X'pert-XRD12-实验操作步骤)

X’pert PRO X射线衍射仪实验操作

固体表面物理化学国家重点实验室

2004.12

X’pert PRO X射线衍射仪实验操作

1.开启仪器

1)合上配电箱冷却水系统空气开关，将冷却水主机电源开关打到“ON”。

2)合上配电箱内仪器电源空气开关。

3)关好仪器门，将仪器上的高压锁开关顺时针向转动90o。

4)按下仪器面板上的“Power on”按钮启动仪器（高压显示15KV，5mA，顶灯亮）。

5)按下仪器面板上的“Light”按钮可以开启仪器内照明灯。

2.启动测试程序与登录

1)启动计算机，以xrd/xrd登录Windows。

2)双击桌面上“X'pert Data Collector” 图标，启动测试程序。

3）在登录框中填入用户名“xrd”，密码“xrd”，点“OK”。

3.联接仪器

选菜单“Instrument”中的“Connect”。

在弹出的窗口中选择相应的测试平台：

一般测试选择“flat sample stage”，选择后点“OK”，并对弹出的提示框点“OK”。

对如下提示点“Yes”。

联接成功，显示如下界面。

4.设置电压和电流

在软件左侧窗口的“Instruments Settings”选项卡中，双击“X-ray” 或其下的任意一项（行），在弹出的对话框的相应栏中[Tension（KV）和Current（mA）]，按规定顺序分步直接输入数据后点“Apply” 按钮。

设置顺序如下：

（1）先升电压：15KV --→ 20KV --→ 30KV --→ 40KV

（2）后升电流：5mA --→ 10mA --→ 20mA --→ 30mA

注意：每一步操作完毕，须等待5–10分钟后才能进行下一步操作！

5. 设置实验参数

选菜单“Files”中的“Open Program”（或工具栏第2个按钮）。

在弹出的窗口中选择相应的测试程序后点“OK”。

可以选择的测试程序如下：

(1) Phase_XRK-p 高温分析测试程序（须更换高温原位反应室）

(2) PW_small_angle 低角度衍射分析测试程序(2 不得小于0.4o)

(3) X’celerator_grazing_angle膜、薄层等的分析测试程序(2θ不得小于3o)

(4) X’celerator_normal一般定性分析测试程序(2θ不得小于3o)

(1)一般定性分析测试程序：X’celerator_normal(2θ不得小于3o)

在菜单“Open Program”——选择程序后点“OK”，在如下页面中可以设置实验参数（直接输入数据）：

可以设置的实验参数有：

每个参数输入数据后，应点一下其它栏或按TAB键。

?注意：未经许可不得修改上述参数之外的其它参数！！！

小数点用“，”（逗号）输入。

实验时间计算：

使用超能探测器(X'celerator)时,每样品测试时间计算公式:

[(结束角-起始角)÷步长(o/步)]×每步测试时间(s/步)÷120÷60 (分)

设置完毕，关闭设置窗口（右上角的“），选“Yes”保存。(或选“Files”菜单中的“Save”，或工具栏第3个按钮）

(2)膜、薄层等的分析测试程序：X’celerator_grazing_angle(2 不得小于3o)

在“Open Program”——选择程序后点“OK”，在如下页面中可以设置实验参数（直接输入数据）：

除(1)中的参数外，还可以设置“Omega”角度，为X射线入射角。

实验时间计算：与“一般性分析测试程序：X’celerator_normal”相同。

(3) 低角度衍射分析测试程序：PW_small_angle (2 不得小于0.4o)

在“Open Program”——选择程序后点“OK”，在如下页面中可以设置实验参数（直接输入数据）：

允许设置的实验参数与“一般性分析测试程序：X’celerator_normal”相同。

实验前应更换平行光探测器。

实验时间计算：

使用平行光探测器时,每样品测试时间计算公式:

[(结束角-起始角)÷步长(o/步)]×每步测试时间(s/步)÷60 (分)

6. 开始测试

1)放置被测样品: 有效测试区域为距样品台垂直面5 –12 mm范围内。同时保证试样表面落

在测角仪轴心上(即保证试样表面与测角仪试样架下表面处于同一水平面上) 。

2)关好仪器门: 可听到门开关的嘀嗒声，门关好的标志为仪器面板上“Shutter Open”下三个

小亮点熄灭。

3)选“Measure”菜单中“Program”。

在弹出的窗口中选择设置实验参数时选择的程序后点“OK”。

4)在下一个弹出窗口中，点目录按钮（图形按钮）建立或选择自己的目录，并设置（保存在

磁盘上的）文件名后，点“Save”。

5)可以在“Sample ID”栏中填写样品名。

样品数较多时，可以采用如下两种方式之一来简化操作：

(a) “复制—粘贴”文件夹路径

设置第一个样品的目录、文件名并回到上图对话框后，可以复制“Folder”栏文件夹路径。

在设置下一个样品时，直接将复制的内容粘贴到上图的“Folder”栏后，点右侧

的目录按钮就直接位于自己的目录下。

(b) 设置自己的缺省目录

在测试前进入菜单“Customize”→“Measurement Type & Data Folder”

选“Single Scan”选项卡→“Absolute scan default folder”栏中输入自己的目录名或按目录按钮选择→“OK”。(缺省目录为 D:\Common)

实验完毕请恢复原设置。

6)点“OK”开始测试

（若测试前更换过测试程序或探测器，此时还会弹出提示，点“OK”即可）。

可以听到仪器门加锁的声音；

仪器内两动臂开始动作；

仪器面板上“Shutter Open”下显示“1”；

仪器内左侧动臂X光管管座上黄灯亮；

仪器面板上2θ、θ数值随测试的进行而变化。

?测试完成

仪器面板上“Shutter Open”下显示的“1”熄灭；

仪器内左侧动臂X光管管座上黄灯熄灭；

可以听到仪器门开锁的声音；

仪器内两动臂下落至起始位置；

仪器面板上2θ、θ数值回到12.000和6.000。

这时，可以打开仪器门取出被测样品，或更换样品重复“开始测试”的步骤进行下一个测试。

?中止测试

测试过程中如需中止，可以点工具栏的“STOP”按钮。并对弹出的提示点“OK”

7.待机设置

1）每日实验完毕，应将仪器设置在待机状态。

A. 降低仪器的工作电流和电压

a)在软件左侧窗口的“Instruments Settings”选项卡中，双击“X-ray”或其下的任意一项

（行）；

b)按如下步骤，分别在弹出的对话框的“Tension（KV）”和“Current（mA）”栏中，

直接输入数据后点“Apply”按钮（最后一步点“OK”）。

先降电流： 30mA --→ 20mA--→ 10mA --→5mA

后降电压： 40KV --→ 30KV

B. 关闭仪器内照明灯

按仪器面板（倾斜的）左侧上部第3个按钮，关闭“Light”灯。

2）每周末停止试验时间较长时，应将仪器设置在更低一级的待机状态。

A. 降低仪器的工作电流和电压

a)在软件左侧窗口的“Instruments Settings”选项卡中，双击“X-ray”或其下的任意一项

（行）；

b)按如下步骤，分别在弹出的对话框的“Tension（KV）”和“Current（mA）”栏中，

直接输入数据后点“Apply”按钮（最后一步点“OK”）。

先降电流： 30mA --→ 20mA--→ 10mA --→5mA

后降电压： 40KV --→ 30KV --→ 20KV --→ 15KV

B. 关闭仪器内照明灯

按仪器面板（倾斜的）左侧上部第3个按钮，关闭“Light”灯。

8.关闭仪器

仪器较长时间不使用时，应关闭仪器。

1)按“待机设置”步骤将仪器的电流、电压分别降至5mA、15KV，并关闭“Light”照明灯。

2)将仪器面板上的高压锁开关按逆时针向转动90o，关闭仪器高压。

3)等待30秒，按“Stand by”按钮关闭仪器。

4)关冷却循环水系统（在关闭高压锁开关后2分钟内必须关闭冷却水）。

5)关配电箱内空气开关。

X射线衍射分析的实验方法及其应用,

自1896年X射线被发现以来，可利用X射线分辨的物质系统越来越复杂。从简单物质系统到复杂的生物大分子，X射线已经为我们提供了很多关于物质静态结构的信息。此外，在各种丈量方法中，X射线衍射方法具有不损伤样品、无污染、快捷、丈量精度高、能得到有关晶体完整性的大量信息等优点。由于晶体存在的普遍性和晶体的特殊性能及其在计算机、航空航天、能源、生物工程等产业领域的广泛应用，人们对晶体的研究日益深进，使得X射线衍射分析成为研究晶体最方便、最重要的手段。本文主要先容X射线衍射的原理和应用。

