紫玉兰花粉的生活力测定及贮藏方法
[收稿日期] 2010-12-11;2011-05-17修回 [基金项目] 河南省创新人才工程项目(2005-126-49);河南科技学院博士基金项目(050106);河南科技学院重点基金项目(050121) [作者简介] 刘会超(1964-),男,教授,从事观赏植物生物技术研究工作。E -m ail:liu hc918@https://www.wendangku.net/doc/f616286023.html,
[文章编号]1001-3601(2011)07-0457-0188-04
紫玉兰花粉的生活力测定及贮藏方法
刘会超,贾文庆,郭艳艳
(河南科技学院,河南新乡453003)
[摘 要]为了探明紫玉兰花粉生活力测定方法以及适宜的贮藏方法,采用离体培养法、醋酸洋红染色
法、碘-碘化钾染色法和T TC(氯化三苯基四氮唑)染色法等方法研究了花粉寿命长短与环境条件的关系。结果表明:4种测定方法中只有离体培养法适用于紫玉兰花粉生活力测定;培养基中添加不同浓度的蔗糖和硼酸对花粉的萌发有促进作用,紫玉兰花粉萌发的最适培养基为2%蔗糖+0.001%硼酸,萌发率达90.57%;在贮藏5d 的情况下,花粉最适宜的贮藏条件为-80e ,不干燥。
[关键词]紫玉兰;花粉;培养基;染色;贮藏[中图分类号]S567.19[文献标识码]A
Th e Determination of Magnolia liliiflo ra Pollen
Viability and Its Storage Meth od
LIU H u-i chao,JIA W en -qing,GUO Yan -y an
(Henan I nstitute of Science and Technology ,Xinxiang,Henan 453003,China)
Abstract:In order to explore appropriate stor ag e m ethod and o ptimum deter mination method and
study the relationship betw een the po llen life and the storag e environment,iso lated cultur e,carm ine acetate dy eing 、I
-KI staining and T TC staining metho ds w ere used to determine the fresh po llen ability of Magnolia liliif lor a .T he results sho wed that culture m edia w ith different concentration of sucrose and bo ric had go od effects on the pollen germination.T he pollen germinating per centage reached the highest (90.05%)after incubated on the m edia supplemented w ith 2%sucro se and 0.001%boric acid.T he best conditions to keep vitality o f pollen is in not dry environment at -80e ,the stor ag e ability lasted for m ore than 5d.
Key words:Magnolia liliif lor a ;pollen;culture;dyeing ;storage 紫玉兰(M ag nolia liliif lor a Desr.),又名木兰、辛夷,为木兰科木兰属大型灌木,是非常珍贵的花木,一般生长在山坡林缘[1]。紫玉兰花具有很高的观赏价值和药用价值。花粉是种子植物遗传信息的载体,早期采集、贮存花粉、花粉生活力测定是进行人工辅助授粉或杂交授粉的基础[2]。花粉生活力对授粉受精有重要影响。不同类群植物花粉在自然条件下的寿命、花粉的适宜贮存条件、营养条件以及
花粉生活力的适宜测定方法均有所差异[2]
。掌握花粉适宜的培养、贮存条件及生活力检测的方法对于提高植物育种效率具有较高的实际应用价值。
目前,国内学者主要在繁殖技术[3]、栽培管理[4]、组培[5]等方面对紫玉兰进行了较为深入的研究,而有关紫玉兰花粉方面的研究尚未见深入报道。为此,笔者对紫玉兰花粉的生活力及贮藏特性进行了研究,旨在摸索花粉生活力测定的方法,进而研究花粉寿命长短与环境条件的关系,探求保存花粉的合适方法,为紫玉兰育种及品种改良提供理论依据。
1
材料与方法
1.1
材料
2010年4月14日上午9:00-10:00,采集紫玉
兰花朵,带回实验室后去除花瓣取花药于培养皿内,置于(25?1)e 的培养箱散粉12h 后,收集花粉放入4e 冰箱中贮藏备用。1.2方法
1.2.1紫玉兰花粉形态观察将干燥花粉和新鲜花粉涂于黑色导电胶上,放在扫描电镜下观察测定。用扫描电子显微镜(Quanta 200)测定花粉的极轴和赤道长度,并计算P/E 值;通过扫描电子显微镜照片观察远极面、近极面和局部的外壁纹饰、网眼大小和网脊宽度,测量、记录数据[6-7]。
1.2.2最佳培养基筛选试验采用2因素(蔗糖、硼酸)完全随机设计的方法,培养基中蔗糖浓度分别为0、2%、4%、6%、8%、10%;硼酸浓度分别为0、0.001%、0.002%、0.003%、0.004%、0.005%。培养基均添加琼脂8g/L,pH 5.8。具体步骤:取2滴培养基于凹玻片上,用头发丝蘸取少量花粉均匀散于培养基上,将凹玻片置于铺有2层湿滤纸的培养皿中,在(25?1)e 的培养箱中培养12h 后,观察统计出萌发的花粉数和未萌发的花粉数。各处理3次重复,每重复统计花粉数不少于100粒,计算萌发率。
贵州农业科学 2011,39(7):188~191 Guizho u A g ricultur al Sciences
萌发率/%=(视野萌发花粉粒数/视野总花粉粒数)@100
1.2.3花粉染色法
1)醋酸洋红染色法。取少量花粉于载玻片上,加1滴醋酸洋红溶液,盖上盖玻片,立刻置于显微镜下观察。凡被染成深红色的为有生活力的花粉,被染成淡红色的为无生活力的花粉。观察3张载玻片,每片取3
个视野,计算有生活力花粉百分率的平均值[8]
。
2)I 2-KI 染色法。取少量花粉置于载玻片上,加1滴I 2-KI 溶液,盖上盖玻片,静置3~4m in 后置于显微镜下观察。染色后有生活力的花粉呈蓝色,无生活力的花粉无色。观察3张载玻片,每片取3个视野,计算有生活力花粉百分率的平均值[9]。
3)TT C(氯化三苯基四氮唑)染色法。取少量花粉放在载玻片上,加1滴0.5%T TC 溶液,盖上盖玻片,置30e 恒温箱中,10~15min 后镜检。凡被染成红色的花粉活力强,淡红次之,无色者为没有活力或不育花粉。观察3载玻片,每片取3个视野,计算有生活力花粉百分率的平均值[10]。
1.2.4不同贮藏条件测定花药采集后,装入离心管中真空干燥3h,然后在以下6种环境条件下贮存:A.室温;B.室温(干燥剂干燥);C.4e ;D.4e (干燥剂干燥);E.-80e ;F.-80e (干燥剂干燥)。贮藏每间隔1d 、3d 后,取出花粉置于试验筛选所得最佳培养基中培养,12h 后观察统计花粉萌发率。花粉耐贮藏力是以待测花粉活力保持时间即待测样品活力降为零的时间长度来表示。
2
结果与分析
2.1
紫玉兰花粉的形态
经扫描电镜(1600倍)观察,花粉粒平均极轴长
42.14L m,平均赤道轴长21.68L m,P/E U 2.07。花粉均具有远极单萌发沟、左右对称、异极、极面观为椭圆形或长椭圆形、侧面观为舟形、两端较尖;萌发沟长度直达两端闭合;表面有明显的瘤状突起和粗颗粒,纹饰不明显(图版-1~3)。干燥花粉的萌发沟多开裂,在扫描电镜下较新鲜花粉清晰(图版-4、8)。2.2离体培养法对紫玉兰花粉萌发的影响
如表1所示,对照与其他处理的差异极显著,对照花粉萌发率最低,12h 花粉的萌发率仅为1.61%;在仅添加蔗糖的培养基中,花粉萌发率比对照有显著提高,在蔗糖浓度为2%时达最大值7.72%,当蔗糖浓度大于2%时,花粉萌发率呈下降趋势。结果表明,花粉萌发的最适宜蔗糖浓度是2%;在仅添加硼酸的培养基中,随着硼酸的增多,花粉萌发率显著增多,硼酸浓度为0.001%时,花粉的萌发率达最大值7.33%,硼酸浓度大于0.001%时,花粉的萌发率也随之下降。因此,花粉萌发的最适宜的硼酸浓度为0.001%。培养基中同时添加不同浓度的蔗糖和硼酸,得出最佳培养基为2%蔗糖+0.001%硼酸,花粉萌发率达最大值90.05%。2.3
不同染色方法对花粉生活力的影响
观察发现,用醋酸洋红染色后,花粉粒均呈深红色(有生活力)(图版-5);碘-碘化钾染色后,花粉均染成黄褐色(无生活力)(图版-6);而TT C 染色后花粉均未染色(无生活力)(图版-7)。因这3种染色法的观察结果均与离体培养法所得的最大萌发率90.05%有显著差异。所以,醋酸洋红染色法、碘-碘化钾染色法、TT C 染色法均不能作为测定紫玉兰花粉生活力的方法,
只有离体培养法较合适。
注:1~3.新鲜花粉;2.花粉侧面;3.花粉极面;4.干燥花粉;5.醋酸洋红染色照片;6.碘-碘化钾染色照片;7.T TC 染色照片;8.花粉萌发照片。
Note:1~3.fres h pollen ;2.side pollen; 3.poleo pollen;4.dry pollen;5.photo of carmine acetate dyeing; 6.photo of I -KI dyeing;7.ph oto of TT C stain ing;8.photos of pollen germin ation.
