降胆固醇植物乳杆菌I4增菌培养基响应面优化_朱奇奇
降胆固醇植物乳杆菌I4增菌培养基响应面优化
朱奇奇1，蒲博1，张驰翔1，王周1，邹奕昊2，焦士蓉1，*
（1. 西华大学 食品与生物工程学院，成都 610039；2. 惠氏制药有限公司，苏州 215000）
摘 要：采用响应面法对降胆固醇植物乳杆菌I4增菌培养基进行优化研究。通过Plackett -Burman 试验设计筛选出影响菌体浓度的主要因素为蔗糖、酵母提取物和乙酸钠。经响应面优化后，得到蔗糖、酵母提取物和乙酸钠的最佳浓度分别为2.05%、1.54%、0.31%。优化后的增菌培养基中，菌体密度OD 620可达2.458，比MRS 培养基OD 620值提高了23.7%，菌落单位提高了3.91倍，通过对I4菌发酵剂降胆固醇能力的测试，得出胆固醇降解率为36.2±1.75（%，n=3）。
关键词：响应面法；Plackett -Burman 试验设计；增菌培养基；菌体密度
中图分类号：Q93-335 文献标识码：A 文章编号：1006-2513（2016）06-0087-09
Optimization of lowering cholesterol Lactobacillus Plantarum I4
enrichment mediumusing response surface method
ZHU Qi-qi 1，PU Bo 1，ZHANG Chi-xiang 1，WANG Zhou 1，ZOU Yi-hao 2，JIAO Shi-rong 1，*
（1. School of Food and Bioengineering ，Xihua University ，Chengdu 610039；
2. Wyeth Pharmaceutical Co.Ltd ，Suzhou 215000）
Abstract ：Response surface methodology was used in lowering cholesterol Lactobacillus I4 enrichment medium optimization studies. Plackett -Burman experimental design was applied in screening the main factors affecting cell concentration of sucrose ，yeast extract and sodium acetate. After the response surface to obtain a sugar ，yeast extract. The optimum concentration of sodium acetate was 2.05%，1.54%，0.31%，the optimized enrichment medium cell density was up to 2.458 OD 620. The OD 620 value improved 23.7% than in MRS medium ，colony unit sincreased 3.91 fold. The test of the cholesterol -lowering ability of the formula indicates a degrading rate of 36.2±1.75（%，n=3）.Key words：the response surface method ；Plackett - Burman experimental design ；enrichment culture medium ；the density of bacteria
收稿日期：2015-12-04
基金项目：
西华大学省级重点试验室开放研究基金项目（szjj2014-009）；教育部春晖计划（12205543）；西华大学研究生创新基金资助（ycjj2015025）
作者简介：朱奇奇（1990-）
，男，在读硕士，研究方向为食品领域。E -mail ：281344180@https://www.wendangku.net/doc/ff17317363.html, 。*通信作者：焦士蓉（1968-）
，女，教授，博士，研究方向为食品工程。E -mail ：jsrong2004@https://www.wendangku.net/doc/ff17317363.html, 。乳酸菌是一类具有许多重要的生理功能微生物群，除了能调节胃肠道健康、消除人体自由基、调节免疫作用、抗肿瘤、预防癌症［1-2］等功能外，还具有降低食物及人体血清中胆固醇含量、降低心血管病的发病率等作用［3-9］。乳酸菌
发酵产品因其具有一定的保健功能而受到越来越多的学者研究开发和消费者的重视和喜爱［10-13］，其中乳酸菌菌制剂就是一类非常重要的产品，而在其制备过程中的关键就是如何获得高密度菌体［14-18］，而这一步需要通过高密度培养来实
现，而高密度培养的前提就是配置相对合适的培养基。
本实验在MRS培养基的基础上，通过Plackett-Burman实验设计、最陡爬坡实验、响应面实验设计等实验设计方法，优化了植物乳杆菌I4的增菌培养基，为制备乳酸菌菌制剂奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌种来源
植物乳杆菌I4为实验室自己分离纯化并经16sRNA序列测定鉴定菌株。
1.1.2 培养基
MRS培养基（g/L）：牛肉膏10g，蛋白胨10g，葡萄糖20g，酵母提取物5g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，磷酸氢二钾2g，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·4H2O 0.25g，吐温80 1mL，蒸馏水1L，pH 6.2～6.4。
MRS固体培养基：在MRS液体培养基的基础上添加2%的琼脂，pH 6.2～6.4。
增菌培养基：按实验设计添加各成分，pH 6.2。
上述三种培养基在灭菌锅中于121℃，0.1MPa下灭菌20～25min。
0.2mg/mL胆固醇培养基：在300mL灭菌后的MRS液体培养基中加入现配的胆固醇溶液，12mL 6mol/L NaOH溶液，振荡混匀，pH 5.5左右。其中6mol/L NaOH溶液灭菌处理，胆固醇溶液用细菌过滤头过滤。胆固醇溶液配法：加胆固醇0.06g、牛胆盐0.12g、蔗糖脂肪酸脂0.06g、冰乙酸5mL、吐温0.6mL于试管中，超声振荡至完全溶解。
1.2 仪器与设备
电热恒温隔水式培养箱（黄石市恒丰医疗器械有限公司）；洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；UV-2600A型紫外可见分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司）；自动台式灭菌锅（山东新华医疗器械股份有限公司）。
1.3 方法
1.3.1 菌种的活化
将实验室保存的菌株I4接种于MRS液体培养基中，37℃静置培养48h后，然后以2%的接种量继续活化，连续接种三次。
1.3.2 菌落测定
采用梯度稀释平板计数法，即在无菌操作条件下，吸取充分混匀的样液1mL，加入9mL灭菌生理盐水中，制成1∶10的均匀稀释液，再依次进行10倍递增稀释，至适当稀释度。吸取1mL置于灭菌固体MRS培养皿中，涂布混匀。于37℃恒温培养箱中倒置培养36h，用菌落计数器计数。
1.3.3 碳源的选择
在MRS培养基的基础上，以葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、麦芽糖、果糖分别作为碳源，添加量2%，以酵母提取物为氮源，添加量1%。以5%的接种量接种，37℃静置培养18h，620nm处测定OD值。
1.3.4 氮源的选择
在MRS培养基的基础上，以硫酸铵、氨水、大豆蛋白胨、牛肉浸膏、酵母提取物、蛋白胨、碳酸氢铵分别作为氮源，添加量1%，以蔗糖为碳源，添加量2%。以5%的接种量接种，37℃静置培养18h，620nm处测定OD值。
1.3.5 pH的选择
在MRS培养基的基础上，以蔗糖为碳源，添加量为2%，以酵母提取物为氮源添加量为1%。分别调pH为5.8、6.0、6.2、6.4、6.6。以5%的接种量接种，37℃静置培养18h，620nm处测定OD值。
1.3.6 培养温度的选择
在MRS培养基的基础上，以蔗糖为碳源，添加量为2%，以酵母提取物为氮源添加量为1%，pH为6.2，以5%的接种量接种，分别在温度为33℃、35℃、37℃、39℃、41℃下静置培养18h，620nm处测定OD值。
1.3.7 接种量的选择
在MRS培养基的基础上，以蔗糖为碳源，添加量为2%，以酵母提取物为氮源添加量为1%，pH为6.2，分别以0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%的接种量接种，37℃静置培养18h，620nm处测定OD值。
1.3.8 植物乳杆菌I4增菌培养基优化［20-22］
1.3.8.1 Plackett-Burman试验设计在单因素实验的基础上，应用Design Expert7.00软件对增菌培养基进行Plackett-Burman试验设计，各变量所代表因素及其水平见表1，响应值为菌体发酵液在620nm的OD值。本试验选取菌体生长的影响因素7个，同时外加4个虚拟变量。每个因素分别确定高（+1）和低（-1）两个水平，共进行12次试验以确定每个因素的影响水平，从而筛选出对菌体生长影响显著的因素。
表1 Plackett-Burman设计因数水平表
Table 1 Plackett - Burman design factor level table 因数（%）低水平（-1）高水平（+1）A：酵母提取物1 1.5
B：蔗糖23
C：K2HPO40.20.3
D：乙酸钠0.50.75 E：MgSO4·7H2O0.060.09
F：MnSO4·H2O0.020.03 G：吐温800.10.15
H、J、K、L：虚拟因数
1.3.8.2 最陡爬坡试验根据Plackett-Burman 试验结果，选取其中重要性排列前三的因数，并确定其爬坡试验的方向和步长，其他因子均取低水平，考察菌体浓度的变化趋势，确定Box-Behnken Design响应面优化试验因素的中心点。
1.3.8.3 Box-Behnken Design响应面优化采用Box-Benhnken Design试验设计，对Plackett-Burman试验设计筛选出的主要因素和最陡爬坡试验确定的最适浓度进行进一步优化，以获得最佳增菌培养基。
1.3.9 降胆固醇能力的测定［8-10］
将培养基优化培养后的I4菌以0.5%的接种量（w∶v）接种于胆固醇培养基中，37℃静置培养48h，以未接种的培养基为空白对照。将培养液漩涡振荡摇匀，吸取0.5mL菌悬液和4.5mL 无水乙醇加入离心管中。静置提取10min后，3000r离心15min。取上清液0.5mL加入洁净试管中，再加入1mg/mL邻苯二甲醛液0.2mL、混合酸（1∶1浓硫酸、冰乙酸）4.3mL，制成实验组，对照组用无水乙醇代替离心后的上清液，振荡摇匀。静置反应30min后，在波长550nm处测定吸光度，计算其胆固醇降解率。
胆固醇降解率（%）= （C-A）/C×100
式中：A为实验菌株培养后的培养液550nm 处OD值对应的胆固醇浓度；C为空白对照的OD 值对应的胆固醇浓度；重复试验3次求平均值。
2 结果与分析
2.1 MRS培养基中I4菌降胆固醇能力、OD
620及菌落数的测定
实验测定植物乳杆菌I4胆固醇降解率为：35.3±1.50 （%，n=3）。由此可知该菌株具有一定的降解胆固醇作用。MRS培养基菌体密度OD620为1.987，菌落数为2.3×109 cfu/mL。
2.2 碳源的选择
不同碳源对菌体密度的影响结果如图1。
2
'
????????????
