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玫瑰花蕾黄酮类化合物提取及清除羟自由基能力_齐亚娥

玫瑰花蕾黄酮类化合物提取及清除羟自由基能力_齐亚娥
玫瑰花蕾黄酮类化合物提取及清除羟自由基能力_齐亚娥

玫瑰花(RosarugosaThunb)别名红玫瑰、徘徊花、刺玫花,为蔷薇科植物落叶小灌木,现全国各地均有栽培。玫瑰花具有理气解郁、和血散瘀、舒肝镇痛、收敛止泻[1]等药理作用。玫瑰花蕾可以酿酒、制糖、作糕点、窨茶,还是日用化学工业制造香脂、香水、牙膏及高级化妆品的配料。本文采用微波法从大瓣玫瑰花蕾和小瓣玫瑰花蕾中提取黄酮类化合物,并测定了总黄酮含量。用Fe2+-H2O2体系产生?

OH,迅速氧化罗丹明B使其褪色,利用其褪色效应,采用分光光度法对两种玫瑰花蕾清除羟自由基能力进行了研究。结果表明,两种玫瑰花蕾黄酮含量较高,并有较强的清除羟自由基能力,随着提取物用量的增加,其清除羟自由基能力逐渐增强。

1材料与仪器1.1

材料

收稿日期:2006-09-28*通讯作者

基金项目:甘肃省教育厅科研项目(0509-02)。

作者简介:齐亚娥(1981-),女,甘肃陇西人,助教,主要从事结构化学的教学工作。

玫瑰花蕾黄酮类化合物提取及清除羟自由基能力

齐亚娥,吴冬青*,安红钢,林

(西部资源环境化学重点实验室,河西学院化学系,张掖734000)

摘要:采用微波法从大瓣玫瑰花蕾和小瓣玫瑰花蕾中提取黄酮类化合物,并测定了黄酮含量,分别为

71.4736mg/g、71.0636mg/g,RSD(n=9)分别为0.5972%、0.5852%。利用了Fe2+-H2O2-罗丹明B分析体系,研究了两种玫瑰花蕾提取物清除羟自由基能力,实验结果表明,两种玫瑰花蕾提取物都具有较强的清除?OH的能力。

关键词:玫瑰花蕾;提取物;黄酮含量;清除?OH能力中图分类号:S685.12

文献标识码:A

文章编号:1005-9989(2007)04-0082-03

Studyoftheextractionoftheflavonolfromrosepetalsandtheir

eliminatingcapacityofthe?OH

QIYa-e,WUDong-qing*,ANHong-gang,LINMin

(KeyLaboratoryofResourcesandEnvironmentChemistryofWestChina,

DepartmentofChemistry,HexiUniversity,Zhangye734000)

Abstract:

Inthispaper,

theapproachofmicrowaveisadoptedtoextracttheflavonolfromroseswithlarge

petalsandsmallonesaswellasmakeavailabletheirrespectivecontentofflavone:

71.4736mg/gand

71.0636mg/g,withtheRSD(n=9)of0.5972%and0.5852%respectively.TheFe2+-H2O2-RhodamineBanalyzingsystemisalsotherebyappliedtostudytheeliminatingcapacitiesofthe?OHofthetwopetals’extract,andtheresultshowthatthetwovarietiesofextractbothhaveastrongeliminatingcapacityofthe?OH.Keywords:rosepetals;extract;contentofflavone;theeliminatingcapacityofthe?OH

大花瓣玫瑰花蕾和小花瓣玫瑰花蕾采集(5月)甘肃省天祝藏族自治县,洗净,晒干粉碎备用。

1.2主要试剂

芦丁:生化试剂,国药集团化学试剂有限公司;罗丹明B:天津市凯通化学试剂有限公司,分析纯;95%乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、硫酸亚铁、H

O2:国产分析纯。

1.3主要仪器

2100型分光光度计:上海分析仪器厂;FA1004型电子天平:上海精密科学仪器有限公司;HH-4数显恒温水浴锅:常州国华有限公司;LG微波炉:天津乐金电子电器有限公司;RE-52型旋转蒸发仪:上海青浦沪西仪器厂;SHB-Ⅲ型循环式多用真空泵:郑州长城科工贸有限公司。

2玫瑰花蕾中黄酮含量测定

2.1黄酮类化合物提取

称取备用的两种玫瑰花蕾样品粉末2.0000g,加入75%乙醇40mL,室温浸提2h后进行微波低火提取2.0min。提取结束后,将溶液冷却到室温,抽滤。滤渣进行第二次、第三次微波提取,滤液合并,浓缩定容为100mL,得一定浓度的黄酮提取液备用。

2.2对照品溶液的制备

精密称取芦丁对照品30mg,以少量乙醇微热溶解后,置于50mL容量瓶中,乙醇定容。精密吸取20mL,再以乙醇定容于50mL,摇匀。即得芦丁对照液,浓度为0.24mg/mL。

2.3标准曲线的制备

精密吸取芦丁对照液0、0.2mL、0.6mL、1.2mL、1.8mL、2.4mL、3.0mL、3.6mL分别于具塞试管中,

均用乙醇稀释至4.0mL,精密加入5%NaNO

0.4mL,

摇匀,放置6min后,加入10%Al(NO

)30.4mL,摇匀,放置6min后,加入5%NaOH4.0mL定容至10.0mL放置15min,测定510nm处吸光度值。以吸光度值为横坐标、芦丁含量为纵坐标绘制标准曲线,得回归直线方程为:y(mg)=1.2194x+0.0006,R2=0.9996,测定范围0 ̄0.90mg。

黄酮含量(mg/g)=x×d/w

式中:d──稀释倍数;

w──样品质量,g。

2.4样品黄酮含量的测定

精密吸取一定量的样品备用液,根据标准曲线的制备方法测定样品在510nm处吸光度值,代入回归方程,计算出样品中黄酮的含量,结果为:大瓣玫瑰花蕾、小瓣玫瑰花蕾总黄酮含量分别为71.4736mg/g、71.0636mg/g,RSDn=9分别为0.5972%、0.5852%。说明黄酮含量测定方法重现性好,结果可靠。

3玫瑰花蕾清除羟自由基能力测定

3.1羟自由基检测

取两支10mL的比色管,1号管中加入罗丹明B溶液2.5mL、H

SO4溶液0.8mL。2号管中加入罗丹明B溶

液2.5mL、H

SO4溶液0.8mL、FeSO4溶液1.5mL、H2O2溶液1.0mL,加蒸馏水稀释至刻度,摇匀,放置5min后,以1cm比色皿,在558nm波长处测定吸光度,计算ΔA。

3.2羟自由基清除率的测定

于10mL具塞刻度试管中,依次加入罗丹明B溶液2.5mL、H2SO4溶液0.8mL、FeSO4溶液1.5mL、H2O2溶液1.0mL,摇匀,放置5min后,加入一定量样品液,

蒸馏水稀释至刻度,测定其吸光度A

,对照以溶剂代替样品液,其余步骤同上,测定其吸光度值A,空白

体系(罗丹明B和H

SO4溶液)吸光度值AO。

清除率(%)=AS-A

AO-A

×100

3.3吸收光谱

按3.1方法配制各种反应体系,于440 ̄620nm范围内进行光谱扫描,结果见图1。

由图1可知,罗丹明B空白体系最大吸收峰在558nm处,罗丹明B与单独的过氧化氢、硫酸亚铁几乎不反应,但被过氧化氢及硫酸亚铁反应产生的羟自由基氧化后明显褪色,吸光度显著下降,但最大吸收波长不变。加入抗氧化剂(Vc、玫瑰花蕾的提取液),也会使吸光度降低,降低程度减弱,最大吸收波长基本不变,因此,以下实验均选558nm为测定波长。3.4实验条件研究

