牛膝的HPLC_UV_MS指纹图谱研究

紫外吸收光谱,结果见表(不包括末端吸收)。

　表山海螺提取液的紫外吸收峰

溶剂水甲醇氯仿石油醚吸收峰位值268277271269 (nm)258241

参考文献

1　《全国中草药汇编》编写组1全国中草药汇编(上册)1北京:人民卫生出版社,1975∶

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195

(2003-06-24收稿)

?化学成分?

牛膝的HPL C/UV/MS指纹图谱研究

王源园1　张尊建1　王兴旺2　徐向阳2　张　蕙2

(11中国药科大学分析测试中心,南京210009;21金陵药业股份有限公司技术中心,南京210009) 摘要　目的:采用HPLC/UV/MS法构建牛膝药材的指纹图谱。方法:采用Agilent Z orbax SB2C18柱;甲醇与

011%甲酸进行梯度洗脱;流速为110ml/min。结果:得到分离度、重现性均较好的牛膝药材HPLC/UV指纹图谱,标示了4个共有峰,并借助HPLC/MS技术对其主要色谱峰进行了初步归属。结论:牛膝药材指纹图谱的构建,为控制其质量提供了依据。

关键词　牛膝　指纹图谱　HPLC/UV/MS

牛膝为苋科植物牛膝A chyranthes bi dentata Bl1的干燥根,具有补肝肾、强筋骨、逐瘀通经、引血下行之功效〔1〕。牛膝中含有皂苷类、植物甾酮类、糖类、黄酮类等化学成分〔2〕。植物甾酮类化合物主要为蜕皮甾酮(ecdysterone,EDS)和牛膝甾酮(i2 nokosterone),这两种甾酮为同分异构体。目前,对牛膝药材有效成分的含量测定多有报道〔3～8〕,但对其指纹图谱的研究尚未见报道。本文采用HPLC/ UV法对牛膝药材的指纹图谱进行了研究,得到分离度、重现性均较好的药材指纹图谱,并利用HPLC/MS技术对其主要色谱峰进行了初步归属,为控制牛膝药材质量提供了依据。

1　仪器与试剂

Agilent1100LC/DAD系统(含在线真空脱气机,低压四元梯度泵,自动进样器,柱温箱,二级管阵列检测器(DAD),HP Chemstation色谱工作站); Agilent1100LC/DAD/MS系统(含在线真空脱气机,高压二元梯度泵,恒温自动进样器,柱温箱,二极管阵列检测器(DAD)、电喷雾(ES)接口)。甲醇(Merck,色谱纯),甲酸、乙醇(分析纯),双蒸水,蜕皮甾酮对照品(南京金陵药业股份有限公司提供),牛膝药材产自河南武陟,经中国药科大学中药学院徐珞珊教授鉴定为牛膝A chyranthes bi dentata Bl1。2　方法与结果

211　供试品溶液的制备　取干燥牛膝药材粉末(40目)215g,置100ml圆底烧瓶中,加无水乙醇25 ml,90℃水浴回流2h,冷却,过滤。滤液在90℃水浴下挥干,冷却,50%甲醇5ml溶解,用0145μm微孔滤膜过滤,作为供试品溶液。

212　参照物溶液的制备　取蜕皮甾酮对照品适量,50%甲醇溶解,制成每1ml约含100μg的溶液,作为参照物溶液。

213　色谱条件及测定方法　色谱柱:Agilent Z or2 bax SB2C18柱(150mm×416mm,5μm);流动相:甲醇(A)与011%甲酸(B),梯度洗脱:0～5min(5% A,95%B),5～60min(5%A～100%A,95%B～0),流速:110ml/min;检测波长:254nm;柱温25℃;柱后分流014ml/min进质谱仪,同时记录总离子流(TIC)图。离子极性:ESI(+);扫描范围: 100～1000;干燥气流速:10L/min;干燥气温度: 350℃;雾化室压:40psi;毛细管电压:4000V;传输电压:70eV;进样量20μl。

214　方法学考察

21411　空白试验:吸取50%甲醇20μl,注入高效液相色谱仪,记录色谱图,结果表明无干扰。

21412　参照物试验:吸取蜕皮甾酮参照物溶液20μl,注入高效液相色谱仪,记录色谱图。

21413　稳定性试验:取同一供试品溶液,分别于0、

1、2、4、12、24h进样检测。各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积比值的RSD均小于2145%,表明样品在24h内稳定。

21414　进样精密度试验:取同一供试品溶液,连续进样6次。各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积比值的RSD均小于1115%,表明精密度良好。21415　重现性试验:取同一批药材,按“211”项下方法分别制备供试品溶液6份,进样检测。各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积比值的RSD 均小于1176%,表明方法的重现性好。

215　样品测定及结果　取10批牛膝药材,分别按供试品溶液制备方法制备并检测。以蜕皮甾酮的色谱峰为参照物峰,共标示了4个共有峰。其相对保留时间和相对峰面积比值分别见表1和表2。

表110批牛膝药材的相对保留时间

峰号批次1批次2批次3批次4批次5批次6批次7批次8批次9批次10 101276012760127601276012590127601276012620127601276 201299012990129901299012840123001299012860129901299 3(s)11000110001100011000110001100011000110001100011000 411023110231102311023110231102311023110231102311023 表210批牛膝药材的相对峰面积

峰号批次1批次2批次3批次4批次5批次6批次7批次8批次9批次10 101167011350110901113011630108101111011620113101089 211533115541117811280113191114611178115351118511122 3(s)11000110001100011000110001100011000110001100011000 401272012470125001241012780125701275012750125201255 注:s为参照物

3　讨论

311　色谱指纹图谱　根据10批牛膝药材的测定结果,并参照国家药品监督管理局颁发的“中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)”〔9〕,制定了牛膝药材的指纹图谱。其中0～5min为非保留组分,不进入积分:5～55min中有4个峰是各批供试品所共有的,因此确定这4个峰为共有指纹峰,以t R 3017min的蜕皮甾酮色谱峰为参照。各共有峰相对保留时间与相对峰面积比值如下:峰号(相对保留时间):1(01273),2(01297),3(s,11000),4(11023);峰号(相对峰面积):1(01126),2(11297),3(s, 11000),4(11259),其中2号峰的单峰面积占总峰面积大于20%,因此其相对峰面积比值的认定范围为±20%(即11038～11556)。共有峰总面积占总峰面积的90%以上。

312　质谱分析　利用HPLC/MS技术,对牛膝供试品进行了质谱的正离子检测,并根据离子质谱图及相关文献,对色谱图中的主要色谱峰进行了初步归属。牛膝LC/MS图谱中,t R912min的色谱峰表现为m/z127[M+H]+峰,同时存在m/z109[M+ H-H2O]+峰,推测为牛膝中的52羟甲基糠醛; HPLC/UV对照品试验表明t R3112min的化合物为蜕皮甾酮,分子量为480,相同位置处MS谱图中出现了蜕皮甾酮m/z481[M+H]+、m/z503[M+ Na]+、m/z519[M+K]+峰,并伴有m/z463[M+H2H2O]+、m/z445[M+H22H2O]+、m/z427[M+ H23H2O]+的系列脱水峰;LC/MS图中t R3119min 的色谱峰也表现为m/z481[M+H]+、m/z503[M +Na]+、m/z519[M+K]+峰,以及m/z463[M+ H2H2O]+、m/z455[M+H22H2O]+的系列脱水峰,推测为蜕皮甾酮的同分异构体牛膝甾酮。

参考文献

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3

(2003-05-13收稿)

Study on the Fingerprints of Achyrant hes bidentata B l1by HPLC/UV/MS

Wang Yuanyuan1,Zhang Zunjian1,Wang Xingwang2,Xu Xiangyang2,Zhang Hui2

(11The Center for Instrumental Analysis,China Pharmaceutical University,Nanjing210009;21Technical Center,Jinling Pharma2 ceutical Company Limited,Nanjing210009)

