酶活测定方法.doc
二十、果蔬中多酚氧化酶活性的测定
一、目的要求
了解多酚氧化酶的作用，掌握果蔬组织中多酚氧化酶活性的测定方法。
二、基本原理
多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）是一种以铜为辅基的酶，能催化多种简单酚类物质氧化形成醌类化合物，醌类化合物进一步聚合形成呈现褐色、棕色或黑色的聚合物。在后熟衰老过程或在采后的贮藏加工过程中，果蔬出现的组织褐变与组织中的多酚氧化酶活性密切相关。
多酚氧化酶催化邻苯二酚氧化形成的产物在420 nm处有最大光吸收峰。因此，可利用比色法测定多酚氧化酶的活性。
三、材料、仪器及试剂
（一）材料
梨、苹果、马铃薯等。
（二）仪器及用具
研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、计时器、移液器、离心管、试管、容量瓶（100mL、1000 mL）。
（三）试剂
1．100 mmol/L、pH 5.5醋酸缓冲液
母液A（200 mmol/L醋酸溶液）：量取11.55 mL冰醋酸，加蒸馏水稀释至1 000 mL。
母液B（200 mmol/L醋酸钠溶液）：称取16.4 g无水醋酸钠（或称取27.2 g 三水合乙酸钠），用蒸馏水溶解、定容至1 000 mL。
取68 mL母液A和432 mL母液B混合后，调节pH至5.5，加蒸馏水稀释至1 000 mL。
2．提取缓冲液（含1 mM PEG、4% PVPP和1% Triton X-100）
称取340 mg PEG 6000（聚乙二醇6000）、4 g PVPP（聚乙烯吡咯烷酮，Polyvinyl–polypyrrolidone），取1 mL Triton X-100，用100 mmol/L、pH 5.5醋酸缓冲液溶解、稀释至100 mL。
3．50 mmol/L邻苯二酚
称取275 mg邻苯二酚，用50 mmol/L、pH 5.5醋酸缓冲液溶解、稀释至50 mL。
四、实验步骤
（一）酶液制备
称取5.0 g果蔬组织样品，置于研钵中，加入5.0 mL提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆，于4℃、12 000×g离心30 min，收集上清液即为酶提取液，低温保存备用。
（二）活性测定
取一支试管，加入4.0 mL 50 mmol/L、pH 5.5的醋酸缓冲液和1.0 mL 50 mmol/L邻苯二酚溶液，最后加入100 μL酶提取液，同时立即开始计时。将反应混合液倒入比色杯中，置于分光光度计样品室中。以蒸馏水为参比，在反应15 s 时开始记录反应体系在波长420 nm处吸光度值作为初始值，然后每隔1 min 记录一次，连续测定，至少获取6个点的数据。重复三次。
五、实验结果与计算
1．将测定的数据填入下表
2．计算结果
记录反应体系在420 nm 处的吸光度值，制作OD 420值随时间变化曲线，根据曲线的初始线性部分计算每分钟吸光度变化值△OD 420。然后以每克鲜重（FW ）果蔬样品每分钟吸光度变化值增加1时为1个PPO 活性单位（U ），则U = △OD 420·min -1·g -1 FW 。计算公式： W
V t V OD U S 420?????=）多酚氧化酶活性（
式中：
△OD 420——反应混合液的吸光度变化值；
△t ——酶促反应时间，min ；
V ——样品提取液总体积，mL ；
Vs ——测定时所取样品提取液体积，mL ；
W ——样品重量，g 。
PPO 活性还可以每分钟反应体系在波长420 nm 处吸光度值变化增加1时所需的酶量为1个活性单位（U ），表示为U = △OD 420·min -1·mg -1蛋白质。酶提取液中蛋白质含量可利用考马斯亮蓝染色法进行测定。
六、注意事项
应进行预实验，测定每一分钟反应体系的吸光度值的变化，确定该酶促反应速度呈线性变化（初级反应）的时间段。这样，只测定某一段时间内反应溶液的初始吸光度值（OD 0）和最终值（OD t ）这两个数据，就可以计算每分钟吸光度值变化的增加量。
七、思考题
随着反应时间的延长，多酚氧化酶活性将呈现什么样的变化？
（四）超氧化物岐化酶活性测定
一、目的要求
学习果蔬组织中过超氧化物歧化酶活性的测定原理和方法。
二、基本原理
超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase ，SOD ）普遍存在于动、植物与微生物体内。SOD 是含金属辅基的酶。高等植物有两种类型的SOD ：Mn-SOD 和Cu/Zn-SOD 。SOD 能够清除超氧自由基（O 2-），它与CAT 、POD 等酶协同作用来防御活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜系统的伤害，从而减少自由基对有机
体的毒害。
超氧阴离子自由基（O2-）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。SOD 能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧阴离子自由基，生成H2O2和O2。H2O2再由CAT 进一步催化生成H2O 和O2。超氧化物岐化酶催化以下反应：
222222O +O H ?→?H +O +-
由于超氧自由基非常不稳定，寿命极短，一般利用间接方法测定SOD 活性。本实验依据SOD 抑制氮蓝四唑（NBT ）在光下的还原作用来确定酶活性的大小。在有氧化物质存在时，核黄素可在光照条件下被还原。被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O 2-。当加入NBT 后，在光照条件下O 2-又可将NBT 还原为蓝色的甲腙，后者在560 nm 处有最大光吸收。
当加入SOD 时，SOD 可通过清除O 2-而抑制了NBT 的光还原反应，使蓝色甲腙生成速度减慢。于是，进行光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶的活性愈低，反之酶的活性愈高。抑制NBT 光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正相关关系，据此可以计算出酶活性的大小。常常将抑制50%的NBT 光还原反应时所需的酶量作为一个酶活性单位（U ）。
三、材料、仪器及试剂
（一）材料
苹果、梨、番茄等。
（二）仪器及用具
研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、计时器、移液器、离心管、光照箱（反应试管处日光灯照度为4 000 LUX ）、指形玻璃管、容量瓶（100 mL 、200 mL 、1 000 mL ）。
（三）试剂
1．提取缓冲液：
（1）100 mmol/L 、pH 7.8磷酸缓冲液
母液A （200 mmol/L Na 2HPO 4溶液）：称取35.61 g Na 2HPO 4·2H 2O 或53.65 g Na 2HPO 4·7H 2O 或71.64 g Na 2HPO 4·12H 2O ，用蒸馏水溶解，定容至1 000 mL 。
母液B （200 mmol/L NaH 2PO 4溶液）：称取27.6 g NaH 2PO 4·H 2O 或31.2 g NaH 2PO 4·2H 2O 用蒸馏水溶解，定容至1 000 mL 。
取91.5 mL 母液A 和8.5 mL 母液B 混合后，调节pH 至7.8，然后稀释至200 mL ，即为100 mmol/L 、pH 7.8磷酸缓冲液。
（2）提取缓冲液
称取77 mg DTT ，5 g PVP ，加入100 mmol/L 、pH 7.8磷酸缓冲液，定容至100 mL ，摇溶，即得提取缓冲液（含5 mmol/L DTT 和5% PVP ），低温（4℃）贮藏备用。
