红细胞裂解液使用方法

红细胞裂解液使用方法

红细胞裂解液是一种常用的实验室试剂，它可以用来破坏血液红细胞膜从而释放出血红蛋白。红细胞裂解液使用方法很简单，只要按照以下步骤进行即可。

第一步，准备材料和设备。需要准备的材料包括红细胞裂解液和待处理的血液样品，需要准备的设备包括离心管、离心机、移液管等。

第二步，制备血浆。将血液样品放入离心管中，以3000rpm的速度离心10分钟，将血细胞和血浆分离。将血浆转移到另一个离心管中。

第三步，加入红细胞裂解液。在离心管中加入适量的红细胞裂解液，根据不同的实验要求可以添加不同的浓度。

第四步，混匀。使用移液管将红细胞裂解液和血浆充分混合，然后放置在室温下静置30分钟。

第五步，离心。将混合液置于离心机中，以3000rpm的速度离心10分钟，离心之后可以直接利用上清液继续进行实验。

注意事项：

1、最好在使用前检查红细胞裂解液的药物有效期，避免因为过期而导致实验结果不准确。

2、在制备血浆的过程中一定要避免将红细胞破坏，否则可能会影响到实验数据的准确性。

3、离心过程中要注意离心管的平衡性，避免因为离心速度不均匀而使血细胞重新沉淀。

总之，红细胞裂解液是一种常用的实验试剂，其使用方法不仅简单易行，而且操作方便，适用于各种血液学和生物学实验。但是在使用时需要注意一些细节问题，遵守操作规程，确保实验结果的准确性。

《分子生物学》实验指导(2015-2016)

《分子生物学》实验指导 实验1 总DNA提取 生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。 [实验目的] 学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。 [实验原理] 植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿/ 异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。 由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。纯的DNA样品A260/280≈1.8，纯的RNA样品A260/280≈2.0，并且1μg/ml DNA 溶液A260=0.020。 [实验器材] 1、高压灭菌锅 2、冰箱 3、恒温水浴锅 4、高速冷冻离心机 5、紫外分光光度计 6、剪刀 7、陶瓷研钵和杵子 8、磨口锥形瓶（50ml） 9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料 [实验试剂] 1、3×CTAB buffer（pH8.0） 100mM Tris 25mM EDTA 1.5M NaCl 3% CTAB 2% β-巯基乙醇 2、TE缓冲液（pH8.0） 10mmol/L Tris·HCl 1mmol/L EDTA 3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V） 4、95％乙醇 5、液氮 [实验步骤] 1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。 2、将叶片剪成1cm长，置预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉末。 3、待液氮蒸发完后，加入15mL预热（60℃）的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，

红细胞裂解液的配方

红细胞裂解液的配方 红细胞裂解液是一种可以用于制备单细胞悬液的液体，是用于培养细胞、测定细胞特性或进行免疫学和细胞生物学分析时必不可少的。红细胞裂解液的配方可能会随着应用不同而有所不同，一般来说，红细胞裂解液应该包含两种主要成分：溶剂和除去红细胞壁的酶。 第一步，选择溶剂。红细胞裂解液的溶剂有多种，如水、生理盐水、PBS(phosphate buffered saline)、Tris-HCl（tris hydrochloric acid）及EDTA （ethylenediaminetetraacetic acid）等。其中，生理盐水和PBS是最常用的，因为它们能够保持细胞环境的稳定性，PBS也是大多数细胞生物学实验中最常用的溶剂之一，而EDTA是一种有助于去除红细胞壁的溶剂。 第二步，选择酶。红细胞裂解液中的酶一般是由trypsin或RNase组成，这两种酶都有助于去除红细胞壁，以便使细胞可以被溶解。有些研究者会添加DNAse （deoxyribonuclease），这种酶可以帮助降解DNA，从而减少胎牛血清白蛋白对细胞的污染。 第三步，添加抗凝剂。抗凝剂可以防止细胞在悬液中凝结，常用的抗凝剂有EDTA、heparin、citrate等。抗凝剂的用量一般以0.1%~0.5%的浓度添加到溶剂中。

