实训八 病毒的鸡胚接种技术(ok)

实训八病毒的鸡胚接种技术

目的要求掌握鸡胚培养病毒的接毒和收毒方法，明确鸡胚培养病毒的应用。

仪器及材料受精卵、恒温箱、照蛋器、接种箱、蛋架、一次性注射器（1～5ml）、中号镊子、眼科剪和镊子、毛细吸管、橡皮乳头、灭菌平皿、试管、吸管、酒精灯、试管架、胶布、蜡、锥子、锉、煮沸消毒器、消毒剂（5%碘酊棉、75%酒精棉、5%石炭酸或3%来苏儿）、新城疫Ⅰ系或Ⅳ系疫苗。

方法与步骤（尿囊接种为例）

1．选择9～12日龄的健康鸡胚，最好是SPF鸡胚。

为便于照蛋观察，以来航鸡蛋或其他白壳蛋为好。选好后用孵化箱孵化，要注意温度、湿度和翻蛋。孵化最低温度为36℃，一般为37.5℃，相对湿度为60%。每日最少翻蛋3次。

健康鸡胚：照蛋时可见清晰的气室、血管及鸡胚的活动。

2．病毒材料的处理

怀疑污染细菌的液体材料：加抗生素（青霉素1000IU和链霉素1000μg/ml）置室温1h或4℃冰箱12～24h→高速离心，取上清液→细菌滤器滤过除菌

若用新城疫Ⅰ系或Ⅳ系疫苗，则无菌操作用生理盐水将其稀释100倍。

3．照蛋以铅笔划出气室、胚胎位置及接种的位置，标明胚龄及日期气室朝上立于蛋架上。

4．消毒先碘酊后酒精，由内向外呈同心圆状消

毒

5．打孔用灭菌小锥子在在气室中心或远离胚胎

侧气室边缘，避开大血管进行打孔，孔径以1ml注射

器针头容量刺入为宜。

6．注入病毒材料用一次性1ml注射器吸取新城

疫病毒液垂直或稍斜插入气室，刺入尿囊，向尿囊腔

内注入0.1～0.3ml。

7．封孔并继续孵化注射后，用熔化的石蜡封孔，

置温箱中直立孵化3～7d。孵化期间，每6h照蛋一次，观察胚胎存活情况。弃去接种后24h内死亡的鸡胚，24h以后死亡的鸡胚应置0～4℃冰箱中冷藏4h或过夜（气室朝上直

立），一定时间内不能致死的鸡胚也放冰箱冻死。

8．收毒

收毒原则：（1）先冷藏再收毒。（2）接种什么部位，收集什么部位。（3）固液分开收集。（4）无菌收集。（5）冷冻保存。

收毒方法：无菌操作轻轻敲打并揭去气室顶部蛋壳及壳膜，用灭菌镊子夹起并撕开或剪开气室中央的绒毛尿囊膜，然后用灭菌吸管从破口处吸取尿囊液，注入灭菌青霉素瓶或试管内。收获的尿囊液应清亮，浑浊说明有细菌污染。收获的病毒经无菌检验合格者冷冻保存。

注意事项鸡胚接种需严格的无菌操作，以减少污染。操作时应细心，以免引起鸡胚的损伤。病毒培养时应保持恒定的适宜条件，收毒结束，注意用具、环境的消毒处理。

思考题：1．病毒的鸡胚接种途径有哪些？分别选用多大日龄的鸡胚？

2．收集病毒时，为什么要弃掉24h以内死亡的鸡胚？

补充说明不同的接种材料需不同的接种途径，不同的接种途径需选用不同日龄的鸡胚。

卵黄囊接种，用6～8日龄鸡胚；绒毛尿囊膜接种，用9～13日龄的鸡胚；绒毛尿囊腔接种，用9～12日龄的鸡胚；血管注射，用12～13日龄的鸡胚；羊膜腔和脑内注射，用10日龄的鸡胚。

