实验二叶绿素的提取与分离
实验二叶绿素的提取与分
离
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实验二叶绿素的提取和分离
一、实验目的
从富含叶绿素的菠菜叶片中提取叶绿素，并在薄层层析板上点样使叶绿素显示不同颜色。
二、实验原理
要求同学们先查询资料，了解叶绿素相关知识，实验课上老师讲解。
三、实验材料、器具
研钵、托盘天平、分液漏斗、干燥锥形瓶、毛细管、薄层层析板、饱和NaCl溶液、无
水Na
2SO
4
四、实验步骤
1、叶绿素的提取
在中放入几片(约5g)菠菜叶(新鲜的或冷冻的都可以．如果是冷冻的，解冻后包在纸中轻压吸左水分)。加入10mL2:1石油醚和丙酮混合液，适当研磨。将提取液用滴管转移至分液漏斗中，加入10mL饱和NaCl溶液(防止生成乳浊液)除去水溶性物质，分去
H
2O层，再用蒸馏水洗涤两次。将有机层转入干燥的小锥形瓶中，加2g无水Na
2
SO
4
，通
风处理。处理后的液体倾至另一锥形瓶中(如溶液颜色太浅，可在通风柜中适当蒸发浓缩)。
2、点样
用一根内径 1mm的毛细管，吸取适量提取液，轻轻地点在距薄板一端1cm处，平行点两点，两点相距1cm左右。若一次点样不够，可待样品溶剂挥发后．再在原处点第二次，但点样斑点直径不得越过2mm。
3、展开
先在小烧杯中放入展开剂[用石油醚和丙酮按3：1的比例进行混合作为展开剂，再将薄层板斜靠于层析缸内壁。点样端接触展开剂但样点不能浸没于展开剂中，密闭层析缸。待展开剂上升到距薄层板另一端约1cm时，取出平放，用铅笔或小针划前沿线位置，在空气中晾干或用电吹风吹干薄层。
毛细管点样薄层色谱展开
4、观察层析板并记录实验结果。
薄层层析时Rf值表示的是原点到层析斑点中心的距离与原点的到展层溶剂的前沿距离包括扩散最快的是什么，扩散最慢的是什么
最宽的色素带是什么，最窄的色素带是什么
哪两个色素带距离相距最远，哪两个最近等等
各种色素在层析液中的溶解度不同，溶解度高的随层析液在滤纸上扩散的快，反之则慢。
最快：胡萝卜素
次之：叶黄素
次之：叶绿素A
最慢：叶绿素B
颜色分别为：橙黄色、黄色、蓝绿色和黄绿色，
最宽的是叶绿素A
最窄的是胡萝卜素
胡萝卜素和叶绿素B最远
叶绿素A和叶绿素B最近
实验十四、植物色素的提取和薄层色谱分析
一、实验目的：
1、了解薄层色谱的基本原理和应用。
2、掌握薄层色谱的操作技术。
二、实验原理：
1、原理
薄层色谱(Thin Layer Chromatography)常用TLC表示，又称薄层层析，属
于固－液吸附色谱。样品在薄层板上的吸附剂（固定相）和溶剂（移动相）之
间进行分离。由于各种化合物的吸附能力各不相同，在展开剂上移时，它们进
行不同程度的解吸，从而达到分离的目的。
2、薄层色谱的用途：
1）化合物的定性检验。（通过与已知标准物对比的方法进行未知物的鉴定）
在条件完全一致的情况，纯碎的化合物在薄层色谱中呈现一定的移动距
离，称比移值（Rf 值），所以利用薄层色谱法可以鉴定化合物的纯度或确定两种性质相似的化合物是否为同一物质。但影响比移值的因素很多，如薄层的厚度，吸附剂颗粒的大小，酸碱性，活性等级，外界温度和展开剂纯度、组成、
挥发性等。所以，要获得重现的比移值就比较困难。为此，在测定某一试样时，最好用已知样品进行对照。
距离溶剂前沿至原点中心的点中心的距离溶质最高浓度中心至原 f R
2）快速分离少量物质。（几到几十微克，甚至μg）
3）跟踪反应进程。在进行化学反应时，常利用薄层色谱观察原料斑点的逐步消失，来判断反应是否完成。
4）化合物纯度的检验（只出现一个斑点，且无拖尾现象，为纯物质。）
此法特别适用于挥发性较小或在较高温度易发生变化而不能用气相色谱
分析的物质。
3、色谱法
色谱法是与植物天然色素的分离提取同时发展起来的.色谱法(纸色谱,薄层
色谱和柱色谱)至今仍然是分离叶绿素等天然色素最有效的方法。
色谱法分离叶绿体色素的基本原理是利用不同色素在各种有机溶剂中的分
配系数,或在吸附剂上的吸附能力的不同,当它们通过色谱柱/床时,这种分配或
