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胰岛分离与纯化的实验研究

实验研究

胰岛分离与纯化的实验研究

韩礼欧,宋春芳,许 评,宋 纯

(哈尔滨医科大学第一临床医学院普外一科,黑龙江哈尔滨150001)

摘要:目的 通过改进胰岛的制备方法,以提高胰岛的获取数量和质量,从而解决可供移植的有功能的胰岛数量不足这一矛盾。方法 在经典的胰岛制备方法基础上对其加以改进,即在胶原酶V分离液及Fio11-400纯化液中加入STI与B SA-Fraction V后,进行胰岛的分离与纯化。结果 胰岛的产量为(1,360275) EI N/胰腺(n=8),纯度为85%,存活率为90%,胰岛的生物学活性良好。结论 改良的胰岛制备方法可大幅

度提高胰岛的获取数量和质量。

关键词:胰岛;分离;纯化

中图分类号:R517 文献标识码:A 文章编号:1004-5775(2002)05-0342-02

Experimental Studies on the Separation

and Purification of the Islets

HAN Li-ou,SONG Chun-fang,XU Ping,et al.

(Dep artment o f General Surgery,First Affiliated Hos p ital o f Harbin Medical University,Harbin150001,China)

Abstract:Objective To increase yield and quality of islets for transplantation by improving the technique of islets preparation.Methods The techniq ue of islet preparation was improved on the base of classical methods,soybean typsin inhibitor and BS A-Fraction V were added i nto sep aration solution of collagenase V and the purified rate was85%and survival rate was90%by the modi fied method.Results The yield of islet was(1.360275)EEIN per pancreas(n=8),and the puri fied rate was85%and survival rate was90%by the modified method,islet has better biological activi ty.Conclusion Improved method could obviously increase yield and quality of islets.

Key words:Islets;Separation;Purification

胰岛移植作为一种潜在的可治愈糖尿病的方法,一直是糖尿病研究领域热点。但目前胰岛移植的效果尚不理想,其中一个重要的原因是可供移植的有功能的胰岛数量不足。本实验通过改进胰岛的制备方法,以期提高胰岛的提取效率和质量,从而解决上述矛盾。

1 材料

wistar大鼠,体重250~300g,由哈尔滨医科大学第一临床医学院实验动物室提供。胶原酶V、Fico11400、DTZ、AO、PI等购自Sigma公司,STI、BSA-Fraction V购自Roche公司,胰岛

素放免试剂盒购自中科院原子能研究所。

2 方法

2.1 胰岛的分离与纯化

2.1.1 消化分离液和纯化液的配制:(1)消化分离液的配制:以Hanks液为基质,内含浓度为1.5mg/ml的胶原酶V,2 0mg/

ml STI,20mg/ml B SA-Fraction V,7.5mmol/L Ca2+,10mml/L HEPES,pH7.8,滤过除菌,备用。(2)纯化液的配制:先将Fi co11配制成375、345、307.5及165g/L4种浓度的储存液,110! 30min高压灭菌,然后用含STI(6mg/m1)和BSA(60mg/m1)的3?Hanks液(过滤除菌)于临用前按2:1分别将Fico11储存液稀释成250、230、205、110g/L4种浓度。

2.1.2 胰岛的分离与纯化方法:Wistel大鼠,雌雄不拘,体重250~300g。术前禁食12h,以0.5%戊巴比妥钠(30mg/kg)于后肢肌肉注射麻醉。经消毒后开腹,显露胰腺及胆总管的走行,在近十二指肠的胆总管远端胆总管近肝门处经后面各穿一缝线,暂不结扎。于胆总管中段向远侧顺行插入4.5号头皮针(已连接装有预温消化分离液的注射器),结扎胆总管近肝门处缝线,向胆总管内推注少量消化分离液,使胆总管内的胆汁排入十二指肠腔,之后结扎胆总管远端缝线,打开胸腔,破心放血,然后将预温的消化分离液10~15ml自插针处缓慢逆行注入胰管内,使胰腺充分膨胀,迅速完整摘取胰腺,移入50ml锥形瓶中(其内装有预温的上述消化分离液6~10ml),并置于38!水浴中轻轻摇动25~30min,然后用2倍体积的4!冷Hanks液(含10%小牛血清)终止消化,消化物经1000r/min离心5min,弃上清,并用Hanks液洗涤2次,之后在涡旋混匀器上混匀5s,使胰腺组织分散,混悬液经600u m孔径的不锈钢网过滤,再洗涤2次。

