从米渣蛋白中制备血管紧张素转化酶抑制肽的研究
血管紧张素转换酶（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ－ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇｅｎ－ｚｙｍｅ，ＡＣＥ，ＥＣ３，４，１５，１）在人体血压调节过程中起重要作用。它催化血管紧张素Ｉ从Ｃ－端裂解二肽形成血管紧张素ＩＩ（肾素－血管紧张素系统中已知最强的血管收缩剂），同时，它能钝化血管舒张剂－舒缓激肽。抑制ＡＣＥ的活性，可使血管紧张素ＩＩ的生成和激肽的破坏均减少，从而达到治疗高血压的目的。自从１９６５年Ｆｅｒｒｅｉｒｒａ首次从巴西蝮蛇蛇毒中分离出ＡＣＥ抑制肽以来，人们又从许多食品蛋白质中发现ＡＣＥ抑制肽，如牛乳酪蛋白，沙丁鱼肉，酸奶，大蒜，大豆等。
米渣蛋白是发酵工业生产味精、乳酸、柠檬酸及其他生化药品后大量存在的副产物，干基蛋白质含量在５０％以上。是大米中蛋白质含量的５～８倍，且高于大豆中蛋白的含量。米渣虽然具有如此高的蛋白质含量，但在我国却未能得到良好地开发利用。截止目前，大米为原料发酵生产乳酸、谷氨酸、柠檬酸及生化药品的糖化工序产生的大量米渣，大部分只是被用来作饲料，造成了蛋白质资源的极大浪费。因此本文通过研究碱性蛋白酶水解米渣蛋白制备血管紧张素转化酶抑制肽的工艺，为米渣蛋白的进一步利用提供技术基础。１仪器、材料与方法
１．１仪器
ＤＦ－１０１Ｓ集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市英峪予华仪器厂；ＤＥＬＴＡ３２０ｐＨ计，梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司；ＵＥＩＰ－５０３膜分离装置，天津膜天膜技术有限公司；ＶＡＲＩＡＮＰｒｏＳｔａｒ２１０泵高效液相色谱系统，美国ＶＡＲＩＡＮ公司。
１．２材料
米渣蛋白（蛋白质７２．７５％，脂肪６．４４％，水分１０．１６％，灰分２．０５％，由武汉佳宝有限公司提供）；碱性蛋白酶（２０万Ｕ／ｇ，无锡雪梅生物科技制品公司）；血管紧张素转化酶（ＡＣＥ，ｓｉｇｍａ公司）；马尿酰组氨酰亮氨酸（ＨＨＬ，Ｓｉｇｍａ公司）；马尿酸标准品（Ｈｉｐ，ｓｉｇｍａ公司）；其他试剂均为分析纯。
１．３方法
１．３．１米渣蛋白制备ＡＣＥ粗肽
精确称取一定量的米渣蛋白，按一定的底物浓度加入蒸馏水后置于恒温水浴锅中，待反应体系温度达到水解温度时，加碱（ＮａＯＨ）达到预定ｐＨ值，然后加入一定量的碱性蛋白酶进行水解，在整个水解过程中用磁力搅拌器不断搅拌，并不断加入适当浓度的ＮａＯＨ以维持ｐＨ值在规定范围的±０．０５内，记录加碱量和时间。到预定时问后，调节到等电点，将反应体系在沸水浴中保温１０ｍｉｎ终止反应。将水解物在４０００ｒ／ｍｉｎ下离心２０ｍｉｎ，去除沉淀即得到粗肽水解液。
１．３．２酶解蛋白质水解度（ＤＨ）的测定
从米渣蛋白中制备血管紧张素转化酶抑制肽的研究
王慧溪汪芳安雷恒李永丽
（武汉工业学院食品学院）
【摘要】本文利用碱性蛋白酶水解米渣蛋白制备血管紧张素转化酶抑制肽，通过正交试验确定在温度５５℃、ｐＨ值９．２、底物浓度４％、加酶量２％的条件下水解５ｈ，其水解度２５．２４％，蛋白质得率６９．０２％，氮含量８０．４４％，将该水解液通过分子量１０ｋＤａ、３ｋＤａ的膜分离后，经高效液相色谱测得其血管紧张素转化酶的抑制率最高可达９６．１５％。
【关键词】米渣蛋白；血管紧张素转化酶；超滤；ＨＰＬＣ
中图分类号：ＴＳ２１０．１文献标识码：Ａ文章编号：１６７３－７１９９（２００８）１０－００９５－０４
在中性及碱性条件下采用ｐＨ—ｓｔａｔ法，水解度的计算公式：
ＤＨ（％）＝Ｂ?Ｎｂ／α?Ｍｐ?Ｈｔｏｔ
