELISA试剂盒购自Roche。 实验步骤： 一、昆虫细胞转染： 1． Sf9细胞计数，取6孔板中的两孔，每孔加入9×10 5个细胞(其中一孔设为正常对照)，并以全培培养至少1小时，使细胞贴壁。 2．准备重组质粒和细胞转染试剂的混合物： a. 溶解1μg纯化重组杆状病毒重组质粒于100μl 无添加成分的Grace’s Medium。 b. 转染试剂充分摇匀后取6μl加入100μl 无添加成分的Grace’s Medium，混匀。 c. 将上述稀释好的质粒及稀释好的转染剂混匀，室温孵育20min。 3．重组质粒与转染剂混合液孵育的同时，以2ml无添加成分的Grace’s Medium洗涤待转染的一孔细胞并弃去洗液。 4．取0.8ml无添加成分的Grace’s Medium加入质粒与转染剂的混合液中，轻轻混匀后，总体积约为1ml。加入上步洗涤后的细胞孔中，27℃继续培养5h。 5．移除质粒、转染剂混合物，加入2ml全培。27℃湿盒孵育，直到病变现象产生。 二、病毒贮液的制备： 1. 病毒感染晚期（正常24-72h）可见细胞停止生长、黏附，呈颗粒状外观。即收集含病毒的培养上清，500g离心5min，去除细胞和碎片。 2. 上清即为P1病毒贮液，移入新的离心管中4℃避光保存。长期保存分装冻存于-80℃。 3. 病毒贮液的扩增，按以下公式进行所需病毒P1贮液的量： 感染所需病毒贮液量(ml)= [MOI(pfu/cell) ×细胞数÷病毒贮液效价(pfu/ml)] 注：若不进行病毒空斑测定，P1贮液效价按照1×10 6到1×10 7计。 4. 扩增P1液制备P2病毒贮液方法如下： a. 转染当天，取2×106个细胞/孔加入六孔板中，贴壁生长至少1h。 b. 每孔加入适量的P1贮液，27℃湿盒孵育48h。 c. 根均细胞病变情况（约48h后）收集各孔中的病毒上清液，500g离心5min取上清，即为P2病毒贮液。4℃避光保存。长期保存分装冻存于-80℃。 d. 制备了高效价的P2液后，按上述方法扩增P3贮液，用于高效表达。 三、病毒贮液初步鉴定 1. SDS-PAGE蛋白电泳：取P2或P3病毒贮液浓缩后上样（或直接上样）进行SDS-PAGE 蛋白电泳，初步根据分子量对表达蛋白进行鉴定。CAT-his融合蛋白分子量约为28KDa，nsp6-his融合蛋白分子量约为34KDa。 2. western blot：以小鼠抗his单克隆抗体鉴定在相应条带出是否有his标记。 3. 以CAT-ELISA检测试剂盒检测Bacmid/CAT对照的蛋白表达情况。方法详见CAT-ELISA 试剂和说明书。 结果 1. CAT-ELISA检测试剂盒成功检测出对照CAT质粒在细胞中的表达，同时可测于上清和细
细胞培养实验课程SOP
实验一传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养 一、实验目的 了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。 二、常用细胞的种类 BHK-21：仓鼠肾传代细胞、PK-15：猪肾传代细胞、IBRS-2：猪肾传代细胞、Hela：人的子宫瘤细胞、Vero：非洲绿猴肾细胞、Marc-145：来源于Vero细胞、Sf9：昆虫细胞。 三、材料 1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头 2、BHK-21（baby hamster kidney）细胞 3、0.25%胰酶 4、生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM 维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM 四、传代细胞培养的条件要求 1）细胞密度：2-3×105个/ml 2）pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8 3）培养温度 哺乳动物细胞一般为37℃ 昆虫细胞28-30℃ 五、常用细胞分散剂与作用原理 1、胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解， 导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。 2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。 3、灰色链丝菌酶：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽 酶的混合物。 六、营养液 1、人工综合营养液 氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。
2、血清 1）血清的种类 胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。 2）血清的处理 无菌采集，过滤除菌。用前56℃灭活30min。 七、传代细胞系培养 1、优点：1) 可以无限的传代。 2) 不少细胞系对病毒很敏感。 3) 某些传代细胞系能在悬浮培养条件下培养，适合病毒抗原的大量生产。 4) 生长旺盛，繁殖快速，对营养条件不苛刻。 2、缺点：在传代过程中遭到支原体和病毒的污染。 细胞培养 步骤： ①取长满单层的细胞一瓶，掉到培养液。 ②加入2ml胰酶消化液，置于37℃培养几分钟（也可以轻轻吹打几下），直到细胞间出现空隙或细胞变圆后倒掉消化液。（目的就是让细胞脱离贴壁状态，但不掉下来） ③加入生长液，吹打几次，使细胞分散成单个细胞（两三个聚集一起这种程度就好），然后分装于3个小瓶中，在每个瓶中补充生长液至10ml。 注意：胰酶消化不能太长（此时细胞大量脱离，会造成细胞损失，后面加生长液吹打时也不容易分散成单个细胞，容易成块，培养后长得不光滑） 细胞冻存 冻存液：现在一般用二甲亚砜，也可以用甘油。 步骤： 1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液； 2. 取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用PBS清洗。