3.4.1罗丹明B的用量加入不同体积的0.002%的罗丹明B溶液,按3.1方法测定,计算ΔA。结果表明,随着罗丹明B用量的增加,ΔA增大,罗丹明B用量大于3.0mL时,空白参比吸光度值超出正常读数范围,故选择罗丹明B的用量为2.5mL。

3.4.2硫酸亚铁的用量加入不同体积的0.4mmol/L注:1.罗丹明B+硫酸;2.罗丹明B+硫酸+硫酸亚铁+双氧水;3.罗丹明B+硫酸+硫酸亚铁+双氧水+抗氧化剂。

图1光谱扫描图

样品体积(mL)

时间(min)

清除率(%)

大瓣玫瑰花蕾1.4591.89小瓣玫瑰花蕾

1.4

86.09

的FeSO4溶液,按3.1方法测定,计算ΔA。实验结果显示,随着FeSO4溶液用量的增加,ΔA增大,

FeSO4溶

液的用量在1.5mL时ΔA增幅不大,趋于平稳,选择FeSO4溶液用量为1.5mL。3.4.3

H2O2的用量

加入不同体积的0.3%H2O2溶液,

按3.1方法测定,计算ΔA。结果是随着H2O2溶液用量的增加,ΔA增大,H2O2溶液的用量在1.0mL时,ΔA为最大,H2O2用量大于1.0mL时,ΔA值随着H2O2溶液的用量增大而减小。选择H2O2的用量为1.0mL。

3.4.4硫酸用量的影响罗丹明B本身显粉红色,不受酸度的影响,其被?OH氧化的程度与酸度有关,在稀H2SO4介质中,罗丹明B可迅速被?OH氧化褪色,按

3.1方法测定,计算ΔA,结果见表1。

随着稀H2SO4(0.2mol/L)用量的增加,体系逐渐

趋于不稳定,重现性差,而用量太少反应缓慢,当

H2SO4用量为0.8mL时,反应速度较快,ΔA较大,体系稳定。故选择H2SO4的用量为0.8mL。

3.4.5反应时间按3.1方法配制?OH反应体系溶

液,每隔1min测定一次吸光度值。实验结果显示,在4min内,吸光度随着时间的增长而急剧的下降,

5min后吸光度基本保持不变。因此本实验选用反应时间为5min。

3.5方法的重现性

按3.1方法配制9份。?OH反应体系的溶液进行重

现性实验,结果见表2。

酸体积(mL)

0.40.60.81.01.21.41.6

△A0.3940.3900.4040.3310.3210.2920.264

表1

酸度对反应体系的影响

编号123456789吸光度0.593

0.593

0.626

0.611

0.5920.596

0.588

0.593

0.599

平均吸光度

0.599RSD(%)

1.204

表2

方法的重现性结果

由表2可知,经过9次的重复性实验它们的RSD为1.204%,表明该实验方法重现性好,方法可靠。3.6玫瑰花蕾清除?OH能力研究3.6.1

玫瑰花蕾清除率测定

分别取一定量大瓣玫瑰

花蕾(0.7147mg/mL)、小瓣玫瑰花蕾(0.7106mg/mL)提取液,按3.2方法测定,计算其对羟自由基的清除率,结果见表3。

从表3可知,两种玫瑰花蕾都具有较强的清除羟自由基能力。

3.6.2提取液用量对清除率的影响随着提取液用量

的增加,清除率增大,到1.4mL时大瓣玫瑰花蕾的清除率达到98.34%,1.4mL时小瓣玫瑰花蕾的清除率达到94.04%。其二者用量大于1.4mL清除率趋于平稳。

3.6.3提取液对?OH清除时间的影响移取1.4mL两

种玫瑰花蕾的乙醇提取液,按3.2方法每隔1min测定一次吸光度,然后计算清除率,从而确定对羟自由基清除时间的影响,结果见表4。

实验表明二者对羟自由基的清除时间有一定的

影响,一定量两种玫瑰花蕾提取液在一定的时间内对羟自由基的清除作用呈增强趋势,在5min后逐渐达到平稳,因此最佳清除时间为5min。

4结论

4.1

大瓣玫瑰花蕾、小瓣玫瑰花蕾黄酮含量较高,

总黄酮含量分别为71.4736mg/g、71.0636mg/g,RSD

(n=9)分别为0.5972%、0.5852%。说明测定黄酮类化合物含量的方法可靠。

4.2采用罗丹明B-Fe2+-H2O2体系光度法测定玫瑰花蕾清除羟自由基重现性好,方法可靠,结果满意。4.3

罗丹明B用量、FeSO4用量、H2O2用量、H2SO4用

量以及反应时间对羟自由基的清除作用都有一定的影

响,最佳实验条件为:0.2mol/L的H2SO4溶液0.8mL、

0.002%的罗丹明B溶液2.5mL、0.4mmol/L的FeSO4溶液1.5mL、0.3%的H2O2溶液1.0mL、反应时间5min。4.4

实验表明:两种玫瑰花蕾对羟自由基具有较强的清除能力,随着提取物用量的增加,其清除能力逐渐增强。当大瓣玫瑰花蕾提取物(0.7147mg/mL)和小瓣玫瑰花蕾提取物(0.7106mg/mL)添加量达到1.4mL时清除率分别达到98.34%和94.04%,大瓣玫瑰花蕾清除羟自由基能力稍强于小瓣玫瑰花蕾。

参考文献:

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研究[J].食品科学,2005,26(11):192-193

样品提取液清除率(%)

大瓣玫瑰花蕾78.31小瓣玫瑰花蕾

75.44

表3样品对?OH清除作用

表4样品提取液对?OH清除时间的影响

[3]田云,卢向阳,何小解.天然植物抗氧化剂清除氧自由基特性研究[J].食品科学,2005,26(6):123-125

[4]徐红,刘峻,等.5种石斛及其组织培养物对活性氧的清除

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阳师范学院学报(自然科学版),2005,18(4):439-441

[7]方光荣,刘洁,宋功武.罗丹明B显色检测Fenton反应产

生的羟自由基[J].分析试验室,2004,23(10):552-557

收稿日期:2006-09-28

基金项目:广东省林业局项目(2004-14)。

作者简介:吴雪辉(1965-),女,湖南益阳人,博士,副教授,主要从事粮油食品的研究工作。

肉桂精油的抗氧化作用研究

吴雪辉1,黄永芳2,高

强1,苏锦强3,周

薇1,李昌宝1

(1.华南农业大学食品学院,广州510642;2.华南农业大学经济林研究中心,广州510642;

3.广东省高要市林业局,高要526100)

摘要:探讨了肉桂精油清除自由基和抗油脂氧化的功能,结果显示:肉桂精油对二苯代苦味肼基(DPPH?)、超氧阴离子自由基(O-2?)及羟基自由基(OH?)均有一定的清除作用,且清除能力随浓度的增加而增强,其中以清除OH?的效果最好,肉桂精油浓度为0.1mg/mL时,清除率达95.5%;同样肉桂精油也具有一定的抗油脂氧化能力,当肉桂精油的添加量为花生油质量的0.5%时,效果最好,且肉桂精油抗油脂氧化能力比0.05%Vc的效果要好,但比0.01%PG稍差。关键词:肉桂精油;清除;自由基;油脂;抗氧化中图分类号:TS201.1