第四步，添加抗生素。抗生素可以有效预防致病微生物的污染，常用的抗生素有penicillin/streptomycin、gentamicin、amphotericin B等，一般以100U/ml的浓度添加到溶剂中，以防止污染。 最后，将上述所有成分添加到一定的比例中，并搅拌均匀，就可以制备出一种完整的红细胞裂解液了。 通常情况下，红细胞裂解液的配方可以根据具体的实验要求而有所不同，可根据实验的具体要求调整添加的各种成分的比例，以满足实验的要求。 总之，红细胞裂解液的配方应当包括溶剂、除去红细胞壁的酶、抗凝剂和抗生素，经过调整添加各种成分的比例，即可制备出一种完整的红细胞裂解液。

树突细胞分离步骤

试剂：红细胞裂解液(139 .6 mmol/L NH4Cl , 16 .96mmol/L Tris , 用1 mol/L HCl 调PH 至7 .2)和GKN缓冲液(8g/L NaCl , 0 .4 g/L KCl , 1 .77 g/L Na2PO4 , 0 .6 g/L NaH2PO4 , 2 g/L 葡萄糖, 0 .01 g/L 酚红), 均由本所配制, 高压灭菌, 4 ℃保存。粒细胞巨噬细胞集 落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-4(I L-4)均为深圳雅为生物公司产品, 均用PBS 配成1 mg/ L 储备液, 过滤除菌, 分装, -20 ℃保存, 临用时加入培养基配成终浓度50 ng/L。 树突状细胞的培养： C57BL/6 小鼠, 拉颈处死, 浸入75 %的乙醇中5～10 min , 无菌手术取出股骨, 反复冲洗出骨髓, 直至骨变白, 收入15 ml 离心管中;离心(1 200r/min , 5min)弃上清, 收集沉淀的骨髓细胞。以1∶10 的体积比加入37 ℃预温的红细胞裂解液, 反复吹打混匀,置室温2 ～ 4 min , 除去红细胞;以含10 %FCS 的RPMI 1640 配成 2 ×106/ml 骨髓细胞悬液, 分装于玻璃细胞培养瓶, 温育2 ～ 3 h , 除去未贴壁细胞;, 然后用RMPI1640 完全培养基(添加1 mmol/ L 丙酮酸钠, 2 mmol/L 谷氨酰胺, 10 mmol/L Hepes , 8 .9 mmol/L NaHCO3 , 50 μmol/ L 巯基乙醇, 20 万u/L青霉素, 20 万u/L 链霉素, 50 ng/L GM-CSF 和50ng/L IL- 4 , 20 %的FCS)调细胞浓度为108/L , 加入6 孔培养板中, 每孔1 . 5 ～2 ml;放入37 ℃, 5 %CO2培养箱中培养, 隔日半量换液, 在培养的第3 天轻轻除去未贴壁细胞, 至第 5 ～7 天, 在倒置显微镜下观察其形态和数量的变化, 强力吹打即可收集DC。

