甲型流感病毒对肺泡上皮细胞作用的研究进展
甲型流感病毒对肺泡上皮细胞作用的研究进展
韩朋 王瑞兰
【摘 要】【摘要】流感是流感病毒引起的一种急性呼吸道病毒感染性疾病，能够引起较高的发病率和病死率，给人类健康带来重大威胁。肺泡上皮细胞是机体抵御甲型流感病毒的肺部关键组成部分，同时也是季节性和流行性甲型流感病毒最主要的靶向细胞和感染细胞之一，本文对甲型流感病毒对肺泡上皮细胞作用的研究进展进行简要阐述。
【期刊名称】国际呼吸杂志
【年(卷),期】2017(037)013
【总页数】4
【关键词】【关键词】甲型流感病毒；肺泡上皮细胞；细胞因子风暴；肺泡上皮-内皮屏障
·综 述·
Fund program:National Natural Science Foundation of China (81471891)
甲型流感病毒(influenza A virus，IAV)是最为常见的流感病毒，根据其表面糖蛋白血凝素(hemaggutinin，HA)和神经氨酸酶(neuraminidase，NA)的不同分成许多亚型，截至目前已发现18个H亚型和11个N亚型[1]。IAV曾多次引起世界性大流行，是全球性的引起显著发病率和病死率的呼吸道病原体[2-3]。通常情况下，IAV只引起上呼吸道的感染，但在重症患者中，IAV能够导致弥漫性肺部损伤，早期可迅速发展为重症肺炎和ARDS，ARDS的主要原因是由于肺泡上皮-内皮屏障受损，进而使肺泡腔内充满液体等，最终影响肺部气体交换引起呼吸功能不全。研究表明感染IAV的死亡患者肺部有明显的肺泡损伤，并且肺泡上皮细胞(alveolar epithelial cells,AEC)是最主要的感染细胞之一[4]。此外，AEC也是维持肺泡上皮-内皮屏障功能的最主要细胞。AEC在IAV引起的人畜禽共患性疾病中发挥着至关重要的作用。本文就IAV的致病过程包括病毒复制、诱发的细胞因子风暴、肺泡上皮-内皮屏障受损和针对AEC的抗病毒治疗等方面进行简要综述。
1 肺泡上皮细胞与病毒复制
肺泡上皮由Ⅰ型肺泡上皮细胞和Ⅱ型肺泡上皮细胞构成。Ⅰ型肺泡上皮细胞约占上皮细胞总量的10%，但却覆盖肺泡表面积的95%，具有交换气体的功能，并在液体和离子运输方面发挥着相当重要的作用；Ⅱ型肺泡上皮细胞约占上皮细胞总量的90%，却仅覆盖肺泡表面积的5%，其分泌的表面活性蛋白SP能够降低肺泡表面张力，有助于肺泡对病原体防御，还有着产生新的AEC替代损伤的细胞以促进损伤肺泡修复的功能。IAV感染宿主人并进入肺部后可以在肺AEC中有效复制，Yu等[5]发现H1N1病毒感染Ⅱ型肺泡上皮细胞24 h后，构成IAV最基本的复制单位的病毒核糖核蛋白复合体(viral ribonucleoprotein complexes，vRNP)的主要蛋白NP蛋白水平明显增加，表明IAV可以在
9.流感病毒的快速检测方法
流感病毒的快速检测方法 一、RT-PCR快速诊断方法 （一）生物安全要求 （二）病毒核酸提取 （三）RT-PCR （四）PCR 产物纯化 （五）流感病毒RT-PCR检测引物 二、免疫荧光方法检测流感病毒 （一）原理 （二）标本处理 （三）间接免疫荧光法 （四）结果判断 三、实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）快速诊断检测 （一）基本原理 （二）实验试剂 （三）实验步骤 四、快速诊断试剂盒 流感的快速检测方法，与传统的病毒分离鉴定相比具有快速、简便的特点。因此常用于流感暴发时早期病原学检测用。流感的快速诊断包括直接和间接免疫荧光法、ELISA、RT-PCR、Real-Time PCR快速诊断速方法、流感快速诊断试剂盒等。这里介绍RT-PCR、Real-Time PCR、免疫荧光快速诊断速诊断方法和几种流感快速诊断试剂盒优缺点。无论那种快速诊断都无法代替传统的病毒分离鉴定方法。 一、RT-PCR快速诊断方法 核酸检测是一种鉴定流感病毒基因组的有力方法，即使基因组含量很低或死病毒也可以检测到。本章将介绍检测流感病毒的聚合酶链式反应（PCR）。 流感病毒的基因组是负链RNA，在进行PCR扩增前必须合成与病毒RNA 互补的DNA，即为cDNA。逆转录酶（RT）就是用于合成cDNA的多聚酶，因此，扩增流感病毒基因组的过程称为RT-PCR。 RT-PCR需要一对型别特异引物，四种脱氧核苷酸（dNTPs），RNA模板，逆转录酶及Taq DNA 多聚酶；首先由逆转录酶将病毒的RNA逆转录合成cDNA，然后再进行聚合酶链反应经25～30个循环，使DNA产物达到倍增的效果。 （一）生物安全要求 生物安全级别与个人防护要求：生物安全二级实验室，防护要求与二级实验室的要求相同。并应遵守相应的生物安全规定。进行高致病性禽H5 RT-PCR快速检测时可以在生物安全二级实验室里进行，核酸提取在生物安全三级实验室的生物安全柜里完成。
肺泡Ⅱ型上皮细胞与支气管哮喘
垦堡堕堂堕堕墨煎坌盟；！！！至！旦塑塾鲞璺！塑！！壁曼！！Ｐ！！！！！里！！！！鲤丛型墅！：！业！！型！！！！：型！型！．！·２７肺泡Ⅱ型上皮细胞与支气管哮喘 李绍波综述李昌崇审校 【摘要】支气管哮喘是多种细胞参与的一种小儿常见的慢性呼吸道炎症性疾病。最近研究表明，肺 泡Ⅱ型上皮细胞（ＡＴ＿Ⅱ）不仅是支气管哮喘发病过程中的受幕细胞，也是重要的参与细胞之～。其可合成 和分泌肺泡表面活性物质（Ｐｓ）、细胞因子，黏附分子和炎症介质而参与哮喘气道慢性炎症过程的发生和气 道反应性增高的改变。本文就ＡＴ—ＩＩ与哮喘关系作一综述，以提高对哮喘气道炎症状态的认识，促进对哮 喘发病机制的研究。 【关键词】肺泡Ⅱ型上皮细胞；哮喘；气道炎症 支气管哮喘是一种ｄ，ＪＬ常见的慢性呼吸道炎症性疾病，其中许多细胞特别是肥大细胞（ＭＣ）、嗜酸粒细胞（ＥＯｓ）和Ｔ细胞参与了这种慢性炎症过程。