文献标识码:A

文章编号:1005-9989(2007)04-0085-04

Studyontheantioxidantactivitiesofcinnamonessenceoil

WUXue-hui1,HUANGYong-fang2,GAOQiang1,SUJin-qiang3,ZHOUWei1,LIChang-bao1

(1.CollegeofFoodScience,SouthChinaAgricalturalUniversity,Guangzhou510642;2.Non-timberForestryResearchCenter,SouthChinaAgricalturalUniversity,Guangzhou

510642;3.GuangdongGaoyaoForestryBureau,Gaoyao526100)

Abstract:Thescavengingfreeradicalandantioxidantactivityofcinnamonessenceoilwasstudied.Theresultsshowedthatthecinnamonessenceoilhadscavengingeffectonfreeradicalof1,1-dippheny-2-picrylhydrayradical(DPPH?),hydroxylradical(OH?)andsuperoxideradical(O-2?).Thescavengingcapacityofthecinnamonessenceoilwasimprovedastheconcentrationincreased,thescavengingcapacitytoOH?wasthebest,itwas95.5%whentheconcentrationofcinnamonessenceoilwas0.1mg/mL.

Andalsothecinnamonessenceoil

possessedantioxidantactivitiesinlipid.Whentherateofcinnamonessenceoilconcentrationandpeanutoilis

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

DPPH自由基清除法

DPPH自由基清除法 李熙灿/Xican Li (广州中医药大学) [文献] Xican Li, Jing Lin, Yaoxiang Gao, Weijuang Han, Dongfeng Chen. Antioxidant activity and mechanism of Rhizoma Cimicifugae. Chemistry Central Journal. 2012; 6(1):140. [原理] DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical)即1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基。分子中,由于存在多个吸电子的-NO2和苯环的大π键,所以,氮自由基能稳定存在。 N 2 2 当DPPH自由基被清除,其最大吸收波长519nm处的吸光度A值随之减小。DPPH这种稳定的自由基为清除自由基活性的检测提供了一个理想而又简单的药理模型。 [实验步骤] 1.1 DPPH测试液的配制 取DPPH 1mg溶于约20mL溶剂(乙醇、95乙醇或甲醇)中,超声5min,充分振摇,务使上下各部分均匀。取1mL 该DPPH溶液,在519nm处测A值,使A=1.2-1.3之间最佳。该DPPH溶液最好避光保存,3.5小时内用完。 1.2 样品液的配制 样品用合适的溶剂溶解,为便于计算,可配成1mg/mL浓度。溶剂根据样品的极性进行选择,首选95乙醇或无水乙醇,如不溶可用DMSO。 1.3 预试 取DPPH溶液2mL,往其中加少量样品液,加样时,先少后多渐加,边加边混合,并观察溶液的褪色情况,当溶液颜色基本褪去时,记下样品的加样量。 此加样量即为样品的最大用量,在此最大用量的基础上,往前设置5个用量,使之成等差数列。 【如】在预试过程中,发现加样到200μL时,DPPH溶液颜色基本褪去,则100μL为该样品液的最大用量。其用量梯度宜设为40、80、120 、160、200μL。 1.4测量 A0值的测量:取DPPH溶液2 mL加入到小试管(或玻璃瓶)中,加95乙醇(或无水乙醇)1mL,充分混合,测A值(519nm),此A值为A0(A0多在0.7-0.9之间)。 A值的测量:取DPPH溶液2mL加入到小试管(或玻璃瓶)中,加样品液xμL (x是根据1.3 预试结果确定样品液的用量),再加(1000 -x)μL 95乙醇(或无水乙醇),混合,静置30分钟后,测A值(519nm)。如:某样品的用量梯度为40、80、120 、160、200μL,则加样表如下: 表1 加样表 1.5 正式测量

清除自由基能力的研究概况

清除自由基能力的研究概况 陶涛 (西南林业大学林学院农学(药用植物)昆明 650224) 摘要:自由基及其诱导的氧化反应是导致生物衰老和某些疾病如癌症、糖尿病、一心血管疾病等的重要因素。乳酸茵作为一种高效、低毒的生物源天然抗氧化荆,正逐步受到食品、制药、化工等领域的广泛关注。就目前国内外常用的乳酸茵抗氧化活性的筛选方法、乳酸茵抗氧化机理的国内外研究进展及未来的发展趋势作一综述。 关键词:自由基;乳酸茵;抗氧化. Study on the scavenging ability of lactic acid bacteria on free radical bstract:Free radical and its inducing oxiditative reaction may CaUSe biological doat and certain diseases such as Cancers,diabetes and the cat- diovascular.The lactic acid baaeria as one ofbiological SOUrCeS oxidation inhibitor is becoming more and more popular in the fields offood.,drug manufacture and chemical industry.This article mainly reviews the screening methods for antioxidative of lactic add bacteria among domestic and foreign countries,the advance of the research progress in lactic add bacteria antioxidative and r∞earch trends in future. 引言 氧化过程可以提供能量.对大多数生物体来说,是维持生命必不可少的一个能量转化过程。但过多的氧化过程会对生物大分子引起损伤.氧化损伤主要是由于自由基和过氧化产物作用于人体而产生的。 自由基(free radicals)27..称游离基.为人体氧化代谢过程中形成含有一个不成对电子的原子或原子团。人体的自由基主要包括超氧阴离子自由基(o2)、

DPPH和ABTS、PTIO自由基清除实验-操作图解-李熙灿-Xican-Li

DPPH?和ABTS+?自由基清除实验(含PTIO?自由基清除实验):详细说明与疑难解答 李熙灿(广州中医药大学中药学院, 2019.7) (以下内容系来源于实验经验及三个参考文献[1]Li, X., Comparative Study of 1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl Radical (DPPH?) Scavenging Capacity of the Antioxidant Xanthones Family. Chemistryselect, 2018. 3,13081-13086. [2]Li, X.; Ouyang, X.; Cai, R.; Chen, D. 3’,8”-Dimerization Enhances the Antioxidant Capacity of Flavonoids: Evid ence from Acacetin and Isoginkgetin. 2019, Molecules. 24, 2039. [3]Li, X.C., 2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl 3-Oxid e (PTIO?) Radical Scavenging: A New and Simpl e Antioxidant Assay In Vitro. J. Agric. Food Chem., 2017. 65,6288-6297 【概述】DPPH?、ABTS+?、PTIO?自由基三者,都是常用的自由基。概述如下表: 1