实训八 病毒的鸡胚接种技术

实训八病毒的鸡胚接种技术 目的要求掌握鸡胚培养病毒的接毒和收毒方法，明确鸡胚培养病毒的应用。 仪器及材料受精卵、恒温箱、照蛋器、接种箱、蛋架、一次性注射器（1～5ml）、中号镊子、眼科剪和镊子、毛细吸管、橡皮乳头、灭菌平皿、试管、吸管、酒精灯、试管架、胶布、蜡、锥子、锉、煮沸消毒器、消毒剂（5%碘酊棉、75%酒精棉、5%石炭酸或3%来苏儿）、新城疫Ⅰ系或Ⅳ系疫苗。 方法与步骤（实验视频六） （一）鸡胚的选择和和孵化应选择健康无病鸡群或SPF鸡群的新鲜受精蛋。为便于照蛋观察，以来航鸡蛋或其他白壳蛋为好。用孵化箱孵化，要注意温度、湿度和翻蛋。孵化最低温度为36℃，一般为37.5℃，相对湿度为60%。每日最少翻蛋3次。 发育正常的鸡胚照蛋时可见清晰的血管及鸡胚的活动。不同的接种材料需不同的接种途径（见图2-4），不同的接种途径需选用不同日龄的鸡胚。卵黄囊接种，用6～8日龄鸡胚；绒毛尿囊膜接种，用9～13日龄的鸡胚；绒毛尿囊腔接种，用9～12日龄的鸡胚；血管注射，用12～13日龄的鸡胚；羊膜腔和脑内注射，用10日龄的鸡胚。 （二）接种前的准备 病毒材料的处理怀疑污染细菌的液体材料，加抗生素（青霉素1000IU和链霉素1000μg/ml）置室温1h或4℃冰箱12～24h，高速离心，取上清液，或经细菌滤器滤过除菌。如为患病动物组织，应剪碎、匀浆、离心后取上清液，必要时加抗生素处理或过滤除菌。若用新城疫Ⅰ系或Ⅳ系疫苗，则无菌操作用生理盐水将其稀释100倍。 照蛋以铅笔划出气室、胚胎位置及接种的位置，标明胚龄及日期气室朝上立于蛋架上。尿囊腔接种选9～12日龄的鸡胚，接种部位可选择在气室中心或远离胚胎侧气室边缘，避开大血管。 （三）鸡胚的接种（以新城疫病毒的绒毛尿囊腔接种为例）在接种部位先后用5%碘酊棉及75%酒精棉消毒，然后用灭菌锥子打一小孔，一次性1ml注射器吸取新城疫病毒液垂直或稍斜插入气室,刺入尿囊，向尿囊腔内注入0.1～0.3ml。注射后,用熔化的蜡封孔，置温箱中直立孵化3～7d。孵化期间，每6h照蛋一次，观察胚胎存活情况。弃去接种后24h内死亡的鸡胚，24h以后死亡的鸡胚应置0～4℃冰箱中冷藏4h或过夜（气室朝上直立），一定时间内不能致死的鸡胚也放冰箱冻死。 （四）鸡胚材料的收获原则上接种什么部位，收获什么部位。 绒毛尿囊腔接种新城疫病毒时，一般收获尿囊液和羊水。将鸡胚取出，无菌操作轻轻敲打并揭去气室顶部蛋壳及壳膜，形成直径1.5～2.0cm的开口。用灭菌镊子夹起并撕开或用眼科剪剪开气室中央的绒毛尿囊膜，然后用灭菌吸管从破口处吸取尿囊液，注入灭菌青霉素瓶或试管内。然后破羊膜收获羊水，收获的尿囊液和羊水应清亮，浑浊说明有细菌污染。收获的病毒经无菌检验合格者冷冻保存。用具消毒处理，鸡胚置消毒液中浸泡过夜或高压灭菌，然后弃掉。 注意事项鸡胚接种需严格的无菌操作，以减少污染。操作时应细心，以免引起鸡胚的损伤。病毒培养时应保持恒定的适宜条件，收毒结束，注意用具、环境的消毒处理。 思考题：1．病毒的鸡胚接种途径有哪些？分别选用多大日龄的鸡胚？ 2．收集病毒时，为什么要弃掉24h以内死亡的鸡胚？ 1