吸附过程反复多次地进行,最后将它们一一分离开来。
通常认为,纸色谱属于分配色谱.它是以滤纸为惰性支持物,滤纸纤维一般能
吸收约20 % 的水分,其中有6~7 % 以氢键形式与纤维素上的羟基结合,构成纸
色谱的固定相.在展开过程中,被分离组分在展开剂和固定相之间不断进行分配,龙岩学院分析化学精品课程分析化学实验项目指导书 2
达到相互分离.薄层色谱和柱色谱的吸附剂(固定相)有硅胶,氧化铝,硅藻土等无机物,也有糖类,纤维素,聚酰胺,C18 和离子交换树脂等有机物.它们的分离机理也各不相同,如吸附,分配,氢键,正相和反相色谱等。对于纸色谱或薄层色谱,毛细
管作用是推动溶剂展开的动力.被分离物质在图谱上的位置,可用比移值 Rf表示
Rf=原点至斑点中心的距离/原点至展开剂前沿的距离。
植物光合作用是自然界最重要的现象,它是人类所利用能量的主要来源.在
把光能转化为化学能的光合作用过程中,叶绿体色素起着重要的作用.高等植物
体内的叶绿体色素有叶绿素和类胡萝卜素两类,主要包括叶绿素a,叶绿素b,β胡萝卜素和叶黄素四种. 叶绿素(chlorophylls)是叶绿酸的酯,它在植物进行光合作用中吸收可见光,并将光能转变为化学能.叶绿素是植物进行光合作用所必需的催化剂.在绿色植物中叶绿素主要以叶绿素a(C55H72O5N4Mg)和叶绿素
b(C55H70O6N4Mg)两种结构相似的形式存在,其差别仅是叶绿素a中一个甲基被叶绿素b中的甲酰基所取代。
三、实验装置
四、实验操作步骤和内容：
（一）步骤
1、吸附剂的选择
薄层色谱的吸附剂最常用的是氧化铝和硅胶。
1）、硅胶：
“硅胶H”—不含粘合剂；
“硅胶G”—含煅石膏粘合剂；
其颗粒大小一般为260目以上。颗粒太大，展开剂移动速度快，分离效果
不好；反之，颗粒太小，溶剂移动太慢，斑点不集中，效果也不理想。
化合物的吸附能力与它们的极性成正比，具有较大极性的化合物吸附较强，
因而Rf 值较小。
酸和碱 > 醇、胺、硫醇 > 酯、醛、酮 > 芳香族化合物 > 卤代物、醚 >
烯 > 饱和烃
本实验选择的吸附剂为薄层色谱用硅胶G。
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2、薄层板的制备（湿板的制备）
薄层板制备的好坏直接影响色谱的结果。薄层应尽量均匀且厚度要固定。
否则，在展开时前沿不齐，色谱结果也不易重复。在烧杯中放入2g硅胶G，加
入5—6ml %的羧甲基纤维素钠水溶液，调成糊状。将配制好的浆料倾注到
清洁干燥的载玻片上，拿在手中轻轻的左右摇晃，使其表面均匀平滑，在室温
下晾干后进行活化。本实验用此法制备薄层板4片。
3、薄层板的活化
将涂布好的薄层板置于室温凉干后，放在烘箱内加热活化，活化条件根据
需要而定。硅胶板一般在烘箱中渐渐升温，维持 105—110℃活化 30min。氧化
铝板在 200℃烘 4h可得到活性为Ⅱ级的薄板，在 150—160℃烘 4h可得活性为Ⅲ—Ⅳ级的薄板。活化后的薄层板放在干燥器内保存待用。
4、点样
先用铅笔在距薄层板一端1cm处轻轻划一横线作为起始线，然后用毛细管
吸取样品，在起始线上小心点样，斑点直径一般不超过2mm。若因样品溶液太
稀，可重复点样，但应待前次点样的溶剂挥发后方可重新点样，以防样点过大，
造成拖尾、扩散等现象，而影响分离效果。若在同一板上点几个样，样点间距
离应为1。点样要轻，不可刺破薄层。
5、展开
薄层色谱的展开，需要在密闭容器中进行。为使溶剂蒸气迅速达到平衡，
可在展开槽内衬一滤纸。在层析缸中加入配好的展开溶剂，使其高度不超过
1cm。将点好的薄层板小心放入层析缸中，点样一端朝下，浸入展开剂中。盖
好瓶盖，观察展开剂前沿上升到一定高度时取出，尽快在板上标上展开剂前沿
位置。晾干，观察斑点位置，计算Rf值。
分离叶绿体色素的展开剂有:石油醚(60 ~ 90℃)-丙酮-乙醚(3:1:1);石油醚-丙
酮 (8:2);石油醚-乙酸乙酯(6:4);苯-丙酮(7:3)和石油醚(30 ~ 60℃)-丙酮-正丁醇(90:10:等.