这种炎症造成反复发作的喘息、呼吸困难、胸闷和咳嗽等症状通常与广泛而多变的通气受限有关，而气流受限除由支气管平滑肌痉挛所致外，还与支气管黏膜水肿、管腔内的黏液栓塞、纤毛运动障碍和气道的不可逆改变等因素有关。ＡＴ＿Ⅱ作为肺泡上皮的干细胞，不仅其合成和分泌的由磷脂和蛋白组成的ＰＳ的数量、活性和组成成分的改变与哮喘的发生发展及喘息症状的程度密切相关，而且ＡＴ一Ⅱ来源的细胞因子、黏附分子和炎症介质也参与哮喘的慢性炎症的发生和气道反应性增高的改变。另外，通过对动物模型观察发现，哮喘急性发作时可观察到ＡＴ一Ⅱ形态和功能的改变以及表面活性物质系统（ＰＳＳ）的损伤，而且临床使用ＰＳ治疗某些哮喘患者也可明显缓解哮喘症状和改善哮喘患者肺功能。所以，研究哮喘发病过程中ＡＴ＿Ⅱ功能的改变和ＡＴ一Ⅱ参与哮喘发病的机制将对哮喘的认识和治疗有重要意义。 １ＡＴ－Ⅱ来源的趋化因子与哮喘 近年来发现，ＡＴ一Ⅱ不仅仅是哮喘发病的受累细胞，也是重要的参与细胞之一。现已证实，多种炎性细胞在气道的募集和活化是哮喘气道慢性炎症的基础。在这些炎症细胞中，ＥＯｓ除可释放主要碱性蛋白（ＭＢＰ）、嗜酸粒细胞阳离子蛋白（ＥＣＰ）和嗜酸粒细胞衍生的神经毒素（ＥＤＮ）等颗粒蛋白外，还可产生Ｉ，ＴＣ４、ＬＴＤ４和ＬＴＥ４等炎症介质，从而在哮喘气道上皮细胞损害和支气管收缩中起重要的作用。嗜酸粒细胞趋化蛋白（Ｅｏｔａｘｉｎ）和调节激活正常Ｔ细胞表达和分泌因子（ＲＡＮＴＥＳ）是与哮喘密切相关的Ｃ—Ｃ趋化因子，两者都是ＥＯＳ强力趋化 作者单位：３２５０２７瀛州医掌院育英儿童医藏挈岁６卢（ 剂。而最近研究表明，Ｅｏｔａｘｉｎ和ＲＡＮＴＥＳ都可由ＡＴ—ＩＩ产生，并且用ＴＮＦ－ａ和ＩＬ－４预处理Ａ５４９细胞（一种Ａ－Ⅱ细胞系）后，其表达的嗜酸细胞趋化活性（ＥＣＡ）主要与释放的Ｅｏｔａｘｉｎ和ＲＡＮＴＥＳ有关。Ｊｅｄｒｚｋｉｅｗｉｃｚ等人进一步证实，ＴＮＦ—ｑ和ＩＬ－Ｉｐ可剂量依赖性诱导Ａ５４９细胞Ｅｏｔａｘｉｎ基因转录增加，这种增加峰值发生在刺激后４小时并与ＮＦ－ｋＢ的参与有关“］。另外，单核细胞趋化蛋白一４（ＭＣＰ－４）也是可在ＴＮＦ—ａ和ＩＬ一１口诱导下由Ａ５４９细胞内表达的一种ＣＣ类趋化因子，其对ＥＯＳ、单核细胞、Ｔ细胞和嗜碱性粒细胞有强大的趋化作用，并且这种ＴＮＦ－ｇ和ＩＬ＿１８诱导ＭＣＰ－４生成增加效应可被ＩＦＮ一７蜘同加强和被地塞米松所抑制”３。 目前有较多的证据支持哮喘时存在Ｔ一，／Ｔ。。平衡失调，并认为Ｔｎｔ细胞优势激活是哮喘发生的重要因素。在Ｔｎ。细胞的参与下，不仅可引起Ｂ细胞产生变应原特异性ＩｇＥ抗体和促使ＥＯＳ在靶组织中的浸润，还可直接或间接影响哮喘的气道重建。 另外，Ｔｎ。细胞选择性表达的ＣＣＲ４还可与巨噬细胞起源的趋化因子（ＭＤＣ）和胸腺活化相关的趋化性细胞因子（ＴＡＲＣ）结合后而促使炎症的循环放大。有研究证实，在ＴＮＦ—ａ和ＩＬ－４作用下，ＴＡＲＣ基因在Ａ５４９细胞内的转录和翻译明显增加，而上述细胞因子促进ＴＡＲＣ基因转录和翻译的上调效应几乎可完全被糖皮质激素所抑制。所以，ＡＴ一Ⅱ在哮喘气道慢性炎症的循环放大效应中可能起了重要的作用，而抑制ＴＡＲＣ的生成可能是吸入糖皮质激素治疗哮喘有效的部分机制ｏ］。 除上述介绍的ＣＣ类趋化因子外，Ａ卜Ⅱ还可生成其它对炎症细胞有强烈趋化效应的细胞因子。 如国外学者证实，用ＴＮＦ—ａ和ＩＬ－ＩＢ处理Ａ５４９细胞后，Ａ５４９细胞内淋巴细胞趋化黏附因子（ＩＬ一１６）ｍＲＮＡ的表达增强和分泌增加“］。而ＩＬ＿１６生成增多可＿通避趋化包括ｅＤ４＋蕾细胞，单棱细胞、ＥＯＳ 万方数据
流感病毒的实验室检测方法及进展
·１９０·星堕墅墅盘查！！！！生篁！！鲞釜ｉ塑！里！』曼！！丛！！至！坠：！！塑！！！！：！！：堕！：！ 流感病毒的实验室检测方法及进展 李月越陈杭薇李兵 【摘要】流行性感冒（流感）是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，其在人群中蔓延快，且具有高发病率及致死率的特点。流感的诊断不仅要根据临床症状和体征，其确诊还有赖于实验室检查。流感病毒的检测技术大致分为４个方面，即病毒分离培养、血清学诊断、现代免疫学诊断及分子生物学诊断。现分别从以上几个方面对流感病毒实验室检测方法及进展进行综述。 【关键词】流感病毒；检测方法 Ｌａｂ帅ｔｏｒｉａｌｍｅｔｈｏｄｓ狮ｄｐ哪哪艄０ｆｄ咖ｔｉＩｌｇｉＩＩｆｌｕ眦ａｖｉｎ麟Ｕｙ访ｙ獬，ＣＨＥＮ协咒ｇ－讹ｉ，ＵＢｉ恕ｇ．＆加仃批，ｚｆｏ，尺Ｐｓ加ｍ￡ｏ删Ｍ毒ｄ觑九８，＆巧ｉ挖ｇＣＤｍ凇挖ｄ＆咒８ｍ￡Ｈｏｓｐｉ￡ｎＺｏ，ＰＬＡ，＆巧锄ｇ１００７００，吼ｉ御 （乃ｒｒ已ｓ户Ｄ行矗ｉ７２９口“腩ｏｒ：（ＨＥ小，Ｈ口ｎｇ一议，Ｐｉ 【ＡｂｓｔＩ’ａｃｔ】Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓｃａｕｓｅａｎａｃｕｔｅｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｄｉｓｅａｓｅｔｈａｔｓｐｒｅａｄｓｅｐｉｄｅｍｉｃａｌｌｙｉｎｔｈｅｈｕｍａｎｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．ＣｈａｒａｃｔｅｒｏｆＩｎｆｌｕｅｎｚａｉｓｈｉｇｈｍｏｒｂｉｄｉｔｙａｎｄｍｏｒｔａｌｉｔｙ．ＤｉａｇｎｏｓｉｓｏｆｉｎｆｌｕｅｎｚａｄｅｐｅｎｄｓｏｎｎｏｔｏｎｌｙｃｌｉｎｉｃｉａｌｓｙｍｐｔｏｍｓａｎｄｓｉｎｇｓｂｕｔａｌｓｏｌａｂｏｒａｔｏｒｉａＩｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓ．Ｖｉｒａｌｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｓｅｒｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ｉｍｍｕｍｏｌｏ—ｇｉｃａｌａｓｓａｙａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏＩｏｇｉｃａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓａｒｅｆｏｕｒｍｅｔｈｏｄｓｔｈａｔｃｏｍｍｏｎｌｙｕｓｅｄｅｄｆｏｒｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉａｌｍｅｔｈｏｄｓａｎｄｐｒｏｇｒｅｓｓｅｓｏｆｄｅｔｅｃｔｉｎｇｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓａｒｅｓｕｍｍａｒｉｚｅｄｉｎｔｈｅｆ０１ｌｏｗｉｎｇｔｅｘｔ． 【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓ；Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ 流行性感冒简称流感，是由流感病毒引起的急 性呼吸道传染病，传染性强，蔓延快，其抗原易变异， 对人群尤其是儿童、老年人及机体免疫力低下的人 群有较高的发病率及致死率，危害很大。流感病毒 分为甲、乙、丙三型，其中变异大的、危害重的主要是 甲型和乙型流感病毒，尤以甲型为主，常可引起较大 范围的流行［１］。 流感的诊断不仅要根据临床症状和体征，还需 要实验室检测来证实。病毒诊断技术大致分为４个 方面，即病毒分离、血清学诊断、现代免疫学诊断及 分子生物学诊断瞳］。现分别进行介绍。 ｌ病毒分离培养 病毒分离培养是诊断流感最可靠的方法之一。 因流感病毒能够在鸡胚中良好生长，所以早期多用 鸡胚分离流感病毒，一般用９日龄至１１日龄的鸡胚 通过羊膜腔或尿囊腔接种分离病毒，接种后２４～９６ｈ 收集鸡胚尿囊液，２４ｈ内死亡的鸡胚弃掉，用鸡的 红细胞检测尿囊液或细胞培养液的血凝活性来证实 病毒的增殖和存在，如初次分离不到病毒，可盲传２ 代再进行检测；但近年来，随着分子生物学技术的发 展，发现通过鸡胚所分离到的流感病毒，其抗原性与 原始标本有所不同，而通过马一达犬１肾细胞（ＭＤＣＫ） 作者单位；１００７００北京军区总院呼吸内科 通讯作者：陈杭薇．综述． 分离病毒的抗原性与原始标本相似，另外由于 ＭＤｃＫ细胞对“ｏ”相毒株的敏感性比鸡胚高很多， 故ＭＤＣＫ细胞已成为流感病毒分离不可缺少的一 种宿主系统，现亦得到较为广泛的应用；ＭＤＣＫ分 离的病毒在很多国家尚未批准用于疫苗生产，因此 病毒分离现同时采用鸡胚及ＭＤＣＫ细胞两套系 统口］。但无论是以上哪种方法对标本中病毒采集、 运输及保存条件要求均较高，病毒样品如能在４８ｈ 分离，可在４℃保存，如果样品要存放较长时间必须 低温冻存（一７０℃）；且要求标本中的病毒含量高， 必须达到鸡胚或ＭＤＣＫ培养法所需要的病毒含量， 分离培养较为复杂、耗时且不稳定，也不能在普通实 验室进行，要确诊需要较长时间，故对流感早期诊断 及临床指导意义不大。 Ｓｈｉｈ等Ｈ３将一种新的实验室培养技术——离 心培养技术（ｓｈｅｌｌｖｉａｌｃｕｌｔｕｒｅ，ＳＶＣ）应用于流感病 毒的培养，其与传统培养方法没有本质的区别，不同 点为在标本接种后进行长时间的低速离心，使标本 中含病毒的颗粒在外力作用下被压挤吸附于培养细 胞，从而大大缩短了培养时间并提高了敏感性。在 国内倪安平等口］亦采用ＳＶＣ技术快速诊断流感病 毒，结果显示该技术能在２４ｈ内获得流感病毒培养 结果，可以快速确诊流感患者。 郭元吉等［６３建立了一种流感快速诊断方法，具 体为：采集标本经成片ＭＤＣＫ细胞扩增，使细胞表万方数据
禽流感的研究进展
禽流感的研究进展 谭飞虎，刁小龙，朱玉娟，张尚弟，张连团，祁越，刘卫军，吴頔 甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃兰州（730070） E-mail：tanfeihu521@https://www.wendangku.net/doc/fb17646622.html, 摘要：禽流感（Avian Influenza,AI），1878年首次发现与意大利，目前在美洲、非洲、亚洲、欧洲一些国家广泛发生。禽流感（AI）是由是由A型禽流感病毒(av ian in fluenza virus,AIV) 引起的禽类烈性传染病，主要在禽类中传播。AI不仅给世界养禽业造成了巨大的经济损失,而且对人类健康和生命安全构成了严重威胁。它可通过多种途径传播，且临床症状多样。本文主要从AIV的结构特征，致病机理，防治措施等方面论述了AIV 的研究进展 关键词：禽流感，结构特征，致病机理 引言 禽流感（Avian Influenza，AI）又名真性鸡瘟、欧洲鸡瘟，1878年首次发现于意大利。禽流感是由正粘病毒科甲型流感病毒属的A型流感病毒引起的禽类感染和疾病综合症。禽流感病毒（Avian Influenza Virus，AIV）亚型众多，变异频繁，根据病毒的血凝素（Hemagglutinin, HA）和神经氨酸酶（Neuraminidase，NA）的差异，将A型流感病毒分为不同的血清型，目前已发现16种HA亚型和9种NA亚型。其分子机制涉及点突变引起的抗原漂移（Antiyentil drife）和不同亚型毒株同源性产生新亚型所引起的抗原转变(Antiyentic shift)。该病在临床上所表现的症状变化从亚临床感染，重轻度的呼吸系统疾病，产蛋下降到严重的致死性疾病，其严重程度取于病毒的毒株以及被感染禽的种类，日龄和有无并发症等因素。