紫色墨绿色蓝紫色 2

3

DPPH抗氧化能力测定

DPPH.法测定绿原酸清除自由基能力 2.1 待测液的制备 将绿原酸(纯度56%)、维生素C 和没食子酸分别配制成体积分数为0.1mg/mL 的无水乙醇溶液。 2.1.1 绿原酸母液的配制 称取 9.0 mg 绿原酸,定容到50ml ,即可得到绿原酸的母液0.1mg/mL 。然后,再将所配制的母液按照要求稀释成不同浓度的溶液。 分别为 mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml 。 2.1.2 Vc 母液的配制 称取 mg VC ,定容到100ml ,即可得到VC 的母液。然后,再将所配制的母液按照要求稀释成不同浓度的溶液。 分别为 mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml 。 2.1.3 没食子酸母液的配制 称取 mg 没食子酸,定容到100ml ,即可得到没食子酸的母液。然后,再将所配制的母液按照要求稀释成不同浓度的溶液。 分别为 mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml 。 2.1.4 DPPH 母液的配制 称取 mg DPPH ,用无水乙醇定容到100ml ,即可得到DPPH 的母液。然后,再将所配制的母液按照要求稀释成至一定浓度的溶液。C DPPH = mg/ml 。(建议用0.025mg/mL ) 2.2 DPPH.溶液的可见光谱 以无水乙醇为对照,在分光光度计上对DPPH.溶液进行在440~600nm 下扫描。A max = nm 2.3 抗氧化活性测定 DPPH.是一种稳定的自由基,它的乙醇溶液呈紫色,在可见光区最大吸收峰为 nm 。当DPPH.溶液中加入自由基清除剂时,溶液颜色变浅,517nm 处的吸光度变小,而吸光度变小的程度与自由基被清除的程度呈线性关系。因此,可用来检测自由基的清除情况,从而评价某物质的抗氧化能力,其能力用清除率(Scavenging Rate,SR)来表示,清除率越大,抗氧化能力越强 [4.5]。 具体实验步骤及方法: 精确吸取的DPPH.溶液2mL 与2ml 无水乙醇混合均匀后,以相对应的溶剂(4mL 无水乙醇)为对照,用分光光度计测定上述溶液在 nm 处的吸光度值(A 0)。 A 0= 2.3.1 绿原酸样品溶液的抗氧化能力测定 精确吸取上述不同浓度的绿原酸溶液2mL ,分别与浓度 mg/ml 的DPPH.溶液2mL 混合,摇匀后放置30min 。以相对应的溶剂(无水乙醇)为对照调零,用分光光度计分别测定上述溶液在 nm 处的吸光度值(A i ),分别测得A i 值。 A 1 ;A 2 ;A 3 ;A 4 ;A 5 ;A 6 ;A 7 。 精确吸取上述不同浓度的绿原酸溶液2mL ,分别与2mL 无水乙醇混合均匀后,以无水乙醇为对照,用分光光度计分别测定各混合液在波长 nm 处的吸光度值(A j ),分别测得A j 值。 A 1 ;A 2 ;A 3 ;A 4 ;A 5 ;A 6 ;A 7 。 将以上数据代入下列公式计算其清除率。 清除率SR(%)=%100A A A 10j i ???? ? ?? -- 其中, A i :为2mL 绿原酸、维生素C 和没食子酸与 2mL 的DPPH.溶液混合后在波长 nm 处的吸光度值; A j :为2mL 绿原酸、维生素C 和没食子酸分别与2mL 无水乙醇溶剂混合后在波长 nm 处的光值; A 0:2mLDPPH.溶液与2mL 无水乙醇溶剂混合后在波长 nm 处的吸光度值。

DPPH自由基SOP

主要目的: ——为了测定样品清除DPPH自由基的能力。 主要原理: ——自由基清除剂与DPPH单电子配对而使其吸收逐渐消失,其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系,因而可用酶标仪进行快速的定量分析。 实验室签章

一、试剂 ——1 ,1-二苯基-1-苦味肼基自由基(DPPH)——甲醇(分析纯) 二、仪器设备 ——96孔酶标板 ——UV-Vis可见多功能酶标仪 ——移液枪 ——200 μL量程枪头

三、实验方法 ◆前期准备 配置2 g/L 的DPPH甲醇标准溶液。 ◆DPPH自由基清除能力 参照Brand-Williams (1995)[1]报道的方法,将其稍加改动后应用在96孔酶标板中[2]。在酶标板的每孔中,依次加入不同体积(10、20、30、40、50、60、70、80、90和100 μL)的样品溶液和200 μL的DPPH标准溶液(2 g/L),最后用甲醇溶液补齐至总体积300 μL。 室温反应30 min后,于515 nm下用UV-Vis可见多功能酶标仪测定其吸光度(EL 340, Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA)。番茄样品消除自由基的能力表示为EC50(清除1 μg DDPH至50 %所需的样品用量(μg干重))。 EC50越小,表示抗氧化活性越高。平行测定三次,取平均值计算。 清除DPPH自由基能力用如下公式计算: 清除率%=(1- Ac Aj Ai )×100% 其中:Ai为样品溶液加DPPH试剂混合液的吸光度,Aj为样品溶液加甲醇的吸光度,Ac为DPPH溶液加样品溶剂的吸光度。 [1] Brand-Williams W, Cuvelier M E. Berset C. Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity [J]. LWT - Food Science and Technology, 1995, 28(1): 25-30. [2] Verma A R, Vijayakumar M, Rao C V. Mathela C S. In vitro and in vivo antioxidant properties and DNA damage protective activity of green fruit of Ficus glomerata [J]. Food and Chemical Toxicology, 2010, 48(2): 704-709.

(完整版)抗氧化试验方法

一、试验方法 1、DPPH自由基清除率的测定 本实验采用1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl(DPPH)法测定样品清除自由基活性。 1.1实验原理 1,1-二苯基-2-苦肼基(1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl(DPPH))是一种稳定的以氮为中心的自由基,其乙醇溶液显紫色,最大吸收波长为517nm。当DPPH 溶液中加入自由基清除剂时,其孤对电子被配对时,吸收消失或减弱,导致溶液颜色变浅,显黄色或淡黄色,在517nm处的吸光度变小,其变化程度与自由基清除程度呈线性关系,故该法可用清除率表示,清除率越大,表明该物质清除能力越强。 1.2溶液的配制 0.08mmol/L DPPH溶液的配制:精密称取DPPH8.0mg,用无水乙醇溶解并定容至200ml棕色容量瓶中,得浓度为0.004%的DPPH溶液,避光保存,备用。 1.3实验步骤:分别取不同浓度的各样品溶液(0.24,0.48,0.72,0.96,1.20mg/ml)1.0ml,置10ml离心管中,加入3.0ml的DPPH溶液,室温避光反应30min,同时以无水乙醇为空白,于517nm波长处测定吸光值。按下列公式计算DPPH自由基清除率。 DPPH自由基清除率(%)= A0-(A s-A c)/ A0×100% 公式中,A0—1.0ml蒸馏水+3.0mlDPPH溶液的吸光度值 A s—1.0ml样品溶液+3.0mlDPPH溶液的吸光度值 A c—1.0ml样品溶液+3.0ml无水乙醇的吸光度值