图版紫玉兰花粉的形态及染色结果
Fig.1 M agnol ia lil iif lor a pollen for m and staining photo
#
189# 第7期刘会超等 紫玉兰花粉的生活力测定及贮藏方法
表1花粉在完全随机试验中12h 的萌发状况
T able 1 T he co ndition of pollen ger mination in the completely random test 12h later
%
萌发率
G ermination per centag e 蔗糖浓度Sucro se co ncentration
02
4
6
8
10
硼酸浓度/%0.00061?0.017.72?0.027.37?0.017.27?0.02 6.43?0.04 5.16?0.01Pq
M N OP no M NO Pnop M N O Pnop N OP no pq O Pnopq Bo ric acid 0.0017.33?0.0090.05?0.01
72.31?0.07
42.41?0.04
36.94?0.07
28.70?0.10
Concentr atio n
M NO Pno p A a
Bb
GH fg H Ihi JKj
0.002 6.99?0.0057.24?0.06
51.96?0.01
39.61?0.0128.52?0.01
20.56?0.00
M NO Pno p D Ed EFe
G HIg h JKj
L k
0.003 5.73?0.0359.99?0.05
46.18?0.04
36.84?0.03
27.87?0.01
12.89?0.00OP no pq CDcd F Gf
HIhi JKj
M N lm 0.004 3.45?0.0064.15?0.01
39.62?0.0028.61?0.00
24.96?0.01
8.98?0.00O Po pq Cc
G HIg h JKj
KL jk JM N O lmn 0.005
2.63?0.0057.21?0.04
34.03?0.00
20.67?0.01
13.30?0.01
8.09?0.01O Ppq
D Ed
IJi
L k
M l
M N OP mno
注:不同大、小写字母分别表示在0.01、0.05水平上存在差异(下同)。
N ote:D iferent lo wer case and capital lett er s in the same co lumn indicate the significant lev el at 0.05and 0.01level respect ive -ly.T he same belo w.
表2不同贮藏环境条件下花粉的萌发率
T able 2 Germinat ion per centag e of pollen under different stor age envir onment
%
时间/d T ime 常温N or mal temper atur e 常温+干燥剂N o rmal tem per at ur e and desiccating ag ent 4e 4e +干燥剂4e and desiccat ing ag ent -80e -80e +干燥剂-80e and desiccating agent 2 1.67?0.03Cb 2.30?0.02Cb 28.46?0.19Aa 26.04?0.15A a 22.46?0.08ABa 0.08?0.06BCb 5
0.00?0.00Cb 0.00?0.00Cb 0.00?0.00Cb 0.00?0.00Cb 2.47?0.02Cb 0.01?0.02Cb
2.4
不同贮藏环境条件对花粉生活力的影响
由表2可以看出,在同一贮藏条件下,花粉萌发率随贮藏时间的延长而下降。贮藏2d 时,4e 不干燥的萌发率最高达28.46%,-80e 不干燥的萌发率最低为22.46%;贮藏5d 时,常温、4e 贮藏的花粉都不再萌发,-80e 不干燥的萌发率仍可达到2.47%,在干燥的条件下降至0.01%。故在贮藏5d 的条件下,紫玉兰花粉最适宜的贮藏条件为-80e ,不干燥。
3
结论与讨论
3.1
紫玉兰花粉的形态观察
本研究所观察到的紫玉兰花粉属于小型花粉,形状为球状花粉。在扫描电镜下外壁较粗糙,表面小穴分布均匀,没有网状纹饰。极轴平均长度40.25~49.11L m ,赤道轴平均长度在20.31~23.68L m,P/E 在1.86~2.07L m 。紫玉兰花粉外壁表面纹饰与芮飞燕等[6]对红花玉兰等5个玉兰种花粉形态观察及分类学意义的观察结果一致。说明,花粉表面纹饰不会由于地区性差异而发生变化,性状稳定,适合推广;但紫玉兰花粉的大小和形状却存在差异,一方面可能是由于地区性差异所致,另一方面可能是在材料处理过程中存在差异所致。3.2离体萌发法对紫玉兰花粉萌发的影响
该研究采用不同浓度配比的蔗糖、琼脂和硼酸混合培养基进行花粉萌发离体培养实验研究,结果表明:1)蔗糖对花粉萌发起促进作用。紫玉兰花粉萌发所需蔗糖的最佳浓度为2%,大于这个浓度
花粉萌发率呈下降趋势,其原因可能是蔗糖浓度过高会造成花粉细胞质壁分离,从而影响花粉的萌发,而蔗糖浓度适宜时,花粉内外的渗透压才能保持平
衡,从而可维持花粉正常的生活力,有利于萌发[13]
。2)硼对花粉的萌发和花粉管的伸长有促进作
用[14-15],不含硼酸的培养基中花粉萌发率很低,最适宜的硼酸用量为0.001%,大于这个浓度花粉萌发率也呈下降趋势。离体萌发法可以模拟自然界中花粉萌发的柱头环境,可视为测定花粉萌发率的最佳方法。
3.3染色法对紫玉兰花粉萌发的影响3.3.1碘-碘化钾染色法碘-碘化钾染色法是利用新鲜的花粉有淀粉积累,遇碘呈蓝色反应这一特性来检测花粉的生活力的。但有报道[16]认为:某些植物退化的花粉和失活的花粉也有淀粉积累,遇碘同样呈蓝色反应,会造成花粉生活力高的假象。本试验发现,碘-碘化钾染色法测定紫玉兰花粉生活力结果全无生活力,可能是因为这个花粉不含淀粉或含淀粉量极低难以检测出来,这个结果有待进一步研究。
3.3.2T T C 染色法TT C 染色法的基本原理是:当T TC 渗入细胞后,可被呼吸代谢中的还原酶所还原,并由无色的氧化型变成红色的还原型,由此来判断花粉的生活力。但本试验的结果却表明,TT C 无法使紫玉兰花粉着色,可能是紫玉兰花粉自身特性(如花粉壁的厚薄,花粉外壁的组成物质,花粉内各种酶活性的强弱等)的影响所致。
3.3.3醋酸洋红染色法具有生活力的花粉的脱
#190# 贵州农业科学2011,39卷
氢酶,在催化去氢的过程中,把氢转移到其他的物质上去,使用醋酸洋红与催化过程中产生的氢结合成红色化合物,从而使具有生活力的花粉变为红色。但该方法有个缺点,当花粉失去活力时间较短时,该酶的活性仍然存在。所以,花粉生活力测定时间非常关键,如测定时间偏早,该方法的测定结果偏高[17],但如果花粉放置时间过长,则测定结果偏低。所以,该方法适合那些花粉生活力丧失后脱氢酶活性也丧失的植物。本试验结果显示,无论是发育良好的饱满花粉,还是发育不良的干瘪花粉,均被染成红色,说明该方法所得数据偏高,不适合紫玉兰花粉生活力的检测。
由上可见,这3种染色法都不适合测定紫玉兰花粉生活力。
3.4不同贮藏环境条件对花粉生活力的影响
花粉生活力的强弱受遗传因素和环境因素的影响,而影响花粉寿命的关键因子是花粉含水量和贮藏温度,低温、干燥处理是长期保存花粉的必要条件[18-19]。试验表明,4e和-80e低温贮藏条件下花粉的萌发率比室温贮藏明显要高且这与罗凤霞等对丁香花粉生命力及贮藏条件的研究结果一致[20]。而紫玉兰花粉却随着温度的降低不易干燥贮藏,这个结果有待进一步研究。因此,可归纳为紫玉兰花粉适宜低温、不干燥贮藏。