Abstract　Objective:To establish the fingerprints of Achyranthes bidentata Bl1by HPLC/UV/MS1Method:Separation was performed on Aglient Z orbax SB2C18column1Gradient elute was performed by the mobile phase consisting of methanol and011% formic acid2water with the flow rate of110ml/min1Result:Perfect fingerprints were obtained which can be used for the evaluation of Achyranthes bidentata Bl1Four common peaks were confirmed in fingerprints1Three compounds were elucidated as52hydrox2 ymethyl furaldehyde,ecdysterone,inokosterone by HPLC/MS1Conclusion:The method can be applied to the quality control of Achyranthes bidentata Bl1

K ey w ords　Achyranthes bidentata Bl1;Fingerprints;HPLC/UV/MS

姬松茸中挥发性风味物质的GC2MS分析

邢增涛1　郭　倩1　冯志勇1　郭力刚1　刘玉敏2

(11农业部食用菌遗传育种重点开放实验室、上海市农业遗传育种重点实验室、上海市农业科学院食用菌研究所,上海201106;21上海交通大学分析测试中心,上海200030)

摘要　利用顶空GC2MS技术对姬松茸新鲜子实体和固体发酵的菌丝体挥发性风味物质进行了分析。在子实体中检测出7种主要的挥发性风味物质,其中以苯甲醛和苯甲醇为主,相对含量分别达到43120%和28198%;在菌丝体中检测出16种主要的挥发性风味物质,其中苯甲醛相对含量最高,达38150%。苯甲醛和苯甲醇是姬松茸中的主要风味物质。

关键词　姬松耳　苯甲醛　苯甲醇

姬松茸(A garicus blazei Murill)属担子菌纲伞菌目蘑茹科蘑茹属,因原产于北美南部和巴西、秘鲁等地,所以又称“巴西蘑菇”。我国在1992年引种栽培成功,目前姬松茸已在全国各地广泛栽培。姬松茸为美味食药用真菌,子实体脆嫩爽口,芳香浓郁,肉质甘美,质地细腻,口感极佳。研究表明姬松茸具有抑制肿瘤、降低血脂、抗癌和抗凝血作用,可以预防心脑血管疾病,提高肌体的免疫力〔1～5〕。姬松茸在菌丝生长阶段会散发出浓郁的苦杏仁香味,它的子实体也同样具有苦杏仁香味,苦杏仁味甚至要浓于杏鲍菇(该菇因具有苦杏仁味而得名),但也有人因此而不喜欢姬松茸的风味。Hui2Ling Chang等〔6〕曾对姬松茸菌丝体中非挥发性呈味物质进行了研究,发现甜味物质的总含量超过10%(主要检测三种糖:阿拉伯糖、葡萄糖、海藻糖);总游离氨基酸的含量为7101mg/g,其中丙氨酸为1105mg/g,缬氨酸为1176mg/g,但类似味精风味的氨基酸含量则较低,其中天门冬氨酸为015mg/g,而谷氨酸则没有检出;风味核苷酸在姬松茸菌丝体中含量处于较高水平,达到5151mg/g。但有关姬松茸中挥发性风味物质的研究国内外均未见报道。为了系统地了解姬松茸中芳香性成分,研究这些物质在姬松茸生长发育过程中的生理作用,进一步利用姬松茸固体发酵技术或生物工程技术来生产食品添加剂或药物的前体物,我们对姬松茸子实体和固体发酵物中的挥发性成分进行了GC2MS分析。

1　材料与方法

111　样品来源　新鲜姬松茸子实体和固体发酵物由上海市农科院食用菌研究所提供。姬松茸子实体栽培的培养料主要是稻草;固体发酵的培养基主要是小麦,菌丝体生长时间为60天。

112　样品处理　将新鲜的姬松茸子实体和固体发酵的姬松茸菌丝体,以及对照品培养基小麦(也经过高温灭菌处理)用旋转混合器打碎后,直接取样,顶空进样。

113　GC2MS分析　分析仪器:色谱仪为美国PE 公司Auto System XL TM G as Chromatograph;色谱柱为PE25MS(30m×0125mm×0125μm);载气为氦气(991999%),12psi;柱温为程序升温:60℃(5min),以3℃/min升温至120℃(1min),再以20℃/min升

中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)

中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)

关于印发《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》的通知 国药管注[2000]348号 2 年 8 月 1 5 日 发 布 各省、自治区、直辖市药品监督管理局：为加强中药注射剂质量管理，我局在《关于加强中药注册管理有关事宜的通知》(国药管注［2000］157号) 中要求“中药注射剂应固定药材产地，建立药材和制

剂的指纹图谱标准，具体要求另行发布”。据此，我局在组织专家论证的基础上制定了《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》，现予发布，并就有关事宜通知如下：一、新的中药注射剂指纹图谱标准复核，临床试验用药品，其药材和制剂的指纹图谱标准由省级药品检验所复核；生产用药品，其制剂的指纹图谱标准由中国药品生物制品检定所进行二次复核。二、已批准生产的中药注射剂，其质量标准若缺乏内在质量控制指标和无严格工艺条件，应提高和完善并起草试行标准，在此基础上制订药材和制剂的指纹图谱标准，试行标准起草管理要求同《中药仿制药品试行标准管理规定》，此项工作由国家药典委员会组织实施。三、已批准多家生产的中药注射剂，各生产厂家可根据实际情况单独或联合起草药材和制剂的指纹图谱。联合起草工作由国家药典委员会牵头组织进行。四、已批准生产的中药注射剂，其药材和制剂的指纹图谱标准复核由省级药品检验所进行，需二次复核的品种由国家药典委员会组织完成。五、制定指纹图谱所需的对照品(单一化合物或提取物)，由生产单位向中国药品生物制品检定所提供对照品原料及有关技术资料，经标

定合格后统一发放。附件：《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》国家药品监督管理局二○○○年八月十五日中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）为了加强中药注射剂的质量管理，确保中药注射剂的质量稳定、可控，中药注射剂在固定中药材品种、产地和采收期的前提下，需制定中药材、有效部位或中间体、注射剂的指纹图谱。一、注射剂用中药材指纹图谱研究的技术要求中药材指纹图谱系指中药材经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示该中药材特性的共有峰的图谱。如原药材需经过特殊炮制（如醋制、酒制、炒炭等），则应制定原药材和炮制品指纹图谱的检测标准。(一)指纹图谱的检测标准包括名称、汉语拼音、拉丁名、来源、供试品和参照物的制备、检测方法、指纹图谱及技术参数。有关项目的技术要求如下： 1.名称、汉语拼音按中药命名原则制定。 2.来源 包括原植、动物的科名、中文名、拉丁学名、药用部位、产地、采收季节、产地加工、炮制方法等，矿物药包括矿物的类、族、矿石名或岩石名、主要成分、产地、产地加工、炮制方法等。动、植物药材均应固