禽流感病毒仅有H5和H7了两个血清型可引起高致病力禽流感（High Pathogentic Avian Influenza，HPAIV），以突然死亡和高死率为特征，在火鸡和鸡种引起的危害最为严重，常可导致感染鸡群的全军覆没，造成严重的经济损失，所以被国际兽医局列为A类烈性传染病。 1 流感病毒的分类 由于禽流感造成的损失巨大，引起国际社会的广泛关注，并对其分类进行了更为详尽的研究。根据国际病毒分类学（ICTV）第六次分类报告（1995年）规定，正粘病毒科分 3个病毒属：A，B型病毒属（Influenza Virus），A,B,C型流感病毒属（Influenza Virus C），类托高土病毒属（Thogotoline Virus），各属的代表中分别为A型流感病毒，C型流感病毒，托高土病毒，但是习惯上仍将A,B,C型流感病毒都归属亚流感病毒属的3个型[1]。这3个型的流感病毒没有共同的抗原，在内部核蛋白和基质蛋白的抗原性上有很大差异，在致病性和基因结构上也有所不同，其中的A型流感病毒感染的范围最大，危害最大，它可以感染人，猪，马，海洋哺乳动物，禽类等，是人和畜禽呼吸道疾病的重要病原。而B，C型流感病毒却只能感染人，所以禽流感可感染人类，引起以呼吸系统症状为主的急性传染病，部分患者可发展为全身多脏器功能衰竭而死亡。2005年1月新英格兰医学杂志上确认了第一例在人与人之间传播的禽流感病例，由于猪既有人类病毒的受体，又具有禽类病素的受体，所以猪可以同时感染两种病毒，并发生重配进而感染人类，这是禽流感病毒传染的最可能途径[ 2 ]。 -1-
小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞使用说明
小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞 小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞产品说明： 为使客户能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞其他相关小鼠原代细胞： 小鼠小肠粘膜上皮细胞小鼠大隐静脉平滑肌细胞 小鼠肺微血管内皮细胞小鼠冠状动脉平滑肌细胞 小鼠肺血管平滑肌细胞小鼠大隐静脉内皮细胞 小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞小鼠冠状动脉内皮细胞 小鼠气管上皮细胞小鼠骨细胞 小鼠气管平滑肌细胞小鼠滑膜细胞 小鼠肺成纤维细胞小鼠骨骼肌细胞 小鼠支气管上皮细胞小鼠表皮细胞 小鼠支气管成纤维细胞小鼠真皮成纤维细胞 小鼠肺大静脉平滑肌细胞小鼠破骨细胞 小鼠肺大动脉平滑肌细胞小鼠皮肤肥大细胞 小鼠肺大动脉内皮细胞小鼠前脂肪细胞
甲型流感病毒抗原检测试剂使用说明(胶体金)-Alere BinaxNOW
甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒（胶体金法）使用说明书 【产品名称】 通用名称：甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒（胶体金法） 英文名称：Alere BinaxNOW? Influenza A＆B Card 【包装规格】 22人份/盒。 【预期用途】 甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒（胶体金法）是一种体外免疫层析试验，用于定性检测鼻咽拭子样本中的甲、乙型流感病毒核蛋白抗原，可快速地对甲、乙型流感病毒感染做出辅助鉴别诊断。 试验简介 流感是发生在呼吸道的具有高度传染性的急性病毒感染，它属于传染病范畴，可通过咳嗽或打喷嚏时排出的带有活病毒的气溶胶而在人与人之间传播。每年的秋季和冬季都可爆发流感1.甲型流感病毒的流行性比乙型流感病毒流行性要强，造成的病情也更严重，并且大多数严重的流感也都是由它引起的，而乙型流感则相对比较缓和。 针对甲、乙型流感的快速诊断试验对获取有效的抗病毒治疗是很有意义的。对流感做出快速诊断不但可减少病人住院的天数，减少抗菌素的使用，而且可减少病人的住院费用1。 甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒（胶体金法）提供了一种用鼻咽拭子标本对甲型和乙型流感进行简便快速诊断的方法，使用方便，结果快速，在急诊检验中提供的信息可帮助医生选择治疗方案并做出是否需要收住院的决定。 甲型流感病毒有许多亚型，有些亚型可在鸟类中发现3。1997年首次报道人类甲型禽流感（H5N1，主要发生于鸟类的一种流感病毒亚型），此后，在人群中出现了H5N1病例，使人们对H5N1关注起来，H5N1的变异使得它更易在人群间传播4，由于备案的禽流感感染病人比例很低，快速试验在该类病人治疗中利用度尚不得知。 【检验原理】 甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒（胶体金法）使用的是薄膜免疫层析技术，它利用具有高度敏感性的单克隆抗体来检测鼻咽拭子标本中的甲型和乙型流感病毒的核蛋白抗原这些单克隆抗体连同一种对照抗体分别被固定到膜支持物上，形成三条独特的线。膜支持物跟其他试剂/垫结合在一起构成检测条。检测条位于一个称作检测卡的书型铰链状的纸板中。 拭子标本需要进行预处理：用洗脱液、盐水或转移介质等将标本从拭子中洗脱出来，将标本加到检测条顶端，闭合检测卡，15分钟时根据是否出现紫红色样品线来报告结果。在有效试验中，蓝色对照线变为粉红色。 【主要组成成分】 提供的材料
9.流感病毒的快速检测方法