2．50 mmol/L 、pH 7.8磷酸缓冲液
3．130 mmol/L 甲硫氨酸（MET ）溶液
称取1.94 g L-蛋氨酸，用50 mmol/L 、pH 7.8磷酸缓冲液溶解，定容至100 mL ，充分混匀（现用现配）。低温保存，可使用1~2天。
4．750 μmol/L 氮蓝四唑（NBT ）溶液
称取61.3 mg NBT ，用蒸馏水溶解，定容至100 mL ，充分混匀（现配现用）。低温避光保存，可用2~3 天。
5．100 μmol/L EDTA-Na 2溶液
称取37.2 mg EDTA-Na 2，用蒸馏水溶解，定容至100 mL ，使用时稀释100倍。低温避光保存可用8~10天。
6．20 μmol/L 核黄素溶液
称取75.3 mg 核黄素，用蒸馏水溶解，定容至100 mL ，使用时稀释100倍。低温避光保存，即用黑纸将装有该液的棕色瓶包好，随用随配。
四、实验步骤
（一）酶液制备
称取5.0 g 果蔬样品，置于研钵中，加入5.0 mL 提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆。将匀浆液全部转入到离心管中，于4℃、12 000×g 离心30 min ，收集上清液，低温保存备用。
（二）活性测定
用5支指形玻璃管进行测定。按照表19所列内容加入各种溶液。注意最后加入核黄素溶液。其中3支为测定管，2支为对照管。混匀后将1支对照管置于暗处，其它各管置于4 000 LUX 日光灯下反应15 min 后，立即取出，置于暗处终止反应。以不照光管做空白参比，于560 nm 处分别测定其它各管的吸光度值。
表19．测定SOD 活性各试剂加入量
试 剂（酶） 用量（m L ） 终浓度（比色时） 50 mmol/L 磷酸缓冲液
1.7 130 mmol/L MET 溶液
0.3 13 mmol/L 750 μmol/L NBT 溶液
0.3 75 μmol/L 100 μmol/L EDTA-Na 2溶液
0.3 10 μmol/L 20 μmol/L 核黄素溶液
0.3 2.0 μmol/L 酶液
0.1 对照2支管以缓冲液代替 总体积
3.0 五、实验结果与计算
2．计算结果
显色反应后，分别记录样品管反应混合液的吸光度值（OD S ）和照光对照管反应混合液的吸光度值（OD C ）。以每分钟每克鲜重（FW ）果蔬组织的反应体系对氮蓝四唑（NBT ）光化还原的抑制为50%时为一个SOD 活性单位（U ）表示。
W
t V OD 5.0V )OD -OD (U SOD S C S C ?????=）活性（ 式中：
OD C ——照光对照管反应混合液的吸光度值；
OD S ——样品管反应混合液的吸光度值；
V ——样品提取液总体积，mL ；
Vs——测定时所取样品提取液体积，mL；
t ——光照反应时间，min；
W ——样品重量，g。
也可以用以每分钟反应体系对氮蓝四唑（NBT）光化还原的抑制为50%时所需的酶量为一个SOD活性单位（U）。
六、注意事项
1．需要通过预实验，摸索显色反应所需的时间。
2．当测定样品数量较大时，可在临用前根据用量将表中各试剂（酶液和核黄素除外）按比例混合后一次加入2.6 mL，然后依次加入核黄素和酶液，使终浓度不变，其余各步骤与上相同。
4．要求各管受光情况一致，所有反应管应排列在与日光灯管平行的直线上。反应温度控制在25℃左右，视酶活性高低适当调整反应时间。温度较高时，光照时间应缩短；温度较低时，光照时间相应延长。
5．所用指形管要洁净透明，透光性好。用浅底广口的小玻璃皿照光效果更好。
七、思考题
1．在SOD测定中为什么设照光和暗中两个对照管？
2．影响本实验准确性的主要因素是什么？应如何克服？
十九、果蔬中过氧化物酶活性的测定
一、目的要求
了解过氧化物酶的作用，掌握愈创木酚法测定果蔬组织中过氧化物酶活性的方法。
二、基本原理
过氧化物酶（Peroxidase，POD）是果蔬体内普遍存在的一种重要的氧化还原酶，它与果蔬的许多生理过程和生化代谢过程都有密切关系。在果蔬的生长发育、成熟衰老过程、抗病、抗氧化、抗逆境胁迫中，POD活性不断发生变化。在受到外界刺激、病原菌侵染、贮藏环境变化、加工条件改变等作用时，果蔬组织中POD酶活性都会做出相应得应答反应。
过氧化物酶催化过氧化氢（H2O2）氧化酚类物质产生醌类化合物。这些化合物进一步缩合或与其它分子缩合形成颜色较深的化合物。在过氧化物酶催化作用下，过氧化氢能将愈创木酚（邻甲氧基苯酚）氧化形成4-邻甲氧基苯酚。该产物呈红棕色，在470 nm处有最大光吸收，故可通比色法测定过氧化物酶的活性。
三、材料、仪器及试剂
（一）材料
各种水果和蔬菜。
（二）仪器及用具
研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、秒表、移液器、离心管、试管、容量瓶（100 mL，1 000 mL）。
（三）试剂
1．100 mmol/L、pH 5.5醋酸缓冲液
母液A（200 mmol/L醋酸溶液）：量取11.55 mL冰醋酸，加蒸馏水稀释至1 000 mL。
母液B（200 mmol/L醋酸钠溶液）：称取16.4 g无水醋酸钠（或称取27.2 g 三水合乙酸钠），用蒸馏水溶解、定容至1 000 mL。
取68 mL母液A和432 mL母液B混合后，调节pH至5.5，加蒸馏水稀释至1 000 mL。
2．50 mmol/L、pH 5.5醋酸缓冲液
3．提取缓冲液（含1 mM PEG、4% PVPP和1% Triton X-100）
称取340 mg PEG 6000（聚乙二醇6000）、4 g PVPP（聚乙烯吡咯烷酮，Polyvinyl–polypyrrolidone），取1 mL Triton X-100，用100 mmol/L、pH 5.5醋酸缓冲液溶解、稀释至100 mL。
4．25 mmol/L愈创木酚溶液
取320 μL愈创木酚，用50 mmol/L、pH 5.5醋酸缓冲液稀释至100 mL。
5．0.5 mol/L H2O2
取1.42 mL 30% H2O2溶液（30% H2O2的摩尔浓度约为17.6 mol/L），用50 mmol/L、pH 5.5醋酸缓冲液稀释至50 mL，现用现配，避光保存。
四、实验步骤
（一）酶液制备
称取5.0 g果蔬组织样品，置于研钵中，加入5.0 mL提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆，于4℃、12 000×g离心30 min，收集上清液即为酶提取液，低温保存备用。
（二）活性测定
取一支试管，加入3.0 mL 25 mmol/L愈创木酚溶液和0.5 mL酶提取液，再加入200 μL 0.5 mol/L H2O2溶液迅速混合启动反应，同时立即开始计时。将反应混合液倒入比色杯中，置于分光光度计样品室中。以蒸馏水为参比，在反应15 s 时开始记录反应体系在波长470 nm处吸光度值作为初始值，然后每隔1 min 记录一次，连续测定，至少获取6个点的数据。重复三次。
五、实验结果与计算
2．计算结果
记录反应体系在470 nm处的吸光度值，制作OD470值随时间变化曲线，根据曲线的初始线性部分计算每分钟吸光度变化值△OD470。然后，以每克鲜重（FW）果蔬样品每分钟吸光度变化值增加1时为1个过氧化物酶活性单位（U），则U =△OD470·min-1·g-1 FW。计算公式：
W
V t V OD U S 470?????=）过氧化物酶活性（
式中：
△OD 470——反应混合液的吸光度变化值；
△t ——酶促反应时间，min ；
V ——样品提取液总体积，mL ；
Vs ——测定时所取样品提取液体积，mL ；
W ——样品重量，g 。