鸡胚尿囊腔接种(单孔接种)SOP

鸡胚尿囊腔接种（单孔接种）操作规程 一、目的：使鸡胚尿囊腔接种规范化。 二、使用范围：适用于鸡胚尿囊腔接种工序。 三、责任者：鸡胚尿囊腔接种操作员。 四、内容： 1 准备工作 1.1 人员着装：操作人员按要求穿工作服、戴帽子、戴口罩、戴手套。 1.2 确认物品：签字笔、记录表、10日龄鸡胚、医用胶带、封孔胶、75%酒精棉、无菌棉 花、4%碘酒、毛笔、打孔器、直镊、1mL一次性无菌注射器（带针）、接种液、含冰容器、打火机、酒精灯、止血钳、危废缸、垃圾桶。 1.3 确认胚蛋全部照检画好气室标记线，气室朝上摆放，检查胚蛋外观完整无破损。 1.4 消毒：用75%酒精棉擦拭操作台面、手部，注意更换酒精棉，用过的酒精棉扔危废缸。 2 鸡胚消毒 2.1 碘酒消毒：用毛笔蘸取4%碘酒并沥干，对胚蛋气室标记处上0.2-0.3cm接种部位逐一 消毒，消毒面积为大拇指盖大小，消毒顺序从左到右、从上到下。 2.2 脱碘：用止血钳夹取75%酒精棉脱碘，脱碘顺序从左到右、从上到下；每15枚蛋胚更 换一个酒精棉，用过的酒精棉扔危废缸。 3 打孔：从不锈钢灭菌盒中取出打孔器，去掉锡箔纸，在蛋胚气室消毒处轻轻打一小孔， 注意打孔力度，防止打破，打孔顺序从左到右、从上到下。 4 接种 4.1 操作前摇匀种毒液，将种毒液放入含冰容器中； 4.2 用75%酒精棉消毒种毒瓶塞，用过的酒精棉扔危废缸； 4.3 取1mL一次性注射器，确认外包装完好后，取出注射器，注意拧紧针头与针筒连接处， 将注射器针帽取下，将接种液瓶倾斜60°，将针头插入接种液瓶塞中央部位，确保接种瓶内液体完全没过针头，抽取病毒液1.2mL，注意缓慢抽取以减少气泡产生；将注射器针头朝上直立，用手指轻弹气泡部位，待气泡上移到注射器顶端时，用75%酒精棉包住针头慢慢排尽气泡，确保病毒液保持在刻度线上，注意不要将种毒液溅到桌面或蛋胚上，用过的酒精棉扔危废缸。 4.4 沿打孔处垂直进针，注入种毒液，每胚0.1mL接种量，接种顺序从左到右、从上到下， 注意注毒时应缓慢推进，避免种毒接后溢出。（此操作否定项：每溢出一枚扣5分，超过3枚则此项操作为零分） 5 封孔：按从下到上、从右到左的顺序将封孔胶滴到打孔处。如发现产生气泡应重新封孔。

病毒接种鸡胚步骤

流感病毒鸡胚接种 材料：9-11龄鸡胚、孵蛋箱、照蛋器、开卵钻、石蜡、注射器、碘酒、70%酒精、镊子、二级生物安全柜等。 方法： 1 照蛋：⑴避开鸡胚及主动脉，找寻两血管间隙划线（最佳点）⑵划线在血管之间⑶标记蛋时不要太靠近气室处，因后面去壳时可能敲掉，导致标记不见 2 开孔：⑴开孔前先用75%酒精擦一下，由下而上或由上至下一遍即可，不可反复擦⑵开孔勿太大（太大不易封住，且易染菌） 3 注射：⑴针头45度斜插入孔中，至针头尾部到达蛋壳⑵注射后不要用力过大，抽出时不要过快⑶一针插入鸡胚，不要在里面搅拌 注：⑴握病毒管时不要握底部，易使病毒失活，融化时最好冰上融化，或流水冲洗⑵吸取液体时先混匀 尿囊腔接种：照检后画出气室边界和胎位，在胚胎面与气室交界处边缘约1mm处并避开血管做一标记，此即为注射点。在点及周围用75%酒精消毒，并用钻蛋机钻开一个约2mm长小口，勿损伤壳膜。用注射器注入流感病毒0.1-0.2ml，然后用石蜡溶化封口，置33-35度孵箱培养。每日照检鸡胚一次，于接种后24h 内死亡者为非特异性死亡应弃去。 甲型流感一般培养44-48h收获，而乙型流感病毒培养72h后进行收获。如病毒用冷冻干燥标本进行传代，无论甲型还是乙型均培养72h后才进行收获 收获前鸡胚须置4度冰箱6h或过夜，但不能置时间过长，过长会引起散黄。如急于收获亦可置-20度冰箱1h左右，但不能过长，过长会引起鸡胚结冰，再融化时卵黄膜就破碎，卵黄就流出。预冷的目的是：将鸡胚冻死使血液凝固，避免收获时流出红细胞并同尿液或羊水里的病毒发生凝集，造成病毒滴度下降。 收获时，用75%酒精消毒气室部卵壳，用消毒镊子轻轻敲碎气室部卵壳并取走之，再用另一无菌镊子撕去气室部壳膜，然后用无菌吸管通过绒毛尿囊膜进入尿囊腔，吸取尿囊液，置试管内4度或低温保存待用。 P3规范：⑴做有毒物需穿两件衣，⑵物从物流走，人从人流过，⑶所有沾毒东西都装2层塑料袋，密封，灭菌。