哖??
图1 不同碳源对菌体密度的影响
Figure 1 the influence of different carbon sources on
bacteria density
由图1可知，在这5中碳源中，蔗糖对对菌体密度的影响最大，葡萄糖和麦芽其次，果糖对其也有一定的影响，而可溶性淀粉对其基本没有影响。蔗糖相对于其他糖来说，价格相对便宜，所以综合考虑选用蔗糖作为该增菌培养基的碳源。
2.3 氮源的选择
不同氮源对菌体密度的影响结果如图2。
2'
???
?≤????????
??≒?
?????????图2 不同氮源对菌体密度的影响
Figure 2 different nitrogen source on the influence of the density
由图2可知，7种氮源中，硫酸铵、氨水、碳酸氢铵为无机氮源，大豆蛋白胨、牛肉浸膏、酵母提取物、蛋白胨为有机氮源。有机氮源对菌
体密度的影响明显大于无机氮源，菌体几乎不能利用三种无机氮源进行生长。在5种有机氮源中，酵母提取物对菌体密度的影响最大，而且价格低廉，所以综合考虑选用酵母提取物作为该增菌培养基的氮源。
2.4 pH 的选择
不同pH 对菌体密度的影响结果如图3。
S+
2'
图3 不同pH 对菌体密度的影响
Figure 3 different pH’s influence on the density of
bacteria
由图3可知，随着pH 的不断增大，菌体密度呈先增加后减小的变化趋势，当pH 为6.2时菌体密度最高，所以选择pH 为6.2作为该增加培养基的初始pH 。
2.5 温度的选择
不同温度对菌体密度的影响结果如图4。
?????
2'
图4 不同温度对菌体密度的影响
Figure 4 different temperature on the influence of the
density
由图4可知，随着温度的不断提高，菌体密度呈先增加后减小的变化趋势，当温度在37℃左右时，菌体密度达到最大值，所以选择37℃作为该增菌培养基的培养温度。
2.6 接种量的选择
不同接种量对菌体密度的影响结果如图5。
???? ?
2'
图5 不同温度对菌体密度的影响
Figure 5 different temperature on the influence of the
density
由图5可知，接种量在4%之前，随着接种量的不断增加，菌体密度呈上升趋势，当接种量在4%左右时，菌体密度达到最大值，这之后菌体密度趋于平稳。所以选择4%作为该增菌培养基的接种量。
2.7 植物乳杆菌I4增菌培养基优化结果及分析2.7.1 Plackett -Burman 试验设计结果及分析
Plackett -Burman 试验设计及结果见表2。
表2 Plackett -Burman 试验设计及结果
Table 2 Plackett - Burman experimental design and
results
试验
号A B C D E F G J K L OD 62011-1111-1-1-11-1 2.2512-11-111-1111-1 2.18331-111-1111-1-1 2.175411-1111-1-1-11 2.2765-111-1111-1-1-1 2.23761
1
-1-1-11-111-1 2.3157-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1 1.8608-1-1-11-111-111 1.81091
-1
-1-11-111-11 2.11810-1-11-111-1111 1.89111-1111-1-1-11-11 1.67112
1
1
1
-1
-1
-1
1
-1
1
1
1.682
应用Design Expert7.00软件对表2中菌体生物量OD 620值进行方差分析及显著性分析，评价每个因素的效应及重要性，结果见表3。
表3 Plackett -Burman 试验结果分析
Table 3 Plackett - Burman test results analysis
变异来源（Source ）系数（con ? dent Etimate ）平方和（Sum of Squares ）自由度（DF ）均方（Mean Square ）F 值（F Value ）P 值（Prob ＞ F ）重要性排列模型（Model ）
0.62080.07831.700.0024显著A 0.200.48210.482172.490.00021B
-0.07
0.057
1
0.057
20.300.0108
2
变异来源（Source ）系数（con ? dent Etimate ）平方和（Sum of Squares ）自由度（DF ）均方（Mean Square ）F 值（F Value ）P 值（Prob ＞ F ）重要性排列
C 0.030.01110.011 3.80
0.1230
5D
-0.06
0.049
1
0.049
17.540.0138
3
E 0.030.012
1
0.012
4.37
0.10474F 0.020.00735110.007351 2.630.18016G -0.01
0.00210710.0021070.750.4342
7
余项0.01130.002702
总项0.63111
R 20.9823R 2adj 0.9513R 2pred 0.8406Adeq Precision
15.4342
由表3可知，P 值为0.0024小于0.05，表明该拟合模型差异显著，可接受。在这7个因素中，A ，B ，D 的P 值都小于0.05，说明这些因素对模型显著。R 2=0.9823，说明模型方程拟和良好。精密度Adeq Precision 达到15.4342大于4，模型合理。经统计筛选出影响该菌生长的主要因素为：酵母提取物、蔗糖、乙酸钠。
2.7.2 最陡爬坡试验结果及分析
由上表3可知酵母提取物为正效应，蔗糖和乙酸钠为负效应。在此基础上进行最陡爬坡实验以确定重要因子的水平。
表4 最陡爬坡试验设计及结果
Table 4 the steepest grade experimental design and
results
试验号酵母提取物（%）蔗糖（%）乙酸钠（%）OD 620
1 1.50 2.000.50 2.119
2 1.75 1.750.40 2.269
3 2.00 1.500.30 2.435
4 2.2
5 1.250.20 2.3005
2.50
1.00
0.10
2.212
由表4可知由，随着酵母提取物、蔗糖、乙酸钠浓度的增加，菌体密度呈先上升后下降的变化趋势。在实验3时菌体密度达到最大值，该处为最大响应值区域，故以实验3的条件作为响应面设计因素水平的中心点，即酵母提取物、蔗糖、乙酸钠浓度分别为2.00%、1.50%、0.30%。
2.7.3 Box-Behnken Design响应面优化结果及分析
Box-Benhnken Design试验的因素与水平见表5、试验结果见表6。
表5 Box-Benhnken Design试验的因素与水平表Table 5 Box - Benhnken Design test factors and levels of
the table
编码因素
水平
-10+1 X1酵母提取物（%） 1.75 2.00 2.25
X2蔗糖（%） 1.25 1.50 1.75
X3乙酸钠（%）0.200.300.40表6 Box-Benhnken Design试验结果
Table 6 Box - Benhnken Design test results
试验号X1X2X3Y/OD620 1000 2.444
20-11 2.381
301-1 2.354
4-110 2.262
5000 2.487
60-1-1 2.335
7000 2.502
8-10-1 2.181
9-1-10 2.211
1010-1 2.298
11000 2.498
12-101 2.222
13000 2.462
14110 2.387
15101 2.352
161-10 2.274
17011 2.335
应用Design Expert7.00软件对表6中菌体生物量OD620值进行多元回归分析，结果见表7。
表7 Box-Benhnken Design试验结果分析
Table 7 Box - Benhnken Design test results analysis
变异来源
（Source）
平方和
（Sum of
Squares）
自由度
（DF）
均方
（Mean
Square）
F值
（F Value）
P值
（Prob＞
F）模型
（Model）
0.1690.01815.510.0008