红细胞裂解

对于组织细胞样品： 1. 新鲜组织经过胶原酶或胰酶等消化处理，通过适当方法分散成细胞悬液，离心弃上清。 2. 加入3-5倍细胞体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解1-2分钟。例如细胞沉淀的体积为1ml，则加入3-5ml的红细胞裂解液。本步骤在室温或4度操作均可。 3. 400-500g离心5分钟，弃红色上清。4℃离心效果更佳。 4. 如果发现红细胞裂解不完全，可以重复上述步骤2和步骤3一次。通常极微量的红细胞不会影响后续的一些检测。 5. 洗涤1-2次：加入适量PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液，重悬沉淀，400-500g离心2-3分钟，弃上清。可再重复1次，共洗涤1-2次。洗涤液的用量通常应至少为细胞沉淀体积的5倍。4℃离心效果更佳。 6. 根据实验需要用适当溶液重悬细胞沉淀后即可进行计数等后续实验。对于组织细胞样品无需洗涤的快速操作步骤： 1. 新鲜组织经过胶原酶或胰酶等消化处理，通过适当方法分散成细胞悬液，离心弃上清。 2. 对于0.2ml细胞沉淀加入1ml红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解1-2分钟。本步骤在室温或4度操作均可。 3. 加入15-20ml PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液，混匀。 4. 400-500g离心5分钟，弃红色上清。4℃离心效果更佳。 5. 如果发现红细胞裂解不完全，可以重复上述步骤2和步骤3一次。通常极微量的红细胞不会影响后续的一些检测。 6. 根据实验需要用适当溶液重悬细胞沉淀后即可进行计数等后续实验。 说明：对于常规步骤，多一步洗涤过程中的离心，但可以节省洗涤液的用量，并且洗涤效果也更好一些，同时不需要大体积的离心管。快速步骤少了一次离心，但洗涤效果略差一些，同时需要大体积的离心管。 对于血液样品： 1. 取新鲜抗凝血，400-500g离心5分钟，离心弃上清。 2. 加入6-10倍细胞体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解1-2分钟。例如细胞沉淀的体积为1ml，则加入6-10ml的红细胞 裂解液。本步骤在室温或4度操作均可。注意：对于鼠的血液，裂解1-2分钟已经足够，对于人的外周血，宜延长裂解时 间至4-5分钟，并且裂解过程中宜适当偶尔摇动以促进红细胞裂解。 3. 400-500g离心5分钟，弃红色上清。4℃离心效果更佳。 4. 如果发现红细胞裂解不完全，可以重复上述步骤2和步骤3一次。通常极微量的红细胞不会影响后续的一些检测。 5. 洗涤1-2次：加入适量PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液，重悬沉淀，400-500g离心2-3分钟，弃上清。可再重复1 次，共洗涤1-2次。洗涤液的用量通常应至少为细胞沉淀体积的5倍。4℃离心效果更佳。 6. 根据实验需要用适当溶液重悬细胞沉淀后即可进行计数等后续实验。 注意：对于微量或少量的血液样品，可以在第一步中不进行离心弃上清的操作，直接在第二步中加入10倍血液体积的红细胞裂 解液，并在室温或4℃裂解4-5分钟。对于鼠的血液，裂解4-5分钟已经足够，对于人的外周血，宜延长裂解时间至10分钟，但 通常不宜超过15分钟，并且裂解过程中宜适当偶尔摇动以促进红细胞裂解。后续步骤相同。对于血液样品无需洗涤的快速操作步骤： 1. 每1ml新鲜抗凝血中加入10ml红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解4-5分钟。本步骤在

红细胞裂解液(RBC Lysis Buffer,10×)