鸡胚培养

鸡胚培养 前言：鸡胚培养法是用来培养某些对鸡胚敏感的动物病毒的一种培养方法，用牛痘病毒（vaccinia virus）和鸡新城疫病毒（Newcastle-disease virus）接种鸡胚。牛痘病毒适宜于在绒毛尿囊膜上生长，经培养后，产生肉眼可见的白色痘疱样病变，似小结节或白色小片云翳状。鸡新城疫病毒适宜接种在尿囊腔和羊膜腔内，生长后，鸡胚全身皮肤出现出血点，以脑后最显著。 基本原理 鸡胚培养法是用来培养某些对鸡胚敏感的动物病毒的一种培养方法，此方法可用以进行多种病毒的分离、培养，毒力的滴定，中和试验以及抗原和疫苗的制备等。 鸡胚培养的技术比组织培养容易成功，也比接种动物的动物来源容易，无饲养管理及隔离等的特殊要求，且鸡胚一般无病毒隐性感染，同时它的敏感范围很广，多种病毒均能适应，因此，是常用的一种培养动物病毒的方法。 器材 牛痘病毒液，鸡新城疫病毒液； 白壳受精卵（自产出后不超过10天，以5天以内的卵为最好）； 孵卵器，检卵灯，齿钻，磨壳器，钢针，蛋座木架，注射器，2．5%碘酒，70%酒精，镊子，剪刀，封蜡（固体石蜡加 1/4凡士林，溶化），灭菌培养皿，灭菌盖玻片等。 操作步骤 1．准备蛋胚 孵育前的鸡卵先用清水以布洗净，再用干布擦干，放入孵卵器内进行孵育（37℃，相对湿度是45—60%），孵育三日后，鸡卵每日翻动1—2次。孵至第4日，用检卵灯观察鸡胚发育情况，未受精卵，只见模糊的卵黄黑影，不见鸡胚的形迹，这种鸡卵应淘汰。活胚可看到清晰的血管和鸡胚的暗影，比较大一些的可

以看见胚动，随后每日观察一次，将胚动呆滞或没有运动的、血管昏暗模糊者，即可能是已死或将死的鸡胚，要随时加以淘汰。生长良好的蛋胚一直孵育到接种前，具体胚龄视所拟培养的病毒种类和接种途径而定。 2．接种 1）绒毛尿囊膜接种 （a）将孵育10—12天的蛋胚放在检卵灯上，用铅笔勾出气室与胚胎略近气室端的绒毛尿囊膜发育得好的地方。（b）用碘酒消毒气室顶端与绒毛尿囊膜记号处，并用磨壳器或齿钻在记号处的卵壳上磨开一三角形或正方形（每边约5—6mm）的小窗，不可弄破下面的壳膜。在气室顶端钻一小孔。 （c）用小镊子轻轻揭去所开小窗处的卵壳，露出壳下的壳膜，在壳膜上滴一滴生理盐水，用针尖小心地划破壳膜，但注意切勿伤及紧贴在下面的绒毛屑囊膜，此时生理盐水自破口处流至绒毛屑囊膜，以利两膜分离。 （d）用针尖刺破气室小孔处的壳膜，再用橡皮乳头吸出气室内的空气，使绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室 （e）用注射器通过窗口的壳膜窗孔滴 0．05— 0．1ml牛痘病毒液于绒毛尿囊膜上。 （f）在卵壳的窗口周围涂上半凝固的石蜡，作成堤状，立即盖上消毒盖玻片。也可用揭下的卵壳封口，则将卵壳盖上，接缝处涂以石蜡，但石蜡不能过热，以免流入卵内。将鸡卵始终保持人工气室在上方的位置进行37℃培养，48—96小时观察结果。 ⑵尿囊腔接种 用孵育10—12天的蛋胚，因这时尿囊液积存得最多。 （a）将蛋胚在检卵灯上照视，用铅笔画出气室与胚胎位置，并在绒毛尿囊膜血管较少的地方作记号。 （b）将蛋胚竖放在蛋座木架上，钝端向上。用碘酒消毒气室蛋壳，并用钢针在记号处钻一小孔。 （c）用带18mm长针头的1ml注射器吸取鸡新城疫病毒液，针头刺入孔内，经绒毛尿囊膜入尿囊腔，注入0．1ml病毒液（图Ⅻ-5）。 （d）用石蜡封孔后于37℃孵卵器孵育72小时。