将实验重复三次,求得清除率的平均值。 2、总的抗氧化活性的测定 总的抗氧化活性实验采用改良后的Prieto法。 2.1实验原理:磷钼络合物测定方法的原理是Mo(VI)被抗氧化物质还原成绿色的Mo(V)络合物,其最大吸收波长为695nm。抗氧化物质活性越强,测定的吸光度值越大。此方法操作简单,所用试剂低廉、方法重现性好,非常适合抗氧化性的测定。 2.2溶液的配制 样品液:同上 磷钼试剂:0.6mol/L浓硫酸溶液、28mmol/L磷酸钠溶液和4mmol/L钼酸胺溶液混匀,即得。 2.3实验步骤 分别取不同浓度的各样品溶液(0.24,0.48,0.72,0.96,1.20mg/ml)1.0ml,置10ml 离心管中,加入3.0ml试剂溶液(试剂溶液中包括0.6mol/L的硫酸、28mmol/L 的磷酸钠、4mmol/L的钼酸铵)。混合液于95℃水浴锅中分别水浴30min,60min、90 min、120 min、150 min。 放冷至室温,695nm处测吸光度值。以蒸馏水为空白,吸光度值越大,表明抗氧化能力越强。BHT做为阳性对照。将实验重复三次,求平均值。 三、还原力的测定 3.1 实验原理 以普鲁士蓝[Fe4(Fe(CN)6)3] 之生成量作为指标,将六氰合铁酸钾[K3 Fe(CN)6] 还原成K4Fe(CN)6,再利用Fe3+形成Fe4(Fe(CN)6)3,由700nm处吸光

清除自由基研究方法汇总

电子自旋共振法(ESR)、高效液相色谱法、化学发光法、比色法、分光光度法 自由基清除剂也称为抗氧化剂,可清除体内多余的自由基,减轻它们对机体的损伤。目前常用超氧阴离子自由基体系(O2-·)、羟基自由基体系(·OH)、二苯代苦味酰基自由基体系(DPPH·)对某抗氧化剂的体外清除自由基能力进行了研究。 其中ESR法和气相色谱法、HPLC 法对自由基的检测灵敏度高,但对设备要求较高,操作复杂,无法在一般实验室普及。而其中的分光光度法、化学发光法、荧光分析法等不需要昂贵的仪器,易于被一般实验室所采用,但测定过程中的干扰因素较多,容易对测定的准确性和灵敏度造成影响。分光光度法最常用。 原理部分: 1.DPPH·法测试机理 DPPH·(二苯代苦味脐基自由基)的甲醇溶液呈深紫色,可见光区最大吸收峰为492nm。当自由基清除剂加入到DPPH·溶液中时,DPPH·的单电子被配对而使其颜色变浅,在最大吸收波长处的吸光度减少,而且颜色变浅的程度与配电子数成化学计量关系,因此,可通过吸光度减弱的程度来评价自由基被消除的情况。 2. 羟基自由基(·OH) 1)邻二氮菲法[70]

实验原理:邻二氮菲可与Fe2+形成络合物,此络合物在510nm 处有最大吸收峰,是一常用的氧化还原指示剂,其颜色变化可敏锐地反映溶液氧化还原状态的改变。H2O2/ Fe2+体系可通过Fenton 反应产生羟自由基,邻二氮菲-Fe2+水溶液被羟自由基氧化为邻二氮菲-Fe3+后,其510nm 最大吸收峰消失。如果反应体系中同时存在羟自由基清除剂,则Fenton 反应产生的羟自由基将被此清除剂全部或部分清除,邻二氮菲-Fe2+络合物受到的破坏将会随之减少。根据这一原理,可建立以A510变化反映自由基清除剂对羟自由基清除作用的比色测定法。 2)水杨酸法[71] 实验原理:羟自由基易攻击芳环化合物产生羟基化合物,因此可用水杨酸捕集Fenton 反应体系中的·OH,生成的2,3-二羟基苯甲酸用乙醚萃取,用钨酸钠和亚硝酸钠显色,然后用分光光度计测定其在510nm 处的吸光值,此吸光值可反映体系中的羟自由基浓度。 3)甲基紫-Fe2+-H2O2反应体系 测定原理:在Fenton反应的基础上加入甲基紫作显色剂,反应式如下: Fe2++H2O2→Fe3++OH-+·OH 甲基紫在酸性溶液中呈现紫色[9],在578nm 处有强吸收。反应产生的·OH 具有高的反应活性,容易进攻高电子云密度点,会与甲基紫中具有高电子云密度的-C=C-基团发生亲电加成反应,使甲基紫褪色。通过测定甲基紫在578nm 处吸光度值的变化可间接测定出·OH 的生成量。当有清除自由基的物质存在时,会阻断甲基紫与·OH 的反应,从而使得甲基紫的颜色有所加重,因此可利用抗氧化剂加入前后溶液吸光度值的变化来评价物质的抗氧化性强弱。

A清除自由基实验方法

1、DPPH 自由基清除实验 取0.2 mL 样品,加入4 mL 醋酸缓冲溶液、3.8 mL 乙醇和2 mLDPPH,混合均匀后室温避光放置30 min,测定在517 nm 处的吸光度A。同理,取0.2 mL 样品、4mL 醋酸缓冲溶液和3.8 mL 乙醇,测定在517nm处的吸光度A b。4 mL 醋酸缓冲溶液、4 mL 乙醇和2 mL DPPH,测定在517 nm 处的吸光度A0。自由基的清除率=[A0-(A-Ab)]/A0。 2、ABTS 自由基清除实验 20 mL 的7 mmol/L ABTS 和352 μL 的140 nmol/L 过硫酸钾混合,在室温、避光条件下静置过夜,形成ABTS+自由基储备液。该储备液在室温、避光的条件下稳定,使用前用无水乙醇稀释成工作液,要求其在30 ℃、734 nm 波长下的吸光度为0.7±0.02。加入的提取液0.1 mL、ABTS 工作液5 mL,混合均匀后在室温下避光反应10 min 后,在734 nm 处测定吸光度At。ABTS 溶液作空白吸光度为Ar,样品0.1 mL、乙醇5 mL 混合均匀吸光度为A0。 ABTS+自由基清除率(%)=[1-(At-A0)/Ar]×100 式中:At 为样品的吸光值;Ar 为空白的吸光值。 3、超氧阴离子清除实验 采用邻苯三酚自氧化法,取4 mL 0.1 mol/L pH8.2 Tris-HCl 缓冲溶液和蒸馏水2 mL,混匀后在25 ℃水浴中保温20min,然后加入样品溶液2 mL,取出后立即加入在25 ℃预热过的5 mmol/L 邻苯三酚0.5 mL(以10 mmol/L HCL 配制,空白管用10 mmol/L HCL 代替邻苯三酚的HCL 溶液),摇匀后倒入比色皿,325 nm下每隔30 s 测定吸光度,连续测定4 min,计算线性范围内每分钟吸光度的增加。在加入一定体积样品溶液时,减少蒸馏水的体积。 抑制率(%)=(△A0-△A)/△A0×100 式中:△A0 为邻苯三酚的自氧化速率;△A 为加入样品溶液后邻苯三酚的自氧化速率。

dpph自由基清除测定

dpph自由基清除测定 DPPH法测定黄芩黄酮的抗氧化活性 抗氧化就是任何以低浓度存在就能有效抑制自由基的氧化反应的物质,其作用机理可以是直接作用在自由基,或是间接消耗掉容易生成自由基的物质,防止发生进一步反应。 目前对自由基清除剂的研究方法主要有2类,一类是体外模型,另一类是体内模型,其中DPPH法是体外模型中最常用的方法。 DPPH又称1,1-二苯基-2-三硝基苯肼,是一种很稳定的氮中心的自由基,他的稳定性主要来自共振稳定作用的3个苯环的空间障碍,使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能发挥其应有的电子成对作用。它的无水乙醇溶液呈紫色,在517nm波长处有最大吸收,吸光度与浓度呈线性关系。。向其中加入自由基清除剂时,可以结合或替代DPPH?,使自由基数量减少,吸光度变小,溶液颜色变浅,借此可评价清除自由基的能力。即通过在517nm波长处检测样品清除DPPH?的效果,来计算抗氧化能力。 [1]实验研究表明,黄芩黄酮中清除DPPH自由基活性的主要成分是黄芩苷,黄芩苷中含有羧羟基和酚羟基能与DPPH反应,反应式如下: ONON22 +H+NNONNONNH22 NONO22 DPPH与抗氧化剂反应原理 材料:DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼);无水乙醇; 仪器:分光光度计 1.DPPH贮备液的制备