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(责任编辑:王海)
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第7期刘会超等紫玉兰花粉的生活力测定及贮藏方法
植物花粉生活力检测技术进展_左丹丹
植物花粉生活力检测技术进展 左丹丹1,2,明军23,刘春2,王丽娜1 (1.长江大学园艺园林学院,湖北荆州434025;2.中国农业科学院蔬菜花卉研究所,北京100081) 摘要 总结了植物花粉生活力检测的染色法、萌发测定法以及田间授粉测定法等的基本原理和应用,并且分析了各种方法的特点。 关键词 花粉;生活力;检测技术 中图分类号 Q945 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2007)16-04742-04 Advance in T echnique of P lant Pollen V iability ZU O Dan2d an et al (C ollege of H orticulture and Landscape Architecture,Y angtze University,Jingzh ou,Hubei434025) Abstract T he principle and application of technique of plant pollen viability were summ arized,including staining m eth od,germ ination m eth od and polli2 nation in field m eth od,etc.T he characteristics of different techniques were studied. K ey w ords P ollen;Viability;T esting technique 花粉是高等植物的雄配子体。它在有性繁殖中传递着雄性亲本的遗传信息。花粉既是植物遗传、育种、进化、生殖等研究的重要对象,又是孢粉分析、蜂群培育、药物制造、医疗及生理试验等的重要材料。花粉生活力是花粉具有存活、生长、萌发或发育的能力。在农业和林业的常规育种中,为了进行人工辅助授粉或杂交授粉,需要早期采集和贮存花粉。尤其是在杂交育种工作中,研究花粉的生活力和育性是必不可少的基础性工作。为了解决亲本花期不一致或远距离杂交的困难,更需要保存花粉的活力。在使用采集和贮存花粉之前,通常要做花粉生活力的鉴定。不同类群植物花粉在自然条件下的寿命、花粉的适宜贮存条件以及花粉生活力的适宜测定方法均有所差异。这些差异对于研究花粉贮藏期间控制花粉生活力、花粉—柱头间的相互作用、品种改良与育种操作、基因库的保持、不亲和性与受精关系、生理调节对花粉萌发的影响以及基因流等均有重要的实践意义[1]。因此,掌握花粉生活力检测的方法对于提高植物育种效率具有较高的实际应用价值。 1 染色法 1.1 I22KI染色法 I22K I染色法的基本原理是:根据淀粉遇碘变蓝的特性,根据蓝色的深浅程度来判断花粉粒中淀粉的含量,从而确定花粉粒活性的高低。 具体操作步骤如下:①I22K I的配制。称取2g K I溶于10 m l蒸馏水中,然后加入1g I2,待全部溶解后,加蒸馏水定容至300m l。②染色。取少量花粉置于载玻片上,滴上1～2滴 I2K I染色液,5m in后在显微镜下观察。③结果判断。凡是染成蓝黑色的花粉粒具较强活力,淡蓝色次之,几乎无色则为无活力花粉。 该方法在柑橘[2]、辣椒[3-4]、梅(桃)属[5]、瓜叶菊[6]、黄 瓜[7]、澳洲坚果[8]等植物上均有应用。该方法的局限在于,它是靠花粉粒内的淀粉着色而进行判定的。虽然花粉失去了活力,但是淀粉依然存在,所以测定值偏高,而且对于那些淀粉含量少的种类如菊属[9]不适宜。 基金项目 国家社会公益研究项目(2005DI B022);湖北省自然科学基金(2004ABA142);林木、花卉遗传育种教育部重点实验室开放 基金(200605212)。 作者简介 左丹丹(1981-),女,湖北宜昌人,硕士研究生,研究方向:园林及观赏植物资源与分子育种。3通讯作者。 收稿日期 20072022061.2 TTC染色法 TT C即2,3,52氯代三苯基四氮唑,它是一种氧化还原染料。TT C染色法的基本原理是:当TT C渗入细胞后,可被呼吸代谢中的还原酶所还原,并由无色的氧化型变成红色的还原型,由此来判断花粉的生活力。 具体操作步骤如下:①磷酸盐缓冲溶液的配制。称取1.673g十二水磷酸氢二钠和0.273g磷酸氢二钾溶解于100 m l的蒸馏水,调整pH值为7.17。②TT C溶液的配制。称取0.02～0.05g TT C(依植物而定)溶解在10m l磷酸盐缓冲溶液中,然后放于棕色瓶中于暗处待用。因氯化三苯基唑有毒,操作时要注意安全。③染色。取少量花粉置于普通载玻片上,滴入TT C溶液2滴,用镊子搅拌均匀,盖上盖玻片,在25～28℃的温度下放置15～20m in。④显微镜下观察。具较强生活力的花粉粒呈红色,微弱活力的花粉粒呈淡红色,无活力或不育的花粉为无色。 该方法已应用于黄瓜[7]、枇杷[10]、猕猴桃[11]、番木瓜[12]、瓜叶菊[7]、芸薹属[13]、百合[14]等的花粉生活力检测。但该方法耗时长,染色后花粉的颜色差别很小,不易分辨,且颜色受染色时间的影响较大,不便统计。 1.3 FCR染色法 FCR染色法即荧光染料反应法(Flu o2 rochrome Reaction),其基本原理是:荧光染料本身不产生荧光,无极性,可以自由地透过完整的原生质膜,当这种染料进入原生质后,即被酯酶作用而形成一种能产生荧光的极性物质———荧光素,并且这种物质不能自由出入原生质膜,而只在细胞内积累,所以可以根据花粉产生荧光的情况判断花粉的生活力。而且,该方法可同时反映出酶活和质膜情况2个指标[15]。 具体操作步骤如下:①母液1(SS1)的配制。1.75m ol/L 蔗糖、3.32mm ol/L硼酸、3.05mm ol/L硝酸钙、3.33mm ol/L硫酸镁、1.98mm ol/L硝酸钾,混合后用蒸馏水定容。另外,可以增加蔗糖浓度以避免由渗透压引起的花粉管破裂,也可以根据荧光的强弱来调整盐的浓度。②母液2(SS2)的配制。 7.21mm ol/L双乙酸荧光素(Flu orescein Diacetate)溶于丙酮中,放于4℃冰箱。③染色液的配制。取8～12滴SS2于10m l SS1中,混匀直到该混合液变为轻乳状。④染色。取2～3滴染色液于花粉粒上,盖上盖玻片,2m in后在荧光显微镜下观察即可。产生绿色荧光的花粉具有生活力,无荧光产生的花粉则没有生活力。 安徽农业科学,Journal of Anhui Agri.Sci.2007,35(16):4742-4745 责任编辑 刘月娟 责任校对 胡先祥
花粉活力测定的3种方法