中药液相色谱指纹图谱实验研究过程中的注意事项

中药液相色谱指纹图谱实验研究过程中的注意事项 （材料整理） 一、供试品收集 供试品收集是研究指纹图谱最初也是最关键的步骤，由于不可能对一个药材的所有样本进行试验，而且生长环境条件对药材代谢产物有影响，所以要收集有代表性的供试品。收集不少于10批供试品的含义是指样本的数和量要有足够的代表性。 (一) 原料药材：在药材的化学成分与中医临床疗效的之间的关联尚未能阐明的现阶段，基本上是在承认其传统的功能主治及临床验证的基础上进行指纹图谱的实验研究。原料药材的指纹图谱主要是反映其自然状态的内在质量情况，研究其指纹图谱是以此作为选择原药材投料或混批提取的依据，同时作为研究注射剂成品指纹图谱相关性的基础。由于自然条件的变化，药材个体之间指纹图谱的差异是正常的，在品种鉴定无误的基础上，力争药材有较为固定和稳定的来源，个体之间的指纹图谱主要特征大致相似即可，使成品指纹图谱特征的稳定有起码的保证。 药材名称 供试品来源（真实记录供试品来自何处：传统产地收集或是资源丰富的产地收集，或者来自GAP基地供应；还是产地购买、市场购买或委托购买，等，以便于生产原料的采购选择和测试数据的可追溯）。 收集时间（购买时间）及收集人 货源情况调查（货源是否充足和稳定） 基原鉴定及鉴定人：产地或GAP基地收集的药材结合植物形态鉴定品种。如缺原植物，由熟练的专业人员凭性状或显微特征鉴别。如近缘品种、难以区分的野生品种（如白花蛇舌草、蒲公英），应在指纹图谱研究中仔细比较，如获得的指纹图谱相似度很高，也可应用，但须明确记录。并在今后实施GAP时确定一个品种，如指纹图谱相似度很低，则须确定品种，改为栽培品使用。商品混乱的品种（如陈皮）产区的选择应缩小范围，并结合资源选用药典收载品种中的一种。复方制剂中的君药及处方量大的药材必需重点注意品种的鉴定，以避免今后执行指纹图谱过程中出现难以预料的困难。 质量评估：为了便于对色谱的正确分析，减少试验结果的判断误差，首先药材需符合药典或部颁标准规定，并详细记录。所有药材均须编号，必要时附药材外形照片。 如以中药饮片或炮制品为起始原料，应采用符合中国药典或饮片炮制规范的供试品。

紫菀药材的高效液相色谱指纹图谱与定量分析讲解

生长在同一地段而致误采。其二是三脉叶马兰生长范围较广而且量多，某些药农见利忘义有意伪充。 ４．２ 药材切成饮片后，形状上较难分辩，但二者的 头状花序较易区分，刘寄奴的呈椭圆形，白色似米粒，小花全为管状花，其叶脉羽状，无离基三出脉。药材具芳香气，味淡。而三脉叶马兰头状花序呈半球形，较大，小花有舌状花和管状花，其叶有离基三出脉和羽状脉。气微，苦、辛。４．３ 二者的显微特征差别较大，刘寄奴药材表面 具“Ｔ”字形非腺毛，腺毛顶面观呈鞋底形；叶主脉底部钝圆略呈圆锥形，上表面稍突起，且中央微凹。叶 图６三脉叶马兰的粉末显微特征 １．非腺毛２．草酸钙针晶３．方晶４．腺毛５．簇晶６．花粉粒７．叶下表皮及气孔 肉组织与茎髓薄壁细胞中有草酸钙簇晶散在。三脉叶马蓝无“Ｔ”字形非腺毛，叶主脉上下面突起明显，底部钝圆呈半圆形。髓部薄壁细胞内含多数短小的草酸钙针晶。二者花粉粒的形态和大小，表面特征差异也较明显。 参 １ 处理２０ｍｉｎ，过滤，取滤液加９５％乙醇稀释至适量浓度。于岛律ＵＶ２４５０型紫外分光度计上，在２００— ４００ ｎｍ波长范围内测定其紫外光谱。结果：刘寄奴 考 文献 在３３０ｎｍ波长处有一最大吸收峰，在３００ｎｍ波长处有肩峰；而三脉叶马兰仅在３２９ｎｍ波长处有一最大吸收峰。 ４４．１ 中国医学科学院药用植物资源开发研究所，中国医学科学院药物研究所等．中药志．第四册．ｊＥ京：人民卫生 出版，１９８８：４３ 讨论 刘寄奴的混杂原因可能有二：其一是二者均 ２ 李时珍．本草纲目（校点本，上册）．北京人民出版社，

１９９ｌ：９５９ 来源于菊科植物，在开花之前茎叶的形状和色泽均有相似之处，其生长环境与习性相似，且二者常混杂 （２００３一１１—２６收稿） 紫菀药材的高效液相色谱指纹图谱与定量分析 周军辉１伍蔚萍１谢子民２孙文基ｈ （１．西北大学陕西省生物医药重点实验室，西安７１００６９；２．西安市药品检验所，西安７１００６８） 摘要目的：建立紫菀药材的反相液相色谱定性和定量鉴别分析方法。方法：Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ ＯＤＳ Ｃ。。色谱柱（２５０ ｍｍ×４．６ｍｍ，５斗ｍ），流动相为甲醇－乙腈（１：２）－０．４％磷酸梯度洗脱，流速为１．０ｍｌ／ｍｉｎ，检测波长为３６０ｎｍ，柱温为２５℃。紫菀药材经８０％甲醇超声处理，进行指纹图谱分析，并对紫菀药材中的主要成分槲皮素进行含量测定。结果ｉ在该色谱条件下，６份不同紫菀药材的ＲＰ－ＨＰＬＣ指纹图谱中可检出１０个共有峰作为定性鉴别；紫菀药材中槲皮素的含量在０．１３５％一０．２４６％之间。结论：本方法样品处理简便，准确性好，可用于紫菀药材的质量控制。 关键词 紫菀槲皮素反相高效液相色谱法 紫菀为菊科植物Ａｓｔｅｒ ｔａｔａｒｉｃｕｓ Ｌ￡的干燥根 在我们制定的紫菀指纹图谱中，含有分离较好的槲皮素色谱峰，这样，既可以得到指纹图谱提供的紫菀化学成分组成信息，又可测定槲皮素有效成分的含量。１ 及根茎，有润肺下气、消痰止咳的功能，用于痰多喘咳，新久咳嗽，劳嗽咳血，是许多常用的止咳平喘复方中药制剂中的重要药物之一。槲皮素（ｑｕｅｒｃｅ．ｔｉｎ）为紫菀中已知的有效成份之一，现代药理研究表明，它具有较好的祛痰、止咳和一定的平喘作用。 －５６２? 仪器与试药 ＢｅｃｋｍａｎＧｏｌｄ Ｓｙｓｔｅｍ高效液相色谱仪，包括

中药注射剂指纹图谱研究的技术要求

中药注射剂指纹图谱研究的技术要求 (草案) 为了加强中药注射剂的质量管理，确保中药注射剂的质量稳定、可控，中药注射剂在固定中药材品种、产地和采收期的前提下。需制定中药材、有效部位或中间体、注射剂的指纹图谱。 一、注射剂用中药材指纹图谱研究的技术要求 中药材指纹图谱系指中药材经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示该中药材特性的共有峰的图谱。如原药材需经过特殊炮制(如醋制、酒制、炒炭等)，则应制定原药材和炮制品指纹图谱的检测标准。 (一)指纹图谱的检测标准 包括名称、汉语拼音、拉丁名、来源、供试品和参照物的制备、检测方法、指纹图谱及技术参数。有关项目的技术要求如下： 1.名称、汉语拼音 按中药命名原则制定。 2.来源 包括原植、动物的科名、中文名、拉丁学名、药用部位、产地、采收季节、产地加工、炮制方法等，矿物药包括矿物的类、族、矿石名或岩石名、主要成分、产地、产地加工、炮制方法等。动、植物药材均应固定品种、药用部位、产地、采收期、产地加工和炮制方法，矿物药应固定产地和炮制、加工方法。供试品的取样参照《中国药典》2000年版中规定的中药材的取样方法，以保证供试品的代表性和均一性。 3．供试品的制备 应根据中药材中所令化学成分的理化性质和检测方法的需要，选择适宜的方法进行制备。制备方法必须确保该中药材的主要化学成分在指纹图谱中的体现。对于仅提取其中某类或数类成分的中药材，除按化学成分的性质提取各类成分制定指纹图谱外，还需按注射剂制备工艺制备供试品，制定指纹图谱，用以分析中药材与注射剂指纹图谱的相关性。