SF21,sf9昆虫细胞
https://www.wendangku.net/doc/fe14639204.html, sf9昆虫细胞 货号基因名称规格货期 huayueyang-531sf9昆虫细胞1ml 现货 细胞描述： Sf9昆虫细胞，可以用来包装扩增杆状病毒并表达蛋白。Sf9昆虫细胞增殖能力取决于培养技术、培养条件等综合因素。请按照正确的培养方法来复苏、传代，以此保证细胞具备良好的增殖能力，方便您的后继研究顺利进行。 质量控制： 本细胞经过严格的质量检测，不含有细菌、真菌、病毒（HIV、HBV、HCV）和支原体等。 培养条件： 27℃，PH值7.2~7.4，120–140rpm，无菌恒温培养。 用途： 本产品仅供科研使用，不可用于治疗等其他用途。 细胞相关操作： sf9细胞复苏 1.37°C水浴预热培养基； 2.从液氮中取出细胞放入37°C水浴快速解冻（解冻后不要继续暖细胞）； 3.在超净台中加入5ml的培养基重悬细胞，1000rpm离心5min； 4.4.弃上清，加入5ml培养基重悬细胞，用血小球计数板进行细胞计数，按细胞密度3-5×105/ml接种到25ml无菌摇瓶中（带空气过滤通气孔的摇瓶）； 5.摇瓶置于27°C培养箱中的摇瓶架上，120–140rpm培养。 sf9细胞传代 1.取细胞计数(详见sf9细胞冻存)，当细胞密度达到1–3×106/ml时，可传代； 2.37°C水浴预热培养基； 3.在超净台中，加适量预热好的培养基到无菌摇瓶中，以细胞终密度为3-5×105/ml接种细胞（也可1000rpm，5min离心后弃上清，用预热好的培养基重悬并调整细胞密度为3-5×105/ml）； 4.摇瓶置于27°C培养箱中的摇瓶架上，120–140rpm培养。 注：昆虫细胞对氧的要求较高，因此，悬浮培养必须具有高表面积体积比，否则细胞的生长会受到抑制。培养基的体积不能超过摇瓶的五分之二；即100毫升的摇瓶不能超过40ml培养基，250ml摇瓶不能超过100ml培养基。
pMIB-V5-HisB昆虫表达载体说明
pMIB/V5-His B 编号 载体名称 北京华越洋生物KCVECT152 pMIB/V5--‐His B pMIB-V5-HisB载体基本信息 载体名称: pMIB/V5-His B 质粒类型: 昆虫细胞表达系统载体 高拷贝/低拷贝: 高拷贝 启动子: OpIE2 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 3600bp 5' 测序引物及序列: OpIE2-F: 5'd[CGCAACGATCTGGTAAACAC]3' 3' 测序引物及序列: -- 载体标签: HBM (Nterm), V5 (Cterm), His (Cterm) 载体抗性: Ampicillin 筛选标记: Blasticidin 备注: 在昆虫细胞中能够稳定表达，HBM标签可实现目的蛋白的分泌表达 稳定性: 稳表达 组成型: 组成型 病毒/非病毒: 非病毒 pMIB-V5-HisB载体质粒图谱和多克隆位点信息
pMIB-V5-HisB载体序列 ORIGIN 1 CATGATGATA AACAATGTAT GGTGCTAATG TTGCTTCAAC AACAATTCTG TTGAACTGTG 61 TTTTCATGTT TGCCAACAAG CACCTTTATA CTCGGTGGCC TCCCCACCAC CAACTTTTTT 121 GCACTGCAAA AAAACACGCT TTTGCACGCG GGCCCATACA TAGTACAAAC TCTACGTTTC 181 GTAGACTATT TTACATAAAT AGTCTACACC GTTGTATACG CTCCAAATAC ACTACCACAC 241 ATTGAACCTT TTTGCAGTGC AAAAAAGTAC GTGTCGGCAG TCACGTAGGC CGGCCTTATC 301 GGGTCGCGTC CTGTCACGTA CGAATCACAT TATCGGACCG GACGAGTGTT GTCTTATCGT 361 GACAGGACGC CAGCTTCCTG TGTTGCTAAC CGCAGCCGGA CGCAACTCCT TATCGGAACA 421 GGACGCGCCT CCATATCAGC CGCGCGTTAT CTCATGCGCG TGACCGGACA CGAGGCGCCC 481 GTCCCGCTTA TCGCGCCTAT AAATACAGCC CGCAACGATC TGGTAAACAC AGTTGAACAG 541 CATCTGTTCG AATTTAAAGC TACCATGAAA TTCTTAGTCA ACGTTGCCCT TGTTTTTATG 601 GTCGTATACA TTTCTTACAT CTATGCCGGC ATGCTAAGCT TGGTACCGAG CTCGGATCCA 661 CTAGTCCAGT GTGGTGGAAT TCTGCAGATA TCCAGCACAG TGGCGGCCGC TCGAGTCTAG 721 AGGGCCCGCG GTTCGAAGGT AAGCCTATCC CTAACCCTCT CCTCGGTCTC GATTCTACGC 781 GTACCGGTCA TCATCACCAT CACCATTGAG TTTATCTGAC TAAATCTTAG TTTGTATTGT 841 CATGTTTTAA TACAATATGT TATGTTTAAA TATGTTTTTA ATAAATTTTA TAAAATAATT 901 TCAACTTTTA TTGTAACAAC ATTGTCCATT TACACACTCC TTTCAAGCGC GTGGGATCGA 961 TGCTCACTCA AAGGCGGTAA TACGGTTATC CACAGAATCA GGGGATAACG CAGGAAAGAA 1021 CATGTGAGCA AAAGGCCAGC AAAAGGCCAG GAACCGTAAA AAGGCCGCGT TGCTGGCGTT 1081 TTTCCATAGG CTCCGCCCCC CTGACGAGCA TCACAAAAAT CGACGCTCAA GTCAGAGGTG