式中，Ｂ为碱液体积，ｍＬ；Ｎｂ为碱液的当量浓度，ｍｏｌ／Ｌ；ａ为氨基的平均解离度，ａ＝［１０（ｐＨ－ｐＫ）］／［１＋１０（ｐＨ－ｐＫ）］，其中ｐＫ为ＮＨ３＋的平均ｐＫ，计７．０，ｐＨ为反应起始的ｐＨ值；Ｍｐ为底物中蛋白质的含量，ｇ；Ｈｔｏｔ为底物蛋白质中的肽键总数，ｍｍｏｌ／ｇ，米渣蛋白为７．４ｍｍｏｌ／ｇ。
１．３．３蛋白质得率的计算
蛋白质得率＝提取物总蛋白／米渣总蛋白×１００％１．３．４超滤分离粗肽水解液的方法
米渣蛋白用碱性蛋白酶水解５ｈ（水解度２５．２４％），将得到的肽液灭酶、离心后通过１０ｋＤａ的超滤膜在室温，０．０５ＭＰａ压力下分离，初步分离后接着通过３ｋＤａ的超滤膜进一步分离，测不同分子量范围内的ＡＣＥ活性。
１．３．５血管紧张素转化酶（ＡＣＥ）抑制活性的测定高压液相色谱（ＨＰＬＣ）系统：ＶＡＲＩＡＮＰｒｏＳｔａｒ２１０泵，３３５二矩阵检测器；色谱柱：ｐｏｌａｒｉｓＣ１８（４．６×１５０ｍｍ，粒径５μｍ）；流动相：甲醇－超纯水（３０∶７０，含１％醋酸）；流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ，检测波长：２３２ｎｍ，柱温：３０℃；上样量：５μＬ。
将样品溶于超纯水中，离心（１００００ｒ／ｍｉｎ，２０ｍｉｎ），取上清液进行ＡＣＥ抑制活性测定。取样品１０μＬ和ＡＣＥ（０．２５Ｕ溶于２．５ｍＬ０．１ｍｏｌ／Ｌ的硼酸盐缓冲液、ｐＨ值８．３、含０．３ｍｏｌ／Ｌ氯化钠中）５μＬ于３７℃恒温水浴中保温６ｍｉｎ，加入５０μＬ６．５ｍｍｏｌ／Ｌ底物（ＨＨＬ溶于相同的缓冲液中），３７℃下反应３０ｍｉｎ，加入８５μＬ１ｍｏｌ／Ｌ盐酸溶液中止反应，至室温取５μＬ反应产物进样，通过ＨＰＬＣ洗脱图谱定量马尿酸生成量，以生成马尿酸的量来判断样品的ＡＣＥ抑制活性。计算公式为：
Ｒ＝（Ａ－Ｂ）／Ａ×１００％
式中，Ｒ为样品对ＡＣＥ的抑制率，％；Ａ为空白对照组中马尿酸的峰面积，ｍＡＵ?ｓ；Ｂ为添加样品后马尿酸的峰面积，ｍＡＵ?ｓ。
２结果与分析
２．１米渣蛋白酶解条件的确定
以水解度作为水解效果的评价指标，考察底物浓度、酶用量、温度、ｐＨ值和水解时间５个因素对水解度的影响，作Ｌ１６（４５）５因素４水平表，试验结果表１。
由表１可知，在影响水解度的五个因素中各因素对水解度影响的大小顺序为：酶用量＞ｐＨ值＞时间＞底物浓度＞温度，最终确定水解条件的最优组合为Ｃ４Ｂ４Ｅ４Ｄ１Ａ３，即酶用量（Ｅ／Ｓ）２．０％，ｐＨ值９．２，底物浓度４％，温度５５℃，时间５ｈ，在此条件下得到的水解度为２５．２４％，得率６９．０２％，氮含量８０．４４％。
２．２米渣肽抑制ＡＣＥ活性的检测
在１．３．４节选定的色谱条件下得到如图１所示图谱。
表１Ｌ１６（４５）酶水解米渣蛋白正交试验结果
试验号
温度
Ａ（℃）
ｐＨ值
Ｂ
酶用量
Ｃ（％）
底物浓度
Ｄ（％）
时间
Ｅ（ｈ）
水解度
（％）１１（４５）１（８．０）１（０．５）１（４）１（２）７．０５
２１２（８．４）２（１．０）２（６）２（３）１１．０２
３１３（８．８）３（１．５）３（８）３（４）１５．４２
４１４（９．２）４（２．０）４（１０）４（５）２０．６４
５２（５０）１２３４１１．７１
６２２１４３９．５３
７２３４１２１９．５１
８２４３２１１６．４２
９３（５５）１３４２１２．５７１０３２４３１１５．０１１１３３１２４１５．０１１２３４２１３１９．１４１３４（６０）１４２３１６．１８１４４２３１４１７．７９１５４３２４１１２．８３１６４４１３２１３．５１
ｋ１１３．５３２５１１．８７７５１１．２７５１５．８７２５１２．８２７５
ｋ２１４．２９２５１３．３３７５１３．６７７５１４．６５７５１４．１５２５
ｋ３１５．４３２５１５．６９２５１５．５５１３．９１２５１５．０６７５