红细胞裂解液(RBC Lysis Buffer,10×) 简介： 在生物科研领域，经常需要去除红细胞。去除红细胞的方法有多种，如ACK Lysis Buffer 、Tris-氯化铵红细胞裂解液、Gey's Lysis Buffer 。红细胞裂解液(Red Blood Cell Lysis Buffer)是一种从人、鼠或其他哺乳动物等体内的组织样品或血液中裂解并去除无核红细胞的溶液，其主要有效成分为NH 4Cl 。 Leagene RBC Lysis Buffer(10×)配方经过优化不同于ACK Lysis Buffer ，在裂解无核红细胞的同时几乎不损伤淋巴细胞(Lymphocyte)或其它有细胞核的细胞。对于裂解、去除有细胞核红细胞，例如鸟或禽类的红细胞，效果不佳，裂解类似细胞时，不建议采用。该裂解液经过滤除菌，为浓缩液，使用RBC Lysis Buffer 处理过的血液或组织细胞样品可以用于后续的细胞培养、细胞融合以及核酸或蛋白的提取及各种常规的分析和检测，尤其适用于流式细胞检测或需要高浓度裂解液的情况。 组成： 自备材料： 1、 胰蛋白酶 2、 离心机 3、 PBS 、HBSS 、生理盐水或无血清培养液 操作步骤(仅供参考)： 注意：绝大多数情况下，应使用无菌去离子水稀释RBC Lysis Buffer(10×)使用，流式细胞术除外。 (一)组织细胞样本的常规操作 1、制备细胞悬液: 新鲜组织经过胰蛋白酶或胶原酶等消化处理，通过适当方法制备成细胞悬液，离心弃上清。 2、裂解: 加入细胞沉淀体积的RBC Lysis Buffer ，轻柔吹打混匀，裂解。本操作步骤在4℃条件下操作更佳，亦可在室温下操作。 3、离心，弃红色上清。本步骤亦可在室温下操作。 4、如果发现红细胞裂解不完全，可以重复上述步骤2和步骤3各一次。 编号 名称 CS0003 CS0003 Storage RBC Lysis Buffer(10×) 100ml 500ml 4℃ 使用说明书 1份

实验七 饱和Nacl法提取全血基因组DNA

实验七全血DNA的提取和凝胶电泳检测 （氯化钠饱和溶液提取法） 实验目的 掌握真核细胞基因组染色体DNA的一种提取方法 学习使用紫外分光光度法鉴定DNA的纯度，估计相对含量。 实验原理 利用高渗溶液裂解红细胞，利用高渗溶液、蛋白酶K溶解白细胞细胞壁，释放核内基因组DNA。 利用DNA不溶于三氯甲烷和乙醇，但其他杂质多溶于此2种溶液，纯化DNA 实验仪器及用品 •高速冷冻离心机；制冰机；紫外可见分光计；冰箱；水浴锅；离心管；烧杯； •电子天平等 实验试剂 红细胞裂解液、STE、10%SDS、蛋白酶K、饱和Nacl溶液、三氯甲烷、异丙醇、70%乙醇、双蒸水 实验步骤 1.裂红细胞：1ml红细胞裂解液+400 l全血加入2mlEP管，反复颠倒混匀，之后静置2min，然后12000rpm离心5min。弃上清。【注意不要把下面的白细胞也倒掉】 2.裂解过夜： ①STE 500μl + ②10% SDS(pH=8.14) 150μl + ③蛋白酶K 10μl 【SDS用之前水浴】 ①②③加至上面步骤1的管子中，裂解过夜，65度水浴（加裂解液后颠倒混匀）(约 每隔一小时操作一次，以使白细胞沉淀充分与裂解混合液接触，裂解更加充分，沉淀要弹起来) 3.向上步EP管中加入饱和Nacl溶液300ul，颠倒混匀轻摇3分钟。【NaCl饱和溶液配制时下面要有一定的未溶解的固体】 4．再加400ul三氯甲烷轻轻混匀轻摇5分钟，之后离心（12000rpm，20min，4度或4度预冷） 5．取上清（用枪吸至1.5ml新EP管），加异丙醇沉淀DNA（异丙醇最好-20度或4度预冷，用前取出），离心（12000rpm，20min，4度或4度预冷）。上清：异丙醇=1：0.6. 【取上清时要注意不要把下面的也吸上来，可稍微留下一些】 6．70%乙醇洗两次（1ml），颠倒混匀。12000rpm，离心5min 7．烘干 8. 加双蒸水或TE溶解。 9.紫外分光光度仪检测 实验结果 1