准确称取DPPH试剂3(5mg,用无水乙醇溶解,并定量转入10mL容量瓶中,用无水乙醇定容至刻度,取2mL至100ml容量瓶中,摇匀得浓度为0.0178mmol,L DPPH贮备液,置于冰箱中冷藏备用。 2.试液的制备(只作参考) 准确称取5.2mg干燥的黄酮提取物(32.75%),用无水乙醇溶解,并定量转入 50ml容量瓶中,用无水乙醇定量至刻度,取10ml至100ml容量瓶中,摇匀得浓度为0.0233mmol,L试液。 3.DPPH?清除率的测定 在10mL比色管中依次加入4.0mLDPPH溶液和黄酮提取液,再加入无水乙醇至刻度,混匀立即用1cm比色皿在517nm波长处测吸光值(A),吸光值记为Ai,再在温室避光保存30min后测吸光值,记为Aj,对照试验为只加DPPH的乙醇溶液,其吸光值记为Ac。按下式计算自由基清除率(K): K(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]*100% 试验重复三次,取其平均值作为最后结果。 [1].刘玉萍,Purusotam Basnet,小松かっ子,曹晖.黄芩清除自由基活性与黄芩苷含量的相关性研究[J].中国中药杂志,2002,27(8):575-579 药品:DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼); 推荐厂家:上海如吉生物科技发展有限公司; 北京诺博莱德科技有限公司; 报价:380元/瓶;500元/瓶; 规格:1g/瓶; 含量:99%; 产地:日本进口 DPPH稳定性不好,要用时,新鲜配制 DPPH浓度要根据样品的活性来定,一般在20-100μg/mL

DPPH抗氧化

DPPH法测定黄芩黄酮的抗氧化活性抗氧化就是任何以低浓度存在就能有效抑制自由基的氧化反应的物质,其作用机理可以是直接作用在自由基,或是间接消耗掉容易生成自由基的物质,防止发生进一步反应。目前对自由基清 除剂的研究方法主要有类,一类是体外模型,另一类是体内模型,其中DPPH法是体外模型中最常用的方法。DPPH又称1,1-二苯基-2-三硝基苯肼,是一种很稳定的氮中心的自由基,他的稳定性主要来自共振稳定作用的3个苯环的空间障碍,使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能发挥其应有的电子成对作用。它的无水乙醇溶液呈紫色,在517nm波长处有最大吸收,吸光度与浓度呈线性关系。向其中加入自由基清除剂时,可以结合或替代DPPH·,使自由基数量减少,吸光度变小,溶液颜色变浅,借此可评价清除自由基的能力。即通过在517nm波长处检测样品清除DPPH·的效果,来计算抗氧化能力。实验研究表明,黄芩黄酮中清除DPPH 自由基活性的主要成分是黄芩苷[1],黄芩苷中含有羧羟基和酚羟基能与DPPH反应,反应式如下:NN+O2NO2NNO2H+NNHO2NO2NNO2 DPPH 与抗氧化剂反应原理材料:DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼);无水乙醇;仪器:分光光度计 1.DPPH贮备液的制备 准确称取DPPH试剂3.5mg,用无水乙醇溶解,并定量转入10mL容量瓶中,用无水乙醇定容至刻度,取2mL至100ml容量瓶中,摇匀得浓度为0.0178mmol/L DPPH贮备液,置于冰箱中冷藏备用。 2.试液的制备 准确称取5.2mg干燥的黄酮提取物(32.75%),用无水乙醇溶解,并定量转入50ml容量瓶中,用无水乙醇定量至刻度,取10ml至100ml容

清除自由基

清除自由基 摘要:自由基这种强氧化性物质,可损害机体的组织和细胞,进而引起慢性疾病及衰老效应,而清除这些自由基则能有益作用于我们的身体。众多权威研究表明,负离子能够消减自由基,减缓人体衰老,增强人体免疫力。 关键词:自由基医学 在生命质量越来越受重视的今天,预防治疗各种隐患和疾病已是迫切需要,随着自由基医学、生物学等的出现,人们对自由基的认识也越来越深刻,清除自由基方面的研究也更加全面具体。现在已经研究出了各式各样的自由基清除剂,应用这些自由基清除剂清除体内多余的自由基,防止机体受损而导致疾病的产生。 一、对自由基的认识 自由基又称游离基,是具有非偶电子的基团或原子,它有两个主要特性:一是化学反应活性高;二是具有磁矩。一般情况下,生命是离不开自由基活动的。我们的身体每时每刻都从里到外的运动,每一瞬间都在燃烧着能量,而负责传递能量的搬运工就是自由基。当这些帮助能量转换的自由基被封闭在细胞里不能乱跑乱窜时,它们对生命是无害的。但如果自由基的活动失去控制,超过一定的量,生命的正常秩序就会被破坏,疾病可能就会随之而来。所以说自由基是一把双刃剑。认识自由基,了解自由基对人体的作用,对健康十分必要。自由基是无处不在的,自由基对人体攻击的途径是多方面的,既有来自体内的,也有来自外界的。当人体中的自由基超过一定的量,并失去控制时,这些自由基就会乱跑乱窜,去攻击细胞膜,去与血清抗蛋白酶发生反应,甚至去跟基因抢电子,对我们的身体造成各种各样的伤害,产生各种各样的疑难杂症。 二、自由基清除剂 自由基清除剂也称为抗氧化剂,可清除体内多余的自由基,减轻它们对机体的损伤。目前常用超氧阴离子自由基体系(O2-·)、羟基自由基体系(·OH)、二苯代苦味酰基自由基体系(DPPH·)对某抗氧化剂的体外清除自由基能力进行了研究。 其中 ESR法和气相色谱法、HPLC 法对自由基的检测灵敏度高,但对设备要求较高,操作复杂,无法在一般实验室普及。而其中的分光光度法、化学发光法、荧光分析法等不需要昂贵的仪器,易于被一般实验室所采用,但测定过程中的干扰因素较多,容易对测定的准确性和灵敏度造成影响。分光光度法最常用。 三、自由基清除实验 3.1 DPPH 自由基清除实验 取0.2 mL 样品,加入4 mL 醋酸缓冲溶液、3.8 mL乙醇和2 mLDPPH,混合均匀后室温避光放置30 min,测定在517 nm 处的吸光度A。同理,取0.2 mL 样品、4mL 醋酸缓冲溶液和3.8 mL 乙醇,测定在517nm处的吸光度Ab。4 mL 醋酸缓冲溶液、4 mL 乙醇和2 mL DPPH,测定在517 nm 处的吸光度A0。 自由基的清除率=[A0-(A-Ab)]/A0。 3.2 ABTS 自由基清除实验 20 mL 的7 mmol/L ABTS 和352 μL 的140 nmol/L 过硫酸钾混合,在室温、避光条件下静置过夜,形成ABTS+自由基储备液。该储备液在室温、避光的条件下稳定,使用前用无水乙醇稀释成工作液,要求其在30 ℃、734 nm 波长下的吸光度为0.7±0.02。加入的提取液0.1 mL、ABTS 工作液5 mL,混合均匀后在室温下避光反应10 min 后,在734 nm 处测定吸光度At。ABTS 溶液作空白吸