一、RT-PCR快速诊断方法 （一）生物安全要求 （二）病毒核酸提取 （三）RT-PCR （四）PCR 产物纯化 （五）流感病毒RT-PCR检测引物 二、免疫荧光方法检测流感病毒 （一）原理 （二）标本处理 （三）间接免疫荧光法 （四）结果判断 三、实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）快速诊断检测 （一）基本原理 （二）实验试剂 （三）实验步骤 四、快速诊断试剂盒 流感的快速检测方法，与传统的病毒分离鉴定相比具有快速、简便的特点。因此常用于流感暴发时早期病原学检测用。流感的快速诊断包括直接和间接免疫荧光法、ELISA、RT-PCR、Real-Time PCR快速诊断速方法、流感快速诊断试剂盒等。这里介绍RT-PCR、Real-Time PCR、免疫荧光快速诊断速诊断方法和几种流感快速诊断试剂盒优缺点。无论那种快速诊断都无法代替传统的病毒分离鉴定方法。 一、RT-PCR快速诊断方法 核酸检测是一种鉴定流感病毒基因组的有力方法，即使基因组含量很低或死病毒也可以检测到。本章将介绍检测流感病毒的聚合酶链式反应（PCR）。 流感病毒的基因组是负链RNA，在进行PCR扩增前必须合成与病毒RNA互补的DNA，即为cDNA。逆转录酶（RT）就是用于合成cDNA的多聚酶，因此，扩增流感病毒基因组的过程称为RT-PCR。 RT-PCR需要一对型别特异引物，四种脱氧核苷酸（dNTPs），RNA模板，逆转录酶及Taq DNA 多聚酶；首先由逆转录酶将病毒的RNA逆转录合成cDNA，然后再进行聚合酶链反应经25～30个循环，使DNA产物达到倍增的效果。 （一）生物安全要求 生物安全级别与个人防护要求：生物安全二级实验室，防护要求与二级实验室的要求相同。并应遵守相应的生物安全规定。进行高致病性禽H5 RT-PCR快速检测时可以在生物安全二级实验室里进行，核酸提取在生物安全三级实验室的生物安全柜里完成。 （二）病毒核酸提取 1.实验材料及仪器
流感病毒分子生物学研究进展
?专题笔谈?病 毒 感 染 流感病毒分子生物学研究进展 中日友好医院(100029) 安 菁 林江涛 流感病毒是研究最早的病毒之一,主要原因与流感的严重危害有关。流感发作快、传播迅速,短时间内可造成局部地区的爆发或全球范围的流行,导致灾难性的后果。从19世纪以来,已出现四次全球性的流感大流行,最严重的一次(1918～1919年)全世界死于流感的人数超过20万。几十年来,人们作了大量的工作,试图运用分子生物学的手段从机理上揭示流感病毒感染性与致病机制,以研究有效的防治(如监测、疫苗)手段。 1 流感病毒的基因组结构 流感病毒属于正粘病毒科,是RNA病毒。依据其核蛋白(NP)抗原性的差异分成A、B、C三型,这三个型分别在基因组结构、多肽组成、感染性和致病性等方面存在差异。 流感病毒为有包膜的病毒,包膜分内、外两层。内层包膜由基质蛋白M1构成,M1在颗粒核蛋白体(vRNP)的胞质、胞核间的有序转移及病毒体的成熟过程中具有重要的调节作用。外层包膜由一脂质双层构成,其上面嵌有三种病毒蛋白:具有血凝素活性的蛋白质H A、具有神经氨酸酶活性的蛋白质NA和基质蛋白M2。包膜内为病毒基因组与病毒RNA聚合酶亚单位P B1、P B2、PA以及NP形成的具有特定空间构象的结构,称为vRNP,具有依赖RNA的RNA 聚合酶活性。 流感病毒基因组由7个(C型病毒)或8个(A、B 型)分节段的单股负链RNA构成,每个RNA节段的两端都有相对保守的非编码序列,如5′端存在13个核苷酸,3′端存在12个核苷酸,且5′端与3′端反向互补形成锅柄结构。这些结构参与病毒vRNA的复制和mRNA的转录,在RNA聚合酶结合活性、启动子活性、poly(A)化作用以及激活核酸内切酶活性中具有重要作用,是流感病毒复制、转录、包装的重要调控成分。每个RNA节段包括至少一个开放阅读框架(ORF),如:A型流感病毒的各RNA节段及其编码的病毒蛋白为RNA1-P B2、RNA2-P B1、RNA32PA、RNA4-H A、RNA5-NP、RNA6-NA、RNA7-M1和M2、RNA32PA、RNA8-NS1和NS2等。 2 流感病毒的复制及调控 流感病毒大多在宿主细胞核中复制其基因组,通过质膜或细胞器膜芽生形成成熟的病毒颗粒。流感病毒基因组为负链RNA,与具有活性的转录酶复合物和其他负链RNA病毒相同,vRNA、cDNA和cD2 NA转录形成的RNA均不具有感染性,只有形成RNP并转染宿主细胞后才能在宿主细胞内起始病毒基因的复制和表达。 流感病毒侵入宿主细胞依赖于H A的凝集素位点与宿主细胞表面的唾液酸的结合。H A介导病毒包膜与内体膜的融合,使病毒壳衣壳释放进入胞质。流感病毒的脱壳与内体的低pH环境引发的病毒核衣壳结构改变有关,但低pH诱导核衣壳结构改变的分子机制尚不清楚。当病毒脱壳,vRNP在ATP供能的条件下,很快通过宿主细胞核孔复合物(NPC)向核内转运。vRNP向宿主细胞核内转运的调控与NP 和胞质因子NPI21、核转运受体、Ran(T C4)及P10 (NTF2)有关。只有当vRNA与NP同时存在时,vRNA 才可转运到细胞核内。流感病毒蛋白的合成分两个时项。NP、RNA聚合酶亚基和NS1在感染后最初2～3小时即生成。其他蛋白质如H A、NAM1、M2和NS2合成较晚。病毒蛋白的合成可能受到病毒mR2 NA向核外运输的调节,并可能与病毒蛋白NS1的功能有关。对病毒蛋白合成时间的控制在病毒感染周期中具有重要作用,与病毒核衣壳的组装、vRNP的成熟和释放等相关。流感病毒在特定时间内合成的蛋白成分均要通过宿主细胞的介导进入核内以完成vRNP的组装。构成vRNP的主要蛋白成分是NP,为子代vRNA的合成所必需,在RNA复制的同时,子代vRNA随即与NP形成具高级结构的子代vRNP。病
甲型流感病毒对肺泡上皮细胞作用的研究进展