红细胞裂解液工作原理

红细胞裂解液工作原理 红细胞裂解液是一种在生物学研究中常用的重要试剂，其主要作用是破坏和溶解红细胞，从而释放出其中的细胞成分，如DNA、RNA、蛋白质等。这种试剂的工作原理非常复杂，涉及到生物化学、物理化学等多个学科的知识。 首先，我们需要了解红细胞的基本结构。红细胞是人体血液中的一个重要组成部分，它们的主要功能是携带氧气和二氧化碳。红细胞的外膜由脂质双层构成，内含丰富的血红蛋白，这是一种能够与氧气结合的蛋白质。红细胞裂解液就是通过破坏这个脂质双层和分解血红蛋白来实现对红细胞的裂解。 红细胞裂解液通常包含多种不同的成分，包括离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂、酶类和其他辅助物质。这些成分各有各的作用，共同协作实现了红细胞的裂解。 1. 离子型表面活性剂：这类物质可以破坏红细胞膜的脂质双层，使其破裂。常见的离子型表面活性剂有十二烷基硫酸钠（SDS）、氯化钠（NaCl）等。 2. 非离子型表面活性剂：这类物质也可以破坏红细胞膜，但其作用方式与离子型表面活性剂不同。非离子型表面活性剂主要通过降低水溶液的表面张力，使红细胞内外的压力差增大，从而使红细胞破裂。常见的非离子型表面活性剂有吐温-20、吐温-80等。 3. 酶类：一些特定的酶可以帮助裂解红细胞。例如，溶菌酶可以分解红细胞膜上的糖苷键，加速红细胞的破裂。而蛋白酶则可以分解血红蛋白，使其从红细胞中释放出来。 4. 辅助物质：除了以上三种主要成分，红细胞裂解液中还可能含有其他辅助物质，如EDTA、柠檬酸盐等，它们可以螯合红细胞内的钙离子，阻止红细胞的凝聚，保证裂解过程的顺利进行。

使用红细胞裂解液时，通常是将待处理的样本（如全血或淋巴细胞悬液）加入到裂解液中，轻轻混匀后静置一段时间（通常为5-15分钟），然后通过离心或过滤的方式去除红细胞碎片和裂解液，得到纯化的白细胞或其他细胞成分。 总的来说，红细胞裂解液的工作原理涉及到多个复杂的生物化学反应，需要精确控制各种成分的比例和反应条件。这也是为什么市场上出售的红细胞裂解液种类繁多，因为每种裂解液都有其特定的应用场合和优缺点。只有深入了解其工作原理，才能正确选择和使用红细胞裂解液，从而提高实验的成功率和精度。

裂解液配制方法

裂解液配制方法 The document was finally revised on 2021

1、红细胞裂解液（去除红细胞） 配制试剂所需材料： 1. Ammonium Chloride x10 Lysing Concentrate Solution a) NH4Cl (1.5 M) 80 g b) KHCO3 (100 nM) 10 g c) Na4EDTA (10 nM) 3.7 g d) Distilled H2O 1000 mL 2. 1N HCl or 1N NaOH（调节pH值用） 配制步骤： 1. 将以上a、b、c试剂溶于900ml 去离子水中； 2.调节溶液pH值到，加去离子水定容到1000ml； 3.在制备工作液时，将此储存液稀释10倍后使用。 保存： 储存液储存于2-8°C不能超过半年（六个月）； 2.在使用前，工作液每天都应该新鲜配制放置于室温，当日用不完的弃掉。 2、ripa裂解液 NP-40 or Triton-100 1% TrisHCl (pH 50mmol/L NaCl 150mmol/L PMSF（苯甲基磺酰氟） L(100μg/ml) Pepstatin(胃蛋白酶抑制剂) 1 μmol/Lμg/ml) Leupeptin（亮抑制肽） ml Aprotinin（抑蛋白酶肽）μmol/L(1μg/ml) （注：PMSF 贮存液：100mmol/L即ml于异丙醇中； Aprotinin 贮存液：10mg/ml溶于LHEPES； Leupeptin 贮存液：10mg/ml溶于水中；