1、X射线衍射原理

1912年劳埃等人根据理论预见，并用实验证实了X射线与晶体相遇时能发生衍射现象，证实了X射线具有电磁波的性质，成为X射线衍射学的第一个里程碑。当一束单色X射线进射到晶体时，由于晶体是由原子规则排列成的晶胞组成，这些规则排列的原子间间隔与进射X射线波长有相同数目级，故由不同原子散射的X射线相互干涉，在某些特殊方向上产生强X射线衍射，衍射线在空间分布的方位和强度，与晶体结构密切相关。这就是X射线衍射的基本原理。

衍射线空间方位与晶体结构的关系可用布拉格方程表示：

1.1 运动学衍射理论

Darwin的理论称为X射线衍射运动学理论。该理论把衍射现象作为三维Frannhofer衍射题目来处理，以为晶体的每个体积元的散射与其它体积元的散射无关，而且散射线通过晶体时不会再被散射。固然这样处理可以得出足够精确的衍射方向，也能得出衍射强度，但运动学理论的根本性假设并不完全公道。由于散射线在晶体内一定会被再次散射，除了与原射线相结合外，散射线之间也能相互结合。Darwin不久以后就熟悉到这点，并在他的理论中作出了多重散射修正。

1.2 动力学衍射理论

Ewald的理论称为动力学理论。该理论考虑到了晶体内所有波的相互作用，以为进射线与衍射线在晶体内相干地结合，而且能往返地交换能量。两种理论对细小的晶体粉末得到的强度公式相同，而对大块完整的晶体，则必须采用动力学理论才能得出正确的结果。动力学理论在参考文献里有具体先容。

2 X射线衍射方法：

研究晶体材料，X射线衍射方法非常理想非常有效，而对于液体和非晶态物固体，这种方法也能提供很多基本的重要数据。所以X射线衍射法被以为是研究固体最有效的工具。在各种衍射实验方法中，基本方法有单晶法、多晶法和双晶法。

2.1 单晶衍射法

单晶X射线衍射分析的基本方法为劳埃法与周转晶体法。

2.1.1 劳埃法

劳埃法以光源发出连续X射线照射置于样品台上静止的单晶体样品，用平板底片记录产生的衍射线。根据底片位置的不同，劳埃法可以分为透射劳埃法和背射劳埃法。背射劳埃法不受样品厚度和吸收的限制，是常用的方法。劳埃法的衍射花样由若干劳埃斑组成，每一个劳埃斑相应于晶面的1～n级反射，各劳埃斑的分布构成一条晶带曲线。

2.1.2 周转晶体法

周转晶体法以单色X射线照射转动的单晶样品，用以样品转动轴为轴线的圆柱形底片记录产生的衍射线，在底片上形成分立的衍射斑。这样的衍射花样轻易正确测定晶体的衍射方向和衍射强度，适用于未知晶体的结构分析。周转晶体法很轻易分析对称性较低的晶体（如正交、单斜、三斜等晶系晶体）结构，但应用较少。

2.2 多晶衍射法

多晶X射线衍射方法包括照相法与衍射仪法。

2.2.1 照相法

照相法以光源发出的特征X射线照射多晶样品，并用底片记录衍射花样。根据样品与底片的相对位置，照相法可以分为德拜法、聚焦法和针孔法，其中德拜法应用最为普遍。

德拜法以一束准直的特征X射线照射到小块粉末样品上，用卷成圆柱状并与样品同轴安装的窄条底片记录衍射信息，获得的衍射花样是一些衍射弧。此方法的优点为：⑴所用试样量少（0.1毫克即可）；⑵包含了试样产生的全部反射线；⑶装置和技术比较简单。

聚焦法的底片与样品处于同一圆周上，以具有较大发散度的单色X射线照射样品上较大区域。由于同一圆周上的同弧圆周角相等，使得多晶样品中的等同晶面的衍射线在底片上聚焦成一点或一条线。聚焦法曝光时间短，分辨率是德拜法的两倍，但在小θ范围衍射线条较少且宽，不适于分析未知样品。

针孔法用三个针孔准直的单色X射线为光源，照射到平板样品上。根据底片不同的位置针孔法又分为穿透针孔法和背射针孔法。针孔法得到的衍射花样是衍射线的整个圆环，适于研究晶粒大小、晶体完整性、宏观残余应力及多晶试样中的择优取向等。但这种方法只能记录很少的几个衍射环，不适于其它应用。

2.2.2 衍射仪法

X射线衍射仪以布拉格实验装置为原型，融合了机械与电子技术等多方面的成果。衍射仪由X 射线发生器、X射线测角仪、辐射探测器和辐射探测电路4个基本部分组成，是以特征X射线照射多晶体样品，并以辐射探测器记录衍射信息的衍射实验装置。现代X射线衍射仪还配有控制操纵和运行软件的计算机系统。

X射线衍射仪的成像原理与聚集法相同，但记录方式及相应获得的衍射花样不同。衍射仪采用具有一定发散度的进射线，也用“同一圆周上的同弧圆周角相等”的原理聚焦，不同的是其聚焦圆半径随2θ的变化而变化。

衍射仪法以其方便、快捷、正确和可以自动进行数据处理等特点在很多领域中取代了照相法，现在已成为晶体结构分析等工作的主要方法。

2.3 双晶衍射法

双晶衍射仪用一束Ｘ射线（通常用Ka1作为射线源）照射一个参考晶体的表面，使符合布拉格条件的某一波长的Ｘ射线在很小角度范围内被反射，这样便得到接近单色并受到偏振化的窄反射线，再用适当的光阑作为限制，就得到近乎准值的Ｘ射线束。把此Ｘ射线作为第二晶体的进射线，第二晶体和计数管在衍射位置四周分别以Δθ及Δ(2θ)角度摆动，就形成通常的双晶衍射仪。

在近完整晶体中，缺陷、畸变等体现在Ｘ射线谱中只有几十弧秒，而半导体材料进行外延生长

要求晶格失配要达到10-4或更小。这样精细的要求使双晶Ｘ射线衍射技术成为近代光电子材料及器件研制的必备丈量仪器，以双晶衍射技术为基础而发展起来的四晶及五晶衍射技术（亦称为双晶衍射），已成为近代Ｘ射线衍射技术取得突出成就的标志。但双晶衍射仪的第二晶体最好与第一晶体是同种晶体，否则会发生色散。所以在丈量时，双晶衍射仪的参考晶体要与被测晶体相同，这个要求使双晶衍射仪的使用受到限制。

3 X射线衍射分析的应用

3.1 物相分析

晶体的Ｘ射线衍射图像实质上是晶体微观结构的一种精细复杂的变换，每种晶体的结构与其Ｘ射线衍射图之间都有着逐一对应的关系，其特征X射线衍射图谱不会由于它种物质混聚在一起而产生变化，这就是Ｘ射线衍射物相分析方法的依据。制备各种标准单相物质的衍射花样并使之规范化，将待分析物质的衍射花样与之对照，从而确定物质的组成相，就成为物相定性分析的基本方法。鉴定出各个相后，根据各相花样的强度正比于改组分存在的量（需要做吸收校正者除外），就可对各种组分进行定量分析。目前常用衍射仪法得到衍射图谱，用“粉末衍射标准联合会（JCPDS）”负责编辑出版的“粉末衍射卡片（PDF卡片）”进行物相分析。

目前，物相分析存在的题目主要有：⑴待测物图样中的最强线条可能并非某单一相的最强线，而是两个或两个以上相的某些次强或三强线叠加的结果。这时若以该线作为某相的最强线将找不到任何对应的卡片。⑵在众多卡片中找出满足条件的卡片，十分复杂而繁锁。固然可以利用计算机辅助检索，但仍难以令人满足。⑶定量分析过程中，配制试样、绘制定标曲线或者Ｋ值测定及计算，都是复杂而艰巨的工作。为此，有人提出了可能的解决办法，以为从相反的角度出发，根据标准数据（PDF卡片）利用计算机对定性分析的初步结果进行多相拟合显示，绘出衍射角与衍射强度的模拟衍射曲线。通过调整每一物相所占的比例，与衍射仪扫描所得的衍射图谱相比较，就可以更正确地得到定性和定量分析的结果，从而免往了一些定性分析和整个定量分析的实验和计算过程。