4．参照物的制备 制定指纹图谱必须设立参照物，应根据供试品中所合成分的性质，选择适宜的对照品作为参照物，如果没有适宜的对照品，可选择适宜的内标物作为参照物。参照物的制备应根据检测方法的需要，选择适宜的方法进行。 5．测定方法 包括测定方法、仪器、试剂、测定条件等。应根据中药材所合化学成分的理化性质，选择适宜的测定方法。建议优先考虑色谱方法。对于成分复杂的中药材，必要时可以考虑采用多种测定方法，建立多张指纹图谱。以色谱方法制定指纹图谱所采用的色谱柱、薄层板、试剂、测定条件等必须固定；以光谱方法制定指纹图谱，相应的测定条件也必须固定。 6．指纹图谱及技术参数 (1)指纹图谱 根据供试品的检测结果，建立指纹图谱。采用高效液相色谱法和气相色谱法制定指纹图谱，其指纹图谱的记录时间一般为l小时；采用薄层扫描法制定指纹图谱，必须提供从原点至溶剂前沿的图谱；采用光谱方法制定指纹图谱，必须按各种光谱的相应规定提供全谱。对于化学成分类型复杂品种，必要时可建立多张指纹图谱。 指纹图谱的建立：根据10批次以上供试品的检测结果所给出的相关参数，制定指纹图谱。 (2)共有指纹峰的标定 采用色谱方法制定指纹图谱，必须根据参照物的保留时间，计算指纹峰的相对保留时间。根据10批次以上供试品的检测结果，标定中药材的共有指纹峰。色谱法采用相对保留时间标定指纹峰，光谱法采用波长或波数标定指纹峰。 (3)共有指纹峰面积的比值 以对照品作为参照物的指纹图谱，以参照物峰面积作为1，计算各共有指纹峰面积与参照物峰面积的比值；以内标物作为参照物的指纹图谱，则以共有指纹峰中其中一个峰(要求峰面积相对较大、较稳定的共有峰)的峰面积作为1，计算其它各共有指纹峰面积的比值。各共有指纹峰的面积比值必须相对固定。中药材的供试品图谱中各共有峰面积的比值与指纹图谱各共有峰面积的比值比较，单峰面积占总峰面积大于或等于20％的共有峰，其差值不得大于土20％；单峰面积占总峰面积大于或等于10％，而小于20％的共有峰，其差值不得大于土25％；单峰

DNA指纹图谱分析

DNA指纹图谱法的基本操作：从生物样品中提取DNA（DNA一般都有部分的降解），可运用PCR 技术扩增出高可变位点（如VNTR系统，串联重复的小卫星DNA等）或者完整的基因组DNA，然后将扩增出的DNA酶切成DNA片断，经琼脂糖凝胶电泳，按分子量大小分离后，转移至尼龙滤膜上，然后将已标记的小卫星DNA探针与膜上具有互补碱基序列的DNA片段杂交，用放射自显影便可获得DNA指纹图谱。 琼脂糖凝胶电泳是分离，鉴定和纯化DNA片段的常规方法。利用低浓度的荧光嵌入染料-溴化乙锭进行染色，可确定DNA在凝胶中的位置。如有必要，还可以从凝胶中回收DNA条带，用于各种克隆操作。琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至近50kbp的DNA。长度100kb或更大的DNA，可以通过电场方向呈周期性变化的脉冲电场凝胶电泳进行分离。在基因工程的常规操作中，琼脂糖凝胶电泳应用最为广泛。它通常采用水平电泳装置，在强度和方向恒定的电场下进行电泳。DNA分子在凝胶缓冲液（一般为碱性）中带负电荷，在电场中由负极向正极迁移。DNA分子迁移的速率受分子大小，构象。电场强度和方向，碱基组成，温度和嵌入染料等因素的影响。 三. 实验材料和试剂 1. DNA样品 2.化学试剂和溶液 （1）DNA样品反应缓冲液：100mM Tris，200mM NaCl，20mM MgCl2，2mM DTT，pH 8.0 （2）EcoRⅠ限制性内切酶 （3）PstⅠ限制性内切酶

（4）电泳缓冲液（50×TAE） Tris 242g 冰醋酸57.1ml EDTA（0.5mol/L pH 8.0）100ml 使用时用蒸馏水稀释50倍。 （5）样品缓冲液（DNA sample loading dye） 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯青 40%（W/V）蔗糖 （6）溴化乙锭（EB）10mg/ml （7）琼脂糖agarose（电泳级） （8）DNA分子量标记物：Lambda HindⅢDNA markers 3. 仪器设备和消耗品 电泳仪、电泳槽、样品梳、微波炉、水浴锅、移液器（10μl，200μl，1000μl）、离心管、一次性枪头（200μl，1000μl）。 四. 实验步骤 1. DNA样品的制备 采集生物检测样本，在弱碱和螯合剂存在条件下进行组织匀浆，溶解细胞或细胞核膜；利用阴离子去垢剂和蛋白酶，在37孵化数小时，消化蛋白质分离DNA；使用有机溶剂如苯酚、氯仿等除去残余蛋白质，萃取DNA；用乙醇或某些盐类从溶液中沉淀DNA。

高效液相色谱法在中药指纹图谱中的应用现状及分析(一)

高效液相色谱法在中药指纹图谱中的应用现状及分析(一) 【关键词】高效液相色谱法 摘要：综述了高效液相色谱(HPLC)法指纹图谱在中药质量控制方面的应用，并通过供试品的制备、标准品的选择、结果分析方法来阐述中药指纹图谱的应用现状，指出高效液相色谱法应用于中药指纹图谱中现有不足之处和未来的发展方向。 关键词：高效液相色谱；中药指纹图谱ApplicationandAnalysisofFingerprintinTraditionalChineseMedicinebyHPLC Abstract:ThispapersummarizedtheapplicationoffingerprintoftraditionalChinesemedicinebyHPLCto thequalitycontrol.ItalsoreviewedtheactualityoffingerprintintraditionalChinesemedicinethroughth epreparationforsample,thechoiceforstandardsample,andthemethodofresultanalysis.Thenpointed outthemainproblemsatpresentandtheprospectivefutureinapplicationoffingerprintoftraditionalChi nesemedicinebyHPLC. Keywords:HPLC;FingerprintofTraditionalChinesemedicine 当前，中药指纹图谱技术在国内外已成为一种发展趋势。首先是美国食品与药品管理局(FDA)允许草药保健品申报资料可以提供色谱指纹图。世界卫生组织(WHO)在1996年草药评价指导原则中也规定：如果草药的活性成分不明，可以提供指纹图谱以证明产品质量的一致。欧共体也将指纹图谱监控技术应用于植物药质量控制〔1〕。我国自200008国家药品监督管理局颁发《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》(国药管注〔2000〕348号)以来，中药指纹图谱的研究成为中药研究的热点。国家药品监督管理局要求到2002年末，所有申报的中药注射剂均应有相关的指纹图谱资料，包括中药原料、提取物、产品3种图谱，3种图谱的峰形必须有较大的相关性，否则不予受理〔2〕。 1中药指纹图谱 中药指纹图谱是一种综合的、宏观的和可量化的鉴别手段，用以对中药材和中成药进行鉴别真伪，评价原料药材、半成品和成品质量的均一性和稳定性。其基本属性是“整体性”和“模糊性”。“整体性”是指完整地比较色谱的特征“面貌”；“模糊性”强调的是对照品与待测样品指纹图谱的相似性〔3〕。指纹图谱一般包含两层含义：1.必须反映出该药材(或成药)有别于其他任何物质；2.对于中药材，指纹特征还能反应出产地和采收期不同而造成的差异；对于中成药，则能反映出同一产品不同批次间的质量差异，差异越小说明药材(或成药)的稳定性越好〔4〕。 2HPLC用于中药指纹图谱的情况 文献分布表明，对中药指纹图谱的研究始于1993年，从1993～1999年共发表11篇〔5〕，指纹图谱的研究基本处于未开发状态。而从2000年开始，研究中药指纹图谱的文献呈直线上升趋势，尤以近2年发展最快，与指纹图谱相关的文献报道就有上百篇，其中又以高效液相色谱法研究的指纹图谱居多，高效液相色谱以其应用的广泛性，检测的精确性成为控制中药质量最主要的检测方法。至今已有50种中药材，21种中成药运用HPLC法测定其指纹图谱并发表。 据文献统计，目前已对下列中药材运用HPLC进行了指纹图谱研究：枸杞、柴胡、新疆雪莲、夏天无、延胡索、白芍、白鲜皮、板蓝根、补骨脂、黄芩、赤芍、川东獐牙菜、川芎、刺五加、大黄、丹参、当归、地黄、茯苓、麻黄、甘草、葛根、马甲、红车轴草、红花、厚朴、怀牛膝、鸡血藤、金银花、绿衣枳实、密花石斛、牛膝、秦艽、人参、西洋参、忍冬、山银花、山楂、芍药、水蔓菁、乌拉尔甘草、五味子、石斛、仙茅、旋覆花、淫羊藿、三七、泽泻、栀子、西红花。中成药中采用HPLC进行指纹图谱研究的有：咳必安胶囊、灯盏花素注射液、白屈菜注射液、板蓝根颗粒、补肾方、川芎制剂、丹参注射液、丹参葡萄糖注射液、复方丹参片、参麦注射液、红花注射液、红景天注射剂、黄连解毒汤、脉络宁注射液、人参