X10.02410.02420.590.0027
X20.00234610.002346 2.040.196
X30.00186110.001861 1.620.2438 X1X20.00096110.0009610.840.3908 X1X30.0000422510.000042250.040.8534 X2X30.00105610.0010560.920.3695
X120.08410.08473.45＜ 0.0001 X220.01210.01210.510.0142
X320.02310.02319.960.0029残差
（Residual）
0.0080470.001149
失拟项
（Lack of
Fit）
0.00557330.001858 3.010.1573
纯误差0.00246740.0006168
三个因子经过拟合后，该二次多项回归方程为：
Y=2.48+0.054X1+0.017X2+0.015X3+0.015X1X2 +3.250E-003X1X3-0.016X2X3-0.14X12-0.054X22-0.074X32
式中：Y为植物乳杆菌I4菌体浓度预测响应值；X1为酵母提取物的编码值；X2为蔗糖的编码值；X3乙酸钠的编码值。
表7中，模型P值＜0.01，差异极显著，可接受；失拟项P值＞0.05，失拟项不显著，说明模型在整个回归区域的拟合度很好，接近真实的响应曲面情况，模型建立合理；CV=1.44%，模型精确度高，试验可信。R2=0.9522，矫正系数Adj R2=0.8908，表明预测值与实际值之间具有高
度相关性，能解释89.08%的响应值变化，故可以利用此模型对菌体数量进行预测。
根据上述回归方程绘出响应面分析图及等高
线图，研究酵母提取物、蔗糖、乙酸钠3个因素对发酵的影响，响应面和等高线图见图6、图7、图8。
图6 酵母提取物与蔗糖交互作用的等高线图和响应面图
Figure 6 the contour map of yeast extract and sucrose interaction and the response surface figure
由图6可知，当酵母提取物浓度一定时，随着蔗糖浓度的增加，OD 620值呈先增加后减少的趋势。当蔗糖浓度一定时，随着酵母提取物浓
度的增加，OD 620值呈先增加后减少的趋势。在蔗糖浓度为1.50～1.63，酵母提取物浓度为2.0～2.13时，OD 620达到最大值。
图7 酵母提取物与乙酸钠交互作用的等高线图和响应面图
Figure 7 yeast extract interaction with sodium acetate contour map and the response surface figure
由图7可知，当酵母提取物浓度一定时，随着乙酸钠浓度的增加，OD 620值呈先增加后减少的趋势。当乙酸钠浓度一定时，随着酵母提取物
浓度的增加，OD 620值呈先增加后减少的趋势。在酵母提取物浓度为2.00～2.13，乙酸钠浓度为0.30～0.35时，OD 620达到最大值。
图8 蔗糖与乙酸钠交互作用的等高线图和响应面图
Figure 8 sucrose interaction with sodium acetate contour map and the response surface figure
由图8可知，当蔗糖浓度一定时，随着乙酸钠浓度的增加，OD 620值呈先增加后减少的趋势。当乙酸钠浓度一定时，随着蔗糖浓度的增加，OD 620值呈先增加后减少的趋势。在蔗糖浓度为1.50～1.63，乙酸钠浓度为0.30～0.35时， OD 620达到最大值。
由图6、图7、图8可知，所得回归模型存在稳定点，即响应值最大点。通过软件计算，得到当酵母提取物浓度为2.05%、蔗糖浓度为1.54%、乙酸钠浓度为0.31%时，OD 620的理论最大值为2.486。
2.7.4 验证试验
以预测确定的各因子值进行验证试验，即培养基中：酵母提取物浓度为2.05%、蔗糖浓度为1.54%、乙酸钠浓度为0.31%，重复实验三次，得到菌体密度OD 620平均值为2.458，菌落数为11.3×109
cfu/mL ，与预测值非常接近，拟合
度为 98.87%，表明预测值和真实值之间有很好的拟合性，进一步验证了模型的可靠性。这比MRS 培养基OD 620值提高了23.7%，菌落单位提高了3.91倍。
2.8 菌制剂降胆固醇能力测试
试验得到菌制剂胆固醇降解率为36.2±1.75（%，n=3），这与培养基优化前的35.3±1.50 （%，n=3）相差不大，说明培养基优化后得到的I4菌
的胆固醇降解率没有明显变化，培养基优化对植物乳杆菌I4的降胆固醇能力没有明显影响。
3 结论
3.1 实验测定了植物乳杆菌I4胆固醇降解率为：37.3±1.50 （%，n=3），说明该菌株具有一定的降解胆固醇作用。MRS 培养基菌体密度OD 620为1.987，菌落数为2.3×109 cfu/mL 。
3.2 通过对培养基中碳源、氮源、pH 、温度、接种量的研究，得到培养基的最佳碳源为蔗糖，最佳氮源为酵母提取物，最适pH 为6.2，培养温度为37℃，接种量取4%。
3.3 通过Plackett -Burman 试验得到影响培养基菌体密度的主要因数为：蔗糖、酵母提取物、乙酸钠；通过最陡爬坡试验得到了响应面设计因素水平的中心点，即酵母提取物、蔗糖、乙酸钠浓度分别为2.00%、1.50%、0.30%；通过响应面优化设计试验得到当酵母提取物浓度为2.05%、蔗糖浓度为1.54%、乙酸钠浓度为0.31%时，OD 620的理论最大值为2.486。
3.4 通过验证实验得到菌体密度OD 620平均值为2.458，菌落数为11.3×109 cfu/mL ，拟合度为 98.87%，与预测值基本一致。这比MRS 培养基OD 620值提高了23.7%，菌落单位提高了3.91倍。3.5 通过对培养基优化培养后的植物乳杆菌I4
菌进行降胆固醇能力的测试，得出胆固醇降解率为36.2±1.75（%，n=3），这与培养基改变前的35.3±1.50 （%，n=3）相差不大，说明培养基优化后得到的I4菌的胆固醇降解率没有明显变化，培养基优化对植物乳杆菌I4的降胆固醇能力没有明显影响。
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枯草芽孢杆菌发酵培养基的优化
枯草芽孢杆菌发酵培养基优化 作者姓名 专业 指导教师姓名 专业技术职务
目录 摘要 (1) ABSTRACT (2) 第一章绪论 (3) 1.1枯草芽孢杆菌简介 (3) 1.2枯草芽孢杆菌的应用 (3) 1.2.1枯草芽孢杆菌在工业酶生产中的应用 (3) 1.2.2枯草芽孢杆菌在生物防治领域中的应用 (3) 1.2.3枯草芽孢杆菌在微生物添加剂领域中的应用 (4) 1.2.4 枯草芽孢杆菌在医药方面的应用 (4) 1.2.5 枯草芽孢杆菌在水产中的应用 (4) 1.2.6枯草芽孢杆菌是微生物学与分子生物学研究的良好试验材 料 (5) 1.2.7枯草芽孢杆菌在环境保护方面的应用 (5) 1.3 国内外的研究现状与发展趋势 (6) 1.4研究的思路、目的及意义 (7) 第二章材料与方法 (7) 2.1实验材料 (7) 2.1.1 菌株鉴定 (7) 2.1.2 培养基 (7)
2.1.3 主要设备 (8) 2.2 培养基的优化 (9) 2.2.1 培养方法 (9) 2.2.2实验流程 (9) 2.2.3实验方法 (10) 2.2.4正交试验 (11) 第三章结果和分析 (11) 3.1 鉴定结果如下 (11) 3.2 枯草芽孢杆菌最优化培养基正交实验结果 (16) 3.3 pH变化曲线（以G18为例） (19) 3.4 实验总结 (25) 致谢 (27)
摘要 枯草芽孢杆菌是主要的饲用益生菌菌株，本论文以两株枯草芽孢杆菌G18和G21培养的延滞期和倍增时间为评价指标，通过三角瓶摇床培养，进行了两因素三水平的正交试验，对发酵培养基主要组分进行了优化，豆粕处理的蛋白酶加量2u/g 豆粕、5u/g豆粕、10u/g豆粕和玉米浆添加量0.5%、1.0% 、1.5% 做两个因素三水平的正交实验，研究表明：G18最佳培养基是：葡萄糖0.5%，淀粉3%，豆粕3%，玉米浆1.0%，破壁酵母0.5%，磷酸氢二钠0.2%，硫酸镁0.1%，硫酸锰0.01%，普通a淀粉酶2u/g淀粉，蛋白酶添加量10u/g豆粕。G21的最佳培养基是：葡萄糖0.5%，淀粉3%，豆粕3%，玉米浆1.5%，破壁酵母0.5%，磷酸氢二钠0.2%，硫酸镁0.1%，硫酸锰0.01%，普通a淀粉酶2u/g淀粉，蛋白酶添加量5u/g豆粕。[关键词] 枯草芽孢杆菌培养基优化正交试验
微生物发酵培养基的优化方法
工业发酵进展