3.2 点阵常数的精确测定

点阵常数是晶体物质的基本结构参数，测定点阵常数在研究固态相变、确定固溶体类型、测定固溶体溶解度曲线、测定热膨胀系数等方面都得到了应用。点阵常数的测定是通过X射线衍射线的位置（θ）的测定而获得的，通过测定衍射花样中每一条衍射线的位置均可得出一个点阵常数值。

点阵常数测定中的精确度涉及两个独立的题目，即波长的精度和布拉格角的丈量精度。波长的题目主要是X射线谱学家的责任，衍射工作者的任务是要在波长分布与衍射线分布之间建立逐一对应的关系。知道每根反射线的密勒指数后就可以根据不同的晶系用相应的公式计算点阵常数。晶面间距丈量的精度随θ角的增加而增加，θ越大得到的点阵常数值越精确，因而点阵常数测定时应选用高角度衍射线。误差一般采用图解外推法和最小二乘法来消除，点阵常数测定的精确度极限处在1×10-5四周。

3.3 应力的测定

X射线测定应力以衍射花样特征的变化作为应变的量度。宏观应力均匀分布在物体中较大范围内，产生的均匀应变表现为该范围内方向相同的各晶粒中同名晶面间距变化相同，导致衍射线向某方向位移，这就是X射线丈量宏观应力的基础；微观应力在各晶粒间甚至一个晶粒内各部分间彼此不同，产生的不均匀应变表现为某些区域晶面间距增加、某些区域晶面间距减少，结果使衍射线向不同方向位移，使其衍射线漫散宽化，这是X射线丈量微观应力的基础。超微观应力在应变区内使原子偏离平衡位置，导致衍射线强度减弱，故可以通过X射线强度的变化测定超微观应力。测定应力一般用衍射仪法。

X射线测定应力具有非破坏性，可测小范围局部应力，可测表层应力，可区别应力类型、丈量时无需使材料处于无应力状态等优点，但其丈量精确度受组织结构的影响较大，X射线也难以测定动态瞬时应力。

3.4 晶粒尺寸和点阵畸变的测定

若多晶材料的晶粒无畸变、足够大，理论上其粉末衍射花样的谱线应特别锋利，但在实际实验中，这种谱线无法看到。这是由于仪器因素和物理因素等的综合影响，使纯衍射谱线增宽了。纯谱线的外形和宽度由试样的均匀晶粒尺寸、尺寸分布以及晶体点阵中的主要缺陷决定，故对线形作适

当分析，原则上可以得到上述影响因素的性质和标准等方面的信息。

在晶粒尺寸和点阵畸变测定过程中，需要做的工作有两个：⑴从实验线形中得出纯衍射线形，最普遍的方法是傅里叶变换法和重复连续卷积法。⑵从衍射花样适当的谱线中得出晶粒尺寸和缺陷的信息。这个步骤主要是找出各种使谱线变宽的因素，并且分离这些因素对宽度的影响，从而计算出所需要的结果。主要方法有傅里叶法、线形方差法和积分宽度法。

3.5 单晶取向和多晶织构测定

单晶取向的测定就是找出晶体样品中晶体学取向与样品外坐标系的位向关系。固然可以用光学方法等物理方法确定单晶取向，但X衍射法不仅可以精确地单晶定向，同时还能得到晶体内部微观结构的信息。一般用劳埃法单晶定向，其根据是底片上劳埃斑点转换的极射赤面投影与样品外坐标轴的极射赤面投影之间的位置关系。透射劳埃法只适用于厚度小且吸收系数小的样品；背射劳埃法就无需特别制备样品，样品厚度大小等也不受限制，因而多用此方法。

多晶材料中晶粒取向沿一定方位偏聚的现象称为织构，常见的织构有丝织构和板织构两种类型。为反映织构的概貌和确定织构指数，有三种方法描述织构：极图、反极图和三维取向函数，这三种方法适用于不同的情况。对于丝织构，要知道其极图形式，只要求出求其丝轴指数即可，照相法和衍射仪法是可用的方法。板织构的极点分布比较复杂，需要两个指数来表示，且多用衍射仪进行测定。

4 展看

随着X射线衍射技术越来越先进，X射线衍射法的用途也越来越广泛，除了在无机晶体材料中的应用，已经在有机材料、钢铁冶金、以及纳米材料的研究领域中发挥出巨大作用，并且还应用于瞬间动态过程的丈量。计算机的普遍使用让各种丈量仪器的功能变得强大，测试过程变得简单快捷，双晶衍射、多重衍射也越来越完善。但是，随之而来的软件也缺陷越来越明显，在各种分析过程中，软件分析检索的正确度都不尽人意。

纵观整个X射线衍射领域，可以看出仪器设备的精密化和多用途化是一个发展趋势，然而各种设备运行的软件明显落后于设备的发展，所以今后迫切的需要是软件系统的更新和完善。

微生物实验操作

油镜的使用和维护 目的：掌握油镜的使用与维护，熟悉油镜的使用原理。材料：显微镜，拭镜纸，液体石蜡油，二甲苯 原理：油镜的透镜极小，工作焦距最短，光线通过玻璃和空气，由于介质密度不同发生折射，射入镜筒的光线极少，视野暗，物象不清晰。如在玻片与镜头（透镜）之间加上折光率和玻片（n=1.52）相近的香柏油（n=1.515）就可减少光线的折射，加强视野的亮度，获得清晰的物象。 步骤：显微镜油镜的使用和维护 1.将显微镜平稳地安放在实验台适宜处。识别油镜头：标有100×、OIL、HI等字样。 2. 打开电源，用低倍镜对光，打开光圈，调节聚光镜的位置，使视野光线充足。 3. 标本上加镜油一滴，转动粗螺旋，使油镜头缓缓下降，用眼从侧面观察，直到油镜头浸入油中接近玻片为止。 4. 从目镜观察，同时徐徐转动粗螺旋提升，见模糊物象后再用细螺旋调节，直到见到清晰物象为止。 5. 观察完毕，粗螺旋提高镜头，取下标本片，油镜头使用后立即用擦镜纸擦净镜头上的油。如油已干，可在擦镜纸上滴少许二甲苯擦拭，并立即用另一擦镜纸

擦去二甲苯，因二甲苯能溶解镜头上的固定胶以致使镜头脱落。 6.将镜头转呈“八”字，调低聚光器，对号送入柜子内存放。 革兰染色 目的：掌握革兰染色的原理及操作。 材料：干净玻片，接种环，葡萄球菌和大肠杆菌18-24h 培养后的混合菌液，酒精灯，一套革兰染液 原理：主要为细胞壁结构的差异。G+三维肽聚糖结构的交联度大，通透性低，脂质少或无，酒精作用使孔径缩小；而G-肽聚糖为二维疏松结构，薄，外膜含大量脂质，易被酒精溶解，使细胞壁通透性增高，结晶紫-碘复合物被酒精溶解而脱色。 步骤： 1. 细菌标本的制作 （1）涂片：无菌操作。取一接种环混合细菌悬液，涂布成直径约1cm的涂片，涂片应薄而均匀。 （2）干燥：涂片最好在室温中自然干燥。必要时可将标本面向上，放在酒精灯上方微火处干燥。 （3）固定：标本面向上，在酒精灯火焰外焰按钟摆的速度来回通过3次，放置待冷后染色。固定的目的是

DNA实验技术：原位杂交实验要求及步骤

原位杂交组织（或细胞）化学（In situ Hybridization Histochemistry，ISHH）简称原位杂交（In Situ Hybridization），属于固相分子杂交的范畴，它是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA 杂交三类。 根据探针的标记物是否直接被检测，原位杂交又可分为直接法和间接法两类。直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交，杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。间接法一般用半抗原标记探针，最后通过免疫组织化学法对半抗原定位，间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。 原位杂交最初是以同位素标记探针进行的。尽管同位素标记（如35S，3H，32P等）仍然广泛使用，但非同位素标记探针的迅速发展（尤其是生物素标记探针和地高辛标记探针），更引起科技工作者的极大兴趣。 一、基本要求 1. 组织取材：组织取材应尽可能新鲜。由于组织RNA降解较快，所以新鲜组织和培养细胞最好在30 min 内固定。 2. 固定目的是： （1）保持细胞结构； （2）最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平； （3）使探针易于进入细胞或组织。 最常用的固定剂是多聚甲醛，与其它醛类固定剂（如戊二醛）不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。 3. 增强组织的通透性和核酸探针的穿透性： （1）稀酸处理和酸酐处理：为防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合，以降低背景，杂交前标本可用0.25%乙酸酐处理10 min，经乙酸酐处理后，组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断。组织和细胞标本亦可用0.2 M HCl处理10 min，稀酸能使碱性蛋白变性，结合蛋白酶消化，容易将碱性蛋白移除。 （2）去污剂处理：去污剂处理的目的是增加组织的通透性，利于杂交探针进入组织细胞，最常应用的去污剂是Triton X-100。注意：过度的去污剂处理不仅影响组织的形态结构，而且还会引起靶核酸的丢失。