中药注射剂指纹图谱实验研究技术指南

说明：本实验研究规程指南为在原技术要求的基础上规范中药注射剂色谱指纹图谱试验研究而制订。本指南未能概括的内容，通过实践可自行补充调整，但申报资料或复核资料中须有相应的说明和申述。指南中的"色谱指纹图谱"指采用柱色谱及薄层色谱等各种色谱技术实验研究的指纹图谱。光谱指纹图谱将另行规定。 一、供试品收集 供试品收集是研究指纹图谱最初也是最关键的步骤，由于不可能对一个药材的所有样本进行试验，而且生长环境条件对药材代谢产物有影响，所以要收集有代表性的供试品。收集不少于10批供试品的含义是指样本的数和量要有足够的代表性。 (一) 原料药材：在药材的化学成分与中医临床疗效的之间的关联尚未能阐明的现阶段，基本上是在承认其传统的功能主治及临床验证的基础上进行指纹图谱的实验研究。原料药材的指纹图谱主要是反映其自然状态的内在质量情况，研究其指纹图谱是以此作为选择原药材投料或混批提取的依据，同时作为研究注射剂成品指纹图谱相关性的基础。由于自然条件的变化，药材个体之间指纹图谱的差异是正常的，在品种鉴定无误的基础上，力争药材有较为固定和稳定的来源，个体之间的指纹图谱主要特征大致相似即可，使成品指纹图谱特征的稳定有起码的保证。 药材的"批" 不是工业生产的"批"，是指相互独立的供试品，即不能将同一地点或同一渠道同一时间获得的供试品分成若干份供试品，以保证试验结果的代表性。由于收集药材供试品受主观和客观的条件限制，供试验的供试品严格讲均没有统计学的意义，所以供试品数越多越好，10批是最低的要求。供试品应保证其真实性，应有完整采样原始记录，内容包括： ?药材名称 ?供试品来源（真实记录供试品来自何处：传统产地收集或是资源丰富的产地收集，或者来自GAP基地供应；还是产地购买、市场购买或委托购买，等，以便于生产原料的采购选择和测试数据的可追溯）。 ?收集时间（购买时间）及收集人 ?货源情况调查（货源是否充足和稳定） ?基原鉴定及鉴定人：产地或GAP基地收集的药材结合植物形态鉴定品种。 如缺原植物，由熟练的专业人员凭性状或显微特征鉴别。如近缘品种、难以区分的野生品种（如白花蛇舌草、蒲公英），应在指纹图谱研究中仔细比较，如获得的指纹图谱相似度很高，也可应用，但须明确记录。并在今后实施GAP时确定一个品种，如指纹图谱相似度很低，则须确定品种，改为栽培品使用。商品混乱的品种（如陈皮）产区的选择应缩小范围，并结合资源选用药典收载品种中的一种。复方制剂中的君药及处方量大的药材必需重点注意品种的鉴定，以避免今后执行指纹图谱过程中出现难以预料的困难。

中药指纹图谱建立的原则和步骤

（一）建立指纹图谱的一般原则 中药指纹图谱的建立，应以系统的化学成分研究和药理学研究为依托，体现系统性、特征性和稳定性三个基本原则。唯此，才能保证指纹图谱的标准化、规范化、客观化，从而便于推广和应用。 1.系统性是指指纹图谱中反映的化学成分应包括该中药有效部位所含大部分成分，或指标性成分的全部，如中药两头尖中抗肿瘤的有效成分为皂苷类化合物，则其指纹图谱应尽可能地反映其中的皂苷类成分；银杏叶的有效成分是黄酮类和银杏内酯类，则其指纹图谱可采用两种方法，针对这两类成分分别分析，达到系统全面的目的。 2.特征性是指指纹图谱中反映的化学信息（如保留时间）应具有较强的选择性，这些信息的综合结果，将能特征性地区分中药的真伪与优劣，成为中药自身的“化学条码”。如北五味子的HPLC指纹图谱和TLC指纹图谱，不仅包括多种的五味子木脂素类成分，而且具有许多未知类成分，这些成分的峰位顺序、比值在一定范围内是固定的，并且随药材品种不同而产生差异，依此可以很好地区别其来源、产地，判别药材的真伪优劣。 3.稳定性是指所建立的指纹图谱在规定的方法、条件下的耐用程度，即不同操作者、不同实验室所重复做出的指纹图谱应在所允许的误差范围内，以体现其通用性和实用性。因而要求包括样品制备、分析方法、实验过程、数据采集、处理、分析等全过程都要规范化操

作，同时，还应建立相应的评价机构，对其进行客观评价。 （二）建立指纹图谱的一般步骤 1.方案设计与思路 （1）研究对象的确定 在调研有关文献、新药申报资料(质量部分和工艺部分)及其它研究结果的基础上，尽可能的详尽地了解药材、中间体及成品中所含成分的种类及其理化性质，综合分析后找出成品中的药效成分或有效成分，作为成品和中间体指纹图谱的研究对象，即分析检测目标。 例如，黄芪含黄酮、皂苷及多糖三类有效组分，黄芪多糖注射液及其中间体的指纹图谱则以多糖为研究对象，黄芪原药材的指纹图谱应把黄酮、皂苷及多糖作为研究对象。 复方注射剂应根据君臣佐使的原则，以君药、臣药中的有效成分作为指纹图谱的研究对象，佐使药中的成分可采用其它指纹图谱方法进行辅助、补充研究。 （2）研究方法的选择 研究方法应根据研究对象的物理化学性质来选择。大多数化合物可采用HPLC。例如黄芪中黄酮、皂苷、多糖等。挥发性成分应采用GC。例如鱼腥草中的鱼腥草素、土木香中的土木香内酯、异土木香内酯和二氢土木香内酯等。某些有机酸经甲酯化后亦可用GC分析。采用上述方法难以分离检测的成分，可考虑使用TLC和CE。