实验16花粉活力的测定 在作物杂交育种、作物结实机理和花粉生理的研究中，常涉及花粉活力的鉴定。掌握花粉活力快速测定的方法，是进行雄性不育株的选育、杂交技术的改良以及揭示内外因素对花粉育性和结实率影响的基础。 一、花粉萌发测定法 【原理】 正常的成熟花粉粒具有较强的活力，在适宜的培养条件下便能萌发和生长，在显微镜下可直接观察计算其萌发率，以确定其活力。 【器材与用具】 载玻片；显微镜；玻棒；恒温箱；培养皿；滤纸。 【试剂】 培养基：10%蔗糖，10mg/L硼酸，0.5%的琼脂。称10g蔗糖、1mg硼酸、0.5g 琼脂与90ml水放入烧杯中，在100℃水浴中熔化,冷却后加水至100ml备用。 【方法】 1.将培养基熔化后，用玻棒蘸少许，涂布在载玻片上，放入垫有湿润试纸的培养皿中，保湿备用。 2.采集丝瓜、南瓜或其他葫芦科植物刚开放或将要开放的成熟花朵，将花粉洒落在涂有培养基的载玻片上，然后将载玻片放置于垫有湿滤纸的培养皿中，在25℃左右的恒温箱（或室温20℃条件下）中孵育，5~10min后在显微镜下检查5个视野，统计其萌发率。 【注意事项】 1.不同种类植物的花粉萌发所需温度、蔗糖和硼酸浓度不同，应依植物种类而改变培养条件。
2.此法也可用于观察花粉管在培养基上的生长速度以及不同蔗糖浓度，离体时间，环境条件等因素对花粉活力的影响。 3.不是所有植物的花粉都能在此培养基上萌发，本法适用于易于萌发的葫芦科等植物花粉活力的测定。 二、碘- 碘化钾染色测定法 【原理】 多数植物正常的成熟花粉粒呈球形，积累较多的淀粉，I 2 -KI溶液可将其染 成蓝色。发育不良的花粉常呈畸形，往往不含淀粉或积累淀粉较少，I 2 -KI溶液 染色呈黄褐色。因此，可用I 2 -KI溶液染色来测定花粉活力。 【器材与用具】 显微镜；载玻片与盖玻片；镊子；棕色试剂瓶；烧杯；量筒；天平。 【试剂】 I 2-KI溶液：取2g KI溶于5～10ml蒸馏水中，加入1g I 2 ，待完全溶解后， 再加蒸镏水300ml。贮于棕色瓶中备用。 【方法】 采集水稻、小麦或玉米可育和不育植株的成熟花药，取一花药于载玻片上， 加一滴蒸馏水，用镊子将花药捣碎，使花粉粒释放，再加1～2滴I 2 -KI溶液，盖上盖玻片，在显微镜下观察。凡是被染成蓝色的为含有淀粉的活力较强的花粉粒，呈黄褐色的为发育不良的花粉粒。观察2～3张片子，每片取5个视野，统计花粉的染色率，以染色率表示花粉的育性。 【注意事项】 此法不能准确表示花粉的活力，也不适用于研究某一处理对花粉活力的影响。因为三核期退化的花粉已有淀粉积累，遇碘呈蓝色反应。另外，含有淀粉而 被杀死的花粉粒遇I 2 -KI也呈蓝色。 三、氯化三苯基四氮唑（TTC）法
实验六 种子生活力的快速测定
实验六 种子生活力的快速测定 一、实验目的 1.加深对种子作用的理解； 2.掌握种子生活力的测定方法。 二、实验原理 在播种、交换和调运种子之前，都要及时了解种子的发芽率，以确定是否作为播种材料或引种种源。因此，快速而又准确地测定种子生活力，对于及时调种和播种后确保全苗、壮苗具有极其重要的意义。种子生活力是指种子能够萌发的潜在能力或种胚具有的生命力。 有生活力的种子进行呼吸作用，呼吸代谢途径催化产生的氢（H ） 种子生活力越强，代谢活动越旺盛，被染成红色的程度越深； 死亡种子没有呼吸作用，不会将TTC 还原成红色； 种胚生活力衰退或部分丧失生活力，染成较浅或局部被染色； 三、实验材料及用品 材料：绿豆种子 实验器皿：恒温箱、小烧杯、镊子、刀片 实验试剂：0.5%TTC 溶液（避光保存） 四、实验步骤 1. 浸种：将待测种子在 30 ～ 35 ℃温水中浸种，以增强种胚的呼吸作用。 2. 显色 ：a 、种子处理：随即选取吸胀的种子 40 粒，小心剥去种皮，勿伤及种胚。 b 、实验组处理：将处理好的20粒种子置于小烧杯中，加入0.5%TTC 溶液，以 刚好浸没种子为宜，恒温（32℃）中保1h 。 c 、对照组处理：另取20粒种子，于沸水浴中煮5min 后，加入0.5%TTC 溶液， 以刚好浸没种子为宜，恒温（32℃）中保温1h 。 有生活力的种子进行呼吸 作用，呼吸代谢途径催化产 生的氢（H ）
3. 统计：染色结束，马上鉴定；倒出TTC溶液，用清水将种子冲洗1-2次，观察种胚乳染 色情况。有生活力种子：种胚全部或大部分被染成红色；无生活力种子：不被染 色。 生活力的种子数 计算种子生活力的比率= ————————X 100% 实验组测定种子数 五、实验现象与结果 表一种子染色情况记录表 图1 未煮沸的种子染色情况 图2 煮沸的种子染色情况 生活力的种子数 未煮沸的种子生活力的比率= ————————X 100% = 14/20 X 100% = 70% 实验组测定种子数
三种常用检测种子生活力方法比较
植物生理学小论文 三种常用检测种子生活力方法的比较 班级：09级生物技术2班 学号: 系别: 化学与生命科学系 : 雪婷 日期：2012年5月15日
浅谈三种常用检测种子生活力的方法 雪婷 （师学院化学与生命科学系675000） [摘要] 种子活力是种子最重要的生理及生产指标之一，近年来，无论在育种选种方面还是植物生理实验方面都得到广泛关注。本文基于对种子活力的概念、影响种子活力的因素和种子活力快速测定的最新研究进展为基准, 对TTC法、BTB法及红墨水染色法三种常见种子活力快速检测方法进行了简要综述。结论：四氮唑染色法是蔓荆子种子生活力测定的最佳方法，生活力与发芽率呈显著的正相关。 关键词：种子活力；TTC法；BTB法；红墨水染色法；研究进展 The discussion on three kinds of methods to detect seed vigor SUN-xueting （Chuxiong normal university，chuxiong，yunnan675000，China） Abstracts: The seed vigor is the most important physiological and seed production indexes. In recent years，No matter in selecting seeds breeding or in plant physiology experiments. The seed vigor is widely mentioned This paper based on the concept of the seed vigor influence factors of the seed vigor and the seed vigor rapid determination of the latest research progress Comparition of three kinds of methods to determine seed vigor. Keywords: seed vigor ；Triphenyl Tetrazolium Chloride method；Bromo—thymol blue method; red ink method;research progress 种子生活力是检测种子质量最重要的指标之一，它对于种子的发育，萌发，成熟以及成长为植株的潜在能力具有十分紧密的联系。对于科学选种，快速预测种子的利用价值也具有重要的意义。快速检测种子生活力的方法很多，但生产实验及植物生理实验中常用的主要有氯化三苯基四氮唑(TTC)法、溴麝香草酚蓝(BTB)法和红墨水染色法。这三种方法都能快速测定种子的正常生理代功能是否受到损害，胚是否存活,以了解种子是否还具有发芽的潜力。 种子生活力（seed viability)是指种子的发芽潜在能力和种胚所具有的生命力，通常是指一批种子中具有生命力（即活的）种子数占种子总数的百分率。早在1876年种子学的创始人Nobbe（德国）[1]就指出在同一批种子存在个体间发芽和幼苗生长速度的差异，并且不
花粉生活力测定方法研究进展.