分子生物学实验室常用仪器及使用方法

实验指导 目录 实验一分子生物学实验室常用仪器及使用方法实验二质粒DNA的提取－碱裂解法 实验三琼脂糖凝胶电泳 实验四限制性内切核酸酶的酶切与鉴定 实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 实验六动物组织细胞基因组 DNA提取 实验七 DNA的定量 实验八 PCR基因扩增 实验九琼脂糖凝胶电泳分离与纯化目的DNA 实验十 DNA重组 实验十一动物组织细胞总RNA的提取 实验一分子生物学实验室常用仪器及使用

事实证明，在科学飞速发展的今天，无论从事哪个领域的研究，要想突破，除了有良好的理论基础外，更重要的是依赖于先进的技术和优良的仪器设备以及良好的研究环境。一个标准的分子生物学实验室除了具有一般生物学实验室的常规仪器设备外，还具有一些特殊用途的仪器，这些仪器一般较精密，价格昂贵。下面介绍这些仪器的使用方法和注意事项。 一、冷冻离心机 低温分离技术是分子生物学研究中必不可少的手段。基因片段的分离、酶蛋白的沉淀和回收以及其它生物样品的分离制备实验中都离不开低温离心技术，因此低温冷冻离心机成为分子生物学研究中必备的重要仪器。在国内，有多个厂家生产冷冻离心机，本实验室的高速冷冻离心机为GL-20G-Ⅱ型（上海安亭），落地式。配有角式转头：6×50ml、12×10ml和12×1.5ml。极限转速20000rpm。 1. 安装与调试 离心机应放置在水平坚固的地面上，应至少距离10cm以上且具有良好的通风环境中，周围空气应呈中性，且无导电性灰尘、易燃气体和腐蚀性气体，环境温度应在0～30℃之间，相对湿度小于80%。试转前应先打开盖门，用手盘动转轴，轻巧灵活，无异常现象方可上所用的转头。转子准确到位后打开电源开关，然后用手按住门开关，再按运转键，转动后立即停止，并观察转轴的转向，若逆时针旋转即为正确，机器可投入使用。 2. 操作程序 （1）插上电源，待机指示灯亮；打开电源开关，调速与定时系统的数码管显示的闪烁数字为机器工作转速的出厂设定，温控系统的数码管显示此时离心腔的温度。 （2）设定机器的工作参数，如工作温度，运转时间，工作转速等。 （3）将预先平衡好的样品放置于转头样品架上，关闭机盖。 （4）按控制面板的运转键，离心机开始运转。在预先设定的加速时间内，其运速升至预先设定的值。 （5）在预先设定的运转时间内（不包括减速时间），离心机开始减速，其转速在预先设定的减速时间内降至零。 （6）按控制面板上的停止键，数码管显示dedT，数秒钟后即显示闪烁的转速值，这时机器已准备好下一次工作。 3. 注意事项 （1）离心机应始终处于水平位置，外接电源系统的电压要匹配，并要求有良好的接地线，机器不使用，要拔掉电源插头。

原位杂交原理及具体操作

原位杂交原理及具体操作

原位杂交实验原理与方法 一、目的 本实验的目的是学会原位杂交的使用方法。了解各种原位杂交的基本原理和优缺点。 二、原理 原位杂交组化（简称原位杂交，in situ hybridization histochemistry；ISHH）属于分子杂交的一种，是一种应用标记探针与组织细胞中的待测核酸杂交，再应用标记物相关的检测系统，在核酸原有的位置将其显示出来的一种检测技术。原位杂交的本质就是在一定的温度和离子浓度下，使具有特异序列的单链探针通过碱基互补规则与组织细胞内待测的核酸复性结合而使得组织细胞中的特异性核酸得到定位，并通过探针上所标记的检测系统将其在核酸的原有位置上显示出来。 当然杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。 探针的种类按所带标记物可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。目前，大多数放

射性标记法是通过酶促反应将标记的基因掺入DNA中，常用的同位素标记物有3H、35S、125I 和32P。同位素标记物虽然有灵敏性高，背底较为清晰等优点，但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害，近来有被非同位素取代的趋势。非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。 探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。cDNA 探针又可分为双链cDNA探针和单链cDNA探针。原位杂交又可分为菌落原位杂交和组织原位杂交。 菌落原位杂交（Colony in situ hybridization）菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸 纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。将NDA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。 组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）组织原位杂交简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落的原位杂交不同。菌落原位杂交需裂解细菌释出DNA，然后进行杂交。而原位

微生物实验操作步骤

微生物试验操作步骤 1.前期准备工作（红色字体需要购买） 10ml离心管（80管）、培养皿（预实验36板，正式试验648板，共计684板）、EP管（预实验36管，正式试验108管，144管）、枪头（5ml、1ml、200ul）、生理盐水现配现用（0.85）2.，灭菌处理 将离心管、枪头、生理盐水、培养基放入高压灭菌锅中灭菌处理后待用。 3.制备不同梯度的样品溶液 预实验 a.梯度稀释试验前一天晚上取置于-80℃盲肠食糜样品于4℃冰箱融化，将需要用到的离心管和EP管分别编号待用。试验期间取盲肠食糜0.5~1g于灭菌后的10ml离心管中，按1：10比例加入生理盐水，制成10-1浓度的样品溶液。然后取0.5ml10-1浓度的样品溶液于下一离心管，按1：10比例加入生理盐水，制成10-2浓度的样品溶液。然后然后取0.1ml10-2浓度的样品溶液于EP管中，按1：1010-3比例加入生理盐水，制成10-3浓度的样品溶液。然后依次如上分别配制10-4、10-5、10-6、10-7、10-8样品溶液。每一次取样前离心管和EP管都要在微型振荡器上震荡混匀。 b.接种和培养：按照平板涂布法进行。分别取各稀释管溶液100μl接种到选择性培养基，大肠杆菌选择性培养基置普通培养箱，37℃培养24h。乳酸菌选择性培养基置5%CO2培养箱，37℃培养48h。双歧杆菌选择性培养基置厌氧发酵罐内，37℃培养48h。沙门氏菌选择性培养基置普通培养箱，37℃培养24h。 c. 微生物计数与鉴定：采用常规微生物平板菌落计数法，选择长有30-300个菌落的平板较为合适，用每克肠道内容物中细菌个数的对数表示( 1gCFU /g) 正式试验 按照预实验操作步骤及适宜梯度进行试验。 4.培养基 总需氧菌营养琼脂（NA）34567 乳酸菌MRS琼脂碱性厌氧234567 双歧杆菌BL琼脂厌氧234567产气袋 大肠杆菌麦康凯需氧234567 沙门氏菌XLD 需氧2345

微生物检验操作步骤

微生物检验操作步骤 Company Document number：WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998

样品制备： 取样品 10 g/ml加入至 90 ml灭菌生理盐水中，混匀，制成 1 ︰ 10 的稀释液； 菌落总数：（结果报告：XXX cfu /g(ml)） 取上述 1 ︰ 10 的稀释液 1 ml加入至 9 ml灭菌生理盐水中，充分混匀， 制成 1 ︰100 的稀释液； 取上述两个稀释级的稀释液分别加入2块平皿中，每块平皿中加 20 ml，然后往平皿中倒入约45℃的卵磷脂吐温80琼脂培养基，待培养基凝固，倒置放于36+/-1 ℃培养箱中培养 48 h，点计菌落数。 霉菌和酵母菌： 操作同菌落总数，加入的培养基为虎红培养基，待培养基凝固，倒置放于℃培养箱中培养 72 h，分别点计霉菌和酵母菌数。 粪大肠菌群：（结果报告（未）检出/ ） 取上述 1 ︰ 10 的稀释液 10 ml加入至 10 ml 双倍乳糖胆盐培养基中，摇匀，置 44 ℃培养箱中培养 48 h； 如果培养物产酸产气（现象为培养基呈黄色，小倒管内有气泡），则应取培养物分别接种至伊红美蓝琼脂平板于 37 ℃培养 18-24 h和蛋白胨水培养基中于 44 ℃培养 24 h。 在上述平板上，粪大肠菌群呈深紫黑色、圆形突起的菌落，并有金属 光泽。 挑取分离的单个菌落，进行革兰氏染色和镜检，在显微镜下应观察到 红色短杆状的菌。挑取菌落时，应使灭菌的接种环冷却后再行操作。