中药指纹图谱和特征图谱的区别以及各自的意义

中药指纹图谱和特征图谱的区别是什么?各有什么意义? 区别:中药材或中成药经过适当处理后 , 利用现代信息采集技术和质量分析手段得到的能够显现中药材或中成药性质的图像、图形、光谱的图谱及其数据 , 称为中药指纹图谱。它可以较全面地反映中药所含化学成分的种类与数量 , 进而反映中药的质量和中医用药所体现的整体疗效 ; 现阶段中药的有效成分大多尚未明确 , 中药指纹图谱的整体性和模糊性正好符合中药质控的要求 , 较之单一成分或指标成分的质控方法 , 更具有科学性和全面性;中药特征图谱是指中药材经过适当的处理后 , 采用一定的分析手段和仪器检测得到 , 能够标识其中各种组分群体特征的共有峰的图谱。它是一种综合的、可量化的鉴别手段 , 可用于鉴别中药材的真伪 , 评价中药材质量的均一性和稳定性。中药特征图谱可分为化学 (成分特征图谱和生物特征图谱。 意义:中药材多为植物的干燥器官 , 由于复杂的自然环境、社会状况以及我国历史上科技发展不平衡等多种原因 , 造成了中药材在应用方面的复杂性。同一名称的中药材可能来自不同基源的植物。同一基源的中药材由于产地不同、采收季节和生长年限不同而存在差别。一些中药材 , 特别是名贵药材 , 常可见到伪品与正品相混淆。由于以上因素的存在 , 使得不同来源的同种中药材其化学组成有可能相同 , 也有可能不同 , 这就必然影响到中医的临床疗效和中药的实验研究 , 并影响以其为原料生产出的中成药的化学组成 , 从而影响其质量和疗效。此外 , 我国中成药品种繁多 , 中成药生产过程中各工艺环节的稳定性等多种因素对产品的化学组成也具有重要的影响。从现有的中药内在质量控制现状来看 , 还存在很多问题需逐步解决。其中 , 最突出的问题之一就是中药整体化学特征的表征。因此建立中药指纹图谱对于更加客观地从整体上评价中药的内在质量具有重要意义。同样,建立准确有效的鉴别中药材方法——中药特征图谱,对于我国中药资源丰富 , 但长期以来 , 缺乏系统的整理和归类 , 导致中药商品混乱 , 中药材同名异物、同物异名的现象屡有发生 , 甚至出现有以假充真 , 以次充好的情况具有重要意义。

DNA指纹图谱分析实验

DNA指纹图谱分析实验 一. 实验目的 1. 掌握DNA指纹图谱技术的概念、原理和基本操作过程 2. 学习DNA的限制性酶切的基本技术 3. 掌握琼脂糖凝胶电泳的基本操作技术，学习利用琼脂糖凝胶电泳测定DNA片段的长度，并能对实验结果进行分析。 二. 实验原理 1984年英国莱斯特大学的遗传学家Jefferys及其合作者首次将分离的人源小卫星DNA 用作基因探针，同人体核DNA的酶切片段杂交，获得了由多个位点上的等位基因组成的长度不等的杂交带图纹，这种图纹极少有两个人完全相同，故称为"DNA指纹"，意思是它同人的指纹一样是每个人所特有的。DNA指纹的图像在X光胶片中呈一系列条纹，很像商品上的条形码。DNA指纹图谱，开创了检测DNA多态性（生物的不同个体或不同种群在DNA结构上存在着差异）的多种多样的手段，如RFLP（限制性内切酶酶切片段长度多态性）分析、串联重复序列分析、RAPD（随机扩增多态性DNA）分析等等。各种分析方法均以DNA的多态性为基础，产生具有高度个体特异性的DNA指纹图谱，由于DNA指纹图谱具有高度的变异性和稳定的遗传性，且仍按简单的孟德尔方式遗传，成为目前最具吸引力的遗传标记。 DNA指纹具有下述特点：1．高度的特异性：研究表明，两个随机个体具有相同DNA图形的概率仅3×10－11；如果同时用两种探针进行比较，两个个体完全相同的概率小于5×10－19。全世界人口约50亿，即5×109。因此，除非是同卵双生子女，否则几乎不可能有两个人的DNA指纹的图形完全相同。2．稳定的遗传性：DNA是人的遗传物质，其特征是由父母遗传的。分析发现，DNA?指纹图谱中几乎每一条带纹都能在其双亲之一的图谱中找到，这种带纹符合经典的孟德尔遗传规律，即双方的特征平均传递50％给子代。3．体细胞稳定性：即同一个人的不同组织如血液、?肌肉、毛发、精液等产生的DNA指纹图形完全一致。 1985年Jefferys博士首先将DNA指纹技术应用于法医鉴定。1989年该技术获美国国会批准作为正式法庭物证手段。我国警方利用DNA?指纹技术已侦破了数千例疑难案件。DNA 指纹技术具有许多传统法医检查方法不具备的优点，?如它从四年前的精斑、血迹样品中，仍能提取出DNA来作分析；如果用线粒体DNA检查，时间还将延长。此外千年古尸的鉴定，在俄国革命时期被处决沙皇尼古拉的遗骸，以及最近在前南地区的一次意外事故中机毁人亡的已故美国商务部长布朗及其随行人员的遗骸鉴定，都采用了DNA指纹技术。

蜂蜜高效液相色谱指纹图谱的研究进展

摘要：指纹图谱技术在食品的质量控制中起着重要的作用。本文主要介绍了高效液相色谱指纹图谱在蜂蜜研究中的应用，以期为蜂蜜的鉴定、质量控制及标准的制定等方面工作奠定基础。 关键词：蜂蜜高效液相色谱指纹图谱 蜂蜜是一种传统的天然保健食品。它是由蜜蜂采集植物的甜味分泌物，通过蜂蜜自身的消化，转化作用及蜜蜂通过气流干燥作用，使水分从花蜜中含６０％以上降低到２０％以下。一般蜜蜂从采集花蜜到酿制为成熟蜜，正常情况下需要３～５ｄ时间［１］［２］。 糖类是蜂蜜的主要的成分，其中有单糖、双糖、低聚糖和多糖，单糖中的葡萄糖和果糖占蜂蜜总糖的５５％～７５％，而双糖和三糖的含量因蜜源种类的不同而变化。此外，蜂蜜还含有多种蛋白质、氨基酸、脂肪酸、维生素及人体所必须的矿物质及微量元素，营养十分丰富［２］［３］。多年来的科学研究与医学临床都证明，蜂蜜具有促进食欲、改善肠胃功能、促进消化吸收、镇静安神、提高肌体免疫能力，促进儿童生长发育等功效；它不仅对婴幼儿、运动员、老人及体弱多病者、重体力劳动者、高强度脑力工作者来说是一种直接有效的营养补充来源，而且对治疗烧伤、烫伤、溃疡愈合、促进伤口愈合及心血管病的辅助治疗等方面来说有很好的疗效［４］｛５］。 蜂蜜作为一种营养丰富、易被人体吸收的天然食品在国内外市场上深受消费者欢迎。为规范蜂蜜市场，保证消费者的利益，我国于１９８２年和２００２年分别颁布了蜂蜜行业标准和推荐性国家标准；但是目前就蜂蜜质量来说，全国各地在蜂蜜生产、流通中仍存在很多不规范的环节，更甚的是出现许多人为掺杂假使的行为，而当前的国家标准不能满足快速、准确的检测需要。 高效液相色谱指纹图谱技术已经广泛的应用于食品行业，特别是药物化学中的中药指纹图谱已经取得了重大的进展。在蜂蜜市场较为混乱且没有准确、快捷的检测方法的情况下，期望建立蜂蜜的高效液相色谱指纹图谱成为必然的趋势。 １．指纹图谱的含义 “指纹（Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓ）”识别技术起源于１９世纪末２０世纪初的犯罪学和法医学。作为一种综合、宏观的和可量化的鉴别手段的指纹图谱，是指经过适当的处理后，采用一定的分析手段如光谱或图谱，得到能够标示该样品特征的色谱或光谱的谱图或图象。在完整地呈现出色谱的特征“面貌”的前提下，表达了对照品与待测样品指纹图谱的相似性，用以产品真伪鉴别，评价其质量的均一性和稳定性。 蜜源植物的花蜜是蜂蜜的主要来源，由于同种蜜源植物具有整体的遗传相似性，因此，同一种类的单一花蜜在成分上也具有相似性。同时，经采集、酿造后的成熟蜂蜜其成分除糖类的含量有明显变化外，来源于蜜源植物的次生代谢物质等微量活性成分一般不会发生较大的变化，这使指纹图谱技术应用于蜂蜜种类和真伪鉴别成为可能。借助于现代分析技术对蜂蜜中主要特征功效成分信息以图形（图像）的方式进行表征并加以描述，这就是蜂蜜指纹图谱的内涵［１８］。 ２．指纹图谱的种类 指纹图谱已广泛的应用于食品品种和质量的鉴别，其根据测定方法的不同，大体分为色谱指纹图谱、光谱指纹图谱和ＤＮＡ指纹图谱。其中，以高效液相色谱指纹图谱应用最为广泛。 ２．１色谱指纹图谱 色谱技术种类繁多，是获得指纹图谱的最常用的方法。其中，高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）是应用最多的一种方法，６０％～７０％的有机物均可应用，具有高压、高速、高效、高灵敏度等特点，是所有光谱色谱分析中最适合绘制指纹图谱的方法。近２０多年来，随着仪器和柱技术、样品预处理技术的发展成熟及仪器的日益普及，ＨＰＬＣ作为食品中的营养成分、功能因子、食品添加剂及污染物的一种快速、准确、易于自动化的检测手段，在食品分析中的应用发展很快；高效液相色谱－质谱（ＭＳ）联用，能够将未知成分的各峰进行归属；当前，高效液相色谱已经用于蜂蜜某些糖分的定量与定性的常规分析；反相液相色谱在类黄酮成分分析方面也有很多的报道［６］。 薄层色谱（ＴＬＣ）法出现于１９５６年，具有操作简单，展开剂组成灵活多样，色谱后衍生方便，可以提供色彩斑斓 蜂蜜高效液相色谱指纹图谱的研究进展 西南大学食品学院王文静