取15ml(12mm?150mm)刻度离心管1支,将获得的胰腺组织混悬于浓度为250g/L的Ficoll纯化分离液4ml中,然后在此悬液中依次按密度递减顺序逐层加入浓度为230g/L、205g/L与110g/L的Ficoll纯化液各2ml,其中另加Hanks液2ml,经2000r/min离心20min(注意缓慢加速),收集200g/L~ 110g/L界面、230g/L~200g/l界面的胰岛组织,用Hanks液洗涤2次。将获得的胰岛组织加入含有200g/L小牛血清、100U/ml青霉素、100mg/L链霉素、10mmol/L HEPES的RPMI~ 1604培养液中,置于体积分数为95%空气、5%CO2,37!的恒温培养箱中培养,待用。

2.2 胰岛特异性染色、计数、纯度估计

采用DTZ对胰岛进行特异性染色,采用平板计数法结合EIN法对DTZ染色阳性的细胞团进行计数,通过镜检胰岛悬液中胰岛悬液中胰岛数量与外分泌组织量之比来估计纯度。

2 3 胰岛活性鉴定及胰岛存活率的估计

应用AO~PI双染色法鉴定胰岛活性并估计胰岛的存活率。

2 4 胰岛素释放试验

计数100个活性胰岛(EIN),分别置于低糖(5.6mmol/L)、高糖(16.7m mol/L)的无血清RPMI~1640培养液中,在37!、5%CO2的恒温培养箱中孵育6h,采用放射免疫法测定培养液中的胰岛素含量。

2.5 统计学分析

本文中所有数据均以X S表示,显著性检验采用2样本均数差别的t检验。

3 结果

3.1 胰岛特异性染色(DTZ染色)

经双硫腙(DTZ)染色后,胰岛呈橘红色,直径多为100~ 300um,而胰岛周围散在分布的腺泡或导管细胞则不着色,对比十分鲜明。

3.2 胰岛的产量及纯度

胰岛的收获量为(1,360275)EIN/胰腺(n=8),纯度约为

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第26卷

2002年第5期

黑 龙 江 医 学

HEI LONG JI ANG MEDIC AL JOURNAL

Vol.26,No.5

May.2002

SP-B、SP-C对肺表面活性物质功能的影响

薄玉龙1,徐咏梅1,王海宽2,段东洋3,张瑞芹1,李文志1

(1 哈尔滨医科大学第二临床医学院麻醉科,黑龙江哈尔滨150086;

2 齐齐哈尔医学院第一附属医院麻醉科,黑龙江齐齐哈尔161041;

3 铁力市医院麻醉科,黑龙江铁力152500)

摘要:目的 探讨肺表面活性物质相关蛋白B、C(SP-B、SP-C)对肺表面活性物质功能影响。方法 将不含有SP-A、SP-D的肺表面活性物质脂质部分和脂质部分加入SP-B和(或)SP-C配制成实验液体。用气泡型表面张力计测定最小表面张力( m i n)。向未成熟胎兔气道内注入实验液体后进行人工通气,测定潮气量。结果 脂质部分加入SP-B和SP-C后 min明显下降至(2.10.8)mN/m,并明显增加动物的潮气量至25.3ml/kg 3.9ml/kg。结论 SP-B、SP-C协同可增加肺表面活性物质的功能。

3.3 胰岛活性的鉴定及胰岛的存活率

胰岛组织悬液经AO~PI染色后,在荧光显微镜下观察,

活性胰岛呈绿色,而非活性胰岛呈红色;应用AO~PI双染色

法估计胰岛存活率约为90%

3.4 胰岛素释放试验的结果见表1。

表1 胰岛素释放试验结果

释放试验例数胰岛素释放量(uU/EIN/min)

低糖n=60.930.16*

高糖n=6 2.050.32

与高糖组比较,*P<0.001

胰岛素释放试验显示高糖组的胰岛素释放量约为低糖组的2.2倍,P<0.001,结果提示分离纯化后获得的胰岛功能状态良好

4 讨论

应用胰岛移植治疗1型糖尿病,是比较合乎生理要求的方法。胰岛移植不仅可以纠正糖代谢紊乱,而且可以避免因血管病变引起的眼、肾、脑和心血管方面的并发症。但胰岛移植仍有许多问题要加以解决或完善,其中如何获得足量、纯净、存活且有良好功能的胰岛则是一个非常重要的问题。虽然分离胰岛的胶原酶消化早已建立,但影响胰岛分离效果的因素很多,因而胰岛的产量及其稳定性和一致性一直难以令人满意#1?#2?。本实验对胰岛的分离与纯化方法进行了改进,即在胶原酶V消化液和Ficoll400纯化液中加入大豆胰蛋白酶抑制剂(S TI)与牛血清白蛋白第5组分(B SA~FractionV)2种成分#3?#4?。