本实验将150 mL石油醚(60 ~ 90℃)-丙酮-乙醚(3:1:1)展开剂倒入层析缸中,并在
层析缸的内壁四周贴一张5 cm高的滤纸,滤纸下部浸在展开剂中,盖好盖子平衡
10~15 min.将点好样的硅胶板放入展开缸里,液面不能超过点样线,盖好盖子进
行上行层析.待展开剂前沿上升到距硅胶板上端 ~2 cm时,取出硅胶板置于通
风橱里晾干,可看到层析板上出现若干色素带,其排列顺序一般是β-胡萝卜素,去镁叶绿素,叶绿素 a,叶绿素 b 和叶黄素等多条色带.用铅笔标记出样品斑点,计算各色素的比移值Rf.
6、显色
被分离物质如果是有色组分，展开后薄层色谱板上即呈现出有色斑点。
如果化合物本身无色，则可用碘蒸气熏的方法显色。还可使用腐蚀性的显
色剂如浓硫酸、浓盐酸和浓磷酸等。
对于含有荧光剂的薄层板在紫外光下观察，展开后的有机化合物在亮的荧
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光背景上呈暗色斑点。
本实验样品本身具有颜色，不必在荧光灯下观察。
7、样品收集
将层析板上分开的β-胡萝卜素,叶绿素a,叶绿素b的色带分别用干净的刮刀刮入
试管中,加入5 mL丙酮提取,低温避光保存.
8*、温度对薄层色谱分离的影响
取两块 1×5 cm 2 的商品硅胶板,点样后,以相同的展开剂,分别置于冰箱(4℃)和室
温(20℃以上)展开.观察和对比它们的分离结果.
(二)实验内容：（以下实验内容选做其一）
1、检验甲基橙的纯度。（通过与已知标准物对比的方法检验物质是否纯净）
实验样品：甲基橙粗品（自制）、甲基橙纯品。
溶剂：乙醇：水=1：1
展开剂：丁醇：乙醇：水=10：1：1
2、混合物的分离
实验样品：圆珠笔芯油
溶剂：95%乙醇
展开剂：丁醇：乙醇：水=9：3：1（体积比）
3、1%偶氮苯、1%间硝基苯胺、荧光黄(95%乙醇, 1mg/1ml)、次甲基蓝、环己
烷:乙酸 9:1
4、植物色素β-胡萝卜素,去镁叶绿素,叶绿素a,叶绿素 b和叶黄素的提取与分离。
五、实验关键步骤：
1、载玻片应干净且不被手污染，吸附剂在玻片上应均匀平整。
2、点样不能戳破薄层板面，各样点间距1—1.5cm，样点直径应不超过2mm。
3、展开时，不要让展开剂前沿上升至底线。否则，无法确定展开剂上升高
度，即无法求得Rf值和准确判断粗产物中各组分在薄层板上的相对位置。
六、思考题
1、如何利用Rf 值来鉴定化合物
答：在条件完全一致的情况，纯碎的化合物在薄层色谱中呈现一定的移动距离，
称比移值（Rf 值），所以利用薄层色谱法可以鉴定化合物的纯度或确定两种性
质相似的化合物是否为同一物质。但影响比移值的因素很多，如薄层的厚度，
吸附剂颗粒的大小，酸碱性，活性等级，外界温度和展开剂纯度、组成、挥发
性等。所以，要获得重现的比移值就比较困难。为此，在测定某一试样时，最
好用已知样品进行对照。
2、薄层色谱法点样应注意些什么
答：（1）先用铅笔在距薄层板一端1cm处轻轻划一横线作为起始线，然后用毛细管吸取样品，在起始线上小心的点样，斑点直径一般不超过2mm。
（2）若因样品溶液太稀，可以重复点样，但应待前次点样的溶剂挥发后方可重新点样，以防样点过大，造成拖尾、扩散等现象，而影响分离效果。
（3）若在同一板上点几个样，样点间距离应为1-1.5cm。
（4）点样要轻，不可刺破薄层。
3、常用的薄层色谱的显色剂是什么
答：显色凡可用于纸色谱的显色剂都可用于薄层色谱。薄层色谱还可使用腐蚀
性的显色剂如浓硫酸、浓盐酸和浓磷酸等。对于含有荧光剂（硫化锌镉、硅酸
锌、荧光黄）的薄层板在紫外光下观察，展开后的有机化合物在亮的荧光背景
