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质粒DNA的提取实验报告

质粒DNA的提取

一、实验方法

碱裂解法抽提质粒DNA

二、实验原理

基于质粒DNA与染色体DNA变性与复性的差异。

质粒DNA的提取实验报告

三、实验步骤

1)质粒提取

1. 10,000g,1min离心收集1.5-5ml菌液沉淀于1.5ml离心管中。

2. 加入100μl溶液1,振荡至彻底悬浮。

3. 加入200μl溶液2,立即轻柔颠倒离心管6次,使菌体充分裂解,随后将离心管冰上放置3分钟

4. 加入150μl溶液3,立即温和颠倒离心管数次,冰上放置3分钟,10,000g离心10min。

5. 将步骤4的上清转移至新的离心管(尽量去除杂质),加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合均匀10,000g离心5min。

6. 将步骤5的上清转移至新的离心管,加入2倍体积的无水乙醇,室温放置5-10min,沉降DNA

7. 10,000g离心10分钟,弃乙醇,保留沉淀,加入1ml 70%的乙醇洗涤沉淀,10,000g离心5分钟

8. 倒掉乙醇溶液,用吸水纸吸净管壁上的水珠,室温蒸发痕量乙醇

9. 加入适量含RNase的TE或灭菌双蒸水溶解质粒DNA

2)质粒鉴定→琼脂糖凝胶电泳

灌胶:胶中加入荧光染料(SYBR Green I)

加样:质粒+上样缓冲液→混匀

电泳

结果观察:UV灯下

四、实验结果

五、实验分析

裂解细胞中除含有质粒DNA外,还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂类等物质,因此用碱裂解法除去杂质

1、防止DNA裂解:Solution 1

1)、所含糖增加溶液黏度,维持渗透压,防止DNA受机械剪切作用降解

2)、所含EDTA抑制酶活性

2、溶解与变性:Solution2

1)强碱使质粒DNA和染色体DNA变性

2)离子型表面活性剂SDS可溶解膜蛋白

3、沉降与复性:Solution3

1)质粒DNA复性

2)在钾盐中,染色体DNA形成缠连的不溶性网状结构,和不稳定的大分子RNA以及变性的蛋白质和细菌碎片等一起沉淀

预期结果为剩余质粒DNA

4、琼脂糖凝胶电泳

1)荧光染色

染料分子可嵌入双链DNA分子配对碱基之间

2)琼脂糖可起到电泳和分子筛的作用,因所带电荷、分子量大小和构型不同,泳动速度不同

六、误差分析

实验失败,本组实验出现4条带,3明1暗,明亮处应为DNA分子数最多的,为质粒DNA,质粒DNA前有较暗的两条带,推测其中一条为未复性质粒DNA,可能Solution2处变性过长,不易复性,或Solution3处时间过短,复性不充分。另一条,RNA-DNA杂交链?因染料分子可嵌入双链DNA分子配对碱基之间。因还有一条在亮带后,推测为染色体DNA,推测很大可能性是Solution3处时间过短,沉降不完全。