花粉生活力测定方法研究进展 摘要:总结了花粉活力测定的染色法、离体萌发法以及田间授粉法等的原理和应用并分析了各种方法的优缺点。 关键词:花粉花粉活力测定方法 花粉是高等植物的雄性配子体,在有性繁殖过程中起到传递雄性亲本的遗传信息。花粉不仅是植物遗传、育种、进化、生殖的重要研究对象,也是孢粉分析、蜂群培育、药物制造、医疗及生理实验的重要材料。花粉活力是花粉具有生长、萌发、或发育的能力。在农业生产及农业常规杂交育种的中,研究花粉的生活力和育性是不可缺少的基础性工作。农业生产和育种工作通常会遇到花期不一致带来的困难,为解决这一难题,保存花粉的活力成为重要手段,而在贮藏花粉之前必须先检测花粉的活力。不同种类植物花粉的自然寿命、适宜的贮藏方式及花粉活力适宜的测定方法不同。因此,掌握花粉活力的检测方法对提高育种效率有较高的作用和意义。 综合前人的研究结果,花粉生活力的检测方法可以分为四大类:①染色法;②萌发测定法;③田间授粉检测法;④形态测定法、无机酸检测法。 1染色法 1.1TTC 染色法 TTC 即 2,3,5-氯代三苯基四氮唑,它是一种氧化还原染料,水溶液无色。基本原理是 [1]:当 TTC 渗入细胞后, 遇到活细胞里的脱氢酶接受氢离子,由无色的氧化型变成红色还原型不溶于水的化合物,由此来判断花粉的生活力。 具体操作步骤:①配制 PH 为 7.17的磷酸缓冲液。称取 0.832克磷酸氢二钠和0.273克的磷酸二氢钾溶于 100ml 的蒸馏水中,调整 pH 为 7.17。② TTC 溶液配制。依据不同植物称取 0.02~1.0g 的 TTC 溶于 100ml 的磷酸缓冲液中, 于棕色瓶中黑暗处保存。③染色。取少量花粉置于载玻片上,加上一滴 TTC 溶液,用镊子搅拌均匀,
花粉的形态观察及生活力测定
实验一花粉贮藏及花粉生活力的测定 花期不遇给杂交工作造成困难，有的园林植物可通过调整花期来解决，有的则不得不进行花粉贮藏，或者从外地寄运花粉。为了避免杂交工作失误，在使用外地寄来的花粉或经过一段时间贮藏的花粉之前，必须对花粉的生活力进行检测，以便对杂交结果进行分析与研究。因此我们必须掌握花粉贮藏及花粉生活力测定的原理和技术 一、实验目的 掌握花粉贮藏及花粉生命力鉴定的方法和原理。 二、实验材料 百合、金鱼草、菊花等花粉。 三、仪器及药品 显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、解剖针、吸水纸、TTC（2.3.5—氯化三苯基四唑）、KI-I2、蓝墨水。 四、实验原理 花粉在低温（ 0 ～ 2 ℃）、干燥、黑暗等条件下代谢强度降低，花粉贮藏的原理就是要创造这样低代谢的环境条件，从而延长花粉的寿命。 花粉的形态、花粉中酶的活性以及积累淀粉的多少（淀粉质花粉）通常与其生活力密切相关，因此可以利用花粉的形态观察、过
氧化物酶、脱氢酶的活性高低、淀粉的含量以及在人工培养基上花粉管萌发的情况作为鉴定花粉生活力高低的标准。 鉴定花粉生活力的方法很多，概括起来主要有如下几种： 1 ．直接测定法将待测花粉直接授粉，然后统计结实情况。此法最准确，但需时较长，且实验结果易受气候条件的影响。也可在授粉后隔一定时间切下柱头，在显微镜下压片检查花粉的萌发情况，根据萌发率的高低来鉴定花粉的生活力。 2 ．形态观察法直接在显微镜下观察花粉的形态，根据品种花粉的典型性（如具有正常的大小、形状、色泽等）判断花粉的生活力，即形态正常的花粉有生活力，而一些小的、皱缩的、畸形的花粉不具有生活力。此法简便易行但准确性差，一般只用于测定新鲜花粉的生活力。 3 ．染色观察法 1 ）碘－碘化钾染色法：以碘－碘化钾溶液（ 0.3g 碘＋ 1.3g 碘化钾溶于 100ml 蒸馏水）染色后于显微镜下观察，花粉被染成蓝色者表示具有生活力，花粉呈黄褐色者不具有生活力。 2 ） TTC 染色法：使用TTC测定花粉生命力的原理，主要是无色药液进入花粉遇到活组织里的脱氢酶，接受氢离子，还原成红色三苯基甲腊TTF，还原结果使有生命力的花粉染上红色，死花粉不着色；花粉生活力强弱有异，染色深浅也有不同。在28—30℃的温度下2小时以上(花卉不同染色时间也不同)。
花粉生活力测定
实验九花粉生活力测定 一、实验目的 1．学习和了解植物花粉生活力测定方法及原理。 2．初步掌握稻、麦的花粉生活力测定方法。 二、内容说明 农业常规育种工作中，为了进行人工辅助授粉和杂交授粉，尤其是杂交育种工作，为解决亲本花期不一致和远距离杂交的问题，通常需要早期采集和储藏花粉。不同类群植物花粉在自然条件下的寿命，花粉的储藏条件，以及花粉生活力的测定有所区别，这一是由花粉本身的特征决定的，二是由贮藏条件决定的。一般来说，禾谷类作物花粉的寿命较短，自花授粉植物花粉的寿命尤其短，如小麦在花药开裂后30min，花粉即由鲜黄色变为深黄色，此时己有大量花粉丧失活力。 在许多特殊条件下，花粉生活力的差异对于研究花粉-柱头的相互作用，作物改良与育种操作，基因库的保持，不亲和性与受精关系，生理调节对花粉萌发的影响和基因流等，均有非常重要的实践意义。因此，对于外地采集来的花粉的短暂贮藏、花粉的生物学研究、自交或远缘杂交分析结实率或不结实原因、鉴定雄性不育系时，花粉生活力的测定显得很重要。 花粉生活力有很多表述法，为了方便起见，现将各种表述方法列表如下(表9-1)，以供参考。 表9-1 花粉生活力的各种表述法 花粉生活力的测定方法较多，通常可分为萌发测定和不萌发测定两大类，常用的有：（1）形态鉴定法是一种简便的鉴定新采集花粉的方法。可通过直接观察花粉在形态上有明显差异来鉴定花粉有无生活力。发育不正常的花粉，内含物不充实而空秕，形状也不规则，大小参差不齐。而正常花粉内含物充实饱满，形状规则，大小整齐。因
内部含有较多淀粉粒而遇1%I-IK溶液呈深紫色反应，遇水易涨而破裂。一般适用于不育系及远缘杂交后代花粉形态和育性的鉴定。 （2）染色鉴定法（FCR法）用不同的化学试剂如双乙酸荧光素(fluorescein diacetate)、联苯胺茶酚等快速鉴定花粉生活力。双乙酸荧光素是一种荧光染料，其本身不产生荧光，无极性，可以自由地透过完整的原生质膜。当此种染料进入原生质后，即被酯酶作用而形成一种能产生荧光的极性物质—荧光素，并且这种物质不能自由出入原生质膜，而只在细胞内积累，所以，可以根据花粉产生荧光的情况判断花粉的生活力。此方法可同时反映出酶活和质膜情况两个指标。 （3）花粉发芽测定法配制一定浓度的蔗糖溶液等作培养基，在人工控制条件下进行花粉发芽试验。根据花粉发芽率的高低衡量花粉生活力。也可以在授粉数小时后直接观察柱头花粉萌发伸长情况。 三、材料仪器药品 1．材料当天采集的稻、麦任一种作物的新鲜花粉。 2．仪器用具冰箱、荧光显微镜、普通显微镜、恒湿箱、载玻片、盖玻片、培养皿、滴管、镊子、解剖针、吸水纸、滤纸、标签、铅笔等。 3．药品KNO3、NaOH、MgSO4、MnSO4、Ca(N03)2、H3BO3、1%I-IK溶液、双乙酸荧光素、丙酮、乳酸、苯酚、甘油、棉蓝、苯胺蓝、冰醋酸、蔗糖、琼脂、马铃薯淀粉、蒸馏水。 四、方法步骤 花粉的育性和生活力可由浅入深按以下顺序观察鉴定：外形观察→I-IK测定内含物的充实度→染色法鉴定花粉酶学性质→花粉发芽试验→观察花粉在柱头上萌发和伸长情况。 （一）形态鉴定 1．将少量正常的稻、麦的新鲜花粉用解剖针播于一般载玻片上，于低倍显微镜下观察花粉形态。根据形态特征，判断花粉的生活力状况。一般来说，畸形、皱缩、小型化等均为无生活力花粉，而有光泽、饱满、具有本品种花粉典型特征等性状的均为有生活力花粉。将观察的结果统计一下填写表格9-2。 2．与形态观察相同。但在有花粉的载玻片上滴1滴1%I-IK，再观察花粉是否染色和染色深浅情况，以判断花粉内含物的充实度。正常花粉应有较多的淀粉粒，遇I-IK呈紫黑色，不正常的染色浅或不染色。 （二）FCR测定法（荧光染料反应法) 荧光染色法可根据细胞质膜完整性判断花粉的生活力。迅速简便，与萌发测定有相