上述蛋白胨水培养基的培养物还需做靛基质试验，阳性现象为培养物表层出现玫瑰红色。 铜绿假单胞菌：（结果报告（未）检出/ ） 取上述 1 ︰ 10 的稀释液 10 ml加入至 90 ml SCDLP 培养基中，摇匀，置 37 ℃培养箱中培养 18-24 h； 挑取上述培养物，接种至十六烷基三甲基溴化铵琼脂平板于 37 ℃培养 18-24 h；在该平板上，铜绿假单胞菌应为灰白色色、圆形湿润的菌落，周围培养基溶有水溶性色的色素； 挑取分离的单个菌落，染色镜检，在显微镜下应观察到红色杆状的菌。 如果平板上只分离到1个可疑菌落，不够做生化试验，则应挑取该菌落于SCDLP增菌培养。 取分离的菌落分别做氧化酶试验、绿脓菌素试验、硝酸盐还原产气试验、明胶液化试验和 42℃生长试验。 金黄色葡萄球菌： 增菌培养同铜绿假单胞菌项下， 挑取上述增菌液的培养物，接种至 B-P 平板于 37 ℃培养 24-48 h；在该平板上，金黄色葡萄球菌应为灰黑色、圆形的菌落，菌落周围有混浊带和透明环 挑取分离的单个菌落，染色镜检，在显微镜下应观察到紫色球状的菌。 取分离的菌落分别接种至甘露醇发酵培养基和肉汤培养基中，于 37 ℃培养24 h；取上述肉汤培养物，做血浆凝固酶试验。

生物实验操作步骤

生物实验操作步骤 一、安装显微镜和对光： A 、操作步骤： 1.一手握住镜臂，一手托住镜座，把显微镜轻轻地放在实验台上，镜臂靠近身体略偏左，镜座距实验台边缘约5厘米。安装好目镜和物镜。 2.转动转换器，使低倍物镜对准通光孔。转动遮光器，使最大的光圈对准通光孔。 3、左眼注视目镜内，同时双手转动反光镜（光强用使用平面镜、光弱使用凹面镜），使光线反射到镜筒里，直到整个视野呈雪白色为止。 4.整理复位：把显微镜的外表擦拭干净。取下镜头放入镜盒内，并将镜筒缓缓下降到最低处。最后把显微镜放进镜箱里，放回原处。 B 、去年考卷： C 、评分标准： （1）安装好物镜和目镜（1分） （2）能将显微镜对好光观察（2分） 记录：雪白色或亮白色（1分） （3）整理器材（1分） 二、制作并观察洋葱鳞片叶临时玻片标本： A 、操作步骤： 1、用干净的纱布把载玻片和盖玻片擦干净。 2、用滴管在载玻片中央滴一滴清水。 3、用刀片在洋葱内表面划一个“井”字，用镊子撕下表皮，然后把它放在载玻片中央的水滴中，用解剖针轻轻地将其展平； 4、用镊子夹起盖玻片，使其一边接触载玻片上面的液滴，然后缓缓地盖在液滴上，盖片时要防止装片上出现气泡； 5、在载玻片的一侧滴一滴碘液，在另一侧用吸水纸吸引，重复几次，使染液浸润到整个标本； 6、安装显微镜和对光； 7、将制作的装片安放在显微镜的载物台上，然后将镜筒缓缓下降直到物镜接近玻片； 8、用左眼注视目镜，调节粗准焦螺旋使镜筒缓缓上升，直到在视野中看到细胞图像，然后旋转细准焦螺旋，使物像更清晰； 9、移动装片，在视野中找到一个完整的细胞进行仔细观察； 10、整理复位：取下玻片标本，平移方式（防止折断盖玻片）取下盖玻片并连同载玻片一起放回原处。取下镜头放入镜盒内，将镜筒下降到最低处，然后把显微镜放进镜箱里。把其他废弃物放入垃圾桶并把实验桌抹干净。 B 、去年考卷： C 、评分标准： （1）用纱布将载玻片、盖玻片擦拭干净（1分） （2）在载玻片中央滴一滴清水（1分） （3）用刀片切取一块洋葱鳞片叶，用镊子撕取鳞片叶的内表皮置于载玻片上清水中并用解剖针将表皮展平，盖上盖玻片（1分） （4）将一滴碘液滴在盖玻片的一侧，用吸水纸从对侧引流使碘液扩散到整个标本（1分） （5）将制作好的临时装片放在显微镜下观察（1分） 记录：气泡（1分） 细胞核（1分） 细准焦螺旋（1分） 左上方（1分） （6）整理器材（1分） 三、制作并观察口腔上皮细胞临时玻片标本： A 、操作步骤： 1、用干净的纱布把载玻片和盖玻片擦干净； 2、用滴管在载玻片中央滴一滴生理盐水； 3、用清水漱口，清除口腔中食物碎屑，用消毒牙签粗的一端在口腔侧壁上轻轻刮几下； 4、将牙签上附着的碎屑放在载玻片的生理盐水中涂抹几下； 用镊子夹起盖玻片让一侧先接触生理盐水在轻轻放平，避免出现 。 你观察到的细胞内染色最深的结构是 如果想让物像更清晰，应转动 。如果物像在视野的左上方，应将玻片标本向 移动，才能使物像移到视野中间。

原位杂交实验操作步骤

原位杂交实验操作步骤 一质粒制备 1质粒的转化和扩增 1.1制备XL1-Blue感受态细菌 1.取400uLXL1-Blue菌种加入到含200mlLB培养基的锥形瓶中，37℃、100rpm 培养4h，离心，倒置，以冰冷的0.1mol/LCaCl_2重悬细菌，冰浴30min，离心，弃上清，倒置，再加4ml(含15%甘油)冰冷的CaCl2重悬细菌，分装(200μ/tube)，-80℃保存。 2.转化：在冰浴中将1管XL1-Blue感受态菌解冻，将浓度为2ng/μ1的质粒DNA4μ1加入到8Oμ1感受态菌中。 3.轻轻摇匀，冰浴30min。 4.42℃热激9O秒，然后迅速冰浴2min。 5.加入LB培养液(无氨苄青霉素)0.8ml，在37℃，100转/min水浴孵育60min。 6.取200μl菌液铺于琼脂板上(涂有X-Gal(20mg/ml)-IPTG(200mg/ml)的LB-氨苄青霉素50mg/ml,1μl/ml培养基)，待菌液全部被吸收后，倒置平板于37℃培养12-16h。 1.2鉴定和挑选含重组质粒的菌落 1.用无菌牙签挑取单菌落，接种到10ml含氨苄青霉素的LB培养液的离心管中，于37℃，200转/分培养2h，取1ml之一Eppendorf离心管，加 50μl10mmol/L EDTA(pH8.0)。 2.加入50μl新配置的0.2mol/LNaOH、0.5%SDS、20%蔗糖溶液后，振荡30秒。 3.在70℃温育5min，然后冷却到室温。 4.加1.5μ14mol/LKCl和0.5μ1含0.4%溴酚兰染液，振荡3O秒后，冰浴5min。 5.12000g，4℃离以3min，以除去细菌碎片。 6.制备1%的琼脂糖凝胶(含EB0.5μg/ml)，取50μl上清液加入到样品孔中，其中一孔加入中等分子量DNAMarker。恒压50V，进行电泳。 7.当溴酚兰迁移到凝胶全长的2/3-3/4时，停止电泳，在紫外灯下检查质粒DNA 分于量的大小是否与转入质粒相符。

微生物实验室技术操作规范

实验室技术操作规范 一、无菌操作要求 食品微生物实验室工作人员，必须有严格的无菌观念，许多试验要求在无菌条件下进行，主要原因：一是防止试验操作中人为污染样品，二是保证工作人员安全，防止检出的致病菌由于操作不当造成个人污染。 1.接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。 2. 进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。 3. 接种食品样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。 4. 进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。 5. 从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。 6. 接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒。 7. 接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min，再经火焰烧灼。 8. 吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。 二、无菌间使用要求 1. 无菌间通向外面的窗户应为双层玻璃，并要密封，不得随意打开，并设有与无菌间大小相应的缓冲间及推拉门，另设有0.5-0.7m2的小窗，以备进入无菌间后传递物品。 2. 无菌间内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。 3. 无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。 4. 处理和接种食品标本时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。 5. 在无菌间内如需要安装空调时，则应有过滤装置。 三、消毒灭菌要求 微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等，必须经灭菌后方能使用。 1．灭菌前准备 （1）所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面通气孔打开。 （2）装培养基的三角瓶塞，用纸包好，试管盖好盖，注射器须将管芯抽出，用纱布包好。