微生物发酵培养基的优化方法 对于微生物的生长及发酵，其培养基成份非常复杂，特别是有关微生物发酵的培养基，各营养物质和生长因子之间的配比，以及它们之间的相互作用是非常微妙的。面对特定的微生物，人们希望找到一种最适合其生长及发酵的培养基，在原来的基础上提高发酵产物的产量，以期达到生产最大发酵产物的目的。发酵培养基的优化在微生物产业化生产中举足轻重，是从实验室到工业生产的必要环节。能否设计出一个好的发酵培养基，是一个发酵产品工业化成功中非常重要的一步。以工业微生物为例，选育或构建一株优良菌株仅仅是一个开始，要使优良菌株的潜力充分发挥出来，还必须优化其发酵过程，以获得较高的产物浓度（便于下游处理），较高的底物转化率（降低原料成本）和较高的生产强度（缩短发酵周期）。设计发酵培养基时还应时刻把工 实验室最常用的优化方法是单次单因子法，这种方法是在假设因素间不存在交互作用的前提下，通过一次改变一个因素的水平而其他因素保持恒定水平，然后逐个因素进行考察的优化方法。但是由于考察的因素间经常存在交互作用，使得该方法并非总能获得最佳的优化条件。另外，当考察的因素较多时，需要太多的实验次数和较长的实验周期[3]。所以现在的培养基优化实验中一般不采用或不单独采用这种方法，而采用多因子试验。 2.多因子试验 多因子试验需要解决的两个问题: (1)哪些因子对响应具有最大(或最小)的效应，哪些因子间具有交互作用。 (2)感兴趣区域的因子组合情况，并对独立变量进行优化。
3.正交实验设计 正交实验设计是安排多因子的一种常用方法，通过合理的实验设计，可用少量的具有代表性的试验来代替全面试验，较快地取得实验结果。正交实验的实质就是选择适当的正交表，合理安排实验的分析实验结果的一种实验方法。具体可以分为下面四步： （1）根据问题的要求和客观的条件确定因子和水平，列出因子水平表； （2）根据因子和水平数选用合适的正交表，设计正交表头，并安排实验； （3）根据正交表给出的实验方案，进行实验； （4）对实验结果进行分析，选出较优的“试验”条件以及对结果有显著影响的因子。 正交试验设计注重如何科学合理地安排试验，可同时考虑几种因素，寻找最佳因 次 报道。CastroPML报道用此法设计20种培养基，做24次试验，把gamma干扰素的产量提高了45%。 6.部分因子设计法 部分因子设计法与P1ackett-Burman设计法一样是一种两水平的实验优化方法，能够用比全因子实验次数少得多的实验，从大量影响因子中筛选出重要的因子。根据实验数据拟合出一次多项式，并以此利用最陡爬坡法确定最大响应区域，以便利用响应面法进一步优化。部分因子设计法与Plaekett-Burman设计法相比实验次数稍多，如6因子的26-2部分因子设法需要进行20次实验，而Plackett-Burman设计法只需要7次实验。 7.响应面分析法
植物组织培养MS培养基配方
植物组织培养MS培养基配方 （一）母液配制与保存 配制培养基时，如果每次配制都要按着杨成分表依次称量，既费时，又增加了多次称量误差。为了提高配制培养基的工作效率，一般将常用的基本培养基配制成10～200倍，甚至1000倍的浓缩贮备液，即母液。母液贮存于冰箱中，使用时，将它们按一定的比例进行稀释混合，可多次使用，并在配制较多数量的培养基时，降低工作强度，也提高试验的精度。 基本培养基的母液有四种：大量元素（浓缩20倍），微量元素（浓缩100倍），铁盐（浓缩200倍），除蔗糖之外的有机物质（浓缩100倍） 1大量元素 配制大量元素母液时要分别称量，分别溶解，在定容时按表1中的序号依次加入容量瓶中，以防出现沉淀。倒入磨口试剂瓶中，贴好标签和做好记录后，可常温保存或放入冰箱内保存。 表1大量元素母液（配1L20倍的母液） 序号成分配方浓度/（mg.L-1）称取量/mg 配1mL培养基吸取 量/mL 1 硝酸铵NH4NO3 1650 33000 50 2 硝酸钾KNO 3 1900 38000 3 磷酸二氢钾KH2PO 4 170 3400 4 七水合硫酸镁MgSO4.7H2O 370 7400 5 氯化钙无水CaCl2 440 6644 2微量元素母液 在配制微量元素母液时，也应分别称量和分别溶解，定溶时不分先后次序，可随意加入溶量瓶中定容（表2），一般不会出现沉淀现象。倒入磨口试剂瓶中，贴好标签和做好记录后，可常温保存或放入冰箱内保有存。 表2微量元素母液(配制1L100倍母液) 成分配方浓度/(mg.L-1) 称取量/mg 配制1L培养基吸取 量/mL 碘化钾KI 0．83 83 10 硫酸锰MnSO4.H2O 22．3 2230 硼酸H3BO3 6．2 620 硫酸锌ZnSO4.7H2O 8．6 860 钼酸钠Na2MoO4.2H2O 0．25 25 硫酸铜CuSO4.5H2O 0．025 2．5 氯化钴CoCl2.6H2O 0．025 2．5 3铁盐母液 由于铁盐无机化合物不易被植物吸收利用，只有基螯合物才能被植物吸收利用，因此需要单独配成螯合物母液表3）。 配制方法：称取5.56g硫酸亚铁和7.46g乙二胺乙酸二钠，分别用450ml的去离子水溶解，分别适当加热不停搅拌，分别溶解后将硫酸亚铁溶液缓缓加入到乙二胺四乙酸二钠溶液中，将两种溶液混合在一起，最后用去离子水定溶于1000mL，倒入棕色贮液瓶中，贴好标签和做好记录后放入冰箱内保存。
双歧杆菌与乳酸菌筛选培养基
BBL培养基 双歧杆菌选择性培养基成份 蛋白胨15.0g 酵母粉2.0g 葡萄糖20.0g 可溶性淀粉0.5g 氯化钠5.0g 5%半胱氨酸10.0mL 西红柿浸出液400.0mL 吐温80 1.0mL 肝提取液80.0mL 琼脂20.0g 蒸馏水520.0mL pH7.0 MRS培养基 乳酸细菌培养基（MRS） 蛋白胨10.0 g 牛肉膏10.0 g 酵母膏 5.0 g 柠檬酸氢二铵[（NH4）2HC6H5O7] 2.0 g 葡萄糖(C6H12O6·H2O) 20.0 g 吐温80 1.0 mL 乙酸钠（CH3COONa·3H2O） 5.0 g 磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O） 2.0 g 硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.58 g 硫酸锰（MnSO4·H2O）0.25 g 琼脂18.0 g 蒸馏水 1 000 mL pH 6.2~6.6 当乳酸菌生长代谢出乳酸后，会使pH下降而使颜色由绿变为黄绿，也由于pH 值降低再加上抗生素及厌氧培养的作用，所以一般的微生物不容易在此培养基上生长，因此十分容易鉴别乳酸菌。 2005-03-10 08:08 消息引用收藏分享 奉上一篇实验，以供参考！ 厌氧菌的分离和培养 目前培养厌氧微生物的简便而又有效的技术包括有：厌氧箱培养技术；厌氧罐培养技术；厌氧袋培养技术；亨盖特厌氧滚管技术。这里介绍的是亨盖特厌氧滚管技术。
亨盖特厌氧滚管技术是美国微生物学家亨盖特（Hungate）于1950年首次提出并应用于瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术。以后这项技术又经历了几十年的不断改进，从而使亨盖特厌氧技术日趣完善，并逐渐发展成为研究厌氧微生物的一整套完整技术。而且多年来的实践已经证明它是研究严格、专性厌氧菌的一种极为有效的技术。 亨盖特厌样滚管培养技术不仅可用于有益厌氧菌如双歧杆菌等的分离、与活菌培养计数，还可以用于有害***菌（如酪酸菌）或病原菌（如肉毒梭状芽孢杆菌）的分离与鉴定。 1材料 1.1 样品 双歧酸奶（液体）、双歧杆菌制剂（固体）。 1.2 培养基 改良MRS培养基，PTYG培养基。 1.3 仪器和器具 亨盖特厌氧滚管装置一套，厌氧管，厌氧瓶，滚管机，定量加样器。 2 流程 铜柱除氧→预还原培养基→稀释用液制备→稀释样品→滚管→培养→计数 3方法 3.1铜柱系统除氧 铜柱是一个内部装有铜丝或铜屑的硬质玻璃管。此管的大小为40—400mm，两段被加工成漏斗装，外壁绕有加热带，并与变压器相连来控制电压和稳定铜柱的温度。铜柱两端连接胶管，一端连接气钢瓶，一端连接出气管口。由于从气钢瓶出来的气体如N2、CO2和H2等通常都含有O2，故当这些气体通过温度约360℃的铜柱时，铜和气体中的微量O2化合生成CuO，铜柱则由明亮的黄色变为黑色。当向氧化状的铜柱通入H2时，H2与CuO中的氧就结合形成H2O，而CuO又被还原成了铜，铜柱则又呈现明亮的黄色。此铜柱可以反复使用，并不断起到除氧的目的。当然H2源也可以由氢气发生器产生。 3.2 预还原培养基及稀释液的制备
植物常用培养基附加配制说明