中药指纹图谱和特征图谱的区别以及各自的意义

. 中药指纹图谱和特征图谱的区别是什么？各有什么意义？ 区别：中药材或中成药经过适当处理后,利用现代信息采集技术和质量分析手段得到的能够显现中药材或中成药性质的图像、图形、光谱的图谱及其数据, 称为中药指纹图谱。它可以较全面地反映中药所含化学成分的种类与数量,进而反映中药的质量和中医用药所体现的整体疗效; 现阶段中药的有效成分大多尚未明确,中药指纹图谱的整体性和模糊性正好符合中药质控的要求,较之单一成分或指标成分的质控方法, 更具有科学性和全面性；中药特征图谱是指中药材经过适当的处理后,采用一定的分析手段和仪器检测得到,能够标识其中各种组分群体特征的共有峰的图谱。它是一种综合的、可量化的鉴别手段,可用于鉴别中药材的真伪,评价中药材质量的均一性和稳定性。中药特征图谱可分为化学(成分)特征图谱和生物特征图谱。 意义：中药材多为植物的干燥器官, 由于复杂的自然环境、社会状况以及我国历史上科技发展不平衡等多种原因, 造成了中药材在应用方面的复杂性。同一名称的中药材可能来自不同基源的植物。同一基源的中药材由于产地不同、采收季节和生长年限不同而存在差别。一些中药材, 特别是名贵药材, 常可见到伪品与正品相混淆。由于以上因素的存在, 使得不同来源的同种中药材其化学组成有可能相同, 也有可能不同, 这就必然影响到中医的临床疗效和中药的实验研究, 并影响以其为原料生产出的中成药的化学组成, 从而影响其质量和疗效。此外, 我国中成药品种繁多, 中成药生产过程中各工艺环节的稳定性等多种因素对产品的化学组成也具有重要的影响。从现有的中药内在质量控制现状来看, 还存在很多问题需逐步解决。其中, 最突出的问题之一就是中药整体化学特征的表征。因此建立中药指纹图谱对于更加客观地从整体上评价中药的内在质量具有重要意义。同样，建立准确有效的鉴别中药材方法——中药特征图谱，对于我国中药资源丰富,但长期以来,缺乏系统的整理和归类,导致中药商品混乱,中药材同名异物、同物异名的现象屡有发生,甚至出现有以假充真,以次充好的情况具有重要意义。 .

指纹图谱方法

方法 1 参照物的选择及溶液制备绿原酸为金银花的主要成分，而且所选择的金银花药材供试品溶液提取方法很容易将绿原酸提取出来，在色谱图中容易辨认，所以选择绿原酸作为参照物。参照物溶液的制备方法：取绿原酸对照品适量，加50％甲醇配制成每毫升含0.06 mg的溶液，即得。 2 检测波长及流动相的选择根据文献报道，绿原酸类化合物是金银花的主要活性成分，经测定绿原酸参照物溶液和金银花药材提取液在327 nm处均有最大吸收，因此，选择327 nm 为测定波长。在用同一浓度的样品溶液、色谱柱、流速（0.7 ml/min）、检测波长和HPLC 仪器的条件情况下，通过对多种溶剂系统进行考察，最后确定的最佳流动相为甲醇-0.1%磷酸（40∶60），流速为0.7 ml/min，检测时间30 min。 3 提取方法的选择金银花中主要有效成分为绿原酸、异绿原酸，它们是奎宁酸和咖啡酸的酯，其中绿原酸含量高，是金银花及其相关制剂的活性指标成分。参照文献资料［4，5］，经对多种提取溶剂研究，结果表明，以50%甲醇溶液作为提取溶液进行超声提取，能将金银花中绿原酸类成分充分提取，提取液中有效成份不需要进一步提取分离与富集，可以直接进样分析。 4 供试品溶液的制备取金银花药材，置硅胶干燥器中干燥24 h，研细，取约0. 5 g，精密称定，置100 ml具塞锥形瓶中，加50％甲醇50 ml，超声处理30 min，用微孔滤膜滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液5 ml，置50 ml量瓶中，用50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。 5 测定法及数据处理分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各20 μl，注入液相色谱仪，记录30min的色谱图。用中国药典委员会推荐的“中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件”（版本2004A）进行数据处理，将多个批次的色谱图进行比较，得到可全面反映多个色谱图特征的金银花药材的对照指纹图谱。以此模式为基准，计算每个色谱图与之相比较的相似度（范围应在0.90～1.99之间）。