竹叶提取物清除DPPH自由基的测定方法

收稿日期:2003-11-06 修回日期:2004-12-05 基金项目:福建省林业厅基金资助项目(闽林[2000]08). 作者简介:郑德勇(1966-),男,副教授.研究方向:树木提取物、林产化工工艺与设备. 竹叶提取物清除DPPH 自由基的测定方法 郑德勇1,安鑫南 2 (1.福建农林大学材料工程学院,福建福州350002;2.南京林业大学化学工程学院,江苏南京210037)摘要:确定了以光度计比色法测定天然抗氧化剂清除二苯基苦基苯肼(DPPH )自由基能力的条件.通过测定抗坏血酸、槲皮素、硫脲和芦丁的DPPH 自由基清除率曲线,提出以IC 50值作为评价试样清除DPPH 自由基能力的指标,并将此应用于21种丛生竹竹叶提取物清除DPPH 自由基能力的测定. 关键词:竹叶提取物;光度计比色法;清除能力;二苯基苦基苯肼 中图分类号:Q946文献标识码:A 文章编号:100627817(2005)0120059204D eterm i n i n g m ethod of D PPH free rad i ca l scaveng i n g acti v ity of bam boo leaf extracti ves ZHENG De 2yong 1,AN Xin 2nan 2 (1.College of Materials Engineering,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou,Fujian 350002,China;2.College of Che m ical Engineering,Nanjing Forestry University,Nanjing,J iangshu 210037,China ) Abstract:A s pectr ophot ometric method f or deter m ining 1,12di phenyl 222p icryl 2hydrazyl (DPPH )free radical scavenging activity of natural anti oxidants was put f or ward .The evaluating criteri on of DPPH free radical scavenging activity was regarded as “I C 50”by deter m ining the scavenging rate curves of ascorbic acid,quercetin,thi ocarba m ide and rutin .The DPPH free radical scavenging ac 2tivity of extractives fr om 21s pecies of cluster 2ba mboo ′s leaf were deter m ined by this method . Key words:leaf extractive of cluster 2ba mboo;s pectr ophot ometry;scavenging activity;1,12di phenyl 222p icryl 2hydrazyl 植物抗氧化剂广泛应用于食品、医药、保健品和化妆品等行业 [1-4].竹叶抽提物含有黄酮、苷类、活性多糖及特种氨基酸等[5,6],具有显著的抗氧活性、防腐性能和抑菌作用 [7-9].竹叶提取物中的抗氧化有效成分主要是水溶、醇溶性物质,可通过测定二苯基苦基苯肼(DPPH )自由基的清除能力进行抗氧化活性研究.清除自由基的检测方法有许多种[10,11],体内试验比较灵敏、繁琐,周期较长,费用高,不适于大量样品 的测定.大量样品的抗氧化活性筛选需采用体外实验法[12-15],其中电子自旋共振波谱法(ESR )是测定自 由基的最直接而有效的体外试验技术,但需要昂贵的仪器和复杂的自由基捕集技术.DPPH 检测法 [16,17]是通过DPPH 分子中1个稳定的自由基与抗氧化剂提供的1个电子配对结合,使DPPH 的特征紫色消失,因 此可用于抗氧化剂清除自由基能力的评价.1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 HP1100高效液相色谱仪(DAD 检测器)为美国安捷伦公司产品;UV2000型紫外分光光度计为上海光 谱仪器厂产品.DPPH 的质量分数≥95%(Sig ma 产品).配制6.5×10-4mol ?L -1乙醇贮备液,置于冰箱, 临用前用体积分数为50%的乙醇稀释.槲皮素、芦丁的质量分数≥95%.其他试剂均为分析纯. 1.2 试样的制备 竹叶采集于福建农林大学南平校区校园和南平市城郊林场丛生竹种源地.取约500g 竹叶,用清水洗净晾干,用微波炉加热30s 杀青,取出风干,破碎,并过20-80目筛,备用.取2份各5.0g 竹叶试样,分别经20mL 石油醚脱脂处理后,加入100mL 体积分数为60%的乙醇50℃提取10h (2次),倒出提取液,抽福建农林大学学报(自然科学版) 第34卷第1期Journal of Fujian Agriculture and Forestry University (Natural Science Editi on )2005年3月

DPPH

DPPH 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼,别名1,1-二苯基-2-苦肼基(自由基);1,2-二苦基-2-三硝基苯亚肼;1,2-二苯基-2-苦肼基。是一个稳定的自由基,为暗紫色棱柱状结晶,熔点127~129℃(分解)。最大吸收波长528nm。可用于光度测定生育酚和脂肪族硫醇类、还原物质的分析试剂,也是常用的阻聚剂。 本品应密封于0℃保存。 DPPH有两个主要的应用,都用于实验室研究中:一是在含有自由基的化学反应中作为一种监测反应的物质,典型的用于抗氧化成分的体外抗氧化性评价[1];还可以作为电子顺磁共振信号位置和强度的标准物质。 DPPH性质应用 编辑 DPPH具有几个不同结晶形态,它们的晶格对称性和熔点(m.p.)存在差异。商品化的粉末是不同晶相的混合物,熔点在130℃附近。DPPH-Ⅰ(m.p. 106℃)是正交晶系,DPPH-Ⅱ(m.p. 137℃)是无定形态,DPPH-Ⅲ(m.p. 128-129℃)是三斜晶系。 DPPH是一种很稳定的氮中心的自由基,它的稳定性主要来自3个苯环的共振稳定作用及空间障碍,使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能发挥其应有的电子成对作用。作为一种稳定的自由基,DPPH可以捕获(“清除”)其他的自由基。因此通过加入DPPH后观察某一化学反应的速率是否减慢,来作为这一反应是否具有自由基反应本质的指标。由于DPPH自由基在以520nm为中心处具有强烈的吸收,因此在溶液中呈现深紫色,并且在被中和之后会变为无色或浅黄色。利用这一特性可以直观地检测反应的过程,通过记录DPPH在在520nm 吸光度值或者EPR信号的变化可以得到初始自由基的量。 由于DPPH是十分有效的自由基捕获剂,因此它在自由基调控的聚合反应中是一种很强的抑制剂(阻聚剂)。 作为一种稳定和良好定性的固体自由基的来源,DPPH可能是最为广泛使用的电子顺磁共振信号位置(g-marker)和强度的标准物质----通过称量可以确定新鲜配置的样品自由基的数目,DPPH的EPR分裂因子校正在g=2.0036。DPPH的信号一般聚合为单一的线,在更宽的功率范围内,信号强度与微波功率的平方根呈线性关系,因此用DPPH作为校正的标准物质十分方便。DPPH的稀释特性(每41个原子含一个不成对自旋)导致它具有一个相对小的线宽(1.5–4.7Gauss)。但是若溶剂分子保持在结晶状态并且在高频率的EPR设定下测定,线宽可能会增加。 DPPH清除测试 DPPH原理 DPPH法于1958年被提出[2],广泛用于定量测定生物试样和食品的抗氧化能力。此法是根据DPPH自由基有单电子,在517nm处有一强吸收,其醇溶液呈紫色的特性。当有自由基清除剂存在时,由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失,其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系,因而可用分光光度计进行快速的定量分析。 DPPH实验步骤 1.用无水乙醇配置0.1mmol/L 的DPPH溶液,避光保存。配置0.5mg/mL 的Vc溶液(作为对照)。将测试样品稀释至不同浓度。 2.将2mL测试样品溶液及2mL DPPH 溶液加入到同一试管中,摇匀,室温下暗处静置30min 后测定其吸光度A sample,同时测定2mL DPPH溶液与2mL 溶剂(蒸馏水或者相应的缓冲溶液)混合后的吸光度A control,以及2mL测试样品溶液与2mL无水乙醇混合后的吸光度A blank。