过氧化物酶活性还可以每分钟反应体系在波长470 nm 处吸光度值读数变化增加1时所需的酶量为1个活性单位（U ），表示为U = △OD 470·min -1·mg -1蛋白质。酶提取液中蛋白质含量可利用考马斯亮蓝染色法进行测定。即：
C
V t OD U S 470????=）过氧化物酶活性（ 其中，C 表示酶提取液中蛋白质含量（mg/mL ）。这里所计算的实际上是酶的比活力，有利于减少操作过程带来的误差。
六、注意事项
1．应进行预实验。测定每一分钟反应体系的吸光度值的变化，确定该酶促反应速度呈线性变化（初级反应）的时间段。这样，只测定某一段时间内反应液的初始吸光度值（OD 0）和最终值（OD t ）这两个数据，就可以计算每分钟吸光度值的变化量。
2．利用100 mmol/L 、pH 6.0磷酸缓冲液作为提取液，可以提取多数果蔬组织中过氧化物酶。配制方法：
母液A ：0.2 mol/L Na2HPO4 溶液（53.65 g Na2HPO4?7H2O 或71.64 g Na2HPO4?12H2O 配成1000 mL ）。
母液B ：0.2 mol/L NaH2PO4 溶液（27.6 g NaH2PO4?H2O 或31.2 g NaH2PO4?2H2O 配成1000 mL ）。
分别取12.3 mL 母液A 与87.7 mL 母液B 充分混匀，调节pH 值，稀释至200 mL 。样品提取液中的其它成分根据需要加入。
3．在提取缓冲液中加入PEG ，PVPP 和Triton X-100等是为了提高酶蛋白的溶解性，减少提取过程中酶活性的损失。这些物质的具体作用可以参阅本书第一篇相关内容。
七、思考题
1．果蔬组织中POD 有哪些方面的作用？
2．讨论POD 或性测定数据的记录与处理的特点及意义。
SOD酶活性测定方法
SOD酶活性测定 所需药品： （1）0.1mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液： A液：0.1mol/l磷酸氢二钠液 B液：0.1mol/l磷酸二氢钠液 1毫升B+10.76毫升A （2）0.026mol/l蛋氨酸液（Met）：现用现配 称取0.3879克蛋氨酸，用1号液定容至100毫升。 （3）75*10-5mol/l氯化硝基四氮唑蓝（NBT）液：现用现配 称取0.1533克NBT，先用少量蒸馏水溶解，然后定容至250毫升。 （4）1umol/lEDTA-2钠和2*10-5mol/l核黄素混合液 （5）0.05mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液 （6）石英砂 实验步骤： 1.酶液制备：称取0.5克鲜叶，放入研钵中，加入3毫升5号液和少量石英砂，于冰浴中研成匀浆。然后用5号液定容至8毫升，于0～4℃、13000g时离心15分钟，上清液即为酶提取液。酶液可在低于0℃下的环境中保存。 2.按下表加入试剂： 试剂摇匀后，迅速遮光处理1号杯，其余杯在25℃、光强为4000勒克司的条件下照光处理15分钟，然后立即遮光。接着在560nm下，以1号杯作为空白测定其余杯中溶液的光密度。假定2、3号杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率为100%，然后按下式分别计算其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率。 M/N=100/X M——2、3号杯中溶液的光密度的平均值 N——其余杯中溶液的光密度值 X——其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率 然后以酶液量为横坐标，以其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率（X）为纵坐标制作曲线，根据线性好的曲线所得出的函数关系计算抑制NBT光还原的相对百分率为50%时所加入的酶液量，以该酶液量作为1个酶活单位。 结果计算：SOD活力按下式计算： A=V*1000*60/（B*W*T）
脂肪酶的概述及应用
脂肪酶的概述与应用 一脂肪酶概述、 脂肪酶（Lipase，甘油酯水解酶）隶属于羧基酯水解酶类，能够逐步的将甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。脂肪酶存在于含有脂肪的动、植物和微生物（如霉菌、细菌等）组织中。包括磷酸酯酶、固醇酶和羧酸酯酶。脂肪酸广泛的应用于食品、药品、皮革、日用化工等方面脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。 脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等（Hara；Schmid）。脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。 脂肪酶的性质研究主要包括最适温度与pH、温度与pH稳定性、底物特异性等几个方面。迄今，已分离、纯化了大量的微生物脂肪酶，并研究了其性质，它们在分子量、最适pH、最适温度、pH和热稳定性、等电点和其他生化性质方面存在不同（Veeraragavan等）。总体而言，微生物脂肪酶具有比动植物脂肪酶更广的作用pH、作用温度范围，高稳定性和活性，对底物有特异性（Schmid等；Kazlauskas等）。 脂肪酶的催化特性在于：在油水界面上其催化活力最大，早在1958年Sarda和Desnnelv 就发现了这一现象。溶于水的酶作用于不溶于水的底物，反应是在2个彼此分离的完全不同的相的界面上进行。这是脂肪酶区别于酯酶的一个特征。酯酶（E C3.1.1.1）作用的底物是水溶性的，并且其最适底物是由短链脂肪酸（≤C8）形成的酯。 脂肪酶是重要的工业酶制剂品种之一，可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应，广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业。不同来源的脂肪酶具有不同的催化特点和催化活力。其中用于有机相合成的具有转酯化或酯化功能的脂肪酶的规模化生产对于酶催化合成精细化学品和手性化合物有重要意义。 脂肪酶是一种特殊的酯键水解酶，它可作用于甘油三酯的酯键，使甘油三酯降解为甘油二酯、单甘油酯、甘油和脂肪酸。 酶是一种活性蛋白质。因此，一切对蛋白质活性有影响的因素都影响酶的活性。酶与底物作用的活性，受温度、pH值、酶液浓度、底物浓度、酶的激活剂或抑制剂等许多因素的影响。
抗氧化酶活性等测定方法
叶绿体得提取 一、试剂配置 １、PＢS提取液:每L水依次加入MES(１9５.2×0。05=９、7６g)、山梨糖醇(0。33×182。2＝60。1２6g)、ＮaCｌ(０、０10×58.5=0、５85g)、MgCｌ(０.002×95=0、19g)、EDＴA(292、２5×０.0０２=０、５84５g)、KH2PO４(２00×0.0005=０、１g);使用时加入ASＡ—Nａ(１98。1×0、00２=0、３962g); 2、悬浮液:将ＰBS提取液中得MES换为238。３×0.05＝１１、９15g得HEＰＥS(238、3×０。05=11。915ｇ); ３、8０%Pｅrｃoｌ:8０ml原液+２0ml水;40％Perｃol:４0ｍl原液＋60ml水; 实际配制: PBS提取液2000ｍl(3个处理*2个品种＊３个重复＊20ml＊３次=1０80mｌ), 悬浮液100ml(３个处理＊2个品种＊3个重复*1mｌ＊3次＝5４ml); 8０％Percol ２０0ml;40%Percｏl 200ml。