ｋ４１５．０７７５１７．４２７５１７．８３５１３．８９２５１６．２８７５
Ｒ１．９５．５５６．５６１．９８３．４６
（ａ）马尿酸标准品
由图１可知，马尿酸、二肽和三肽能达到良好的分离，加米渣肽粗液后的马尿酸的峰面积比空白组马尿酸的峰面积大幅度减少，说明肽液具有良好的抑制ＡＣＥ活性。
将粗肽水解液通过一级超滤１０ｋＤａ的膜分离后进行二级超滤３ｋＤａ的膜分离，将原液，１０ｋＤａ超滤液、３ｋＤａ超滤液经冷冻干燥后配成不同浓度梯度，比较超滤对ＡＣＥ抑制活性（见表２）及同一样品不同浓度对ＡＣＥ抑制活性影响的大小，结果如图２、图３、图４所示。
由以上图表比较后得知：不论是原液还是超滤液在不同浓度都具有较高的ＡＣＥ抑制活性，１０ｋＤａ的超滤液和３ｋＤａ的超滤液其ＡＣＥ抑制活性随着浓度的增大明显增加，并且其ＡＣＥ抑制活性整体要比原液高，说明经过超滤膜分离纯化后的米渣肽具有更好的抑制ＡＣＥ活性。
３结论
（１）通过酶法水解米渣蛋白制备ＡＣＥ抑制肽的正交试验得出最佳水解条件，温度５５℃、ｐＨ值９．２、底物浓度４％、加酶量２％、时间５ｈ，水解度２５．２４％，氮含量８０．４４％，蛋白质得率６９．０２％，这与孔祥珍用碱性蛋白酶水解小麦面筋蛋白，得出蛋白质回收率变化范围为４２．５０％～８１．３３％相近。
（２）利用ＨＰＣＥ法测定米渣蛋白水解物对ＡＣＥ的抑制效果，样品不需前处理，分析时间短，结果准确，通过图谱分析计算得到，通过１０ｋＤａ和３ｋＤａ的超滤膜分离，在浓度１０ｍｇ／ｍＬ下测得的ＡＣＥ抑制活性均
（ｂ）空白
（ｃ）米渣肽粗液
图１米渣肽抑制ＡＣＥ活性的检测图谱
表２超滤对酶解物ＡＣＥ抑制活性的影响分子量原液（１０ｍｇ／ｍＬ）１０ｋＤａ（１０ｍｇ／ｍＬ）３ｋＤａ（１０ｍｇ／ｍＬ）抑制率（％）７２．２３９６．１５９４．４０
图２原液的ＡＣＥ抑制率
图３１０ｋＤａ超滤液的ＡＣＥ抑制率图４３ｋＤａ超滤液的ＡＣＥ抑制率
米厂的控制系统经过了一个从手动到自动的发展过程，采用手动控制系统，由工人单独操作不同的设备，控制米厂的运行。这样米厂的工作不能成为一个整体，安全和保护措施不方便实现，采用控制继电器数目过多，控制系统复杂，可靠性差。同时效率较低，需要人员多。针对手动控制的缺点，现代化的米厂已经采用自动控制系统来完成。主要采用二级控制系统，由ＰＬＣ完成前端控制，工控机完成后台处理。１米厂工艺分析
米厂加工工艺比较复杂，主要工艺流程由稻谷进仓、清选、垄谷、碾米、抛光组成。采用设备包括稻米提升、风机、关风器、清初筛、垄谷机、去湿机、振动筛、白米筛、色选机、空压机、包装机、流量秤和各种米仓，以及相关的供电系统。
米厂的工艺流程：
米厂自动化控制系统
于军１陈亮明２
（１．武汉理工大学机电学院２．武汉市江汉大学物理与信息工程学院）
【摘要】本文探讨了米厂的自动化的总体框架，分别分析了在米厂控制系统中，组态软件的设计要点，ＰＬＣ程序设计问题，以及相关通讯技术。针对某米厂日产１２０ｔ米厂的具体设计，给出了相关的解决方案。对其中的难点算法给出了例程和分析。
【关键词】ＣＰ１ＨＰＬＣ；组态软件；报警系统；通讯。
中图分类号：ＴＤ２１２．８文献标识码：Ａ文章编号：１６７３－７１９９（２００８）１０－００９８－０３
超过９０％，这与管骁所测的燕麦麸蛋白制备ＡＣＥ抑制肽的活性达９２．３１％，与李世敏用玉米为原料制备的降血压肽抑制率达９０％以上相近，比赵骏用酪蛋白源制备ＡＣＥ抑制肽的抑制率（８４．４％）要高。
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收稿日期：２００８－０６－０３
作者简介：王慧溪（１９８４－），女，内蒙古人，硕士研究生，研究方向食品加工新技术与资源开发。
通讯地址：（４３００２３）武汉汉口常青花园中环西路特１号