备注：培养基和激素母液配制方法 （1）母液配制时，先向容量瓶中注入1/3定容体积的蒸馏水，再一一称取各种盐放入烧杯中溶解，装入容量瓶， 不得一次称取所有盐，混合溶解！在配制大量母液时，氯化钙最后加入。 （2）200×Fe盐溶液 称取1.39g FeSO4?7H2O溶于水（A液）；称取1.865 g Na2?EDTA溶于热水（B液）； 将A液缓慢倒入正在加热的B液中，加水接近250ml，煮沸，混合液颜色变深，冷却到室温，定容到250ml后,置于棕色试剂瓶内4℃保存。 （3）0.5mg/ml 2,4-D母液的配法 称取50mg 2,4-D，置于小烧杯内；加少量无水乙醇或95%乙醇使之完全溶解； 加水定容至100ml，4℃保存。如果出现沉淀，需要重新配置。 （4）0.5mg/ml α-NAA母液的配法 称取100mgNAA置于小烧杯内；用1N的KOH溶液溶解NAA；用水定容至200m l，4℃保存。 （5）0.5mg/ml 6-BA母液的配法 称取100mg 6-BA置于小烧杯中；加少量的浓盐酸，用玻棒研磨成糊状，再加入少量浓盐酸，使之完全溶解；用水稀释并定容至200ml，4℃保存。 （6）100mM乙酰丁香酮（As）的配制 称取196.2mg As，用5ml DMSO直接溶解，再加水定容至10ml，过滤灭菌后，分装入无菌小管，-20℃冰冻保存。使用前加入灭菌培养基。 （7） 0.5mg/ml KT和ABT的配法 称取50mg kenetin或ABT生根粉，先用少量1N KOH溶解，再用水稀释定容至100ml，4℃保存。 （8）其他附加物的溶解及配制 A、称取吗啉乙磺酸（MES）5g溶于水中，定容至10mL。4℃保存。 B、称取1g L-半胱氨酸(Cys) 溶于2mL 0.2mol/L或10%的NaOH溶液, 用蒸馏 水稀释定容至10mL，现用配制。4℃保存。 C、称取850mg硝酸银，用蒸馏水溶解后定容至100mL。4℃保存。 D、头孢霉素（cefotaxime）2500mg，用蒸馏水溶解后定容至10mL。4℃保存。 E、潮霉素（Hyg B），商品已溶解，筛选时一般加5、8、12mg/L梯度浓度。
实验方案(双歧杆菌的分离)
1 双歧杆菌的分离 1.1 样品 取出生后20天母乳喂养健康婴儿粪便。 1.2 培养基 根据目前的双歧杆菌选择性培养基，以及X-Gal在这方面的应用。选择使用NPNL培养基，在其基础上添加X-Gal。 1.2.1 缓冲蛋白胨水溶液（BP） 成份：蛋白胨10g 磷酸氢二钠2g 葡萄糖5g 磷酸二氢钾2g 氯化钠5g 蒸馏水1000ml 制法：精确称取各种试剂，加人到1000ml的蒸馏水中，加热溶化后分装于250ml的三角瓶中，每瓶90ml，121℃，杀菌15min后置4℃的冰箱中备用。 1.2.2 选择性改良NPNL培养基（苏世彦） 成份：酵母膏5g 淀粉0.5g 蛋白胨10g L-半胱氨酸0.5g 胰蛋白胨5g 溶液A 10ml 大豆蛋白胨5g 溶液B 5ml 葡萄糖10g 溶液C 50ml 乳糖3g 琼脂 15g 吐温80 1g pH 7.2 牛肝提取液150ml 制法：将各成分准确量取后，分别加热溶化，混合摇匀后分装，121℃杀菌10min，备用。 溶液A：K2HPO4 10g、KH2PO4 10g溶于蒸馏水100ml。 溶液B：FeSO4·7H2O 0.2g、MgSO4·7H2O 4g、MnSO4·4H2O 0.135g、NaCl 0.2g溶于蒸馏水100ml。 溶液C：丙酸钠30g、硫酸巴龙霉素400mg、硫酸新霉素200mg、NaCl 6g溶于蒸馏水1000ml。 1.2.3 NPNL培养基(孙雪) 培养基成分及用量：牛肉浸汁粉(oxoid)3g，蛋白胨10g，胰蛋白酶5g，
植胨3g，酵母浸出汁5g，肝浸出汁150ml，葡萄糖10g，可溶性淀粉0.5g，溶液A 10ml，溶液B 5ml，吐温80 1g，盐酸半胱氨酸0.5g，琼脂15g，蒸馏水815ml，X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D- 半乳糖苷)60mg。pH 7.2，121℃，15min 高压灭菌。 溶液A：K2HPO425g，KH2PO425g，蒸馏水250ml。 溶液B：MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，MnSO40.337g，蒸馏水250ml，硫酸新霉素100μg/ml，硫酸巴龙霉素200μg/ml，萘啶酮酸15μg/ml，氯化锂3mg/ml。 1.3 分离方法 取成年人的粪便1g，放人含有9ml缓冲蛋白胨水溶液中，用液枪充分混匀，制成1:10的稀释液，摇匀后取1ml注人含有9ml缓冲蛋白胨溶液中制成1:100的稀释液，在此基础上作10-3~10-9与的稀释，由于肠道中双歧杆菌的菌数一般在109左右，所以取10-4~10-9稀释液用倾注法倒平板，每个稀释液都各取1ml分别注人到两只无菌平皿中，每个稀释度重复3个平板。待培养基凝固后倒置，将温度调至37℃进行厌氧培养48h。用缓冲蛋白胨水溶液做稀释液可以有效地保护双歧杆菌的存活，避免受外界环境因素的影响。 1.4 分离培养 在加人样品稀释液的平皿中，分别注人适量冷却至50℃左右的选择性改良NPNL培养基，然后放人37℃的恒温培养箱中厌氧培养1.4.1 培养特性与镜检特性 双歧杆菌在改良NPNL培养基上，经过厌氧培养以后，菌落直径1-2cm，圆形、凸起，表面光滑，边缘整齐，乳白色，粘稠湿润。经革兰氏染色后镜检，双歧杆菌为革兰氏阳性无芽抱杆菌，呈多形性、典型的双歧杆菌为V字型或Y型；也有直、弯、棒状、匙形等多种形态，排列成单、双、短链、X、Y、V 或栅状；其大小为2-8×0.4-0.6μm，不具英膜和鞭毛，无运动性。 培养48h 后，平板上菌落呈现深蓝色、白色、浅蓝色三种颜色。
植物组织培养基配制
培养基的配制 植物组织培养中常用的一种培养基是MS培养基。MS培养基的配制包括以下步骤。 培养基母液的配制和保存 MS培养基含有近30种营养成分，为了避免每次配制培养基都要对这几十种成分进行称量，可将培养基中的各种成分，按原量的20倍或200倍分别称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做培养基母液。这样每次使用时，取其总量的1/20(50 mL)或1/200(5 mL)，加水稀释，制成培养液。现将制备培养基母液所需的各类物质的量列出，供配制时使用。 大量元素(母液Ⅰ) mg／L NH4NO3 33 000 KNO3 38 000 CaCl2·2H2O 8 800 MgSO4·7H2O 7 400 KH2PO4 3 400 微量元素(母液Ⅱ) KI 166 H3BO3 1 240 MnSO4·4H2O 4 460 ZnSO4·7H2O 1 720 Na2MoO4·2H2O 50 CuSO4·5H2O 5 CoCl2·6H2O 5 铁盐(母液Ⅲ) FeSO4·7H2O 5 560 Na2-EDTA·2H2O 7 460 有机成分(母液Ⅳ) ⅣA
肌醇 20 000 ⅣB 烟酸 100 盐酸吡哆醇(维生素B6) 100 盐酸硫胺素(维生素B1) 100 甘氨酸 400 以上各种营养成分的用量，除了母液Ⅰ为20倍浓缩液外，其余的均为200倍浓缩液。 上述几种母液都要单独配成1 L的贮备液。其中，母液Ⅰ、母液Ⅱ及母液Ⅳ的配制方法是：每种母液中的几种成分称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，最后定容到1 L。 母液Ⅲ的配制方法是：将称好的FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O 分别放到450 mL蒸馏水中，边加热边不断搅拌使它们溶解，然后将两种溶液混合，并将pH调至5.5，最后定容到1 L，保存在棕色玻璃瓶中。 各种母液配完后，分别用玻璃瓶贮存，并且贴上标签，注明母液号、配制倍数、日期等，保存在冰箱的冷藏室中。 MS培养基中还需要加入2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、萘乙酸(NAA)、6 苄基嘌呤(6BA)等植物生长调节物质，并且分别配成母液(0.1 mg/mL)。其配制方法是：分别称取这3种物质各10 mg，将2，4-D和NAA用少量(1 mL)无水乙醇预溶，将6BA用少量(1 mL)的物质的量浓度为0.1 mol/L的NaOH溶液溶解，溶解过程需要水浴加热，最后分别定容至100 mL，即得质量浓度为0.1 mg/mL的母液。 配制培养液用量筒或移液管从各种母液中分别取出所需的用量：母液Ⅰ为50 mL，母液Ⅱ、Ⅲ、ⅣA和ⅣB各5 mL。再取2，4-D 5 mL、NAA 1 mL，与各种母液一起放入烧杯中。 配制培养液时应注意：①在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制；②用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次；③量取母液时，最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上，量取1种，划掉1种，以免出错。