(3个处理*2个品种*3个重复*3mｌ＊3次=162ｍl) 二、提取步骤 1、10g鲜样加20ｍl提取ＰＢS(50mM MES PH６、1,含0、３3M山梨糖醇,10mM NaＣl,2mMＭgCｌ２,２ｍM EＤTA,０.5 mMKH2PＯ４,2mM ASA—Ｎa,ASＡ—Na使用前现配现加) 2、快速研磨,使叶片碎成绿豆粒大小,４层纱布过滤,去除残渣(注意过滤时不可用力挤压,以免叶绿体膜破碎) 3、滤液20００g ３ｍin,小心倒出上清液,将离心管放入离心机后,使离心机得加速很快上升到预定值(水平转头,加速度调到9),约经30s后很快使其下降停止,整个离心持续大约2—3ｍｉｎ左右完成; 4、沉淀用１ml提取液漂洗表面悬浮物; 5、用1ml悬浮液(５０mM HＥPＥS pＨ7。6,含０、３３mM山梨糖醇,１０mM NaＣl,2mM MgＣl2,2mM EDTA,0。5mMKH2PＯ４,2mM ASA－Ｎａ,ASＡ-Na使用前现配现加)将沉淀悬浮,在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷,或者用手握住离心管在冰块之间搅动,使叶绿体由于震动分散开来,不要用棉球吸滤,以防被膜压破。叶绿体悬浮时要浓点,含叶绿素２ｍg、ml-1以上,这样有利于保持活性。 6、２000g 1min; 7、沉淀再用悬浮液悬浮;(悬浮液同5,可以不做) 8、用Ｐｅrcol试剂进行梯度离心(将3ml含有80％Peｒcｏl(原液按100％算)铺在１0mｌ离心管下层,再把３ｍl 40％Perｃol铺在离心管中层,然后将1mｌ叶绿体悬浮液轻轻铺在离心管上层)１500ｇ2-3mｉn(用
脂肪酶活检测原理及方法
脂肪酶活检测原理及实际方法：一、 原理以及标准曲线做法 1. 对硝基苯酚酯( 4-Nitrophenyl ester )是 脂肪酶水解活力测定中运用最为广泛的一种底物，脂肪酶水解其产生pNP(对硝基苯酚)在碱性条件下显黄色，在410nm 下有吸光值，且灵敏度很高。 2. 所需试剂有： CAS 碳链长度出货号价格名称830-03- 5C2N8130-1G ￥462 对硝基苯乙酸酯2635-54-9 C4 N9876-1G￥570 对硝基苯丁 酸酯 1956-10-1 C821742-1G-F ￥487 对硝基苯辛酸酯 1956-11-2 C12 61716-1G ￥435 对硝基苯月桂酸酯 1492-30-4 C16 N2752-1G ￥379 对硝基苯棕榈酸酯 14617-86-8C18 N3627-1G￥对硝基苯硬酸脂 全部为色谱纯试剂，购于sigma 公司 3. 标准曲线绘制： a. 标准对硝基苯酚母液(2mM ，2mmol / L): 称取的对硝基苯酚(p-NP)溶于100ml 的溶液B(即不同pH 的缓冲液) ，置于棕色试剂瓶内，4℃冰箱保存。 方法一： b. 标准曲线绘制：分别取，，，，，的对硝基苯酚母液(2mM) ，用溶液B(即不同pH 的缓冲液)稀释至4ml ，分别测定在410nm 处的吸收值。以对硝基苯酚浓度x(对应浓度分别是，，，，，，单位：mM ) 为横坐标，吸光值y 为纵坐标，绘制标准曲线。方法二：全部对硝基苯酚经过与测酶活相同的处理，获得吸光度。 b.标准曲线的绘制： 分别取0、、、、15、、30、45μL的对硝基苯酚分别加入、、、55、、40、、μL的异丙醇和 (全部都是)的溶液B，40℃15min，95%乙醇，10000r / min ，3min ，测出标准曲线。
脂肪酶活检测原理及实际方法：
脂肪酶活检测原理及实际方法： 一、原理以及标准曲线做法 1.对硝基苯酚酯（4-Nitrophenyl ester）是脂肪酶水解活力测定中运用最为广泛的一种 底物，脂肪酶水解其产生pNP（对硝基苯酚）在碱性条件下显黄色，在410nm下有吸光值，且灵敏度很高。 2.所需试剂有： CAS 碳链长度出货号价格名称 830-03-5 C2 N8130-1G ￥462 对硝基苯乙酸酯2635-54-9 C4 N9876-1G ￥570 对硝基苯丁酸酯1956-10-1 C8 21742-1G-F ￥487 对硝基苯辛酸酯1956-11-2 C12 61716-1G ￥435 对硝基苯月桂酸酯1492-30-4 C16 N2752-1G ￥379 对硝基苯棕榈酸酯14617-86-8 C18 N3627-1G ￥2621.97 对硝基苯硬酸脂 全部为色谱纯试剂，购于sigma公司 3.标准曲线绘制： a.标准对硝基苯酚母液(2mM，2mmol / L): 称取0.02789g的对硝基苯酚(p-NP)溶于100ml的溶液B（即不同pH的缓冲液），置于棕色试剂瓶内，4℃冰箱保存。 方法一： b.标准曲线绘制： 分别取0.02，0.04，0.06，0.08，0.12，0.16ml的对硝基苯酚母液(2mM)，用溶液B（即不同pH的缓冲液）稀释至4ml，分别测定在410nm处的吸收值。以对硝基苯酚浓度x（对应浓度分别是0.01，0.02，0.03，0.04，0.06，0.08，单位：mM）为横坐标，吸光值y为纵坐标，绘制标准曲线。 方法二：全部对硝基苯酚经过与测酶活相同的处理，获得吸光度。 b.标准曲线的绘制： 分别取0、1.875、3.75、7.5、15、22.5、30、45μL的对硝基苯酚分别加入62.5、60.625、58.75、55、47.5、40、32.5、17.5μL的异丙醇和（全部都是）562.5的溶液B，40℃15min，95%乙醇，10000r / min，3min，测出标准曲线。
脂肪酶活力测定方法及其比较
万方数据
苯萃取后进行比色测定．酶的活力单位定义同平板法．酶活计算同铜皂法． １．３．３对硝基苯酚法 对硝基苯酚法是以对硝基苯酚酯作为底物，脂肪酶水解底物产生具有颜色的对硝基苯酚，在４２０ｎｍ波长下测出其吸光光度值，再对照对硝基苯酚吸光度工作曲线得出脂肪酶活力．这样可以使操作更加简单同时可以避免金属离子的干扰［２．１８｜．酶的活力单位定义为检测条件下每分钟产生１ｂｔｍｏｌ对硝基苯酚所需的脂肪酶量，其计算公式为：脂肪酶活力一ＶＮ（Ｃ（样）一Ｃ（空白））／丁／Ｖ（稀释酶液）．式中。Ｖ反应总体积，Ｎ稀释倍数，Ｃ根据吸光度Ａ求出的对硝基苯酚的浓度，ｔ反应时间，ｙ（稀释酶液）稀释酶液的体积． ２３种方法的比较 ２．１实验仪器和操作难易程度的比较 平板法所使用的主要仪器是超净工作台，微量注射器。培养皿，恒温培养箱，价格便宜，操作简单Ｌ２?１３］；滴定法仅需要酸碱滴定管、试管、恒温水浴锅、酸度计、高速组织捣碎机等一些比较常见，操作简单［”］；比色法包括铜皂法、微乳液法和对硝基苯酚法．铜皂法使用的主要仪器是分光光度计。超声波装置，仪器较常见，但操作繁琐［１５］；微乳液法使用的仪器主要是分光光度计，操作简单。精确度高Ｌ１６—１７］；对硝基苯酚法所使用的仪器主要是分光光度计。操作简单［２?１８］（表１）． ２．２实验试剂及精确度的比较 平板法使用的试剂主要有维多利亚蓝、三丁酸甘油脂、罗丹明Ｂ等，该实验反应时间长且精确度差［１１］．滴定法所使用的主要试剂有氢氧化钠、酸碱指示剂、聚乙烯醇、橄榄油等［１３｜．滴定中酸碱指示剂不能很好地指示反应终点，即使用酸度计代替酸碱指示剂控制反应终点，产物中丙酮酸的干扰使实验的结果偏大［１ｌ’１９］．铜皂法中的底物有３种：榄橄油，三油酸甘油脂和三丁酸甘油脂［１５］．其中榄橄油作为底物，精确度不高，当用三油酸甘油脂和三丁酸甘油脂作为底物检测脂肪酶的活性。精确度较高．微乳液法使用的试剂有三油酸甘油脂，吐温一８０和正己烷，实验重复性好，精确度高Ｌ１６。１７｜．对硝基苯酚法使用的试剂主要是对硝基苯酚，稳定性好且非常精确［２．１８］（表１）． ２．３各种方法的适用范围 平板法所使用的仪器十分常见、所使用的试剂也比较便宜，但该种方法的误差较大同时需要的时间很长．因此该种方法主要应用于产脂肪酶菌种的筛选及批量酶样品的快速测定［１１］；滴定法所使用的仪器常见、操作简单，所使用的试剂比较便宜，精确度较高，适合于学生实验和具备简单仪器的实验室测定脂肪酶的活性［２］；铜皂法所使用的仪器较常见、操作繁琐、稳定性不高。