中药指纹图谱研究技术要点

中药指纹图谱是指中药材经适当处理后，采用一定的分析手段和仪器检测得到的，能够标示该中药及其制剂中的各种组分群体特性的共有峰的图谱。通过指纹图谱整体特征峰的相对保留时间及含量或比例的制定和比对，可有效地控制中药材及中药产品质量，保证产品质量的相对稳定。目前，指纹图谱已成为国际公认的控制中药或天然药物质量的最有效手段。 实施中药指纹图谱难免会有一个提高、完善的过程。从技术上说，中药指纹图谱的建立是完全可行的，但在实际应用中，还要解决诸多问题。中药指纹图谱研究的技术要点主要有以下几个方面。 ■中药材来源及样品处理 对制作指纹图谱的动、植物药材必须做到固定品种、药用部位、产地、采收期、产地加工和炮制方法。对矿物药应固定产地和炮制、加工方法，这是制定合格指纹图谱的先决条件。对供试样品的取样应注意样品的代表性与均匀性，以保持实验室取样与实际生产应用药材一致。除此之外，还必须做到组方和用量固定，生产工艺稳定。 ■检测方法 作为一张合格的指纹图谱必须具有特征明显、专属性强、重现性好的特点，而且要求做到操作和应用方便。目前最常采用的制备中药指纹图谱的检测方法有光谱法和色谱法。光谱方法如紫外光谱和红外光谱在实际应用中能提供识别的信息较少，往往当同类化合物其取代基团发生变化时，对应的光谱却难以体现出来，建议尽量不要采用。 色谱法最大特点在于可进行复杂组分的成分分离，特别是新的高效、通用检测器的发展和引入，使得采用色谱法检测可得到足够多的图谱识别信息，是目前制备指纹图谱的主流方法。尤其是薄层色谱(TLC)、气相色谱(GC)和高效液相色谱(HPLC)技术已成为3种公认常用的指纹图谱分析手段。其中特别又以HPLC分离效率高、分析速度快、样品适应性广、检测器种类多、灵敏度高、稳定性、重复性好而备受推崇，成为制备指纹图谱的首选方法。 参照物的选择：以色谱法制备得到的特征指纹图谱识别信息，主要是色谱峰的相对保留时间和相对峰面积比值。因此，在图谱测定中必须选择合适的参照物，以起到辨认和评价色谱指纹图谱特征的指引作用。 常用的参照物可采用对照品或内标物。采用内标物作为参照物时，要求其化学性质应能适合与供试品相同或相似的色谱分离检测条件。这在实际分析中往往难以满足，尤其较复杂的指纹图谱往往难以选择到保留时间合适的内标物插入图谱中。因此，在实际应用中一般尽量选择容易获取的，一个以上注射剂中的主要活性成分或指标成分作为参照物，以考察指纹图谱的稳定程度和重现性，并有助于色谱的辨认。同时，也可初步了解图谱中各色谱峰成分的性质。 高效液相色谱试验条件选择：色谱指纹图谱一次进样记录时间—般为60分钟，有时甚至需要记录更长时间。因此，要求实验使用的高效液相色谱仪器系统，尤其是高压恒流泵和检测器应具有良好的稳定性和可靠性，以减少漂移。同时，应有特别的措施保证仪器系统的清洗和维护。

DNA 指纹图谱分析方法

第10章 DNA指纹图谱分析方法 10.1 DNA指纹图谱产生的原理 10.1.1 高变异DNA序列的发现 1980年，Wyman 和 White在进行人体DNA 基因文库的研究中，筛选到一个随机DNA片 段，以其为探针进行RFLPs分析，检测到8个等位基因，平均杂合率超过75％，因此推测该 位点的多态性来源于DNA重排而非碱基突变，这是人类基因组中发现的第一个高变区（hyper variable regions，简称HVRs）。此后，人们在人类基因组中又陆续发现了其他一些高变区， 如α-珠蛋白基因（Higgs等 1981，1986）、胰岛素基因（Bell等 1982）、脂蛋白基因（Knott 等 1986）、D-Ha-ras癌基因（Capon等 1983）、Zata-珠蛋白基因（Goodbourm等 1983）等基 因的侧翼及肌红蛋白基因（Weller等1984）的第一个内含子区域，都含有这种HVRs。这些高 变区的共同特点为：都是由一短序列（即重复单位）首尾相连、多次重复而成，其多态性来源 于重复单位的重复次数不同。同一高变区的这些重复单位还具有高度的保守性，但因重复单位 的重复数目不同，形成了众多的等位基因。这些高变区后来被叫做小卫星（minisatellite）（Jeffreys等 1985a），有的人又称其为可变数目串联重复序列（variable number of tandem repeat，简称VNTR）（Nakmura等1987）。在小卫星DNA内，重复单位数目的高度变异是由于不 等交换所造成的，换言之，即在有丝分裂时的姊妹染色单体（sister chromatids）或减数分裂 时的同源染色体间互换所致。有时候，发现DNA链架突变的发生频率高于点突变，其频率为每 世代每千个核苷酸对在10－5～10－2。虽然不等互换导致重复单位数目增加或减少，但不同重复 的形成却是由于点突变造成的。此外，基因转换（gene conversion）与重组似乎在同源性的维 持上扮演着重要的角色。在DNA复制期间的滑动复制（slippage）是重复单位内简单序列 （1～4个核苷酸对）演化的机制（Wolf等 1989）。故有丝分裂或减数分裂时不等互换、基因转换及滑动复制，均足以导致重复单位间同源性的维持及重复单位数目的变化。 大多数重复序列单位共有一个约 10～15个核苷酸对的核心序列（core sequence），此核心序列高度地保留于相关的小卫星DNA家族中，它是重组信号，可能是真核生物DNA重组交换的热点，可促进小卫星DNA的不等交换（Jeffreys等 1985a；Wyman等 1990）。核心序列是重复单位间序列相似的基础。在小卫星DNA区域内，同源染色体可能有不同数目的重复单位，利用限制性内切酶可产生DNA指纹。由此可见，串联重复序列的高度变异性与其特殊的结构密切相关。然而，基因组中此类串联重复序列的真实生物学功能至今仍不清楚。 本章作者：丁 波，张亚平

中药指纹图谱质控技术的意义和作用

中药指纹图谱质控技术的意义和作用 中药指纹图谱质控技术的意义和作用 中药指纹图谱质控技术的意义和作用 中药业发展到今天，中成药指纹图谱质控技术已是牵动行业全面进步的关键技术。其应用研究，对保证中成药功效，提高中药工业整体水平，带动中药农业现代化，推进中药走向世界，具有非常重要的现实意义。 一、采用指纹图谱质控技术是保证中成药功效实现中药现代化的必需 自晋代葛洪在;肘后备急要方)首次提出8220;成药8221;概念以来，中成药已有一千七百年历史。受科学技术条件的限制，中成药在成品内在质量的控制上缺乏检验的方法手段，可谓8220;丸散膏丹，神仙难辨8221;。中成药功效，主要依靠原料药材的地道性和药工制作的经验性予以保证。同仁堂8220;炮制虽繁，必不敢省人力；品味虽贵，必不敢减物力8221;的古训，集中反映了传统中成药生产保证质量的基点。虽然这种缺乏事后内在质量检验方法的状况，直到二十世纪六十年代徐国钧先生提出显微鉴别方法才发生变化。但由于传统中成药蜜丸、水丸、散剂等主要剂型都以药材饮片粉末为制剂主料，又是小生产状态，所以中药材的地道性、老药工的经验性，基本尚可保证成药功效。

从二十世纪五十年代中叶起到现在，中成药从剂型工艺到生产方式发生了根本的变化。片剂、颗粒剂、口服液等现代剂型已取代8220;丸、散、膏、丹8221;占主体地位。制剂主料也由提取物取代原料粉。已有上百个中成药工业企业规模化、机械化，年产亿元以上，前三名达十亿元以上。与此同时，从一九五八年起，各地为解决需求供应短缺，广泛引种药材，许多药材地道性显著淡化。所有这些巨大变化都表明中成药生产质量稳定性的传统基础基本已不适应。中成药业和世界上一切产业发展过程一样，在由手工业小生产向工业大生产过渡的同时，其产品质量也必须实现由凭过程经验控制到事后检验控制的过渡。时至今日，中成药功效的稳定性，已到必须建立在现代化成品内在质量标准的基础上，予以检验控制的时候。 随着三十多年来现代化学分析技术的不断进步，中药材和中成药内在化学成分的研究手段和方法越来越多，越来越好。将研究知晓的内在成分及其测定方法用于质量控制，制定相应检验标准，在近二十年来，有了很大进展。如中国药典一九六三年版收载的中药材只有基源与外观状鉴别，中成药则仅有处方和制法，没有任何检验项目。14年之后颁布的七七年版药典大量采用了显微鉴别。从八五版药典开始，色谱、光谱技术在中药质量控制上被采用，应用的具体方法、技术、测定的成分和被要求的品种，都不断增长，最新二年