原位杂交操作流程

原位杂交操作流程 1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天 1）二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟； 2）无水乙醇浸泡2次，每次3分钟； 3） 95%乙醇浸泡2次，每次3分钟； 4） PBS清洗3分钟； 5） 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟； 6） PBS清洗10分钟； 7）加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育15分钟； 8） PBS清洗2次，每次3分钟； 9） 0.2N的HCl孵育30分钟； 10）PBS清洗2次，每次3分钟； 11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟； 12）PBS清洗2次，每次5分钟； 13）预杂交缓冲液孵育30分钟； 14）准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针，85℃加热5分钟，置于冰块中10分钟； 15）杂交；第二天 16）将玻片置于SSC中2次，每次5分钟以去除封片； 17）PBS清洗3分钟； 18）RNA酶A溶液中（或0.1-1ng/mlPBS中），37℃孵育30分钟； 19）PBS清洗5分钟； 20）室温，2×SSC清洗10分钟； 21）37℃，1×SSC清洗10分钟； 22）37℃，0.5×SSC清洗10分钟； 23）缓冲液A孵育10分钟； 24）缓冲液A（1%正常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100）孵育30分钟； 25）加入抗地高辛抗体（1/200的上述缓冲液，来自Boehringer Mannheim），37℃孵育3 小时； 26）缓冲液A清洗2次，每次10分钟； 27）缓冲液B清洗2次，每次5分钟； 28）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到16小时；29）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗； 30）固红，脱水以及封片进行核的复染。 2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交第一天 1）二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟； 2）无水乙醇浸泡2次，每次5分钟； 3） 95%乙醇浸泡2次，每次5分钟； 4） PBS清洗5分钟； 5） 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟； 6） PBS清洗5分钟； 7）加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育10分钟； 8） PBS清洗2次，每次5分钟； 9） 0.2N的HCl孵育30分钟； 10）PBS清洗2次，每次5分钟； 11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；

微生物学实验试题集

微生物学实验试题 一、选择题 1.革兰氏染色的关键操作步骤是： A.结晶紫染色 B.碘液固定 C.酒精脱色 D.复染 答:(C) 2.放线菌印片染色的关键操作是： A.印片时不能移动 B.染色 C.染色后不能吸干 D.A和C 答:(D) 3.高氏培养基用来培养： A.细菌 B.真菌 C.放线菌 答:(C) 111821.肉汤培养基用来培养: A.酵母菌 B.霉菌 C.细菌 答:(C) 111822.无氮培养基用来培养: A.自生固氮菌。 B.硅酸盐细菌 C.根瘤菌 D.A、B均可培养 E.A、B、C均可培养 答:(D) 111823.在使用显微镜油镜时，为了提高分辨力，通常在镜头和盖玻片之间滴加: A.二甲苯 B.水 C.香柏油 答:(C) 111824.常用的消毒酒精浓度为: A.75% B.50% C.90% 答:(A) 111825.用甲醛进行空气熏蒸消毒的用量是: A.20ml/M3 B.6ml/M3

111826.实验室培养基高压蒸汽灭菌的工艺条件是: A.121℃/30min B.115℃/30min C.130℃/30min 答:(A) 111827.巴氏消毒的工艺条件是: A.62-63℃/30min B.71-72℃/15min C.A.B.均可 答:(C) 111828.半固体培养基的主要用途是: A.检查细菌的运动性 B.检查细菌的好氧性 C.A.B.两项 答：(C) 111829.半固体培养基的琼脂加入量通常是: A.1% B.0.5% C.0.1% 答:(B)。 111830.使用手提式灭菌锅灭菌的关键操作是: A.排冷气彻底 B.保温时间适当 C.灭菌完后排气不能太快 D.A-C 答:(A)。 111831.目镜头上的“K”字母表示: A.广视野目镜 B.惠更斯目镜 C.补偿目镜 答:() 111832.目镜头上的“P”字母表示: A.平场目镜 B.广视野目镜 C.平场补偿目镜 答:() 111833.物镜头上的“PL”字母表示: A.正低相差物镜 B.正高相差物镜 C.负高相差物镜 答:() 111834.物镜头上的“UVFL”字母表示。 A.无荧光物镜 B.照相物镜

原位杂交的方法

原位杂交 1 探针的设计与合成 1)根据实验室已有的p8基因cDNA全长序列，用premier primer5.0设计引物p81和p82， 以卤虫cDNA为模板，PCR扩增得到346bp的产物，用Takara胶回收试剂盒回收纯化。引物编号引物序列长度 p81 TGCGGACGAAACAGGAAG 18 bp p82 GCTCAAACAGTGA TGCCAGT 20 bp 2)目的片段克隆 a. 在无菌离心管中加入连接载体的各种成分，载体与片段的摩尔比控制在1:3-1:8，根据凝胶电泳检测后的浓度及载体与片段分子大小来计算摩尔比。加入成分及比例如下： 目的PCR片段 5 μl pGM-T载体（约50ng/uL） 1 μl 10×T4 DNA Ligation Buffer 1 μl T4 DNA Ligase（3U/uL） 1 μl 无菌去离子水 3 μl 总体积10 μl b. 轻轻弹动离心管以混合内容物，短暂离心。置于PCR仪中16℃过夜连接，反应结束后将离心管置于冰上。 c. 向铺好的含有氨苄青霉素的固体平板表面加入16 μl的IPTG（50mg/ml）、40 μl的X-gal （20mg/ml），使用无菌的弯头玻璃棒将其均匀的涂开，避光置于37℃培养箱1-3小时，使溶解X-gal的二甲基甲酰挥发干净。 d. 将10 μl的连接产物加到100 μl DH5 感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴半小时，将离心管置于42℃水浴90秒，取出管后立即置于冰浴上放置2-3分钟，其间不要摇动离心管。向离心管加入500 μl 37℃预热的LB（不含抗生素）培养基，150rpm摇床37℃振荡培养45分钟。目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。将菌液于4000g下离心10分钟，去掉上清，加入100 μl培养液重溶并加入到配制好的LB固体培养基上，用无菌的弯头玻璃棒轻轻将细胞均匀涂开。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培养12-16小时。 e. 挑取白色菌落直接进行PCR检测，筛选转化子。 f. 将转化子接种于LB液体培养基中培养24小时，吸取1mL菌液送至大连宝生物公司进行序列测序。 3)重组质粒的线性化 取6 μl以测序的重组质粒，选取NcoI内切酶37℃酶切4h。酶切反应体系为20 μl： 质粒 6 μl 10xK Buffer 2 μl NcoI酶 1 μl 0.1% BSA 2 μl 灭菌水9 μl 终体积20 μl 取酶切前后的质粒各4 μl，经1%琼脂糖电泳检测，确认酶切完全，将酶切产物用Takara胶回收试剂盒回收纯化，作为探针合成的模板。 4)探针合成 按罗氏DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)试剂盒使用指南，标记反义RNA探针。 使用的所有试剂和器皿均经去RNase处理，合成方法如下:先准备反应体系。冰上向RNase-Free的微离心管中顺序加入下列试剂:

微生物实验操作基础——灭菌及无菌操作

实验十二微生物实验操作基础——灭菌及无菌操作 一、目的要求 学习灭菌的方式方法，区别几种灭菌方式的相同点和不同点。掌握实验室无菌操作的操作方法和注意事项，体会无菌操作技术在微生物研究中的重要性。 二、知识介绍 灭菌技术sterilization 为什么要灭菌？（杂菌污染的后果） 1.营养基质或产物被消耗损失； 2.抑制生产菌的生长； 3.抑制产物的生物合成； 4.杂菌繁殖导致培养液性质（如pH）改变，造成生物反应异常。 灭菌原理与方法 灭菌(sterilization）是指利用物理或化学方法，杀灭或去除物料或设备中所有微生物的技术或工艺过程。灭菌方法有化学物质灭菌、辐射灭菌、过滤介质除菌和热灭菌等。 （一）、化学物质灭菌 通过改变微生物细胞膜的渗透性，或者损伤细胞膜，影响微生物细胞的正常代谢。不适合于培养基的灭菌，只适合于局部空间或某些器械的消毒。 1.无机酸、碱及盐类 酸碱的杀菌能力主要由其电离度而定，电离出得氢离子或氢氧根离子浓度越高，杀菌力越强。 盐溶液的杀菌力与其浓度成正比。 （腌咸菜可以保藏很长时间而不染菌） 2.重金属盐