我们知道,胰腺是由内分泌部的胰岛和外分泌部的胰腺腺泡组成。胰岛散在分布于胰腺的腺泡实质中,其总体积仅占整个胰腺的1%~2%。因此,胰岛的分离是将其从丰富的外分泌腺泡中分离出来。在胰岛的分离过程中,无论是早期的胰腺剪切后胶原酶再消化胰腺片段的方法,还是经典的经胰管逆行灌注胶原酶溶液膨胀胰腺的消化分离方法,都会不可避免地引起胰腺外分泌部的破坏,大量的胰蛋白酶原及其他一些消化酶原(如糜蛋白酶原、磷脂酶A2等)自破坏的外分泌部中被释放出来,释放出来的胰蛋白酶原具有微弱地激活自身的能力,从而改变其分子组成,释放活性肽,即胰蛋白酶。所形成的胰蛋白酶又可以迅速地加快胰蛋白酶原的自身激活(autoactivation),这是一种正反馈式的激活。大量被激活的胰蛋白酶对胰岛组织具有强烈的破坏作用,同时胰蛋白酶还是一个关键性的触发酶,可以激活许多其他的酶原引起一系列酶促反应的%爆发&导致胰岛损害。

STI的主要作用是其与胰蛋白酶分子结合后使胰蛋白酶失活,从而抑制已激活的胰蛋白酶的活性,并进而避免大量胰蛋白酶原及其他一些消化酶原被过早激活,这是防止胰岛组织被裂解破坏的重要保护措施之一。值得强调的是,胰蛋白酶除直接对胰岛组织有破坏作用外,还可以激活磷脂酶A2引起继发性的损害,磷脂酶A2通常以无活性的酶原形式存在于胰腺的导管内,它可被胰蛋白酶和胆盐激活而成为活化的磷脂酶A2,从而将返流入胰胆液中的卵磷脂和脑磷脂转变为溶血卵磷脂和溶血脑磷脂,这些物质具有很强的细胞毒作用,使细胞和组织发生坏死。因此,在胰岛的分离过程中,一方面应加入STI抑制胰蛋白酶活性,防止其被过早、过量激活;另一方面,还应注意的是在经胆总管逆行胰管内灌注胶原酶消化液之前,应先排空滞留于胆总管内的胆汁,这一步骤对于防止磷脂酶A2的激活亦是非常必要的。

在胰岛的分离纯化过程中,氧自由基的含量可明显增高,其原因可能有如下几个方面:?胰蛋白酶、糜蛋白酶及胆汁酸盐激活黄嘌呤氧化酶,该酶催化次黄嘌呤而产生大量氧自由基;(磷脂酶A2及损伤的血管内膜细胞均可活化血小板而释放氧自由基;)组织缺血、缺氧时从线粒体呼吸链中泄漏的氧自由基增多,且ATP生成减少致黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶增加。氧自由基含量增高的危害在于:一方面,氧自由基本身具有损伤DNA和致蛋白质内巯基氧化等细胞毒作用而直接损伤胰岛:另一方面,氧自由基的过氧化物可造成细胞膜稳定性降低,使胰腺细胞溶酶体酶释放、消化酶活化从而破坏胰岛。因此,在胰岛的分离纯化过程中,必须设法减少氧自由基的含量,防止过量的氧自由基对胰岛细胞造成损害,本实验在胶原酶V消化分离液和Ficoll纯化液中均加入牛血清白蛋白第5组分(BSA~FractionV)这是因为BSA-Fraction V分子表面存在的游离巯基(-SH)能够直接与氧自由基发生反应从而以氧自由基清除剂的作用。通过上述改进,从啮齿类动物单个供体获得胰岛的数量、纯度、存活率及稳定性、一致性均得到显著的提高,胰岛的生物学活性良好。组织形态学的研究证实#5?,胰岛细胞根据其颗粒的染色特点主要分为3种类型,分别称为 、A、D细胞,这3种细胞在胰岛内的排列有一种规律, 细胞排列在细胞团的中央,而A细胞围绕在细胞团的表面, 和A细胞层之间则有少许量D细胞,使3者在解剖结构上相互毗邻接触,内分泌机能上互相影响,构成所谓%旁分泌系统&。因此,在胰岛的分离纯化过程中保持胰岛细胞团的完整有着重要的生理学意义。本实验中所采用的分离、纯化方法由于减轻了胰酶及氧自由基等因素对胰岛的损害作用。所以,不仅胰岛的产量幅度增加,而且可以更好地保持胰岛细胞团的完整性,从而有利于胰岛整体功能的发挥。

参考文献

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#3?Basir I,van der Burg MP,Scheri nga M,et al.Improved out come of pig islet isolation by Pefabloc inhibi tion of trypsin#J?.Trans plant Proc,1997,29(4):1939~41.

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#5?袁耀宗.胰腺病学新进展与新技术#M?.上海:上海科学技术文献出版社,2001.43~44.

(编辑:刘学振)

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第26卷2002年第5期

黑 龙 江 医 学

HEI LONG JI ANG MEDIC AL JOURNAL

Vol.26,No.5

May.2002