实验四、花粉生活力的测定
实验四、花粉生活力的测定 一、实验目的：通过实验掌握花粉生活力测定的具体技术和方法。 二、实验原理：花粉生活力是指在正常条件下花粉在雌蕊上萌发的能力。花粉生活力测定在杂交工作中很重要，尤其亲本花期不相同需要从外地采集花粉作父本时，花粉要经过一段较长时间的贮藏运输过程，因此在杂交前应检验花粉的生活力，以免应用无生活力的花粉而造成杂交工作的失败。 三、实验材料：苹果花粉 四、实验用具与试剂：指形管、显微镜、载玻片、盖玻片、凹式载玻片、滴瓶、培养皿、天平、烧杯、玻璃棒、微波炉、滤纸、水浴锅、计数器、镊子；碘化钾（KI）、碘、蓝墨水、蒸馏水、蔗糖、琼脂、硼酸等。 五、实验步骤 常用的测定花粉生活力的方法：形态观察法、碘-碘化钾染色法、蓝墨水染色法和培养基发芽法。 1. 形态观察法 直接在显微镜下观察花粉的形态，根据花粉的典型性（如具有正常的大小、形状、色泽等）判断花粉的生活力，即形态正常的花粉有生活力，而一些小的、皱缩的、畸形的花粉不具有生活力。具体方法：将花粉置于载玻片上，在显微镜下观察3个不同视野，要求被检查的花粉粒总数达到100粒以上，计算正常花粉粒占总数的比率。 此法简便易行但准确性差，一般只用于测定新鲜花粉的生活力。 2. 染色法 (1) 碘-碘化钾染色法 ①原理：正常的花粉积累淀粉较多，而不正常的花粉则少。据此，可用化学物质染色，根据呈色反应来间接测定花粉的正常与否和花粉生活力的差别。通常正常花粉用I-KI染色后呈蓝色，而发育不良畸形花粉则不积累淀粉，当I-KI染色时呈黄褐色。 ②I-KI溶液：取2.0 g KI溶于5～10mL蒸馏水中，然后加入1.0 g I2待全部溶解后，再加蒸馏水至200mL，贮于棕色瓶中备用。 ③具体方法：取少量花粉撒于载玻片上，加一滴蒸馏水，用镊子使花粉散开，再加一滴I-KI溶液，盖上盖玻片置于显微镜下观察。凡被染色呈蓝色表示具有生活力，呈黄褐色者为发育不良生活力弱的花粉。为了保证实验的准确性，要求观察不同的3个视野，求其平均值，统计花粉生活力。 (2) 蓝墨水染色法 ①蓝墨水溶液：正常购买的蓝墨水稀释10倍。
四唑法测定种子生活力Word版
四唑染色法测定种子生活力 福建农林大学20**级农学0******* ***** 一、目的 1、了解种子生活力测定方法 2、熟悉利用四唑染色法测定种子活力方法及操作方式 二、原理 有生活力的种子活细胞在呼吸过程中都发生氧化还原反应，四唑溶液作为一种无色的指示剂，被种子吸收后参与活细胞的还原反应，从脱氢酶接受氢离子，在活细胞里产生红色、稳定、不扩散、不溶于水的三苯基甲。化学反应如下：DPNH2 + TTC DPN + TTCH + HCl （辅酶IH2）（四唑）（辅酶Ⅰ）（甲）（氯化氢） H N‐N‐C6H5N‐N‐C6H5 ∥2H ∥ C6H5‐C C6H5‐C +HCl \ \ N﹦N+‐C6H5 N＝N‐C6H5 无生活力的种子则无此反应。 根据种子的四唑显色的部位，即可区分有活力的部分和死亡部分。一般鉴定原则是，凡是胚的主要结构及有关活营养组织染成有光泽的鲜红色，且组织状态正常的，为有生活力的种子。凡是胚的主要构造局部不染色或染色成异常的颜色和光泽，并且活营养组织部染色成无光泽的淡红色或灰白色，且组织已软腐或异常、虫蛀、损伤、腐烂的为死种子。 三、试材与设备 1、材料大豆种子 2、设备烧杯、滤纸、刀片、镊子、恒温培养箱 3、试剂 1.0%的四唑溶液 四、实验步骤 从净度分析后并经过充分混合的大豆种子中，随机抽取30粒，3次重复。 1、种子预湿将选取的大豆种子水浸预湿，室温下浸泡8h，使其充分吸胀。 2、种子处理将吸胀的大豆种子的种皮去除，掰开子叶，露出子胚芽，保持湿润备用。 3、四唑染色将处理好的种子放入烧杯中，加入1.0%的四唑溶液，将种子淹没，然后置于35℃恒温培养箱中避光染色0.5~1 h。 4、观察鉴定将染色后的大豆种子经清水冲洗后进行染色情况的观察鉴定。胚部全部显成鲜红色、仅子叶远离胚芽部分少量未染色、仅子叶边缘少许未染色，为有生活力的种子。 5、结果计算及处理统计各个重复中有生活力的大豆种子数，并计算其平均值。
种子发芽箱延长种子生活力与提高种子发芽率
延长种子生活力和提高种子发芽率 一、简介概述： 提供种子生长的最适宜环境种子发芽需要合适的环境参数，如温度、湿度、光照度、空气质量等。种子发芽需要每个参数的参与，任何一个参数如果超出了临界值，都会造成不可逆的后果。但是，自然环境的各种参数，受着很多情况的制约导致它的不可控，从而决定了种子发芽的不可知性。那么如何才能做到对种子发芽充分了解和控制呢。现在市场上有很多种子发芽箱或者光照箱等仪器，就是为人们解决自然环境参数的不可控制性而研发生产的。我们不得不承认，这些种子发芽箱或者光照箱的诞生，改变了种子或者植物的生长，让我们对植株的生长有了更加深刻的认识和更加全面的掌握。水分：水分是一切植物生长的源泉，是所有植物生长最重要的因素。有了水分，种子才能进行呼吸作用，才能进行细胞生长，才能进行其他一切生命活动。温度：种子发芽需要合适的温度，一般的，种子发芽的温度在0-40℃，而一般种子发芽的最适温度为15-30℃之间，如太阳花的适宜发芽温度为13-18℃。植物的发芽温度因植物而异，因原产地而异。光照度：一般种子的发芽都需要阳光，需旋光性植物，而一些嫌旋光性植物并不需要阳光。由于这一特性，植物播种后可以根据植物种子发芽是否需要阳光来决定是否覆盖土壤。而种子发芽箱正好弥补了自然界的各种环境参数，如温度的不可控，湿度的不可知性。跟光照箱类似，种子发芽箱采用微电脑全自动控制，控制板一体化，能够人工任意设置种子发芽的温度、湿度和光照度，以及运行时间。此时我们只需将程序设定成种子发芽最合适的温度、湿度等，就能够保证种子按照我们需要的方式发芽，基本达到我们预期的发芽率要求。这样，不仅大大提高了种子的发芽率和成活率，同时也节约了成本和资源。 二、功能特点： 具有超温和传感器异常保护功能，保证仪器和样品安全；选配全光谱的植物生长灯，有利于植物的生长，提高抗病性。具有掉电记忆、掉电时间自动补偿功能。种子发芽箱采用大屏幕液晶屏程序控制，中文指导操作流程，操作简单，控制精确，可设置0-99个时段随意自动转换功能，具有超温和传感器异常保护功能，保证仪器和样品安全。
三花粉的贮藏和生活力测定