清除DPPH自由基能力检测方法

DPPH自由基清除法 [文献] Xican Li, Jing Lin, Yaoxiang Gao, Weijuang Han, Dongfeng Chen. Antioxidant activity and mechanism of Rhizoma Cimicifugae. Chemistry Central Journal. 2012; 6(1):140. [原理] DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical)即1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基。分子中,由于存在多个吸电子的-NO2和苯环的大π键,所以,氮自由基能稳定存在。 N 2 2 当DPPH自由基被清除,其最大吸收波长519nm处的吸光度A值随之减小。DPPH这种稳定的自由基为清除自由基活性的检测提供了一个理想而又简单的药理模型。 [实验步骤] 1.1 DPPH测试液的配制 取DPPH 1mg溶于约20mL溶剂(乙醇、95乙醇或甲醇)中,超声5min,充分振摇,务使上下各部分均匀。取1mL 该DPPH溶液,在519nm处测A值,使A=1.2-1.3之间最佳。该DPPH溶液最好避光保存,3.5小时内用完。 1.2 样品液的配制 样品用合适的溶剂溶解,为便于计算,可配成1mg/mL浓度。溶剂根据样品的极性进行选择,首选95乙醇或无水乙醇,如不溶可用DMSO。 1.3 预试 取DPPH溶液2mL,往其中加少量样品液,加样时,先少后多渐加,边加边混合,并观察溶液的褪色情况,当溶液颜色基本褪去时,记下样品的加样量。 此加样量即为样品的最大用量,在此最大用量的基础上,往前设置5个用量,使之成等差数列。 【如】在预试过程中,发现加样到200μL时,DPPH溶液颜色基本褪去,则100μL为该样品液的最大用量。其用量梯度宜设为40、80、120 、160、200μL。 1.4测量 A0值的测量:取DPPH溶液2 mL加入到小试管(或玻璃瓶)中,加95乙醇(或无水乙醇)1mL,充分混合,测A值(519nm),此A值为A0(A0多在0.7-0.9之间)。 A值的测量:取DPPH溶液2mL加入到小试管(或玻璃瓶)中,加样品液xμL (x是根据1.3 预试结果确定样品液的用量),再加(1000 -x)μL 95乙醇(或无水乙醇),混合,静置30分钟后,测A值(519nm)。如:某样品的用量梯度为40、80、120 、160、200μL,则加样表如下: 表1 加样表 1.5 正式测量 方法大致与1.4相同,只不过,每测一个用量需要测三个平行数据。而且在每测一个用量的三个平行数据后,都要重测一次A0.

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DPPH实验步骤 一、原理: DPPH是一种很稳定的氮中心的自由基,它的稳定性主要来自3个苯环的共振稳定作用 及空间障碍,使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能发挥其应有的电子成对作用。作为一 种稳定的自由基,DPPH可以捕获("清除")其他的自由基。因此通过加入DPPH后观察某一化 学反应的速率是否减慢,来作为这一反应是否具有自由基反应本质的指标。由于DPPH自由 基在以520nm为中心处具有强烈的吸收,因此在溶液中呈现深紫色,并且在被中和之后会 变为无色或浅黄色。 DPPH在有机溶剂中是一种稳定的自由基,其醇溶液呈紫色,且需低温避光储藏,具有 单一电子,故能接受一个电子或氢离子,在波长为517nm下具有最大吸收。有自由基清除 剂存在时,DPPH的单电子被捕捉而使其颜色变浅,在最大光吸收波长处的吸光值下降,且 下降程度呈线性关系,吸光度水平的降低表明抗氧化性的增加,从而以评价试验样品的抗氧 化能力。此抗氧化能力用抑制率来表示,抑制率越大,抗氧化性越强。 二、实验步骤: 1.配制0.1mM的DPPH溶液:配两次,每次取0.002gDPPH溶于50mL乙醇,避光保存。 2.配制0.5mg/mL的Vc溶液,至少2mL(设为阳性对照,选择性做) 3.配制一定浓度的样品溶液,至少2mL母液(也可以配制不同溶度梯度样品,计算IC50) 4.上板(避光操作,上完板后,室温避光30分钟,测吸光度) 96孔板,三组,每组设3个复孔,每孔加入量及96孔板分布如下:sample(样品组):样品溶液100uL+ DPPH醇溶液100uL (每个浓度3个孔) blank(空白组):样品溶液100uL+无水乙醇100uL (每个浓度3个孔) 样品VC 浓度 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 sample blank control 5.检测并计算清除率 测517nm处的吸光度,取平均値,计算每个浓 度的DPPH清除率,做出折线图。 清除率=(1 -(A sample - A blank)/ A control)X 100%

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DPPH 实验步骤 一、原理: DPPH 是一种很稳定的氮中心的自由基,它的稳定性主要来自3个苯环的共振稳定作用及空间障碍,使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能发挥其应有的电子成对作用。作为一种稳定的自由基,DPPH 可以捕获("清除")其他的自由基。因此通过加入DPPH 后观察某一化学反应的速率是否减慢,来作为这一反应是否具有自由基反应本质的指标。由于DPPH 自由基在以520nm 为中心处具有强烈的吸收,因此在溶液中呈现深紫色,并且在被中和之后会变为无色或浅黄色。 DPPH 在有机溶剂中是一种稳定的自由基,其醇溶液呈紫色,且需低温避光储藏,具有单一电子,故能接受一个电子或氢离子,在波长为517nm 下具有最大吸收。有自由基清除剂存在时,DPPH 的单电子被捕捉而使其颜色变浅,在最大光吸收波长处的吸光值下降,且下降程度呈线性关系,吸光度水平的降低表明抗氧化性的增加,从而以评价试验样品的抗氧化能力。此抗氧化能力用抑制率来表示,抑制率越大,抗氧化性越强。 二、实验步骤: 1.配制0.1mM 的DPPH 溶液:配两次,每次取0.002gDPPH 溶于50mL 乙醇,避光保存。 2.配制0.5mg/mL 的Vc 溶液,至少2mL (设为阳性对照,选择性做) 3.配制一定浓度的样品溶液 ,至少2mL 母液(也可以配制不同溶度梯度样品,计算IC50) 4.上板(避光操作,上完板后,室温避光30分钟,测吸光度) 96孔板,三组,每组设3个复孔,每孔加入量及96孔板分布如下: sample (样品组):样品溶液100uL+ DPPH 醇溶液100uL (每个浓度3个孔) blank (空白组):样品溶液100uL+无水乙醇100uL (每个浓度3个孔) 5.检测并计算清除率 测517nm 处的吸光度,取平均値,计算每个浓 度的DPPH 清除率,做出折线图。 清除率=(1 -(A sample - A blank )/ A control )X 100%

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