细胞培养实验步骤
细胞培养这个生物学研究最基础的技术之一，已经渗透进了科研工作的方方面面。本文将与大家分享一篇细胞培养的攻略，也是公司一位同事9年细胞培养经验的总结，涵盖了昆虫细胞蛋白表达常用到的sf9细胞与哺乳动物细胞蛋白表达系统的CHO细胞与HEK293细胞，主要介绍了细胞复苏、细胞传代、细胞冻存的具体操作 方法。 细胞复苏： 1、细胞培养条件 2、复苏流程： （1）确认水浴锅的水清洁可用，方可提前打开37度预热。 （2）确认好复苏细胞的液氮罐中具体位置，并做好复苏登记。 （3）提前做好复苏准备，预热培养基。 （4）悬浮和贴壁细胞复苏参数：
（5）将细胞快速放入37度水浴锅中迅速溶解，1.8 ml时间大概1分30秒，1 ml 大概1 min左右，需计时，期间不要老是拿起来观察，需要快速复溶，避免细胞受到损伤。 （6）贴壁细胞需离心， 1000 rpm，5 min；悬浮细胞直接加入预热的培养基中然后放入培养箱中 （7）贴壁细胞离心后去除上清，用预热的培养基重悬细胞后加入到T25方瓶，最后放入培养箱中培养。 （8）取小样计数观察，细胞活力在70%以上算正常。低于70%活力可能细胞状态不太好，需要培养和恢复。 细胞传代培养 1．悬浮细胞传代流程： （1）先将装有细胞的摇瓶从培养箱拿出，用酒精喷洒瓶身后将摇瓶拿进超净台；（2）打开摇瓶瓶盖，用200 ul移液器取100~200 ul细胞放入1.5 mlEP管中，瓶盖过火，拧紧，将培养瓶放回摇床； （3）将200 ul细胞混匀，取10 ul细胞加入10 ul台盼蓝，显微镜下计数。根据细胞数决定下游实验； （4）细胞需计数两次求平均值； （5）悬浮细胞生长参数
pIEXBac-1昆虫表达载体说明
pIEX/Bac-1 编号 载体名称 北京华越洋生物KCVECT102 pIEX/Bac--‐1 pIEXBac1载体基本信息 载体名称: pIEXBac1, pIEXBac-1, pIEX/Bac1, pIEX/Bac-1 质粒类型: 昆虫细胞表达载体；蛋白纯化 启动子: Polyhedrin 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 6796 bp 5' 测序引物: -- 3' 测序引物: -- 载体标签: C-His, N-EK, N-Strep 载体抗性: Ampicillin 氨苄 备注: 拥有hr5增强子和IE1启动子；双标签系统可以采用两种纯化方案。 稳定性: 瞬转Transient 组成型: 组成型Constitutive 病毒/非病毒: 杆状病毒 pIEXBac1载体质粒图谱和多克隆位点信息
pIEXBac1载体简介 The dual-purpose pIEx/Bac? vectors are designed for cloning and high-level expression of proteins by transiently transfecting Spodoptera-derived insect cells or by generating baculovirus recombinants. Transient transfection and early baculovirus expression is driven by a promoter/enhancer combination that recruits endogenous insect cell transcription machinery, the AcNPV derived hr5 enhancer and ie1 promoter. Late/very late expression in the baculovirus mode is driven by the strong p10 promoter. The pIEx/Bac-1 vector carries an N-terminal Strep?Tag II coding sequence (1) followed by a recognition site for enterokinase. The multiple cloning region is followed by an optional C-terminal His?Tag? coding sequence. The presence of two “gentle elution" tags at both the N- and C-terminus is ideal for dual purification strategies designed to isolate full-length fusion proteins (2). Unique restriction sites are shown on the circle map. pIEXBac1载体序列 ORIGIN 1 GGAACGGCTC CGCCCACTAT TAATGAAATT AAAAATTCCA ATTTTAAAAA ACGCAGCAAG 61 AGAAACATTT GTATGAAAGA ATGCGTAGAA GGAAAGAAAA ATGTCGTCGA CATGCTGAAC 121 AACAAGATTA ATATGCCTCC GTGTATAAAA AAAATATTGA ACGATTTGAA AGAAAACAAT 181 GTACCGCGCG