杀菌原理是重金属盐使细胞中蛋白质失活。 比如升汞。 服食牛奶、 鸡蛋等高蛋白含量食物可解毒。 3.氧化剂 高锰酸钾 4.有机化合物 乙醇：脱水、使蛋白质变性和沉淀，70~75%最有效。 (二)、辐射灭菌 1.紫外线：诱导胸腺嘧啶二聚体的形成，从而抑制了DNA的复制；空气在紫外线照射下产生臭氧，臭氧也具有一定的杀菌作用。 2.X射线、γ射线：能量极高，被菌体吸收后，菌体内的水和有机物产生强烈的离子化反应，形成OH-、过氧化氢和有机过氧化物，这些过氧化物阻碍微生物的代谢活动而导致菌体迅速死亡。 （三）、过滤介质除菌 工业上利用过滤的方法制备大量的无菌空气，供好氧微生物的深层培养使用。 （四）、干热灭菌 1.火焰灼烧法 2.干热空气灭菌法：140~160℃维持2~3h。 （五）、湿热灭菌 湿热灭菌条件为121℃维持20~30min。 巴氏杀菌（Pasteurization）低温消毒法，主要应用于生产酸奶乳制品。目前国际上通用的巴氏高温消毒法主要有两种： 1.一种是将牛奶加热到62~65℃，保持30分钟。采用这一方法，可杀死牛奶中各种生长型致病菌，灭菌效率可达97.3%~99.9%，经消毒后残留的只是部分嗜热菌及耐热性菌以及芽孢等，但这些细菌多数是乳酸菌，乳酸菌不但对人无害反而有益健康。 第二种方法将牛奶加热到75~90℃，保温15~16秒，其杀菌时间更短，工作效率更高。但杀菌 的基本原则是，能将病原菌杀死即可，温度太高反而会有较多的营养损失。

原位杂交实验操作步骤

原位杂交实验操作步骤 撰写人：范为民 一、实验原理 原位杂交是指借助于核酸分子杂交的方法，在显微镜水平检测和定位特异的核苷酸片段。现在原位杂交已经成为在分子水平研究肿瘤和遗传性疾病的发生，发展和调控等根本性问题的有力工具。 二、试剂盒 本实验室常用的原位杂交试剂盒是博士德公司生产的敏感加强型原位杂交检测试剂盒，此试剂盒分为两种，一种为过氧化物酶（POD）检测（MK1030型），一种为碱性磷酸酶(AP)检测系统（MK1032型），用于mRNA的杂交。过氧化物酶（POD）检测的最终信号为棕黄色，而碱性磷酸酶(AP)检测的信号为紫色，因后者信号比较突出，所以一般采用后一种检测方法。两种检测方法的实验步骤相差不多，所用洗脱缓冲液也大同小异。用于杂交的探针也可以分为两种，一种是DNA探针，即是用DNA与组织中的mRNA杂交，另一种是RNA 探针，即用RNA与组织中的mRNA杂交。DNA探针处理操作简单，但杂交信号一般不如RNA探针强烈，所以条件允许的话一般采用RNA探针。下面先介绍碱性磷酸酶(AP)检测试剂盒，采用RNA作为探针的操作步骤。 三、实验步骤 原位杂交实验主要包括三大部分，即组织冰冻切片、RNA探针标记、原位杂交三部分。 （一）组织冰冻切片 1. 实验准备 （1）原位杂交专用载玻片：用多聚赖氨酸处理后的载玻片，使切片紧密粘附在玻片上，可以用于后面的洗脱。一般一张载玻片上可以贴至多十张切片（可以是不同组织的切片），所以需要玻片的数目需要根据实验的要求而定。这种专用载玻片可以从中杉金桥公司购买，目前价格是每片2.2元，玻片有一面的一端是毛玻璃，用于标记组织名称等，切片应该贴在此面，切勿贴到反面。 （2）缓冲液配备 1.1器具准备 剪刀、镊子各三把，开壳钳一把，100ml量筒一个，磁力搅拌子一个；100ml试剂瓶一个，250ml试剂瓶三个。以上器具均洗净后置于180摄氏度以上烘烤6小时以上。铅笔、显微镜、冰、吸水纸、一次性塑料手套等。 1.2 溶液配制 0.1M PB缓冲液：Na2HPO4?12H2O 5.8021g,NaH2PO4?2 H2O 0.5928 g,加入200ml ddH2O溶解于之前准备的250ml试剂瓶中，再加入200ūl DEPC，充分摇匀后过夜，高压灭菌。以上溶液配制两份，其中一份瓶中放入磁力搅拌子。

初中生物实验操作步骤

实验名称：观察植物细胞 1、用洁净的纱布把载玻片和盖玻片擦拭干净 2、把载玻片放在试验台上，用滴管在载玻片的中央滴一滴清水。 3、①用镊子从洋葱鳞片叶内侧撕取一小块透明薄膜内表皮。②把撕下的内表皮浸入载玻片的水滴中，用镊子把它展平。 4、用镊子夹起盖玻片，使它的一边先接触载玻片上的水滴，然后缓缓地放下，盖在要观察的材料上。 5、把一滴稀碘液滴在盖玻片的一侧。染 6、用吸水纸从盖玻片的另一侧吸引，使染液浸润标本的全部。 观察人的口腔上皮细胞 1、用干净的纱布把载玻片和盖玻片擦拭干净。 2、把载玻片放在实验台上，用滴管在载玻片的中央滴一滴生理盐水 3、用凉开水把口漱净。用消毒牙签从口腔侧壁处轻轻刮几下，牙签上就附着了一些碎屑。把牙签放在载玻片的生理盐水滴中均匀地涂抹几下。 4、用镊子夹起盖玻片，使它的一侧先接触载玻片上的液滴，然后缓缓放平。 5、在盖玻片的一侧滴加稀碘液（染），另一侧用吸水纸吸引，使染液浸润到标本的全部。 观察鸡卵的结构 1.取一个鸡卵，观察其外部形态。（放大镜，气孔） 2.将鸡卵的钝段轻轻敲出裂纹，将碎裂的卵壳连同紧贴壳的膜除去，观察鸡卵的气室。（镊子，卵壳，外卵壳膜和气室） 3.用剪刀将气室下的内卵壳膜剪破。（剪刀） 4.将卵壳膜内的卵白和卵黄转移到培养皿中，卵黄完整。（培养皿） 5.观察鸡卵的结构。若未见胚盘，可用镊子夹起细系带把卵黄轻轻翻转。 观察种子的结构 1.观察菜豆种子的结构 ⑴取一粒浸软的菜豆种子，观察它的外形[来源:学|科|网Z|X|X|K] ⑵剥去种子最外面的一层薄皮-------种皮，分开合拢着的两片子叶。 ⑶用放大镜仔细观察子叶.胚根.胚轴和胚芽，看看它们各有什么特点？ 2观察玉米种子的结构 ⑵一粒浸软的玉米种子，观察它的外形。 ⑵用刀片将这粒种子从中央纵向剖开。 剖面上滴一滴碘液，在用放大镜仔细观察被碘液染成蓝色的胚乳以及未被染成蓝色的果皮和种皮，胚芽，胚根，胚轴和子叶，看看它们各有什么特点？ 测定某种食物中的能量 1．取一只锥形瓶（50毫升），量筒量取30毫升水注入其中，再将它固定在铁架台上。 2.再锥形瓶里放入一支温度计（温度计下端要浸入水中，但不要接触锥形瓶的瓶底） 3.参照右图安装好试验装置，并测定水温。 4.称出一粒干燥花生种子的质量，将这粒种子放倒火焰上点燃， 5.将刚刚燃烧的花生种子尽快放倒锥形瓶底部。待这粒花生种子完全燃烧后，测量水温。 6.计算：Q=CM△T=30×4.2×（t2－t1）(把测量的温度代入，得出数据)