但实验精确度高且试剂较便宜，大部分实验室和生物技术公司用该种方法测定脂肪酶的活性［１５］；微乳液法所使用的仪器常见、操作简单，重复性好，但试剂价格偏高，主要适用于实验室和生物技术公司对酶活性的精确测定［１６－１７］；对硝基苯酚法所使用的仪器常见，但试剂对硝基苯酚价格昂贵且有毒，主要适用于实验室对酶活性的精确测定［２．１８］（表１）． 表Ｉ平板法、滴定法及比色法的比较 ３结论 在脂肪酶活性检测时，可根据实验目的、实验设施及节约成本的原则选择适宜的方法和底物来检测脂肪酶活性．在活性检测过程中，酶活力单位的计算尽量在最适温度、最适ｐＨ、酶浓度以及适宜的底物浓度下进行。从而使测定的脂肪酶活性达到最大值，使结果更加准确和可信．另外，由于酶的活力单位可以根据计算和记录的方便而自行定义。给交流和工业生产造成麻烦，建议在测定脂肪酶的活力时，尽量使用国际单位来计算?４４?酶活． 致谢本文受到贵州省教育厅重点扶持学科基金和凯里学院植物学重点学科基金资助． 参考文献： ［１］ＧＵＰＴＡＲ，ＧｕｐｔａＮＲａｔｈｉＰ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌｌｉｐａｓｅｓ：ａｎｏ’ｖｅｒｖｉｅｗｏｆｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ［Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ—ｇＹ。２００４，６４（６）：７６３—７８１． 万方数据
脂肪酶、淀粉酶测定方法
脂肪酶测定——采用p-NPP法 取0.5g样品，加去离子水10mL，40℃水浴浸泡2h，过滤。取滤液1mL于试管中，加入pH8.0缓冲液3mL和1mmol/L p-NPP溶液0.1mL 于40℃下精确反应3min，迅速置于冰上终止反应。在波长405nm处测定吸光度值。对照管酶液用等体积去离子水代替，其余试剂相同。Npp标准曲线Y=0.287x+0.0861 （y：吸光度x：NPP浓度（umol/L）） 试剂配制： 1mmol/L p-NPP溶液：称取0.0378g pNPP，加入1mL曲拉通-100与5mL异丙醇，用Tris-HCL（pH8.0）定容至100mL。 pH8.0 Tris-HCl：50mL 0.1M tris碱溶液与29.2mL 0.1M HCl溶液混合，加蒸馏水定容至100mL。 淀粉酶测定 称取六神曲0.5g，研细，用20mL去离子水40℃浸泡1h，过滤。取2只250mL的碘瓶，各加入5%的淀粉液25mL，10mL醋酸钠缓冲液（pH4.5），10mL蒸馏水，摇匀，40℃水浴预热5min。A管中加入滤液5mL，准确反应1h，立即加2mol/L HCl 1mL终止反应，B管中先加入HCl，再加滤液5mL。2只碘瓶分别加入0.05mol/L碘液10mL，0.1mol/L氢氧化钠45mL，边滴边振摇，暗处放置20min，加入1mol/L 硫酸2mL，用0.1mol/L硫代硫酸钠滴定至无色。每份样品测定3次。记录消耗硫代硫酸钠的体积，计算得淀粉酶活力。
淀粉酶活力是指1g六神曲粉末在一定条件下(T=40℃，pH=5.0)，1h 内催化可溶性淀粉水解生成葡萄糖的毫克数。计算公式: 淀粉酶活力=［c×(vB－vA)·M·N］/2×m·t 式中:c为硫代硫酸钠的浓度(mol/L)，M为葡萄糖的摩尔质量(g/mol)，N为酶液稀释倍数，V A为样品滴定值(mL)，VB为空白滴定液(mL)，m为六神曲的取样量(g)，t为反应时间(h)，淀粉酶活力单位为mg/(g·h) 。 试剂配制 pH4.5醋酸钠缓冲液：18g醋酸钠加9.8mL冰醋酸，定容至1000mL。1mol/L硫酸溶液：量取6mL浓硫酸，倒入适量水中，用水稀释至100mL。 0.1mol/L碘液：取碘13.0g，加碘化钾36g与水50ml溶解后，加盐酸3滴与水适量使成1000ml，摇匀，用垂熔玻璃滤器滤过。 蛋白酶活力测定 称取六神曲1g，研细，加蒸馏水20ml，于40℃水浴放置1h，间断搅拌，过滤，滤液以磷酸钠缓冲液稀释1倍。取1mL稀释液置离心管中，于40℃水浴预热5min，加入预热的酪蛋白1mL，保温10min，立即加入0.4 mol / L 三氯醋酸2 ml，终止反应，继续置水浴中保温20 min，使残余蛋白质沉淀后离心滤过。取1 mL滤液，加入0.4 mol/L 碳酸钠溶液5 mL，福林试液1 mL，蒸馏水2 mL，摇匀，置水浴锅中，40 ℃保温显色20 min。以试剂溶液为空白，于763 nm 波长处测定吸光度。 在40℃时每1min水解酪蛋白产生1g酪氨酸的酶量，定义为1个蛋白酶活力单位。
土壤酶活性测定方法综合
土壤酶活性测定方法 1、土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法） 一、原理 脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。 土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚—次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。 二、试剂 1）甲苯 2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。 3）柠檬酸盐缓冲液（）：184g柠檬酸和氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至，用水稀释定容至1000ml。 4）苯酚钠溶液（L）：苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和丙酮，用乙醇稀释至100ml （A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。
5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为%，溶液稳定。 6）氮的标准溶液：精确称取硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有氮的标准液；再将此液稀释10倍（吸取10ml标准液定容至100ml）制成氮的工作液（ml）。 三、操作步骤 称取5g土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振荡均匀，15min后加10ml10% 尿素溶液和20ml PH 柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37℃恒温箱培养24小时。培养结束后过滤，过滤后取1ml滤液加入50ml容量瓶中，再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计与578nm波长处比色。（靛酚的蓝色在1h内保持稳定）。 标准曲线制作：在测定样品吸光值之前，分别取0、1、3、5、7、9、11、13ml 氮工作液，移于50ml容量瓶中，然后补加蒸馏水至20ml。再加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计上于578nm波长处比色。然后以氮工作液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。 注意事项: 1、每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作 与样品实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。 2、整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验 试剂纯度和基质自身分解。