植物细胞培养
植物细胞培养 一、定义 ●在离体条件下，将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中进行振 荡培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量细胞群体的一种技术。 ●植物中含有数量极为可观的次生代谢物质，是各种色素、药物、香精、酶等天然 产物的主要来源。 ●植物细胞培养具有以下优点： 1、提高产率 2、缩短周期 3、提高产品质量 4、易于管理，减轻劳动强度 因此主要用于生产色素、药物、食品、酶、精细化工产品等次生代谢物。 二、培养基 常用MS培养基，另外还有B5、N6、NT、AA、KM8p等培养基 三、单细胞培养 1、制备方法 （1）机械法（机械磨碎、切割） （2）酶解法（目前最有效的获得单细胞方法） （3）愈伤组织诱导法（高频振动愈伤组织） 2、培养方法 （1）平板法（似微生物平板培养） （2）看护培养与饲养层培养法 看护培养：将单个细胞接种到滤纸上再置于愈伤组织之上进行培养。 饲养层培养：用处理过（如X射线）的无活性的或分裂很慢、不具分裂能力的细胞来饲养细胞。 （3）液体浅层静置培养法：将一定密度的悬浮细胞在培养皿中形成浅薄层，封口静止培养。
（4）细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。植物细胞在悬浮培养中的游离性较差，容易团聚进入不同程度的分化状态，因此要达到完全同步化相当困难。 ①低温法：冷处理可提高培养体系中细胞同步化程度。 ②分选法：通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中。 ③饥饿法：在一个培养体系中，如果细胞生长的基本成分丧失，则导致细胞因饥饿而分裂受阻，从而停留在某一分裂时期。 ④抑制剂法：通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，如尿苷等，使细胞滞留在DNA 合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期—G1期的同步化细胞。 3、保存 （1）继代培养（高等植物、海藻等） （2）低温（ 5℃～10℃） （3）冷冻（ -20℃或液氮） 植物细胞冷冻保存方法： 在冰浴条件下加入预冷的冰冻保护剂，密封，继续冰浴15min，在-40℃停留2h后投入-196℃液氮罐中保存。 植物细胞冷冻保护剂组成： 7.5%二甲基亚砜（DMSO）＋0.5mol／L山梨醇＋5%甘油＋5%蔗糖 四、植物细胞培养的应用 1、生产药用植物代谢产物（紫杉醇、苷类等） 2、生产天然食品、食品添加剂（可可碱等） 3、生产杀虫剂、杀菌剂（鱼藤酮、除虫菊脂） 4、生产饲料、精细化工产品（桑叶、橡胶等） 五、植物细胞的生物反应器大规模培养 1、培养特性 （1）细胞本身特性（生长慢、易结团、易损伤、易污染） （2）培养液流变特性（黏度增高） （3）气体传递与影响（O2与CO2需平衡）
培养基配方及配制方法
培养基配方 1 斜面菌种保存培养基 1.1PDA培养基（马铃薯葡萄糖琼脂培养基） 称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸0.5h，纱布过滤，滤液补足1000ml，再加15g葡萄糖和15-20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，每试管约5-10ml（视试管大小而定），121℃灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。 1.2麦芽汁琼脂培养基 麦芽汁的制备：干麦芽首先进行粉碎（不能太粗，也不必太细。太粗影响糖化效率，过细影响过滤速度），按麦芽重量的3~4倍加水，搅拌均匀后，37℃左右浸泡1小时，然后缓缓加温至55~63℃（在升温过程中应不断搅拌使温度均匀），保温4~6小时（用0.02摩尔/升碘液测定为黄色至无色时），糖化结束。在糖化过程中，应每小时搅拌一次。取过滤后的清液，加1.8%琼脂，分装试管，每试管约5-10ml （视试管大小而定），121℃灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。 2 基菌落总数检测 2.1平板计数琼脂培养基 将胰蛋白胨5.0g、酵母浸膏2.5g、葡萄糖1.0g、琼脂15.0g 加入蒸馏水1000ml中，煮沸溶解后，调pH，然后在121℃下灭菌15min，取出，稍微冷却后，带热倒入培养皿中。 3志贺氏菌检测
3.1 GN增菌液 成分：胰蛋白胨：20g，葡萄糖：1g，甘露醇：2g，柠檬酸钠：5g，去氧胆酸钠0.5g，磷酸二氢钾4g，磷酸氢二钾1.5g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml。pH7.0 制法：将上述物品加入蒸馏水中，加热溶解煮沸，调pH为7.0，分装，在115℃高压灭菌15min。 3.2 HE琼脂 成分：胨：12g，牛肉膏3g，乳糖12g，蔗糖12g，水杨素2g，胆碱20g，氯化钠5g，琼脂18~20g，蒸馏水1000ml0，0.4%溴麝香草酚蓝溶液16ml，Andrade指示剂20ml.，甲液20ml，乙液20ml。pH7.5 制法：将上述前七种成分加入400ml蒸馏水中作为基础液，将琼脂加入到600ml蒸馏水中加热溶解，加入甲液乙液到基础液中，调pH，再加入指示剂，并与琼脂液合并，待冷却至50~55℃，倾注浇平板。注1：此培养基不能高温灭菌。 注2：甲液的配置： 硫代硫酸钠：34g，柠檬酸铁钠：4g，蒸馏水：100ml。 注3：乙液的配置： 去氧胆酸钠：10g，蒸馏水：100ml。 注4：Andrade指示剂的配置： 酸性复红：0.5g，1mol/l的氢氧化钠溶液：16ml，蒸馏水：100ml。将酸性复红溶解于蒸馏水中，加入氢氧化钠溶液，数小时后如复红褪色不全，再加氢氧化钠溶液1~2ml。
实验一 植物组织培养基母液配制的若干关键环节
实验一、植物组织培养基母液配制的若干关键环节目的与要求： 熟悉MS培养基的组成，掌握贮备液的配制方法. 植物组织培养（plant tissue culture）是指植物的任何器官、组织或细胞，在人工预知的控制条件下，放在含有营养物质和植物生长调节物质等组成的培养基中，使其生长、分化形成完整植株的过程.植物组织培养具有取材少，培养材料经济；人为控制培养条件，不受自然条件影响；生长周期短，繁殖率高；管理方便，利于自动化控制等特点.因而被广泛应用于各种植物的快速繁殖之中. 为了避免每次配制培养基都要对几十种化学药品进行称量，应该将培养基中的各种成分，按原量10倍、100倍或1000倍称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做母液。这样，每次配制培养基时，取其总量的1/10、1/100、1/1000，加以稀释，即成培养液。现将培养液中各类物质制备母液的方法说明如下。 以MS培养基为例，其母液的配制包括大量元素、微量元素、铁盐、维生素、氨基酸、植物生长调节物质和有机附加物等种类.(见表1) 表1 MS培养基母液的配制 成分规定用量 /mg.L-1 扩大倍 数 称取量/ mg 母液定溶 体积/ml 配1LMS培 养基吸取量 /ml 大量元素 KNO3 NH4NO3 MgSO4·7H2O KH2PO4 CaCl2·2H2O 微量元数 MnSO4·4H2O ZnSO4·7H2O 1900 1650 370 170 440 22.3 8.6 20 20 20 20 20 1000 1000 38000 33000 7400 3400 8800 22300 8600 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 50 50 50 50 50 1 1
常用培养基的配制