甲型流感病毒对肺泡上皮细胞作用的研究进展 韩朋 王瑞兰 【摘 要】【摘要】流感是流感病毒引起的一种急性呼吸道病毒感染性疾病，能够引起较高的发病率和病死率，给人类健康带来重大威胁。肺泡上皮细胞是机体抵御甲型流感病毒的肺部关键组成部分，同时也是季节性和流行性甲型流感病毒最主要的靶向细胞和感染细胞之一，本文对甲型流感病毒对肺泡上皮细胞作用的研究进展进行简要阐述。 【期刊名称】国际呼吸杂志 【年(卷),期】2017(037)013 【总页数】4 【关键词】【关键词】甲型流感病毒；肺泡上皮细胞；细胞因子风暴；肺泡上皮-内皮屏障 ·综 述· Fund program:National Natural Science Foundation of China (81471891) 甲型流感病毒(influenza A virus，IAV)是最为常见的流感病毒，根据其表面糖蛋白血凝素(hemaggutinin，HA)和神经氨酸酶(neuraminidase，NA)的不同分成许多亚型，截至目前已发现18个H亚型和11个N亚型[1]。IAV曾多次引起世界性大流行，是全球性的引起显著发病率和病死率的呼吸道病原体[2-3]。通常情况下，IAV只引起上呼吸道的感染，但在重症患者中，IAV能够导致弥漫性肺部损伤，早期可迅速发展为重症肺炎和ARDS，ARDS的主要原因是由于肺泡上皮-内皮屏障受损，进而使肺泡腔内充满液体等，最终影响肺部气体交换引起呼吸功能不全。研究表明感染IAV的死亡患者肺部有明显的肺泡损伤，并且肺泡上皮细胞(alveolar epithelial cells,AEC)是最主要的感染细胞之一[4]。此外，AEC也是维持肺泡上皮-内皮屏障功能的最主要细胞。AEC在IAV引起的人畜禽共患性疾病中发挥着至关重要的作用。本文就IAV的致病过程包括病毒复制、诱发的细胞因子风暴、肺泡上皮-内皮屏障受损和针对AEC的抗病毒治疗等方面进行简要综述。 1 肺泡上皮细胞与病毒复制 肺泡上皮由Ⅰ型肺泡上皮细胞和Ⅱ型肺泡上皮细胞构成。Ⅰ型肺泡上皮细胞约占上皮细胞总量的10%，但却覆盖肺泡表面积的95%，具有交换气体的功能，并在液体和离子运输方面发挥着相当重要的作用；Ⅱ型肺泡上皮细胞约占上皮细胞总量的90%，却仅覆盖肺泡表面积的5%，其分泌的表面活性蛋白SP能够降低肺泡表面张力，有助于肺泡对病原体防御，还有着产生新的AEC替代损伤的细胞以促进损伤肺泡修复的功能。IAV感染宿主人并进入肺部后可以在肺AEC中有效复制，Yu等[5]发现H1N1病毒感染Ⅱ型肺泡上皮细胞24 h后，构成IAV最基本的复制单位的病毒核糖核蛋白复合体(viral ribonucleoprotein complexes，vRNP)的主要蛋白NP蛋白水平明显增加，表明IAV可以在
甲型流感病毒抗原检测试剂使用说明-Alere
【产品名称】 通用名称：甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒（胶体金法） 英文名称：Alere BinaxNOW? Influenza A＆B Card 【包装规格】 22人份/盒。 【预期用途】 甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒（胶体金法）是一种体外免疫层析试验，用于定性检测鼻咽拭子样本中的甲、乙型流感病毒核蛋白抗原，可快速地对甲、乙型流感病毒感染做出辅助鉴别诊断。 试验简介 流感是发生在呼吸道的具有高度传染性的急性病毒感染，它属于传染病范畴，可通过咳嗽或打喷嚏时排出的带有活病毒的气溶胶而在人与人之间传播。每年的秋季和冬季都可爆发流感1.甲型流感病毒的流行性比乙型流感病毒流行性要强，造成的病情也更严重，并且大多数严重的流感也都是由它引起的，而乙型流感则相对比较缓和。 针对甲、乙型流感的快速诊断试验对获取有效的抗病毒治疗是很有意义的。对流感做出快速诊断不但可减少病人住院的天数，减少抗菌素的使用，而且可减少病人的住院费用1。 甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒（胶体金法）提供了一种用鼻咽拭子标本对甲型和乙型流感进行简便快速诊断的方法，使用方便，结果快速，在急诊检验中提供的信息可帮助医生选择治疗方案并做出是否需要收住院的决定。 甲型流感病毒有许多亚型，有些亚型可在鸟类中发现3。1997年首次报道人类甲型禽流感（H5N1，主要发生于鸟类的一种流感病毒亚型），此后，在人群中出现了H5N1病例，使人们对H5N1关注起来，H5N1的变异使得它更易在人群间传播4，由于备案的禽流感感染病人比例很低，快速试验在该类病人治疗中利用度尚不得知。 【检验原理】 甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒（胶体金法）使用的是薄膜免疫层析技术，它利用具有高度敏感性的单克隆抗体来检测鼻咽拭子标本中的甲型和乙型流感病毒的核蛋白抗原这些单克隆抗体连同一种对照抗体分别被固定到膜支持物上，形成三条独特的线。膜支持物跟其他试剂/垫结合在一起构成检测条。检测条位于一个称作检测卡的书型铰链状的纸板中。 拭子标本需要进行预处理：用洗脱液、盐水或转移介质等将标本从拭子中洗脱出来，将标本加到检测条顶端，闭合检测卡，15分钟时根据是否出现紫红色样品线来报告结果。在有效试验中，蓝色对照线变为粉红色。 【主要组成成分】 提供的材料 1.检测卡：22人份。包含对甲型流感病毒核蛋白抗原具有高度特异性的单克隆抗体、结合
流感病毒的快速检测方法样本