实验三花粉的贮藏和生活力测定 一、目的和要求 在正常条件下花粉在雌蕊上萌发的能力，就是花粉的生活力。花粉生活力测定在杂交工作中很重要，尤其亲本花期不相同需要从外地采集花粉作父本时，花粉要经过一段较长时间的贮藏运输过程，因此在杂交前应检验花粉的生活力，以免应用无生活力的花粉而造成杂交工作的失败。 从生产上来看，在选择相互授粉的品种时，也应考虑到品种的花粉发芽能力，凡是花粉发育不全的品种，其花粉的发芽率都很低。因此不适宜做授粉品种。 本实验的主要目的是掌握花粉贮藏和花粉生活力测定的方法。 二、花粉及用具 材料：桃或苹果树的花粉。 用具：显微镜、天平、盖玻片、凹式载玻片、培养皿、干燥器、试管、滴瓶、蒸馏水、凡士林、蔗糖、氯化钙、琼脂、联苯胺、α-奈酚、碳酸钠、过氧化氢等。 三、方法 （一）花粉贮藏 从发育良好的植株上采下将开的花朵、取出花药放在纸上或培养皿中，放于干燥的室内，令其开裂，花药裂开后将花粉倒入小玻璃瓶或指形管中，口上塞以棉花或橡皮塞，贴上写有品种名称的标签。再把花粉瓶放于干燥器内，使花粉在空气相对湿度较低的条件下（一般0～40%）保存；为了减少呼吸作用，可以放在低温（0～4℃）黑暗的地方贮藏。 （二）花粉生活力试验 1、花粉发芽法 人为的创造适合于花粉发芽的环境条件，以花粉发芽的情况来鉴定花粉生活力的强弱，此法的缺点是花粉发芽条件与实际不完全相符，所得的结果与实际有一定的差异，但操作方便，能测定出相对发芽率来。 （1）培养基的制作与接种 一般采用5～20%蔗糖或葡萄糖加1～2%琼脂，溶于蒸馏水中。加热煮沸即可，将已配制好的培养基保持在40℃温度即不凝固，用玻璃棒点一点培养基敷在载玻片的凹坑内，然后用接种针或解剖针沾以少量花粉。轻轻振动，使花粉均匀地撒在培养基上，将载玻片放在垫有湿润棉花培养皿内或倒扣在培养皿上，并
花粉生活力萌发试验
实验二花粉生活力的测定―――悬滴培养法 一、实验目的：掌握了解花粉生活力测定的意义和方法。 二、实验材料：二月兰花粉 三、实验仪器及药品：凹玻片、盖玻片、解剖针、镊子、纱布、标签、铅笔、显微镜、恒温 箱、蔗糖、蒸馏水、硼酸、凡士林。 四、实验原理：花粉是植物自然授粉和人工杂交的主要物质基础，花粉生活力的大小是保证 杂交成功的关键。在有性杂交育种中，常因父母本花期的不同，作为父本的花粉必须经过贮藏直到母本植株开花时再用于授粉（花粉在低温0－2℃、干燥、黑暗等条件下代谢强度降低。花粉贮藏的原理就是创造代谢强度低的环境，以延长花粉的寿命）；或者双亲不在同一个地方，必须由外地邮寄花粉供应。经过贮藏或外地邮寄的花粉是否已经丧失生活力，必须经过测定才能确定。 鉴定花粉生活力的方法主要有四种：一是将待测花粉直接授粉，然后统计结实率和结子数。此法的缺点是需要的时间较长，且实验的结果易受气候条件的影响。二是将待测花粉授到柱头上，隔一定时间切下柱头，在显微镜下检查花粉的萌发情况。根据萌发率的高低来鉴定花粉的生活力。三是在培养基上进行花粉的人工萌发，检查待测花粉萌发率的高低。后两种方法都是根据花粉的萌发率来反映生活力的高低，有一定的参考价值。但是萌发的不一定都能受精，特别是人工萌发还受许多条件的限制，所以也只有相对的可靠性。四是用染色方法来鉴定花粉的生活力。其原理是在活的花粉内有过氧化氢酶的存在，它可以促进过氧化物（如H2O2）放氧分解。这些刚被放出的活性氧很容易使还原剂氧化，常用无色联苯胺、α－萘酚等还原剂做指示剂，这些还原剂被氧化后表现红色或玫瑰红色。如果花粉是活的，那么会很快被染成红色或玫瑰红色，如果花粉是死的，则这一反应迟迟不能进行，花粉保持原色。此法优点是比较快捷，但是比较间接。本试验采用悬滴培养法鉴定花粉生活力。 五、实验步骤： 1.配培养液：用蒸馏水和蔗糖分别配成5％、10%、15％的蔗糖溶液，并在各培养液 中加少量硼酸。 2.取盛开的正在散粉的二月兰花朵。 3.播花粉：在凹玻片的凹点滴一滴清水。在盖玻片中央滴一滴培养液，用镊子轻轻夹 取二月兰的花药，在培养液中央轻轻蘸一下，使花粉均匀的分散在培养液的球面上。 在盖玻片的四角涂抹少量的凡士林，用镊子夹住盖玻片在上提的过程中迅速把它翻 转过来，小心放在凹玻片上，使培养液处在盖玻片和凹点形成的小密室中。每个凹 玻片分别做蔗糖溶液的三个浓度，并用蒸馏水做对照。 4.培养：做好的凹玻片上贴好标签，注明花粉种类、培养液的浓度以及时间，然后小 心放到铺有湿润滤纸的培养皿中，放到22－24℃的恒温箱中培养5h。 5.观察：从恒温箱中取出凹玻片，在低倍镜下随机观察三个视野，计算花粉的萌发率。 以花粉管长度达到花粉粒径的2倍及以上视为萌发。 六、结果分析 1.分析花粉萌发率高或低的原因。 2.本实验关键性步骤总结及实验中所存在问题的讨论。 七、作业 1.绘制一幅花粉粒萌发形态图。 2.花粉生活力测定在杂交育种中的重要意义？测定花粉生活力的方法有哪些？
实验四 种子生活力测定
实验四种子生活力测定 一、目的要求 应用化学药剂处理和生物化学法快速测定体眠种子生活力并比较不同方法的效果。 二、材料用具 （一）材料：水稻和玉米种子 （二）药品：2．3—5一氯化三苯基四氮唑和红墨水等。 三、方法步骤 （一）四唑盐类法： 1．在洁净的水稻种子中，随机数取试样2份，各100粒剥去谷壳，浸入30℃的水中6－8小时。 2．用2．3．5－氯化三苯基四氮唑配制成的溶液，装在棕色玻璃瓶里，保存在黑暗中。 3．将已剥去壳的软化的米粒沿种胚纵切，取其一半浸于已配好的药液中，放于暗处（最好用棕色发芽皿盛放），经24小时可观察结果，如果提高温度可以缩短处理时间（40℃1小时）。 4．观察结果：凡种胚的主要构造染成深红色者为有生活力的种子，凡种胚的主要构造染成浅红色或不染色者为无生活力的种子。 5．具体种子具体做法： 取水稻种子样品200粒，去壳，放纸间或水中30℃预湿12h，沿种子侧面胚纵切，放入0.1%四唑溶液35℃染色1-2h，凡是胚的主要构造染成正常鲜红色，或胚根尖端2/3不染色而其他部分正常染色的种子为有生活力种子。 （二）红墨水染色法： 1．从洁净玉米种子随机数取试样二，各100粒，于30℃温水中浸2-3小时。 2．配制红墨水溶液，用红墨水加水配成1：60的溶液。 3．取出软化过的种子，沿胚切成对半，取其半粒种子。 4．浸入红墨水溶液，15分钟后取出，用清水冲洗。 5．观察结果：凡种胚的主要构造不染色或染色浅者为有生活力的种子，凡种胚染色者为无生活力的种子。
四、结果表示与报告 计算各个重复中有生活力的种子数，重复间最大容许差距不得超过附表（生活力测定重复间的最大容许差距）的规定，平均百分率计算到最近似的整数。
百合花粉生活力测定
百合花粉生活力测定 孙永田 （齐齐哈尔大学生命科学与农林学院园艺101，齐齐哈尔 161006） 摘要百合，球根花卉近年来在我国市场需求越来越大，培育新的百合品种是我国花卉科研工作者的工作之重。通过染色观察发测定百合花粉生活力，本实验采用两种方法为碘-碘化 钾法和α-奈酚法。 关键词百合生活力测定染色观察法碘-碘化钾法α-奈酚法 引言我国球根花卉近年来生产面积不断扩大，特别是百合种球的用量不断增加，根据资料统计2004年国内种植百合的面积达2567hm2，生产切花4.7亿枝，但是每年生产中使用的种球一亿粒以上都是从荷兰进口的。我国是百合属植物自然分布的中心，原产于中国的约47种，野生百合种质资源丰富，有很多独特的特性。但是长期以来，我国百合的育种工作远远落后于荷兰、美国、日本等发达国家，充分利用我国丰富的野生百合资源和国外的优良品种资源，培育具有自主知识产权的百合新品种，打破垄断行为，加快百合产业的发展，是我国花卉科研工作者的当务之急。 当前育成的百合新品种中，大部分采用的是常规杂交育种方法，一部分为远缘杂交种。进行杂交工作之前，熟悉掌握花粉的生活力是育种工作的必要准备。从花粉生活力作为亲本选择的标准进行亲本筛选，提高杂交授粉成功率。 