鸡胚培养和细胞培养

第一节 鸡胚接种 一、鸡胚的结构 鸡胚是正在发育的活的机体，组织分化程度低，细胞代谢旺盛，适于许多人类和动物病毒的生长增殖，是常用的病毒分离培养方法之一（衣原体、立克次体的分离亦用鸡胚）。目前，鸡胚在正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、疱疹病毒及脑炎病毒，尤其在禽类病毒的研究上应用较多。可用于病毒的分离、鉴定，抗原和疫苗制备，以及病毒性质的研究等。虽然随着组织培养技术的不断发展，不少病毒已不再用鸡胚来分离培养，但对某些病毒来说，鸡胚仍是一种不可缺少的培养手段。鸡胚培养的优点是，来源充足，价格低廉，操作简单，无需特殊设备或条件，易感病毒谱较广，对接种的病毒不产生抗体等。当然，鸡胚培养也有其缺点，即除痘斑和鸡胚死亡是特异性感染指征外，多需用第二试验系统来测定病毒存在与否；非SPF鸡胚，亦可能含有对某些家禽病毒的母源抗体，甚至还可能带有鸡白痢沙门氏菌、霉形体、鸡白血病等病毒。因此，用鸡胚分离培养病毒时，必须考虑这些问题。原则上应使用非免疫蛋来孵鸡胚，最好用SPF鸡胚。 一般说来，孵育至8-14天的鸡胚最有利于病毒的生长，因为此阶段鸡胚发育日趋完善，各种脏器均已形成，已能经受接种物的适当刺激，同时胚胎细胞幼嫩，骨胳不健全，还未长出羽毛，很利于病毒在胚胎中增殖，同时也有利于收获高滴度的病毒，14天以后，胚胎骨骼硬化，胚皮表面羽毛渐生，已不便感染病毒，特别是已不利于收获病毒材料。在操作鸡胚时）一定要注意到这一点。 孵育至21天左右，羊水和尿囊液已全部被胚胎吸收，一部分卵黄陷入胚胎腹部，另一部分则仍留在体外，胚胎已发育成小鸡，破壳而出。鸡胚的基本结构如图，从图中可以看出，鸡胚的最外层为石灰质的卵壳，上有气孔供气体交换，卵壳之下为壳膜，很易与卵壳分离，其功能是使气体分子与胚胎内的液体分子在内外进行交换，因此在孵育时需要有一定的湿度和空气。如果湿度太低，鸡胚就容易脱水、引起鸡胚死亡。气流不通，鸡胚缺氧，同样会造成鸡胚死亡。鸡胚的钝头（俗称“大头”），是气室，其功能是呼吸和调节胚内压力。壳膜之下为血管丰富的绒毛尿囊膜，其外层为绒毛膜，系外胚层形成，内层为尿囊膜，系内胚层形成，两膜所夹为中胚层。由于胚胎的肺发育不完善，此时绒毛尿囊膜代行胚胎呼吸器官的作用，气体的交换是在绒毛尿囊膜的血管内通过卵壳进行的。尿囊腔是胚胎的排泄器官，内含的尿囊液初为透明液体，成分极类似于生理盐水溶液，以后则尿酸盐含量增高。尿囊液量在11-13日龄时最高，平均达6毫升左右。 羊膜是胚胎的最内层包被，系外胚层和中胚层形成，羊膜腔内含羊水，胚胎浸于其中，羊水在起初是单纯的生理盐水溶液，以后蛋白质含量增加。羊水量在8-15日龄时最高，平均约为1毫升左右。附着于胚胎上的是卵黄囊，其膜系由内胚层和中胚层形成，内包卵黄，是胚胎发育的养料。卵的尖端（俗称“小头”） 是卵白，是胚胎发育晚期的养料

病毒的鸡胚接种

病毒的鸡胚接种 教学目标 使学生掌握病毒的鸡胚接种方法和收获方法。 材料准备 1.器材温箱、照蛋器、蛋架、超净工作台、1 mL注射器、20～27 号针头、镊子、酒精灯、灭菌吸管、灭菌滴管、灭菌青霉素瓶、铅笔、透明胶纸等。 2.种毒新城疫病毒悬液。 3.受精卵健康鸡群的受精卵，无母源抗体，产后10 d之内5 d最佳。 4.其他石蜡，质量分数为2.5%的碘酊及质量分数为75%的酒精棉球。 方法步骤 （一）鸡卵的保存、孵育及检卵 1.保存孵育前，保存在4.5～20 ℃的室温内，以10 ℃左右最佳，最多不能超过10 d。 2.孵育先将温箱调节温度为37.3～37.8 ℃，湿度45%～60%。将鸡卵孵入后，每日翻卵2～3次。 3.检卵孵后第4~6 d，用照蛋器检查发育情况，检出未受精及死亡鸡胚。鸡胚的生长情况分为以下几类： （1）未受精 4 ~6d后仅见模糊的卵黄黑影，无鸡胚迹象。 （2）生活鸡胚 4~6 d后可见到清晰的血管小团，内有鸡胚暗影，较大的鸡胚可见胚动。 （3）濒死或死亡鸡胚鸡胚活动呆滞或不能主动运动，血管昏暗或断折沉落。 （4）作标记将待接种的鸡胚取出，在照蛋器上照视，划出气室范围，并在鸡胚黑影，或绒毛尿囊膜发育中心等处，按接种途径要求标出记号。 （二）各种途径的鸡胚接种方法 1.尿囊腔接种 （1）接种方法孵育9～11日龄的鸡胚（实图6-20），经照视后，划出气室及胚胎位置，标明胚龄及日期，气室朝上立于卵架上。在气室中心或远离胚胎侧