GCGGTATGTA CAGGAAGAGG TTTATACTAA ACTGTTACAT TGCAAACGTG 241 GTTTCGTGTG CCAAGTGTGA AAACCGATGT TTAATCAAGG CTCTGACGCA TTTCTACAAC 301 CACGACTCCA AGTGTGTGGG TGAAGTCATG CATCTTTTAA TCAAATCCCA AGATGTGTAT 361 AAACCACCAA ACTGCCAAAA AATGAAAACT GTCGACAAGC TCTGTCCGTT TGCTGGCAAC 421 TGCAAGGGTC TCAATCCTAT TTGTAATTAT TGAATAATAA AACAATTATA AATGCTAAAT 481 TTGTTTTTTA TTAACGATAC AAACCAAACG CAACAAGAAC ATTTGTAGTA TTATCTATAA 541 TTGAAAACGC GTAGTTATAA TCGCTGAGGT AATATTTAAA ATCATTTTCA AATGATTCAC 601 AGTTAATTTG CGACAATATA ATTTTATTTT CACATAAACT AGACGCCTTG TCGTCTTCTT 661 CTTCGTATTC CTTCTCTTTT TCATTTTTCT CTTCATAAAA ATTAACATAG TTATTATCGT 721 ATCCATATAT GTATCTATCG TATAGAGTAA ATTTTTTGTT GTCATAAATA TATATGTCTT 781 TTTTAATGGG GTGTATAGTA CCGCTGCGCA TAGTTTTTCT GTAATTTACA ACAGTGCTAT 841 TTTCTGGTAG TTCTTCGGAG TGTGTTGCTT TAATTATTAA ATTTATATAA TCAATGAATT 901 TGGGATCGTC GGTTTTGTAC AATATGTTGC CGGCATAGTA CGCAGCTTCT TCTAGTTCAA
昆虫杆状病毒基因转移与表达系统在海洋动物中的应用进展
Advances in Marine Sciences 海洋科学前沿, 2020, 7(2), 31-36 Published Online June 2020 in Hans. https://www.wendangku.net/doc/fe14639204.html,/journal/ams https://https://www.wendangku.net/doc/fe14639204.html,/10.12677/ams.2020.72005 Advances in the Application of Insect Baculovirus-Mediated Gene Transfer and Expression System in Marine Animals Mengxi Wu1, Huarong Guo2* 1Key Laboratory of Marine Genetics and Breeding, Ministry of Education, and College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao Shandong 2Institute of Evolution and Marine Biodiversity, Ocean University of China, Qingdao Shandong Received: Apr. 19th, 2020; accepted: May 8th, 2020; published: May 15th, 2020 Abstract Baculovirus-mediated gene transfer and expression system was designed to effectively deliver the foreign genes into the target cells by the translocation of Tn7 transposon, the packaging of insect cells and infection of the recombinant baculovirus, with the merits of biological safety, high ex-pression level and post-translational modification of the recombinant proteins. Thus, the baculo-virus-mediated gene transfer and expression system has been widely used in the mammalians, birds, insects and freshwater fishes, but rarely in the marine animals. This review has summarized and prospected the applications of the above-mentioned gene transfer and expression technology in the marine vertebrates and invertebrates. Keywords Baculovirus-Mediated Gene Transfer and Expression System, Marine Vertebrates, Marine Invertebrates 昆虫杆状病毒基因转移与表达系统在海洋动物中的应用进展 毋梦茜1，郭华荣2* 1中国海洋大学，海洋生命学院，海洋生物遗传学与育种教育部重点实验室，山东青岛 2中国海洋大学，海洋生物多样性与进化研究所，山东青岛 *通讯作者。