最新脂肪酶酶活测定方法
脂肪酶是一种特殊的水解酶，广泛地存在于动物组织、植物种子和微生物体中，是能水解甘油三酯或脂肪酸酯产生单或双甘油酯和游离脂肪酸，将天然油脂水解为脂肪酸及甘油，同时也能催化酯合成和酯交换的酶。其在轻工、化工、医药、食品等行业有广泛的用途。近年来，随着非水酶学和界面酶学的不断深入，脂肪酶应用也不断地扩展，被广泛应用于酯合成、手性化合物的拆分、化工合成中间体的选择性基团保护、高聚物的合成、肽合成等方面，应用前景广阔。脂肪酶在微生物中有广泛的分布。脂肪酶催化的反应是:甘油三酸酯+水→甘油二酸酯+游离脂肪酸→甘油酸酯+游离脂肪酸→甘油+游离脂肪酸。脂肪酶只能在异相系统，即在油-水界面上作用，对水溶性底物无作用，这一点在有机合成中合成手性中间体方面具有很多的优越性。 1 滴定法（参照国家标准，适用于脂肪酶制剂） 1.1 脂肪酶活力定义 为1g固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度的pH条件下，1min水解底物产生1μmol的可滴定的脂肪酸，即为一个酶活力单位，以u/g（u/mL）表示。 1.2 测定原理 脂肪酶在一定条件下，能使甘油三酯水解成脂肪酸、甘油二酯、甘油单酯和甘油，所释放的脂肪酸可用标准碱溶液进行中和滴定，用pH计或酚酞指示反应终点，根据消耗的减量，计算其酶活力。反应式为：RCOOH+NaOH→RCOONa+H2O。 1.3 仪器设备 恒温水浴箱，移液枪，高速匀浆机，pH计，电磁搅拌器 1.4 试剂溶液 95％酒精 4%聚乙烯醇（PVA，聚合度1750±50）：称取4g PVA，加蒸馏水80mL，沸水中加热，并不断搅拌，使其完全溶解，慢速搅拌，以免产生过多气泡，冷却后定容至100mL，用双层纱布过滤后备用。 橄榄油(分析纯) 底物溶液：按4%聚乙烯醇：橄榄油=3:1比例混合，用高速匀浆机处理6min（分两次处理，间隔5min，每次处理3min）。 pH7.5磷酸缓冲液：称取十二水磷酸氢二钠39.62g，磷酸二氢钾1.96g，用水溶解并定容至500mL，调节溶液的pH 到7.5±0.05。 0.05mol/L氢氧化钠按GB/T601配制与标定。使用时稀释10倍。 10g/L酚酞指示液：GB/T603配制。 1.5 待测酶液的制备
纤维素酶活力测定方法_张瑞萍
测试与标准 纤维素酶活力测定方法 张瑞萍 南通工学院(226007) 摘 要 用DN S 为显色剂,分别以滤纸和CM C 为底物,以滤纸糖酶活性(FP A )和羧甲基纤维素酶活性(CM C a se )表征纤维素酶活力。确定酶活测定用波长为530nm,参比溶液应为失活酶、底物和DN S 等共热的反应物;比较了两种底物的酶活力测定方法。结果表明,CM C a se 比FP A 高,说明酶对水溶性底物有较高的活力,也表明吸附对酶的活性部位与纤维素分子链段的结合及催化均有很大影响;对于不同牌号的纤维素酶,织物的酶减量率与CM C 酶活力关系密切。 叙 词: 测试 纤维素酶 活度中图分类号: TS197 纤维素酶是多组分复合物,各组分的底物专一性不同。纤维素酶作用的底物比较复杂,反应产物不同,致使纤维素酶活力测定方法很多,各国的方法亦不统一。我们选择滤纸、CM C 为底物,原理系利用纤维素酶催化水解纤维素,产生纤维多糖、二糖及葡萄糖等还原糖,与显色剂反应,求出还原糖的浓度,间接求出酶的活力。由不同底物测得的酶活力分别称作FPA (滤纸糖酶活力)和CM C ase (羧甲基纤维素酶酶活力)。本文分析确定酶活力测定的主要条件,比较两种底物的酶活力测定方法的结果,探讨纤维素酶活力与织物减量率的关系,为酶在生产中的利用提供依据。 1 实验方法 1.1 化学药品、材料 纤维素酶(工业品),DNS 试剂(自配),冰醋酸,醋酸钠,葡萄糖(均为分析纯),滤纸(定性),羧甲基纤维素酶CM C (试剂级),纯棉针织物半制品(南通针织厂)。 1.2 FPA 滤纸酶活力和CMC 酶活力的测定 取适当稀释的酶液,分别以滤纸或1%的CM C 溶液为底物,于50℃恒温水解反应1h ;然后加入显色剂DNS,沸水浴中煮沸5min;再加入蒸馏水,于530nm 测定吸光度OD 值。 酶活可定义为:每毫升酶液1min 产生1mg 葡萄糖为一个单位( )。 1.3 针织物酶减量率的测定 将酶处理前后的试样在烘箱中105℃烘至恒重。减量率= 处理前织物干重-处理后织物干重 处理前织物干重 ×100% 2 结果与讨论 2.1 显色剂的选择 选用DNS ,在碱性条件下与还原糖反应,生成有色化合物,用分光光度计比色,确定低分子糖含量。 碱性条件下DNS 与还原糖共热反应如下: O 2N OH O 2N CO OH +还原糖 H 2N OH CO OH O 2N DN S(黄色) 3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色) 生成的棕红色氨基化合物系比色法测定基础。2.2 最大吸收波长的确定 选取490～580nm 波长对显色液进行比色。由图1可知,不同浓度的葡萄糖溶液在490～500nm 处有最大吸收,DNS 在此波长下也有较明显的吸收。为了排除DNS 的干扰,选择在波长 530nm 处进行测定,此波长下的葡萄糖吸收虽有所降低,然而符合“吸收最大、干扰最小”的原则。 图1 D NS 与葡萄糖的吸收曲线 2.3 底物及酶本身含糖量的影响 在实验过程中发现,底物特别是滤纸,也含有一定的还原糖,在碱性的DNS 试剂中也会发色。而且,试验所用的纤维素酶是一种工业级的复合酶,品种不同,其本身含糖量也不同。为了排除这类还原糖的干扰,参比溶液取失活后的酶、底物、DNS 等共热的反应物。2.4 葡萄糖标准曲线 用不同浓度的葡萄糖溶液作为标准溶液,与DNS 共热反应显色后,测出其吸光度OD 值(见图2)。标准曲线的线性相关系数R 2为0.9991(见图2),线性相当好,可以用于酶活力的测定。 38 印 染(2002No .8) www .cdfn .com .cn
各种酶活性测定方法
抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定 过氧化氢酶（CAT）活性测定 过氧化物酶（POD）测定方法 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定 小组第一次讨论结果： 一、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定 1.原理 APX 是植物体内重要的抗氧化酶, 主要功能是分解H2O2, 此过程通过抗坏血酸- 谷胱甘肽循环来完成。此外, 它还直接参与抗坏血酸的氧化还原代谢, 而抗坏血酸能有效地清除多种活性氧自由基。因此，APX被认为与果实的抗热性直接相关。 2.所用方法 （1）采用碘液滴定法: 称取新鲜材料1 g，剪碎置研钵中，加少量石英砂及pH值6.0 的磷酸盐缓冲液，迅速研磨成浆，20 ℃下浸提30 min，中间摇动数次，3000 r /min 离心后保留上清液即为酶液。反应底物为抗坏血酸，加入酶液2 mL，20 ℃下反应10 min 后，立即加入偏磷酸1 mL，终止酶的活动，抗坏血酸被消耗的量，可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来进行测定，加淀粉溶液几滴作指示剂，以碘液滴定出现浅蓝色为止，记录滴定值，用底物被消耗的量来表示APX 的活性。每个处理设3 个重复。（2）紫外吸收法： 称取1g芥蓝叶片组织，加入1.6 mL预冷的磷酸缓冲液（PBS-K）（pH 7.8）提取液（含1 mmol·L-1 AsA，3 mmol·L-1β-巯基乙醇，0.5 mmol·L-1PMSF，