常用培养基的配制 （一）营养琼脂培养基 【用途】供细菌总数测定、保存菌种、细菌纯化、一般细菌培养、血琼脂培养基基础之用。 【成分】牛肉膏 3g NaCl 5g 蛋白胨 10g 琼脂 20g 【pH值】7.2±0.2 【制法】上述成分称取38g加蒸馏水1000ml，经121.3℃ 30min高压灭菌备用。 （二）蛋白胨水培养基 【用途】供细菌培养、吲哚试验之用。 【成分】蛋白胨 10g 氯化钠 5g 【pH值】7.6 【制法】将上述成分溶于1000ml蒸馏水中，过滤，分装于试管，每管2～3ml，经121.3℃20min高压灭菌备用。 （三）半固体培养基 【用途】供观察细菌动力、菌种保存、H抗原位相变异试验等。 【成分】蛋白胨 10g 氯化钠 5g 琼脂 2.5～3g 【pH值】7.6 【制法】上述成分加入1000ml蒸馏水中，加热溶解，分装于试管，每管3～4ml，经121.3℃ 20min高压灭菌备用。 （四）营养肉汤培养基 【用途】供一般细菌培养、转种、复苏、增菌等，也可用于消毒效果的测定。 【成分】蛋白胨 10g 氯化钠 5g 牛肉粉（牛肉浸汁） 3g 【pH值】7.2±0.2 【制法】将上述成分溶于1000ml蒸馏水中，分装小试管，每管2～3ml，经121.3℃ 20min 高压灭菌备用。 （五）葡萄糖蛋白胨水培养基 【用途】供甲基红试验及V-P试验之用。 【成分】蛋白胨5g 葡萄糖5g K2HPO4 (K2HPO4·3H2O) 5g (0.65g) 【pH值】7.0～7.2 【制法】将上述成分溶于1000ml蒸馏水中，过滤，分装试管，每管2～3ml，经112.6 ℃ 20min高压灭菌备用。 （六）伊红美蓝培养基（EMB培养基）
植物组织培养步骤
植物组织培养概念（广义）又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织.器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。植物组织培养概念（狭义）指用植物各部分组织，如形成层.薄壁组织.叶肉组织.胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。 组织培养的步骤 一、培养基配制 配制培养基有两种方法可以选择，一是购买培养基中所有化学药品，按照需要自己配制；二是购买商品的混合好的培养基基本成分粉剂，如MS、B5等。 自己配制可以节约费用，但浪费时间、人力、且有时由于药品的质量问题，给实验带来麻烦。就目前国内的情况看，大部分还是自己配制。为了方便起见，现以MS培养基为例介绍配置培养基的主要过程。 1、配制几种母液 （1）配制MS大量元素母液 一般将大量元素分别配制成100倍的母液，使用时再分别稀释100倍。 分别称取 NH4NO3 165g KH2PO4 17g KNO3 190g CaCl2·2H2O 44g MgSO4·7H2O 37g 各自配成1L的母液。倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。 （2）配制MS微量元素母液 一般将微量元素配制成100倍母液。 依次称取 KI 0.083g Na2MoO4·2H2O 0.025g H3BO3 0.62g CuSO4·5H2O 0.0025g MnSO4·H2O 1.69g CoCl2·6H2O 0.0025g ZnSO4·7H2O 0.86g 配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。 CuSO4·5H2O和CoCl2·6H2O 由于称取量很小，如果天平精确度没有达到万分之一，可先配成调整液。 分别称取 CuSO4·5H2O 0.05g CoCl2·6H2O 0.05g 各自配成100ml的调整液，然后取5ml就还有0.0025g的量。 （3）配制MS有机母液
比较动植物细胞培养条件
动植物细胞培养条件的比较
动植物细胞培养条件的比较 动植物细胞的培养是细胞工程中非常重要的环节，在培养动植物细胞的过程中，培养条件有相似之处，但也有各自特殊的地方。下面，先就培养条件的不同之处进行比较： 一、培养基 植物细胞培养基一般为合成培养基，多为固体培养基，成分主要有无机营养、碳源、维生素、植物生长物质和有机附加物等。
动物细胞培养基包括天然培养基和合成培养基，可为固态，也可为液态，成分主要是水、葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等，此外，动物细胞培养还需要各种培养液。
二、营养要求 根据动植物细胞培养基的不同，我们可以看出，动植物细胞对培养基的营养要求有所不同。 植物细胞培养基根据无机盐成分可分为： （1）富盐平衡培养基（MS、LS、BL、BM）：无机盐浓度高，离子平衡性好，具较强缓冲性；营养丰富，无需额外添加复杂有机成分；微量元素种类多，浓度高。 （2）高硝态氮培养基（B5、N6）：硝酸钾含量高；铵态氮含量低；含有较高的VB1。 （3）中盐培养基（H、Nitsch）：大量元素为MS的一半；微量元素种类减少而含量增高；维生素种类比MS多（生物素、叶酸等）。 （4）低盐培养基（White、WS）：无机盐含量低；有机成分含量低。 对植物细胞的营养要求：生长代谢需要大量无机盐，需多种维生素、氨基酸和激素，要求的N源一般为无机N源，一般以蔗糖为C 源，细胞培养基要有缓冲性、等渗性。
动物细胞培养基可分为：基本培养基、通用培养基（能满足多种类型细胞生存）、完全培养基、生长培养基（基本培养基加入血清）、无血清培养基（基本培养基加入取代血清的成分）。 并且动物细胞培养基中都要加入血清或可代替血清的物质来提 供必须生长因子，以保证动物细胞的正常生长。 三、特殊条件 在所有的细胞离体培养中，最困难的是动物细胞培养。下面是它所需要的特殊条件。 (1)血清：动物细胞离体培养常常需要血清。最常用的是小牛血清。血清提供生长必需因子，如激素、微量元素、矿物质和脂肪，血清等于是动物细胞离体培养的天然营养液。 (2)支持物：大多数动物细胞有贴壁生长的习惯。离体培养常用玻璃，高速冷冻离心机塑料等作为支持物。 (3)气体交换：二氧化碳和氧气的比例要在细胞培养过程中不断进行调节，不断维持所需要的气体条件，每一次开箱操作后的快速恢复对设备的要求很高，由此决定了动物细胞离体培养设备要求高、投资大。 植物细胞由于其特殊性，其培养过程需要一定的特殊条件： (1)光照：离体培养的植物细胞对光照条件不甚严格，因为细胞生长所需要的物质主要是靠培养基供给的。但光照不但与光合作用有关，而且与细胞分化有关，例如光周期可对性细胞分化和开花调控作用，所以以获得植株为目的的早期植物细胞培养过程中，光照条件特别重
细胞培养基及其配制方法
D M E M(A)细胞培养基（粉末型）成分
DMEM(H) 细胞培养基（粉末型）成分 DMEM(L) 细胞培养基（粉末型）成分
双蒸水。（2）在室温（20℃到30℃）的水中加入干粉培养基，轻轻搅拌，不要加热。 （3）水洗包装袋的内部，转移全部的痕量干粉到容器内。 （4）加NaHCO3到培养基中。 （5）用双蒸水稀释到想要的体积，搅拌溶解。注意不要过分搅拌。 （6）通过缓慢搅拌加入1N NaOH 或1N HCL调节pH值，由于pH值在过滤时会上升到，因而调节pH值使它比最终想要的pH值低到。培养基在过滤前要保持密封。 配制培养基要注意以下问题： ●认真阅读说明书。说明书都注明干粉不包含的成分，常见的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。这些成分有些是必须添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根据实验需要决定。 ●配制是要保证充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物质都要等培养基完全溶解之后才能添加。 ●配制所用的水应是三蒸水，离子浓度很低。 ●所用器皿应严格消毒。 ●配制好的培养基应马上过滤，无菌保存于4度。
●液体培养基主要是为了科研工作的方便而设计的培养基，它是一种灭菌后保证无菌的溶液，必要时可制成无内毒素等的溶液，可节省科研人员的工作量。 DMEM各种成分都有什么作用 一般的基础培养基包括四大类物质：无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物。 （1）无机盐：对调节细胞渗透压、某些酶的活性及溶液的酸碱度都是必须的。 （2）氨基酸：缬氨酸、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精氨酸、胱氨酸(L型)都是细胞用以合成蛋白质的必需氨基酸，不能由其他氨基酸或糖类转化合成。除此之外，还需要谷氨酰胺(glutamine)。谷氨酰胺具有特殊的作用，对细胞的培养特别重要，能促进各种氨基酸进入细胞膜；它所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶的来源，还是合成—磷酸腺苷、二磷酸腺甘和三磷酸腺苷的原料。细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏可导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应补加一定量的谷氨酰胺。值得注意的是：谷氨酰胺在溶液中很不稳定，故4℃下放置1周可分解50%，使用中最好单独配制，置-20℃冰箱中保存，用前加入培养液中。 （3）维生素：是维持细胞生长的一种生物活性物质，在细胞中大多形成