气室边缘先后用碘酊棉球及酒精棉球消毒。以钢锥在气室的中央或侧边打一小孔，针头沿孔垂直或稍斜插入气室，进入尿囊，向尿囊腔内注入0.1～0.3 mL 新城疫病毒悬液，拔出针头,用融化的石蜡封孔，直立孵化（实图6-21）。孵化期间，每晚照蛋，观察胚胎存活情况。弃去接种后24 h 内死亡的鸡胚。 （2）收获方法 收获时间须视病毒的种类而定。新城疫病毒在接种后24～48 h 即可收获病毒。收获前将鸡胚置于0～4 ℃冰箱中冷藏4 h 或过夜，使血管收缩，以免解剖时出血。气室朝上立于卵架上，无菌操作轻轻敲打并揭去气室顶部蛋壳，形成直径为1.5～2.0 cm 的开口。用灭菌镊子夹起并撕开气室中央的绒毛尿囊膜，然后用吸管从破口处吸取尿囊液，每胚可得5～6 mL ，贮于无菌小瓶内，无菌检验后，冰冻保存，做种毒或试验之用。 （3）消毒 将用过的镊子、注射器等放入煮沸锅消毒5 min ，取出后擦干包好，高压灭菌待用。卵壳、鸡胚等置于消毒液中浸泡过夜，然后弃掉。无菌室内用紫外线灯消毒30 min 。 2.卵黄囊接种法 （1）接种方法 选用6～8日龄鸡胚，划出气室和胚胎位置，垂直放置在固定的卵架上，用碘酊及酒精棉消毒气室端，在气室的中央打一小孔，针头沿小孔垂直刺入约3 cm ，向卵黄囊内注入0.1～0.5 mL 病毒液。拔出针头,用融化的石蜡封孔，直立孵化3～7 d （实图6-22）。孵化期间，每晚照蛋，观察胚胎存活情况。弃去接种后24 h 内死亡的鸡胚。 （2）收获方法 将濒死或死亡鸡胚气室部用碘酊及酒精棉消毒，直立于卵架上，无菌操作轻轻敲打并揭去气室顶部蛋壳。用另一无菌镊子撕开绒毛尿囊膜，夹起鸡胚，切断卵黄带，置于无菌双碟内。如收获鸡胚，则除去双眼、爪及嘴，置于无菌小瓶中保存；如收获卵黄囊，则用镊子将绒毛尿囊膜与卵黄囊分开，将后者贮于无菌小瓶中。收获的鸡胚或卵黄囊，经无菌检验后，放置-25 ℃冰箱冷冻保存。 实图6-20鸡胚的结构 实图6-21尿囊腔接种

鸡胚尿囊腔接种(单孔接种)记录

鸡胚尿囊腔接种（单孔接种）操作记录 考生姓名：准考证号： 鸡胚接种物品准备 物品名称数量是否齐全物品名称数量是否齐全 签字笔1支含冰容器1个 记录表1张打孔器1把 10日龄鸡胚15枚1mL一次性注射器3个 标签纸1卷止血钳1把 封孔胶1瓶75%酒精棉1瓶 4%碘酒1瓶危废缸1个 毛笔1支不锈钢托盘1个 接种液1瓶利器桶1个 操作步骤及记录 1 准备工作 1.1 确认物品。 1.2 确认胚蛋全部照检画好气室标记线，气室朝上摆放，检查胚蛋外观完整无破损。 1.3 消毒：用75%酒精棉擦拭操作台面、手部，注意更换酒精棉，用过的酒精棉扔危废缸。 是否完成□ 2 鸡胚消毒 2.1 碘酒消毒：用毛笔蘸取4%碘酒并沥干，对胚蛋气室标记处上0.2-0.3cm接种部位逐一消毒，消毒 面积为大拇指盖大小，消毒顺序从左到右、从上到下。 2.2 脱碘：用止血钳夹取75%酒精棉脱碘，脱碘顺序从左到右、从上到下，用过的酒精棉扔危废缸。 是否完成□ 3 打孔：从不锈钢灭菌盒中取出打孔器，去掉锡箔纸，在蛋胚气室消毒处轻轻打一小孔，注意打孔力 度，防止打破，打孔顺序从左到右、从上到下。 是否完成□ 4 接种 4.1 操作前摇匀种毒液，将种毒液放入含冰容器中。 4.2 用75%酒精棉消毒种毒瓶塞，用过的酒精棉扔危废缸。 4.3 取1mL一次性注射器，抽取病毒液1.2mL，用75%酒精棉包住针头慢慢排尽气泡，确保病毒液保 持在刻度线上，注意不要将种毒液溅到桌面或蛋胚上，用过的酒精棉扔危废缸。 4.4 沿打孔处垂直进针，注入种毒液，每胚0.1mL接种量，接种顺序从左到右、从上到下，注意注毒 时应缓慢推进，避免种毒接后溢出。 是否完成□ 5 封孔：按从下到上、从右到左的顺序将封孔胶滴到打孔处。如发现产生气泡应重新封孔。 是否完成□ 6 标记：在已标记接毒名称、批号的标签上填写接种日期、接种数量、接种人，贴在蛋盘明显处。 是否完成□ 7 记录：按操作顺序填写记录。是否完成□ 8 清场：将含毒用具放入不锈钢托盘中，清洁、消毒台面，将危废缸内的垃圾放入危废垃圾桶。 是否完成□操作人签名：日期：年月日 备注： 1、物品准备齐全在□内画“√”，不齐全的在□内画“×”。 2、步骤完成的在□内画“√”，未完成的在□内画“×”。