流感病毒的快速检测方法一、.................................................................. RT-PCR快速诊断方法 ( 一) 生物安全要求 ( 二) 病毒核酸提取 ( 三) RT-PCR ( 四) PCR 产物纯化 ( 五) 流感病毒RT-PCR检测引物二、........................................................ 免疫荧光方法检测流感病毒 ( 一) 原理 ( 二) 标本处理 ( 三) 间接免疫荧光法 ( 四) 结果判断 三、................. 实时荧光定量PCR( Real-Time PCR) 快速诊断检测 ( 一) 基本原理 ( 二) 实验试剂 ( 三) 实验步骤四、............................................................................. 快速诊断试剂盒 流感的快速检测方法, 与传统的病毒分离鉴定相比具有快速、简便的特点。因此常见于流感暴发时早期病原学检测用。流感的快速诊断包括直接和间接免疫荧光法、ELISA、RT-PCR、Real-Time PCR快速诊断速方法、流感快速诊断试剂盒等。这里介绍RT-PCR、
Real-Time PCR、免疫荧光快速诊断速诊断方法和几种流感快速诊断试剂盒优缺点。无论那种快速诊断都无法代替传统的病毒分离鉴定方法。 一、RT-PCR快速诊断方法 核酸检测是一种鉴定流感病毒基因组的有力方法, 即使基因组含量很低或死病毒也能够检测到。本章将介绍检测流感病毒的聚合酶链式反应( PCR) 。 流感病毒的基因组是负链RNA, 在进行PCR扩增前必须合成与病毒RNA互补的DNA, 即为cDNA。逆转录酶( RT) 就是用于合成cDNA的多聚酶, 因此, 扩增流感病毒基因组的过程称为RT-PCR。 RT-PCR需要一对型别特异引物, 四种脱氧核苷酸( dNTPs) , RNA模板, 逆转录酶及Taq DNA 多聚酶; 首先由逆转录酶将病毒的RNA逆转录合成cDNA, 然后再进行聚合酶链反应经25～30个循环, 使DNA产物达到倍增的效果。 （一）生物安全要求 生物安全级别与个人防护要求: 生物安全二级实验室, 防护要求与二级实验室的要求相同。并应遵守相应的生物安全规定。进行高致病性禽H5 RT-PCR快速检测时能够在生物安全二级实验室里进行, 核酸提取在生物安全三级实验室的生物安全柜里完成。（二）病毒核酸提取
流感病毒检验
流感病毒检验 发表时间：2009-08-10T09:20:24.920Z 来源：《中外健康文摘》2009年第20期供稿作者：谭耀武 (黑龙江省宝清县八五三农场疾控中心黑龙江宝清 [导读] 流行性感冒病毒（influenza virus）简称流感病毒 【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085(2009)20-0277-01 流行性感冒病毒（influenza virus）简称流感病毒。流感病毒属正粘病毒科，可分为甲（A）、乙（B）、丙（C）3型。甲、乙、丙不仅反映了病毒被发现的前后顺序，更重要的是反映了对人危害程度的顺序，甲型常以流行的形式出现，可造成世界性的大流行，乙型常以局部流行的形式出现，丙型主要是侵犯婴幼儿。 1 样本采集 1.1采样液 Hank平衡盐、细胞培养液、牛肉浸液（小牛肉浸膏l0g、牛血清白蛋白2g，加蒸馏水至400ml、庆大霉素40mg、多粘菌素 B 0. 8mg，过滤除菌）等均可作采样液。 1.2采集鼻咽腔拭子标本（1）咽拭子：用棉签擦拭双侧扁桃体及咽后壁，将棉签头部浸人2～3ml采样液中。（2）鼻咽抽取物：用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液。先将收集器头部插人鼻腔、接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。收集抽取的粘液，并用采样液刷洗收集器3次。（3）含漱液：用8～10以采样液漱口。 1.3收集血清标本血清标本应包括急性期和恢复期双份血清。急性期应在发病7天内采集，恢复期则在发病后2～4周采集。血液标本以2500r/min离心l5min，收集血清，弃血凝块。 1.4标本运送病毒分离标本采集后应立即低温保存，应尽快送至实验室。24～48h内样品可置4℃保存，如48h内未能进行接种，应置－70℃或以下保存。血清标本可在4汇存放一周，在－20℃长期保存。 1.5标本处理咽拭子标本，收集管于混合器充分震荡，用无菌镊子取出棉拭子并在管壁上反复挤压棉拭子后弃拭子，标本加入双抗（青霉素、链霉素）终浓度为l000IU/ml，混匀置4℃2h方可接种或低温保存；含漱液标本，混匀后自然沉淀，取上清液3ml，加双抗；鼻咽抽取物标本，取无菌毛细吸管将洗液反复吹打，把粘液打散，而后按上述方法进行处理；器官组织标本，先用无菌的乳钵磨碎，用生理盐水配成20％悬液，2000r/min离心l0min，取上清液3ml按上述方法进行抗菌处理。 2 检验方法 2.1材料和方法 2.1.1器材孵卵箱（38℃、33～35℃：各一个）、照卵器、卵盘、注射器、消毒剂、镊子、无菌生理盐水、毛细吸管、试管、液体石蜡和封口胶等。 2.1.2方法当今国内外常用狗肾传代细胞（MDCK）。将已长成单层的细胞管弃生长液，用含有l00IU/ml双抗HanK's液洗2遍，用0.2～0.4ml处理过的标本液接种于细胞管，每份标本接种4管，置35T吸附1～2h后弃标本液，加入病毒培养液，其量为生长液的2倍。如标本液清亮和进行病毒传代时，可不必吸附，直接加入。置33～35℃孵育7d。从第3d开始观察细胞病变（CPE），如细胞出现颗粒增多、变圆、脱落达+++～++++时进行收获。如果7d还不出现CPE，可收集病毒培养液做血细胞凝集试验，在做试验前将细胞管冻融1～2次，以提高病毒滴度。阳性者可测定其血凝滴度并鉴定之，阴性者混合4管细胞液盲传2代，仍为阴性则弃去。 2.3病毒鉴定新分离的病毒可用血细胞凝集抑制试验、补体结合试验和中和试验等方法进行鉴定。最常用和简单的方法是血细胞凝集抑制试验，必要时采用补体结合试验。 2.4快速诊断流感病毒的主要感染部位是呼吸道上皮细胞，在病人呼吸道标本的脱落细胞中含有流感病毒抗原，通过直接检查脱落上皮细胞内抗原即可诊断。标本最好采用负压抽吸法收集呼吸道分泌物。 2.5血清学诊断病毒分离是诊断流感最常用的方法之一，如因各方面因素未分离出病毒，血清学亦可作为一种代替手段，但必须收集急性期和恢复期双份血清，如恢复期血清特异性抗体较急性期增高4倍或以上，即可诊断。本章介绍两种常用的方法：血凝抑制试验和中和试验。