1 试验方法和试验方案 1.1试验方法 染色观察法 1.1.1碘-碘化钾法（I-KI） 碘-碘化钾溶液的配制：取2g碘化钾溶于5~10ML蒸馏水中，然后加入1g碘，待全部溶解后加入蒸馏水至300ML定容。取适量新鲜花粉置于载玻片上，加1滴蒸馏水，再加1~2滴碘-碘化钾溶液，盖上盖玻片，置于低倍显微镜下观察。凡花粉粒被染成蓝色的表示具有生活力，呈黄褐色为缺少生活力的花粉。 1.1.2α-奈酚法 A.配置药液：①将0.20g联苯胺溶于100ml的50%的乙醇中，盛入棕色瓶中，放暗处备用。 ②将0.15gα-奈酚溶于100ml的乙醇中，盛入棕色瓶中，放暗处备用。③将0.25克碳酸钠溶于100ml蒸馏水中，盛入白色瓶中备用。④将以上三种溶液等量混合，即成“甲液”，盛入棕色瓶中。⑤将3%过氧化氢，临用前用蒸馏水稀释成0.3%溶液，即成“乙液”，随配随用。 B.制片：取花粉少许，撒入凹型载玻片的凹点内，滴入“甲液”，片刻后再滴入“乙液”，三至五分钟后，在显微镜下观察不同的五个视野。凡有生活力的花粉为红色或玫瑰红色。黄色的（不着色的），为无生活力的花粉。 1.2实验方案 取同种百合花，不同生长程度的百合花花粉，分别用两种方法染色实验花粉生活力。取5 组花粉，每组花粉查看五个视野观察花粉生活力情况，每个视野读书用“，”隔开。A表示从开裂的百合花花药上采集的花粉，A取三组。B表示从即将开裂的百合花花药上采集的花粉，B取两组。
花粉生命力的测定与形态观察
实验三花粉生命力的测定与形态观察 花期不遇，给杂交工作造成困难，有的树木和园林植物可通过催延花期解决，有的则不得不进行花粉贮藏，为此我们必须掌握花粉贮藏的原理与技术。 为了避免杂交工作失误，在使用远地寄来的花粉或经过一段时间贮藏的花粉之前，必须对花粉生命力进行鉴定，以便对杂交成果进行分析与研究。 一、实验目的 掌握了解花粉贮藏及花粉生命力鉴定的方法及原理。 二、实验材料 芙蓉花的花粉。 三、仪器及药品 载玻片、盖玻片、标签、标记笔、显微镜、蔗糖、蒸馏水、联苯胺、 -萘酚、酒精、碳酸钠、过氧化氢、琼脂。 四、实验原理 在园艺植物有性杂交工作中，常因杂交亲本间花期不遇，或父本植株栽在异处(地)而必须预先收集花粉。花粉贮藏在低温(0～4℃)、干燥(相对湿度0～40％)、黑暗的环境下，代谢降低，可以较长时间地保持花粉生活力，但其贮藏期长短对花粉生活力的影响因品种而不同。在授粉之前，对贮藏的或外地采来的花粉必须预先测定花粉的生活力，以确定哪些花粉不能用于杂交，这对取得杂交效果有直接影响。 一是将待测花粉直接授粉，然后统计结实率和结子数。此法的缺点是需时间较长，且实验结果易受气候条件的影响； 二是将待测粉受到柱头上，隔一定时间切下柱头，在显微镜下检查花粉的萌发情况，根据萌发率的高低来鉴定花粉的生命力； 三是在培养基上进行花粉的人工萌发，检查待测花粉萌发率的高低。将花粉播种在特定的培养基上，并在一定的环境条件下来测定其发芽能力的方法。培养基常用蔗糖、琼脂(1％)和蒸馏水配制而成。不同植物的花粉，对蔗糖浓度要求不同，如柑桔花粉要求25％左右，苹果和梨10～15％，桃10％左右为宜。蔗糖浓度高低可调节培养基的渗透压，以防止花粉在培养基上破裂。培养基以微酸性为宜，一般在pH5.2～6之间。发芽温度在20～25℃左右，并需要空气和湿度，为了促进花粉发芽，在培养基中还可加入少量的硼酸和维生素B1。 利用花粉发芽试验测定花粉生活力是一种直接的测定方法，其结果也最可靠，但操作较麻烦，要有一定设备和一定时间。 四是用染色方法来鉴定花粉的生命力。其原理是在活的花粉内有过氧化氢酶
种子生活力的测定
种子生活力的测定 一、氯化三苯基四氮唑（TTC）法 【原理】 凡有生活力的种子胚部在呼吸作用过程中都有氧化还原反应，而无生活力的种胚则无此反应。当TTC溶液渗入种胚的活细胞内，并作为氢受体被脱氢辅酶（NADH或NADPH）还原时，可产生红色的三苯基甲（TTF），胚便染成红色。当种胚生活力下降时，呼吸作用明显减弱，脱氢酶的活性亦大大下降，胚的颜色变化不明显，故可由染色的程度推知种子的生活力强弱。TTC还原反应如下： TTC（无色）TTF（红色） 【仪器与用具】 培养皿2套；镊子１把；单面刀片１片；垫板（切种子用）１块；烧杯１个；棕色试剂瓶；解剖针１把；搪瓷盘１个；pH试纸。 【试剂】 TTC溶液的配制：取1g TTC溶于１L蒸馏水或冷开水中，配制成0.1％的TTC溶液。药液pＨ应在6.5～7.5，以pH试纸试之（如不易溶解，可先加少量酒精，使其溶解后再加水）。 【方法】 1.将玉米、小麦等作物的新种子、陈种子或死种子，用温水（30℃）浸泡2～6h，使种子充分吸胀。 2.随机取种子2份，每份50粒，沿种胚中央准确切开，取每粒种子的一半备用。 3.把切好的种子分别放在培养皿中，加TTC溶液，以浸没种子为度。 4.放入30～35℃的恒温箱内保温30min.也可在20℃左右的室温下放置40～60min. 5.保温后，倾出药液，用自来水冲洗2～3次，立即观察种胚着色情况，判断种子有无生活力，把判断结果记入表32-1内。 表32-1 染色法测定种子生活力记载表 方法种子名称供试粒数有生活力种 子粒数 无生活力 种子粒数 有生活力种子 占供式粒数的% 【注意事项】 1.TTC溶液最好现配现用，如需贮藏则应贮于棕色瓶中，放在阴凉黑暗处，如溶液变红则不可再用。 2.染色温度一般以25～35℃为宜。 3.判断有生活力的种子应具备：胚发育良好、完整、整个胚染成鲜红色；子叶有小部分坏死，其部位不是胚中轴和子叶连接处；胚根尖虽有小部分坏死，但其它部位完好。 4.判断无生活力的种子应具备：胚全部或大部分不染色；胚根不染色部分不限于根尖；
种子生活力的测定红墨水法教学设计
《林果生产技术》实验实训2“种子质量的简易测定”之五： 种子生活力的测定（红墨水法）教学设计 课题：种子生活力的测定（红墨水法）课型：专业技能实训课 班级：2014级现代农艺班时间：2015年10月9日 教学目标： 1、应知：种子生活力的概念，红墨水法测定生活力的原理、意义、步骤。 2、应会：掌握用红墨水染色法测定种子生活力的操作技能，熟悉种子质量鉴定技术过程。 3、能力培养：学会自主学习、合作学习、探究学习，培养动手能力、观察能力、合作意识和专业情感。 教学重点： 小麦种子生活力红墨水染色法测定的方法步骤。 教学难点： 1、切分种子。 2、有无生活力的判断。 教学方法：
1、紧抓生本课堂的五大元素“前置学习、合作学习、展示分享、质疑问难、教师点拨”，让学生自主学习，先做后学，先学后教。 2、恰当运用信息化教学手段。 课前任务布置： 提前一天晚自习分发学案和适量材料样品（每小组分发经浸泡后充分吸胀了的小麦种子50粒左右，单面刀片2片，镊子2把，放大镜1个），自学时间2课时。学案附后。 材料器具准备： 经浸种吸胀后的小麦种子（每小组600粒左右）、直尺、烧杯、9cm培养皿（每小组4套）、镊子（每人1把）、单面刀片（每人1片）、瓷盘、洗瓶、滤纸、5%红墨水。 导入： 种子质量的好坏，直接关系到农业的丰歉。种子的纯度、净度、发芽率、生活力、含水量等是种子分级、是否合格的重要指标。今天我们以小麦种子为例，通过实训操作一起来学习种子生活力的测定方法。同学们课前已经做了预习，在操作之前我们先来弄清楚几个问题，分小组回答： 问题一：种子生活力指的是什么？（一组回答） 答案：种子生活力是指种子潜在的发芽能力。