病毒的鸡胚培养

病毒的鸡胚培养 一、目的要求 掌握鸡胚尿囊腔接种培养新城疫病毒的操作技术。 二、器材 1.鸡胚应选用健康鸡群的受精蛋，接种鸡的鸡胚应无母源抗体，以免影响病毒在胚胎中的增殖。实验用的鸡胚多采用9—10日龄的活胚。 2.接种材料新城疫I系疫苗 3.各种器械孵卵器、照蛋箱、蛋架、打孔器、1ml结核菌素注射器、41/2号注射针头、镊子、3%碘酊、75%酒精棉球、铅笔、酒精灯、剪刀、眼科镊子、灭菌的疫苗瓶、灭菌滴管和固体石蜡等。 三、内容和方法 （一）接种前的准备 1.鸡胚的准备 本实验选择9—10日龄的鸡胚，在照蛋时以铅笔勾划出气室，于气室稍下方胚胎活跃而血管明显的区域中，在血管之间的间隙划上记号，作为接种部位；用0、1%新洁尔灭把蛋壳搽洗干净并抹干，再以2%碘酊对接种部位进行消毒，用75%酒精再擦一遍，在接种定位出打孔，气室向上竖放于蛋架上。 2.病毒接种材料的准备 要分离培养的病毒材料应是无菌的，因此为达到材料无菌的目的，可在每ml接种物质中加青霉素和链霉素各100—500IU，置室温中1

小时或冰箱中12—24小时处理。或经滤器除菌。 （二）接种 绒毛尿囊腔内注射：用6号针头的1ml注射器吸取新城疫病毒材料，针头从已打好的小孔中向鸡胚方向插入0.5—-1cm,注入0、1ml （相当0、5羽份），再加氧化锌胶布贴封,再加融化的固体石蜡封口,放回孵化箱中进行孵化,每天翻蛋两次,照视一次.24小时内死亡的舍去。（三）收获 新城疫I系病毒材料，在接种24—48小时即可收获。收获前应将鸡胚置4度冰箱冷藏4小时或过夜，以免解剖时血管破裂。碘酒消毒蛋壳，用镊子去卵壳和尿囊膜，用吸头吸尿囊液于瓶内，可收集5-8ml，无菌检查，冰冻保存

IBV的鸡胚培养

IBV的鸡胚接种和培养规程 一．实验材料 鸡胚：选用健康无病鸡群或ＳＰＦ鸡群的新鲜受精蛋，一般选白或浅色壳蛋，以便照蛋时清晰，孵化至９～１０日龄。 1.接种材料：ＩＢＶ病毒液或组织病样，需要保证无菌处理。 2.器械：孵化箱、照蛋灯、蛋架、锥子、１ｍｌ和２.５ｍｌ注射器、镊 子、２%碘酊、75%酒精棉球、铅笔、酒精灯、剪刀、灭菌的疫苗瓶、蜡烛、铜筛网、０.２２μｍ过滤器。 二、实验步骤 １、鸡胚的孵化 打扫孵育箱：清理孵育箱中的垃圾，换掉脏水，用０.１％的新洁尔清洗蛋架、擦拭孵育箱各处。用甲醛和高锰酸钾熏蒸消毒：甲醛毫升数与高锰酸钾克数之比为2:1。福尔马林30mL/立方米，高锰酸钾15克/立方米。先用少量温水将高锰酸钾在玻璃容器中溶解，再加入福尔马林，人即离开，密闭箱门。熏蒸12~24h后再开启箱门。 孵化：条件相对湿度６０％，温度３７.５℃，每日翻蛋至少３次。孵化３～４天，用照蛋器观察：发育正常的鸡胚，血管清晰主要的分枝明显且呈鲜红色，鸡胚可以活动；未受精的蛋及时检出，死胚固定一端不动，看不到血管或血管消散，应检出。 ２.病毒接种材料的处理 病毒液：怀疑污染细菌的病毒液，经过滤器无菌过滤 组织病样：剪碎→研磨→２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ→取上