常用流感病毒实验室检测方法的比较
常用流感病毒实验室检测方法的比较 摘要目的通过对四种常用流感病毒检测方法的比较，确定适用于常规监测及疫情暴发时的检测方法。方法用四种方法对随机抽取的50份样品进行检测，对结果进行对比分析。结果胶体金法虽简单快速，但漏检率较高（20.00%）；RT-PCR法灵敏快捷，准确度高（34.00%）；细胞培养法费用适中，检出率较高（14.00%）；鸡胚培养法检出率最低（2.00%）。结论胶体金法适合疫情现场检测，RT-PCR法适合实验室内快速检测，组织培养法适合常规监测，鸡胚培养法适合流感疫苗生产。 关键词组织培养；鸡胚培养；病毒分离；RT-PCR；流感病毒 现在实验室对流感病毒的检测手段有很多种，在本科室常用的方法有胶体金法、细胞培养法、鸡胚培养法、RT-PCR法四种。为实际工作中找到最适合的检测方法，更及时准确的提供检测结果，对实验室常用的四种流感病毒检测方法进行比较。现报告如下。 1 资料与方法 1. 1 检测样品2014年1～4月份本院对就诊的流感样病例（发热，体温≥38℃，伴咳嗽或咽痛之一者，未服用过抗病毒药物[1]）采集的鼻咽拭子，随机抽取50份。流感病毒采样管由北京友康恒业科技有限公司购买。 1. 2 实验方法 1. 2. 1 胶体金法美国QUIDEL公司，QuickVue Influenza A+B Test，按照试剂盒说明书操作。 1. 2. 2 细胞培养法MDCK细胞由辽宁省疾病预防控制中心提供。样品前处理：将采样管漩涡震荡10 s，反复挤压拭子头后弃去拭子，加入青霉素、链霉素、制霉菌素，4℃静置2 h。细胞传代及病毒接种按照郭元吉等所著的《流行性感冒病毒及其实验技术》操作[2]。样品接种MDCK细胞培养出的第一代病毒培养液用1%豚鼠血红血球进行微量血凝实验（haemagglutination assay，HA），HA≥1：8的第一代病毒培养液用血凝抑制法（hemagglutination inhibition，HI）进行流感病毒分型鉴定（鉴定试剂盒由国家流感中心提供）。HA<1：8的第一代病毒培养液再次接种MDCK细胞增毒，增毒后HA≥1：8的第二代病毒培养液用HI法进行流感病毒分型鉴定，HA<1：8的第二代病毒培养液用RT-PCR法进行流感病毒分型鉴定。第一代病毒培养液HA为阴性的再次接种MDCK细胞，盲传一代后仍为阴性的报告未检出流感病毒。 1. 2. 3 鸡胚培养法9～11日龄无特定病原菌（specific pathogen free，SPF）鸡胚蛋由北京梅里亚维通实验动物技术有限公司购买。双腔接种法按照郭元吉等所著的《流行性感冒病毒及其实验技术》操作[2]。样品前处理、增毒、盲传、
流感病毒的快速检测方法样本
流感病毒的快速检测方法—......................................................................... R T-PCR丿快速诊断方法 （-）生物安全要求 （-）病毒核酸提取 （三）RT-PCR （四）PCR产物纯化 （五）流感病毒RT-PCR检测引物 二 ............................. 免疫荧光方法检测流感病毒 （-）原理 （-）标本处理 （三）间接免疫荧光法 （四）结果判断 三 ......... 实时荧光定量PCR（ Real-Time PCR）快速诊断检测 （-）基本原理 （二）实验试剂 （三）实验步骤 四 ....................................... 快速诊断试剂盒 流感的快速检测方法，与传统的病毒分离鉴定相比具有快速、简便的特点。因此常见于流感暴发时早期病原学检测用。流感的快
速诊断包括直接和间接免疫荧光法.ELISA、RT-PCR. Real-Time PCR 快速诊断速方法、流感快速诊断试剂盒等。这里介绍RT-PCR. Real-Time PCR、免疫荧光快速诊断速诊断方法和几种流感快速诊断试剂盒优缺点。无论那种快速诊断都无法代替传统的病毒分离鉴定方法。 一、RT-PCR快速诊断方法 核酸检测是一种鉴定流感病毒基因组的有力方法，即使基因组含量很低或死病毒也能够检测到。本章将介绍检测流感病毒的聚合酶链式反应(PCR) o 流感病毒的基因组杲负链RNA,在进行PCR扩增前必须合成与病毒RNA互补的DNA,即为cDNA o逆转录酶(RT)就是用于合成cDNA的多聚酶，因此，扩增流感病毒基因组的过程称为RT-PCR O RT-PCR需要一对型别特异引物，四种脱氧核昔酸(dNTPs), RNA 模板，逆转录酶及Taq DNA多聚酶;首先由逆转录酶将病毒的RNA 逆转录合成cDNA,然后再进行聚合酶链反应经25一30个循环，使DNA产物达到倍增的效果。 (一)生物安全要求 生物安全级别与个人防护要求：生物安全二级实验室，防护要求与二级实验室的要求相同。并应遵守相应的生物安全规定。进行高致病性禽H5 RT-PCR快速检测时能够在生物安全二级实验室里进行，核酸提取在生物安全三级实验室的生物安全柜里完成。