双歧杆菌的培养
双歧杆菌的培养和分离 双歧杆菌是专性厌氧菌，对氧气非常敏感，因此，双歧杆菌的分离、培养及活菌计数的关键是提供无氧和低氧化还原电势的培养环境。 双歧杆菌的最适生长温度37℃~41℃，最低生长温度25℃~28℃，最高43℃~45℃。初始最适pH 6.5~7.0，在pH4.5~5.0或pH 8.0~8.5不生长。其细胞呈现多样形态，有短杆较规则形、纤细杆状具有尖细末端形、球形、长杆弯曲形、分枝或分叉形、棍棒状或匙形。单个或链状、V形、栅栏状排列，或聚集成星状。革兰氏阳性，不抗酸，不形成芽孢，不运动。双歧杆菌的菌落光滑、凸圆、边缘完整、乳脂至白色、闪光并具有柔软的质地。双歧杆菌是人体内的正常生理性细菌，定殖于肠道内，是肠道的优势菌群，占婴儿消化道菌丛的92%。该菌与人体终生相伴，其数量的多少与人体健康密切相关，是目前公认的一类对机体健康有促进作用的代表性有益菌。该菌可以在肠粘膜表面形成一个生理性屏障，从而抵御伤寒沙门氏菌、致泻性大肠杆菌，痢疾致贺氏菌等病原菌的侵袭，保持机体肠道内正常的微生态平衡；能激活巨噬细胞的活性，增强机体细胞的免疫力；能合成B族维生素、烟酸和叶酸等多种维生素；能控制内毒素血症和防治便秘，预防贫血和佝偻病；可降低亚硝胺等致癌物前体的形成，有防癌和抗癌作用；能拮抗自由基、羟自由基及脂质过氧化，具有抗衰老功能。 双歧杆菌的培养方法很多，如厌氧箱法、厌氧袋法、厌氧罐法。本实验介绍的是一种简便的试管培养法——亨盖特厌氧滚管技术该技术的优点是：预还原培养基制好后，可随时取用进行试验；任何时间观察或检查试管内的菌都不会干扰厌氧条件。 近年来兴起的一种新的RAPD等分子生物学技术对双歧杆菌进行基因指纹图谱的构建，分析不同双歧杆菌种间存在的同源性和多态性；RAPD技术也可用于双歧杆菌菌种鉴定及分型。一般来讲，我们都应用适合鉴定所有厌氧菌的方法，主要包括双歧杆菌特定酶的检测、乙酸、乳酸等有机酸的测定、糖发酵试验和其他相关指标等。 一、实验方法 1、铜柱系统除氧 2、预还原培养基及稀释液的制备 制作预还原培养基及稀释液时，先将配置好的培养基和稀释液煮沸驱氧，而后用半定量加样器趁热分装到螺口厌氧试管中，一般琼脂培养基装4.5～5.0mL，稀释液装9mL，并插入通N2气的长针头以排除O2。此时可以清楚的看到培养基内加入的氧化还原指示剂—刃天青由蓝到红最后变成无色，说明试管内已成为无氧状态，然后盖上螺口的丁烯胶塞及螺盖，灭菌备用。 3、分离 （1）编号 取五支无菌水试管，分别用记号笔标明10-1、10-2……10-5。 （2）稀释 在无菌条件下，用无菌注射器吸取1mL混合均匀的液体样品，加入装有预还原生理盐水的厌氧试管中，用震荡器将其混合均匀，制成10-1稀释液。用无菌注
培养基配制的基本过程
培养基配制的基本过程 1.配制溶液 向容器内加入所需水量的一部分，按照培养基的配方，称取各种原料，依次加入使其溶解，最后补足所需水分。对蛋白胨、肉膏等物质，需加热溶解，加热过程所蒸发的水分，应在全部原料溶解后加水补足。 配制固体培养基时，先将上述已配好的液体培养基煮沸，再将称好的琼脂加入，继续加热至完全融化。并不断搅拌，以免琼脂糊底烧焦。 2.调节pH值 用pH试纸（或pH电位计、氢离子浓度比色计）测试培养基的pH值，如不符合需要，可用10%HCl或10%NaOH进行调节，直到调节到配方要求的pH值为止。 3.过滤 用滤纸、纱布或棉花趁热将已配好的培养基过滤。用纱布过滤时，最好折叠成六层，用滤纸过滤时，可将滤纸折叠成瓦棱形，铺在漏斗上过滤。 4.分装 已过滤的培养基应进行分装。如果要制作斜面培养基，须将培养基分装于试管中。如果要制作平板培养基或液体、半固体培养基，则须将培养基分装于锥形瓶内。 分装时，一手捏松弹簧夹，使培养基流出，另一只手握住几支试管或锥形瓶，依次接取培养基。分装时，注意不要使培养基粘附管口或瓶口，以免浸湿棉塞引起杂菌污染。 装入试管的培养基量，视试管和锥形瓶的大小及需要而定。一般制作斜面培养基时，每只15×150毫米的试管，约装3～4毫升（1/4～1/3试管高度），如制作深层培养基，每只20×220毫米的试管约装12～15毫升。每只锥形瓶装入的培养基，一般以其容积的一半为宜。 5.加棉塞 分装完毕后，需要用棉塞堵住管口或瓶口。堵棉塞的主要目的是过滤空气，避免污染。棉塞应采用普通新鲜、干燥的棉花制作，不要用脱脂棉，以免因脱脂棉吸水使棉塞无法使用。制作棉塞时，要根据棉塞大小将棉花铺展成适当厚度，揪取手掌心大小一块，铺在左手拇指与食指圈成的圆孔中，用右手食指插入棉花中部，同时左手食指与姆指稍稍紧握，就会形成1个长棒形的棉塞。棉塞作成后，应迅速塞入管口或瓶口中，棉塞应紧贴内壁不留缝隙，以防空气中微生物沿皱折侵入。棉塞不要过紧过松，塞好后，以手提棉塞、管、瓶不下落为合适。棉塞的2/3应在管内或瓶内，上端露出少许棉花便于拔取。塞好棉塞的试管和锥形瓶应盖上厚纸用绳捆札，准备灭菌。 6.制作斜面培养基和平板培养基 培养基灭菌后，如制作斜面培养基和平板培养基，须趁培养基未凝固时进行。 (1)制作斜面培养基。在实验台上放1支长0.5～1米左右的木条，厚度为1厘米左右。将试管头部枕在木条上，使管内培养基自然倾斜，凝固后即成斜面培养基。 (2)制作平板培养基。将刚刚灭过菌的盛有培养基的锥形瓶和培养皿放在实验台上，点燃酒精灯，右手托起锥形瓶瓶底，左手拔下棉塞，将瓶口在酒精灯上稍加灼烧，左手打开培养皿盖，右手迅速将培养基倒入培养皿中，每皿约倒入10毫升，以铺满皿底为度。铺放培养基后放置15分钟左右，待培养基凝固后，再5个培养皿一叠，倒置过来，平放在恒温箱里，24小时后检查，如培养基末长杂菌，即可用来培养微生物。
植物组织培养的培养基配制
植物组织培养的培养基配制、分装与灭菌 一、实验目的 1.配制培养基母液是植物组织培养的基本技术。掌握植物组织培养基母液的配制方法和分装原则与方法。 2.掌握大量元素母液、微量元素母液、铁盐、有机物质、植物激素的配制和灭菌方法。 二、仪器设备及试剂 电磁炉天平(0.0001 g) 高压灭菌锅、量筒: 10ml、20ml、100ml、500 ml烧杯: 1000ml、500 ml、250 ml 、移液管: 1ml、2ml、5 ml 吸管若干、记号笔、三角瓶或试管、试管架锡铂纸、玻璃棒配制好的各种母液，如大量元素母液、微量元素母液、铁盐、有机物、生长调节剂等，个别生长调节剂要随配随用。蒸馏水、pH试纸蔗糖、琼脂等 1 molL NaOH溶液、1 mol/L HC1溶液。 三、方法和步骤 1.量取所配培养基总体积的2/3体积的蒸馏水，如要配1升培养基,先量取约700 m1体积的水。 2.根据培养基配方，用量筒量取所需要的各种元素的母液。 物质加入体积或重量大量元素母液(10x)100ml 、微量元素母液( 100)1 ml有机物质母液(200x)5ml 、铁盐母液(200x)5 ml、肌醇(200x)5 ml、蔗糖30g、琼脂7g
吸取母液时,注意应先将几种母液按顺序排好,不要弄错以免使培养基中药品成分发生改变。在培养不同的外植体时，应加入不同的激素，如培养康乃馨侧芽或茎段时加入1ml的1mg/ml 的6 BA;而胡萝卜愈伤组织培养中应加入2ml的1mg/ml 的24-D。加入一种母液后应先搅拌均匀,避免因不均而使局部浓度过高而引起沉淀,琼脂可在加入蔗糖调节完pH值后再加入，此时应注意搅拌,以免琼脂或蔗糖沉淀于烧杯底而炭化。 3.调节培养基的pH值，用pH计或pH试纸测定 培养基的pH按照培养材料的要求分别用1moILNaOH溶液、1molL HC1溶液来调节所配制培养基的pH值，- -般培养基的pH值约为5.8,培养的材料不同，对培养基的pH值要求也不同 4.分装 加热至沸腾片刻,以使琼脂充分溶解,检查时可注意烧杯内溶液是否透明。将配制并加热好的培养基分别装在事先洗净的三角瓶,用封口膜封口，注明标签,然后和用牛皮纸或报纸包好的培养皿及用三角瓶装好的蒸馏水一道进行高压灭菌。 5.培养基的灭菌 一般用医用高压锅来灭菌(方法略)，本实验采用全自动高压灭菌锅。 5.培养基的保存 毒过的培养基通常放在接种室或培养室中保存，一般应在消毒后的两周内用完,最好不要超过一个月。 四、注意事项