清→过滤 ３.照蛋：以铅笔划出气室，胚胎头的位置 ４.打扫无菌间：地面拖干净，桌面用０.１％的新洁尔擦拭干净，紫外照射２０ｍｉｎ。 ５.打孔：以2%碘酊对接种部位进行消毒，用75%酒精再擦一遍，用锥子在酒精灯火焰灼烧消毒后，在气室下沿无血管处扎一小孔。 ６.接种：针头从气室下沿小孔处插入，深１.５ｃｍ，即已穿过了外壳膜且距离胚胎有半指距离，注射量约０.２ｍＬ。注射后以蜡封闭小孔，置孵育箱中直立孵育，6小时后可以横放，以便翻蛋。

实验五十 动物病毒的鸡胚培养

实验五十一动物病毒的鸡胚培养 三、器材 1．病毒痘苗病毒（Vaccinia virus），鸡新城疫病毒（Newcastle distase virus）。 2.仪器或其他用具孵卵器，检卵灯，齿钻，磨壳器，钢针，蛋座木架，注射器，2.5％碘酒，70％乙醇，镊子，剪刀，封蜡（固体石蜡加1／4凡士林，溶化），灭菌培养板，灭菌盖玻片等。 3.白壳受精卵（自产出后不超过10d，以5d以内的卵为最好）。 四、操作步骤 1．准备蛋胚 孵育前的鸡卵先用清水以布洗净，再用干布擦干，放入孵卵器内进行孵育（37℃，相对湿度是45%~60%），孵育3d后，鸡卵每日翻动1~2次。孵至第4d，用检卵灯观察鸡胚发育情况，未受精卵，只见模糊的卵黄黑影，不见鸡胚的形迹，这种鸡卵应淘汰。活胚可看到清晰的血管和鸡胚的暗影，比较大一些的可以看见胚动，随后每日观察一次，将胚动呆滞的或没有运动的、血管昏暗模糊者，即可能是已死或将死的鸡胚，要随时加以淘汰。生长良好的蛋胚一直孵育到接种前，具体胚龄视所拟培养的病毒种类和接种途径而定。 鸡卵孵化期间，箱内应保持新鲜空气流通，特别是孵化5~6d后，鸡胚发育加快，氧气需要量加大，空气供应不足，会导致鸡胚大量死亡。 2.接种 （1）绒毛尿囊膜接种 ①将孵育10~12d的蛋胚放到检卵灯上，用铅笔勾出其实与胚胎略近气室端的绒毛尿囊膜发育的好的地方。 ②用碘酒消毒气室顶端与绒毛尿囊膜记号处，并用磨壳器或齿钻在记号处的卵壳上磨开一三角形或正方形（每边约5~6mm）的小窗，不可弄破下面的壳膜。在气室顶端钻一小孔。 ③用小镊子轻轻揭去所开小窗处的卵壳，露出壳下的壳膜，在壳膜上滴一滴生理盐水，用针尖小心地划破壳膜，但注意切勿伤及紧贴在下面的绒毛尿囊膜，以利两膜分离。 ④用针刺破其实小孔处的壳膜，再用橡皮乳头吸出气室内的空气，是绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室（图Ⅻ—4）。 ⑤用注射器通过窗口的壳膜窗孔滴0.05~0.1ml痘苗病毒液于毛绒尿囊膜上。 ⑥在卵壳的窗口周围涂上半凝固的石蜡，作成堤状，立即盖上消毒盖玻片。也可用揭下的卵壳封口，则将卵壳盖上，接缝处涂以石蜡，但石蜡不能过热，以免流入卵内。将鸡卵始终保持人工气室在上方的位置进行37℃培养，48~96h观察结果。 温度对痘苗病毒病灶的形成影响显著，应严格控制培养温度在37℃，高于40℃的培养温度，鸡胚不能产生典型病灶。 （2）尿囊腔接种用孵育10~12d的蛋胚，因这是尿囊液积存得最多。 ①将蛋胚在检卵灯上照视，用铅笔画出其实与胚胎位置，并在绒毛尿囊膜血管较少的地方做记号。 ②将蛋胚竖放在蛋座木架上，钝端向上。用碘酒消毒气室蛋壳，并用钢针在记号处钻一小孔。 ③用带18mm长针头的1ml注射器吸取鸡新城疫病毒，针头刺入孔内，经绒毛尿囊膜入尿囊腔，注入0.1ml病毒液（图Ⅻ—5）。 ④用石蜡封孔后于37℃孵卵器孵育72h。 （3）羊膜腔接种 ①将孵育10~11d的蛋胚照视，画出气室范围并在胚胎最靠近卵壳的一侧做记号。 ②用碘酒消毒气室部位的蛋壳。用齿钻在气室顶端磨一三角形，每边约1cm的裂痕。注意