微生物实验室的工作流程

微生物实验室的工作流 程 GE GROUP system office room 【GEIHUA16H-GEIHUA GEIHUA8Q8-

微生物实验室的工作流程 为了防止交叉污染，保护工作人员健康，微生物实验室划分成4个区：污染区、半污染区、无菌区、清洁区，以下为各个区的工作制度。?一、污染区? (一)?实验室工作人员进入操作区应穿好工作服并配戴好口罩、帽子、手套及鞋套，严格按照操作规程进行。?(二)?每天早上工作前，每天工作后，用紫外线照射60?min?，对整个操作区进行消毒；? (三)?本区只能进行：临床标本的接收，保存，标本接种、培养、及其菌株检验前处理、菌悬液制备、染色标本检查、非上机鉴定与药敏试验操作等危险操作，其它操作不得在此区进行。（注：标本的接种和涂片必须在生物安全柜中进行，直接涂片、革兰染色和抗酸染色的片子必须通过生物安全柜紫外线照射30?min才可拿出进行染色观察。）?(四)?污染物处理：操作区备有消毒缸，以处理沾有细菌的玻片等污染物品。检验剩余的标本及使用过的带菌平板等集中地点安全放置，经消毒灭菌处理后再洗涤或丢弃。?(五)?工作结束后必须立即对操作区进行清洁或消毒。操作区地面用专用拖把每天拖1?次，每周用消毒剂擦洗1?次。下午工作结束后用消毒液消毒工作台面，以保证工作环境的安全清洁。? (六)?非本实验室工作人员未经允许不得进入。?二、半污染区? (一)?实验室工作人员在此区穿好专用工作服并配戴好口罩、帽子、手套及鞋套，严格按照操作规程进行。?(二)?每天早上工作前，每天工作后，用紫外线照射60?min?，对整个操作区进行消毒；?

荧光原位杂交(FISH)实验步骤

仪器设备 1、医用微波炉； 2、水浴锅； 3、OLYMPUS BX51荧光显微镜； 4、OLYMPUS DP11数字显微照相机。 FISH试剂 （1）1×PBS：由10×PBS溶液稀释而成，储存于4℃； （2）20×SSC（）； （3）2×SSC，由20×SSC溶液稀释而成； （4）25mg/ml蛋白酶K消化液。 （5）变性液(70％甲酰胺+2×SSC，：4ml 20×SSC；8ml蒸馏水；28ml甲酰胺。每次新鲜配制。 （6）杂交后洗涤液：20×SSC 4ml；蒸馏水16ml；甲酰胺20ml。每次新鲜配制。调节pH 前升至室温。 实验步骤 1、脱蜡： 1）二甲苯脱蜡3次，每次5min； 2）100％酒精两次，每次2min； 3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。 2、蛋白酶处理: 1）每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。 2）37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20min。 3）×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。 4）梯度酒精脱水（-20℃预冷）。 3、变性： 1）每一个立式染色缸配制40ml变性溶液； 2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸； 3）78℃孵育8min； 4）即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2min； 5）空气干燥。 4、杂交： 1）准备探针； 2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片； 3）滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片； 4）盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。 杂交后的水洗： 5）镊子小心去除盖玻片； 6）43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min； 7）2×SSC(37℃)洗两次，每次10min； 8）切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。 检测：

生物实验操作步骤

生物 一、A类实验操作练习题 1.用显微镜观察洋葱鳞片叶表皮细胞 实验器材及设置：显微镜、载玻片、盖玻片、吸水纸、纱布、滴管、单面刀片、镊子、清水、稀碘液、解剖针、小块木板、洋葱鳞片叶、擦镜纸（备用）。 [附]显微镜状态:目镜已安装好，最大光圈对准通光孔，转换器上两个物镜位于通光孔两侧，呈外八字形，镜筒降到最低处。 实验要求：（1）制作洋葱鳞片叶表皮细胞临时装片； （2）用显微镜观察洋葱鳞片叶表皮细胞。 方法步骤： （一）、制作洋葱鳞片叶表皮细胞临时装片 1. 准备用洁净的纱布把载玻片和盖玻片擦拭干净；用滴管在载玻片中央滴1-2滴清水。 2. 取材用刀片切取一块洋葱鳞片叶（大约0.5cm2），用镊子撕取洋葱鳞片叶的内表皮；把撕取的表皮浸入载玻片上的水滴中，并展平。 3.盖盖玻片用镊子夹起盖玻片，使它的一边先接触载玻片上

的水滴，然后缓缓地放下，盖在要观察的材料上。 4.染色把一滴碘液滴在盖玻片的一侧，用吸水纸从盖玻片的另一侧吸引，使染液浸润标本全部。 （二）、用显微镜观察洋葱鳞片叶表皮细胞 1.取镜与安放一手握镜臂，一手托镜座，把显微镜放在实验台中央略偏左，距实验台边缘约7cm。 2.对光上升镜筒，转动转换器，使低倍物镜对准通光孔；一只眼注视目镜，另一只眼睁开，同时转动反光镜，使视野明亮。 3.安放玻片将玻片轻放载物台上，标本正对通光孔的中心，用压片夹压住玻片的两端。 4.调焦双手转动粗准焦螺旋，使镜筒缓缓下降，同时眼睛从侧面看着物镜下降，直到物镜接近玻片；一只眼注视目镜，同时转动粗准焦螺旋，使镜筒缓缓上升至视野中出现物像，微调细准焦螺旋使物像清晰。 5.观察移动玻片，将物像移到视野中央，在低倍镜下观察洋葱鳞片叶表皮细胞。 2.用显微镜观察人的口腔上皮细胞 实验器材及设置：显微镜、载玻片、盖玻片、吸水纸、纱布、滴

微生物学实验报告

微生物学实验报告 （格式标准参考） (生命科学专业，生物技术专业) 教师：黎勇

目录索引 实验一油镜的使用和细菌的简单染色法 (3) 实验二细菌的革氏染色与芽孢染色 (4) 实验三常用培养基的配制 (6) 实验四酵母菌霉菌的形态结构观察及酵母死活细胞的鉴别 (7) 实验五、微生物大小的测定与显微计数 (9) 实验六环境中微生物的检测和分离纯化 (10) 实验七细菌鉴定中常用的生理生化反应 (12) 实验八（综合实验）化能异养微生物的分离与纯化 (13) 课程名称：微生物学实验班级：化生系生命科学本科

实验日期：指导教师：黎勇 实验一油镜的使用和细菌的简单染色法 〔目的要求〕学习并熟练掌握油镜的使用技术；观察细菌的基本形态；学习观察细菌的运动性的基本方法。 〔基本原理〕 1.N·A=n·sinα 2.D=λ/2N.A 3.目镜可提高放大倍数，但有效放大率取决于镜口率。已经分辨的物体不放大看不清，未分辨物放得再大也看不清。 4.用悬滴法或凹玻片法观察细菌的运动性时，可以通过真运动能定向地由一处快速运动来区别于颗粒的布朗运动。 〔器材用具〕显微镜、载玻片、凹玻片、盖玻片、接种环、香柏油、二甲苯、凡士林、吸水纸、擦镜纸；细菌、放线菌等固定装片；培养18小时左右的B.subtilis. S.arueus菌斜面培养物；无菌水、生理盐水。 〔方法步骤〕： （一）油镜的使用 镜检装片在中倍（或高倍镜）下找到目的物，并使位于视野正中聚光镜上升到最高位置，虹彩光圈开到最大，镜头转开成八字形在玻片的镜检部位（光斑处）滴一滴香柏油油镜转入正下方侧视小心上升载物台（缩短镜头与装片距离，镜头浸入油中，至油圈不扩大为止镜头几与装片接触）粗调器徐徐下降载物台（密切注视视野，当捕捉到物像时，立即用细调器校正）仔细观察并绘图取出装片，清洗油镜：擦镜纸拭去镜头上的香柏油擦镜纸沾少许二甲苯擦去残留（用手指辅助，迅速拭擦一、二次）用清洁擦镜纸仔细擦干二甲苯（2-3次）。 （二）细菌的简单染色法：涂片干燥火焰固定染色水洗干燥油镜观察（三）细菌运动性的观察取洁净盖玻片，四周涂上凡士林滴加一小滴菌悬液凹玻片的凹窝向下盖于盖玻片上翻转观察 〔结果分析〕 1、画一圆圈表示视野，选取所观察的微生物绘图，注意特殊结构、形状和排列。（描绘时按视野实际大小5－10倍绘制） 菌名：大肠杆菌菌名：金黄色葡萄球菌 放大倍数：100×10（×5）放大倍数：100×10（×5） 特殊结构：无特殊结构：无 视野观察下微生物的形态 2、油镜使用时为什么必须干燥装片？