上呈暗色斑点。也可用卤素斑点试验法来使薄层色谱斑点显色。
4、薄层板的展开方式有哪些
答：（1）上升法：将色谱板垂直于盛有展开剂的容器中，适合于含粘合剂的色
谱板。
（2）倾斜上行法：色谱板倾斜10-15角；色谱板倾斜45-60角。
（3）下降法：用滤纸或纱布等将展开剂吸到薄层板的上端，使展开剂沿板下行，这种连续展开的方法适用于Rf 值小的化合物。
（4）双向色谱法：将样品点在方形薄层板的角上，先向一个方向展开，然后转
动90角的位置，再换另一种展开剂展开。适合于成分复杂的化合物分离。
注意：展开时，不要让展开剂前沿上升至底线。否则，无法确定展开剂上升高
度，即无法求得Rf值和准确判断粗产物中各组分在薄层板上的相对位置。
5、硅胶G薄层如何涂布和活化
答：取硅胶 G 或硅胶 GF一份，置烧杯中加水约 5 份混合均匀，放置片刻，随
即用药匙取一定量，分别倒在一定大小的玻璃片上（或倒入涂布器中，推动涂
布），均匀涂布成~0.5mm厚度，轻轻振动玻璃板，使薄层面平整均匀，在
水平位置放置，待薄层发白近干，于烘箱中 100℃活化 ~1 小时，冷后贮于
干燥器内备用。活化温度和时间可依需要调整，一般检识水溶性成分或一些极
性大的成分时，所用薄层板只在空气中自然干燥，不经活化即可贮存备用。
6、薄层色谱法有哪些优点
答：薄层色谱法是一种高效、简便的分离方法，其优点是：快速，全过程只需
10~60min（纸色谱法需几小时到几十小时）；分离效率高；灵敏度高，可检出
g
的物质；显色的方法比纸色谱法多；应用面广。
7、薄层色谱法中展开剂、吸附剂是如何选择的
答：薄层色谱法的固定相吸附剂颗粒要比柱色谱法细得多，其直径一般为
10~40
m
。由于被分离的对象及所有展开剂的极性不同，应选用活性不同的吸
附剂作固定相，吸附剂的活性可分为I~V级，I级活性最强，V级的活性最弱。
吸附剂和展开剂选择的一般原则是：非极性组分的分离，选用活性强制吸附剂，
用非极性展开剂；极性组分的分离，选用活性弱的吸附剂，用极性展开剂。实
际工作中要经过多次试验来确定。
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E Stahl 根据被吸附物质的极性、吸附剂的活泼性和展开剂的极性三者关
系，设计了选择展开剂的简明图（图9-9）。
图展开剂极性、吸附剂活泼性和被分离物质极性三者关系示意图
使用此图时，首先确定被分离物质的极性，转动图中的三角形指针，使其一
个顶角固定在被分离物质的极性处，其他两个顶角的指向处，即为应该选择的
吸附剂的活泼性和展开剂的极性。
七、注意事项：
1、叶绿体色素对光,温度,氧气环境,酸碱及其它氧化剂都非常敏感.色素的提取和分析一般都要在避光,低温及无酸碱等干扰的情况下进行.乙醚使用前应重蒸除
去过氧化物.
2、使用低沸点易挥发有机溶剂要注意实验室安全.实验室要保持良好的通风条
件,不得靠近明火操作.
3、提取液不宜长期存放,必要时应抽干冲氮避光低温保存.
八、参考文献：
（1）《分析化学》（第五版），四川大学化工学院、浙江大学化学系编，2002年（2）《分析化学》（第三版），华中师范大学、东北师范大学、陕西师范大学、
北京师范大学编。
（3）《分析化学实验》，武汉大学主编（第四版），高等教育出版社，2001年
（4）《基础分析化学实验》，第二版，北京大学化学系分析化学教学组，1998
年
（5）《化学分析基本操作规范》，《化学分析基本操作规范》编写组编，高等教
育出版社
（6）《定量分析中的误差和数据评价》，宋清编，人民教育出版社，1982
（7）《仪器分析实验》复旦大学编写组，复旦大学出版社