2% PVP，1 mM EDTA）。用液氮研磨，提取液于4℃，12000×g离心20 min，上清液用于酶活性的测定。取0.10 ml 酶液（可视情况调整），加入1.70 ml 含0.1 mM EDTA-Na
脂肪酶实验方案
脂肪酶实验方案 富集培养基( %) :酵母膏0. 02 , Na2HPO4 0.35 , K2HPO4 0. 15 , MgSO4·7H2O 0. 05 , NaCl 0.05 , 橄榄油1. 0 , pH 7. 0. 溴甲酚紫筛选平板分离培养基 ( %) : 牛肉膏0. 5 , 蛋白胨1. 0 , NaCl 0. 5 ,葡萄糖0. 3 ,聚乙烯醇1. 0 ,橄榄油2. 5 , 琼脂1. 5 ;灭菌后加入过滤灭菌的溴甲酚紫(50 mg/ 100 mL) 0. 4 mL , pH 6. 0 ,7.0 ,8. 0. 种子培养基( %) :葡萄糖2. 0 , (NH4 ) 2SO4 0.5 , K2HPO4 0. 1 ,MgSO4·7H2O 0. 05 , 蛋白胨2. 5 ,橄榄油1. 0 , pH 7. 0. 发酵培养基( %) :蛋白胨2. 0 , 蔗糖0. 5 , 橄榄油1. 0 , (NH4 ) 2SO4 0. 1 , MgSO4 〃7H2O 0. 05 ,K2HPO4 0. 1 ,pH 自然 产脂肪酶菌株的筛选：将细菌接种到种子培养基上，于30 ℃,200 r/ min 摇床培养24 h，划线于溴甲酚紫筛选平板分离培养基上。观察已生长的菌落周围有无透明圈,有红色水解圈的菌落对应的菌株即为产脂肪酶菌株。 脂肪酶高产菌株的筛选： （1）产脂肪酶菌株发酵培养：将产脂肪酶菌液按1 %的接种量接入50 mL 发酵培养基中(250 mL 三角瓶) ,30 ℃,200 r/ min 摇床培养48 h； （2）上清液的制备：经6000 rpm/min离心10 min，收集上清液，用0.20 μm滤膜对上清液过滤除菌，滤液分装后-20℃保存待用； （3）(i)度法测定各菌株产酶相对大小：在pH7.5, 30℃条件下, 每分钟释放 1 μmol 对-硝基酚( ρ- nitrophenol) 所需的酶量, 定义为一个活力单位。脂肪酶催化对- 棕榈酸硝基苯酯分解产生ρ- nitrophenol, 在该过程中不断测定其光吸收值的变化。根据单位时间产生ρ- nitrophenol 的量来反应脂肪酶的活力。（本实验采用如下方法：分别向各菌株等量上清液中加入等量过量的对- 棕榈酸硝基苯酯，在反应过程中不断测定其光吸收值的变化，根据吸光值变化幅度确定产酶量大小。） [A液:16.5mmol/L的对硝基苯棕搁酸酯(p一NPP)的异丙醇溶液(冷藏，两周内使用)。B液:含有0.4%Trilonx一100和0.1%阿拉伯树胶的50mmol/L的Tris一HCI缓冲液(pH8.0)。测定时，将相应的A液与B液1:9混和，取100ul适当浓度的酶液加人900ul的上述混和液中，混匀，37℃反应10min后，用可见分光光度计(410nm)读取A值。在此反应条件下，对硝基苯的消光系数是1.46x105cm3/mol。1个单位的脂肪酶活力定义为每分钟分解p一NPP并释放出1umol对硝基苯所需的酶量。] (ii)平板法：采用三丁酸甘油脂平板鉴定法,鉴定板含2 %的三丁酸甘油脂乳化液和2 %的琼脂粉。取10μl粗酶液加入鉴定板上各小孔(直径0. 20cm) 中,特定温度下放置12h 后,通过水解透明圈的直径大小来测定脂肪酶酶活性大小。 菌株产酶条件的优化 碳源对产酶的影响；分别选用葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖、玉米粉、糊精、玉米淀粉、大豆油、橄榄油为碳源(均为2 %) 进行发酵,以平板透明圈法测定其产酶情况。
酶活性测定方法
酶活性测定 1、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase) 试剂：0.1% p-nitrophenylphosphate disodium salt（P-硝基苯磷酸二钠） 0.2mol/L 碳酸盐/碳酸氢盐缓冲溶液(pH: 9.6)——buffer 0.2mol/L NaOH 测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% P-硝基苯磷酸二钠及buffer 37°C孵化30 min； (2) 1mL污泥样品+1mL0.1% P-硝基苯磷酸二钠+2mL buffer 37°C孵化30 min； (3) 加入2mL 0.2mol/L NaOH终止反应； (4) 2500g 离心，上清液在410nm测定吸光度。 计算： 每个污泥样品酶活性的测定均包含两个平行样S+一个空白样品S0。 [(S1- S0)+(S2- S0)]/2*0.704 (Eu) 2、酸性磷酸酶(Acid phosphatase) 试剂：0.1% p-nitrophenylphosphate disodium salt（P-硝基苯磷酸二钠） 0.2mol/L HAc/Ac缓冲溶液(pH: 4.8)——buffer 0.2mol/L NaOH 测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% P-硝基苯磷酸二钠及buffer 37°C孵化30 min； (2) 1mL污泥样品+1mL0.1% P-硝基苯磷酸二钠+2mL buffer 37°C孵化30 min； (3) 加入2mL 0.2mol/L NaOH终止反应； (4) 2500g 离心，上清液在410nm测定吸光度。 计算： 每个污泥样品酶活性的测定均包含两个平行样S+一个空白样品S0。 [(S1- S0)+(S2- S0)]/2*0.719 (Eu) 3、a-葡萄糖甘酶(a-glucosidase) 试剂：0.1% p-nitrophenyl a-D glucopyranoside（p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷） 0.2mol/L Tris-HCl (pH: 7.6) 测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷及Tris-HCl 37°C 孵化30 min； (2) 1mL污泥样品+1mL 0.1% p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷+2mL Tris-HCl 37°C孵化
各种酶活力测定方法及注意事项
碱性蛋白酶及各种蛋白酶活力测定方法及测定有感 因长期测定碱性蛋白酶酶活力与角蛋白酶活力与胶原酶活力和弹性蛋白酶活力，碱性蛋白酶活力测定还好，因有国家标准，测定按照国标来便可大大减少误差。其余酶活力测定过程中因无统一标准且底物差异大，导致长期酶活力测定的混乱，各种酶活力测定方法与各种试剂添加，最后实际测定的酶活力只能仅作参考。 以下是各种蛋白酶活力测定方法及标曲绘制： 碱性蛋白酶测定方法 根据国标GB/T 23527-2009 附录B 蛋白酶活力测定福林法 以下是方法
碱性蛋白酶的测定方法参考 GB/T 23527-2009 附录 B 中福林酚法进行，即 1 个酶活力单位（U/mL）定义为 1 mL 酶液在 40℃、pH= 10.5 条件下反应 1 min 水解酪蛋白产生 1 μg 酪氨酸所需要的酶量，主要步骤如下。 2.2.6.1 标准曲线的绘制 （1）L-酪氨酸标准溶液：按表 2-6 配制。 表 2-6 L-酪氨酸标准溶液配置表 Table 2-6 L-Tyrosine standard solution form 管号酪氨酸标准溶液的浓度/ （μg/mL） 取 100 μg/mL 酪氨酸标准 溶液的体积/（mL） 取水的体积/ （mL）
0 0 0 10 1 10 1 9 2 20 2 8 3 30 3 7 4 40 4 6 5 50 5 5 （2）分别取上述溶液各 1.00 mL，各加 0.4 mol/L 碳酸钠溶液 5.0 mL，福林试剂使用 液 1.00 mL，置于 40 ℃±0.2 ℃水浴锅中显色 20 min，用分光光度计于波长 680 nm，10 mm 比色皿，以不含酪氨酸的反应管作为空白，分别测定其吸光度值，以吸光度值 A 为纵坐标，酪氨酸浓度 C 为横坐标，绘制 L-酪氨酸标准曲线。 图 2-1 L-酪氨酸标准曲线 Fig. 2-1 L-tyrosine standard curve 根据作图或用回归方程计算出当吸光度为 1 时的酪氨酸的量（μg），既为吸光度常数 K 值。其 K 值应在 95-100 范围内。上图所示标准曲线符合要求，可用于下一步实验。 2.2.6.2 测定方法 （1）计算方法 X = A × K × 4 / 10 × n = 2 / 5 × A × K × n 式（2-1） 式中，X —样品的酶活力，μ/g； A —样品平行实验的平均吸光度； K —吸光常数； 4 —反应试剂的总体积，mL； 10—反应时间 10 min，以 1 min 计； n —稀释倍数。 （2）测定方法 ①先将干酪素溶液放入 40 ℃±0.2 ℃恒温水浴中，预热 5 min。 ②按下列程序操作，进行测定。 于 680 nm 波长，用 10 mm 比色皿测其吸光度。
粮食脂肪酶活力、脂肪酸及其组成测定
粮食脂肪酶活力、脂肪酸及其组成测定 试验方法 脂肪酶活力的测定 参考文献(Aizono et al.，1973)的方法。准确称取6.00g糙米粉，加入Tris-HCl (pH7.5)定容至25mL，振荡均匀，置于4℃下浸提1 h，然后于4℃下10000 r/min 冷冻离心15min，过滤。取滤液l.5mL于试管中，依次加入l mL 0.5 mol/L KCl，l mL 5 m mol/L CaCl2，0.5mL Tris-HCl (pH7.5)，然后置于37℃恒温水浴摇床中保温10 min，加入l mL三乙酸甘油酯在37℃恒温水浴摇床中震荡反应l h，沸水浴灭酶10min。以酚酞-乙醇为指示剂，采用0.05 mol/L NaOH滴定至微红，记录滴定所消耗的体积V。 脂肪酶活力定义为：在上述反应条件下，每分钟消耗0.05 mol/L NaOH 0.01mL为1个酶活力单位U。 酶活力(U) = (V-V0)×l00 / t 其中：V为样品所消耗NaOH的体积(mL)，V0为空白消耗NaOH的体积(mL)，t为反应时间(min)，100为NaOH体积转化为酶活力单位的系数。数据处理以每克绝干糙米中脂肪酶活力进行分析。 游离脂肪酸含量的测定 参考GB/T15684-1995的方法。准确称取5.00 g糙米粉于250 mL锥形瓶中，加入40 mL无水乙醇在25 ℃恒温振荡10 min，过滤。取25 mL滤液用标准KOH-乙醇溶液滴定。以每100g绝干稻谷消耗的KOH毫克数表示游离脂肪酸的含量。脂肪酸组成的测定 样品处理：准确称取糙米粉10.00g置于100mL锥形瓶中，加入20mL氯仿-甲醇溶液(体积比为2：l)，用均质机均质20s，然后用5mL氯仿-甲醇溶液洗涤均质
酶活性测定方法
一、过氧化物酶（POD）活性的测定 POD测定参照李合生等（2003）的愈创木酚法方法进行测定，略加改动。 测定：称取样品0.5g，加入5mL 1／15mol／L PH=7.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成匀浆，4℃条件下12000r/min离心15min，上清液为粗酶液。然后在试管中加pH 7.0的磷酸缓冲液2 ml，愈创木酚（0.2%）0.5ml，浓度为0.15%的H2O2 0.5ml，取0.3ml的酶提取液加入到试管中，空白以缓冲液代替。在470nm下测定其吸光度，加入酶液时开始计时，每隔30s读数一次，连续记录5分钟。以每分钟每克鲜重增加0.1的酶量作为一个酶活性单位。 △470 ×V T POD活性= 0.01×t×Vs×W 式中：△470----反应时间内吸光度值的变化； V T ----提取酶液的总体积（ml） t----反应的时间（min） Vs ----测定时取用酶液体积（ml） W----样品鲜重（g） 二、多酚氧化酶（PPO）活性的测定 多酚氧化酶活性测定参照朱广廉等(1990)的方法，略加改动。 酶液制备：称取样品0.5g，加入5mL 0.1mol／L PH=6.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成浆，4℃条件下12000r/min离心15min后上清液即为粗酶液。 PPO活性测定：反应试管中分别加入0.1 mL酶液+3.9 mL磷酸缓冲液+ 1 mL 1m mol／L的邻苯二酚。混匀后于30℃保温10 min，迅速加入2 mL质量分数为20％的三氯乙酸终止反应，立即于525nm下测定其吸光度值，计算酶活。 PPO活性= O D×V T 0.01×t×0.5g×V s = O D×V T 0.005 OD——反应时间内吸光值的变化； V T ----提取酶液的总体积（ml） Vs ----测定时取用酶液体积（ml） T———反应时间(min)；
脂肪酶
脂肪酶的应用进展综述 09生物技术0902021040 陈莹莹 摘要：脂肪酶被认为是工业中很重要的一利酶。本文概述了当前研究中广泛使用的脂肪酶及其固定化产品的应用途径, 包括在食品加工、饲料、纺织、医药、生物柴油和传感器等领域中的应用。脂肪酶应用的主要障碍是其成本高。但技术进步尤其是基因技术的发展有望使成本降低, 脂肪酶在药物合成中的应用在本文中也作了展望。 关键词：脂肪酶；性质；生产；来源，应用 脂肪酶（Triacylglycerol lipase E C3.1.1.3）是广泛存在的一种酶，在脂质代谢中发挥重要的作用。在油水界面上，脂肪酶催化三酰甘油的酯键水解，释放更少酯键的甘油酯或甘油及脂肪酸。脂肪酶反应条件温和，具有优良的立体选择性，并且不会造成环境污染，因此，在食品、皮革、医药、饲料和洗涤剂等许多工业领域中均有广泛的应用。 一、脂肪酶的来源 脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。在动物体内，各类脂肪酶控制着消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代谢等过程；细菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更为丰富(Pandey等)。由于微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用p H、作用温度范围以及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高纯度样品，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源，并且在理论研究方面也具有重要的意义。 二、脂肪酶的性质 脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等(Hara；Schmid)。脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。 脂肪酶的性质研究主要包括最适温度与pH、温度与pH稳定性、底物特异性等几个方面。迄今，已分离、纯化了大量的微生物脂肪酶，并研究了其性质，它们在分子量、最适pH、最适温度、pH和热稳定性、等电点和其他生化性质方面存在不同(V eeraragavan等)。总