Pepstatin 贮存液 10mg/ml于甲醇液中.均于-20℃保存） 3、细胞裂解液（Tris－HCL） 1．1M Tris 溶液的配置 取Tris242.2g，加ddH2O至1600ml，加热溶解。 2．1M Tris－HCL Ph=溶液的配置 取 1M Tris 溶液160ml用分析纯盐酸调至Ph=（需浓盐酸约），加ddH2O定容至200ml，高压灭菌备用。 3. 0.5M EDTA溶液的配置 称EDTA－Na2 37.2g 先用140ml ddH2O溶解，加入14ml NaOH（10M）使EDTA－Na2溶解，再用NaOH（10M）溶液调至Ph=，加ddH2O定容至 200ml，高压灭菌备用。 4. 细胞裂解液的配制 称15gCTAB（Hexadecyltrimethylammonium bromide）（先用约600ml ddH2O 加热溶解）放入烧杯中，加入75ml 1M Tris－HCL（Ph=），58.5g NaCL（先用少量ddH2O溶解），30ml 0.5M EDTA，定容至1000ml，混合均匀备用。 4、组织裂解液配方：` 7M Urea(60. 06) 4.2042 g 2M thiourea g 100mM DTT? g 4% CHAPS g 0.5mM EDTA? 0.00146 g 40Mm Tris? g 2%(v/v) NP-40 ml

rnablood超纯全血总rna快速提取试剂盒操作方法及步骤说明书

RNAblood超纯全血总RNA快速提取试剂盒 目录号：RN25 50次 RN2502 ❖适用范围: 木试剂盒在室温储存12个丿J不影响使用效果。 储存事项： 1.所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直 -1 -

接使用，可在37C水浴加热几分钟，即可恢复澄清。 2.不合适的储存于低温(4C或者一20C)会造成溶液沉淀，影响使用效果，I対此运输 和储存均在室温下(15C—259)进行。裂解液RL可以常温运输•收到后JC避光保存. 3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖 紧盖子。 • 产品介绍： 1.第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定绘乙醇，加入后请及时 打钩标记已加入乙醇，以免多次加入！ 2.所有离心步骤如未加说明.均在室温进行。使用转速可以达到13, OOOrpm的传统台 式离心机.如Eppendorf5415C或者类似离心机。 3.裂解液RL和去贵白液RE中含有刺激性有害化合物.操作时要戴乳胶于•套，避免沾 染皮肤、眼睛和衣服.若沾染皮肤、眼睛时，要用大量淸水或者生理盐水冲洗。 4.考虑到环保问题，本试剂盒不含有实验室常用试剂氯仿.用户使用前需要自备氮仿。 5.常规的琼脂糖凝胶电泳和变性胶电泳均可以用來分析RNA的质量。好的RNA产物 在电泳后应该可以看到明显的二条优势核糖休RNA带，分别为~5Kb(28S) • ~2Kb (18S),条带亮度比值约为2： lo有时候也可以看到~O」kb和O.3Kb(5S・ tRNA) 带。 但有时候根据不同的物种如某些植物组织可以看到4, 5条带也属于正常现彖, 如果RNA未成熟的前体或者不均一核RNA.小核RNA提収出來也可能看到介干7Kb和15Kb之间的不连续的高分子虽条带「 6.检测OD2W yOD28o吸光度比值时.RNA样品应该溶于TE后检测.如果用水稀释后检 测，由干一般水离子强度和PH值低，会使OD280升臥从而使比值降低。 7.加入裂解液RL匀浆后，加氮仿前•样品可在-609・70€保存一个丿J以上。 & 关于DNA的微址残留: 一般说來任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微虽残留.在大

血液标本采集处理标准操作规程

血液标本采集及处理原则操作规程 目旳：血清(ELISA或化学发光法检测蛋白体现检测)；血浆(游离核酸旳检测)；有核细胞(循环肿瘤细胞旳检测)。 合用范围：肿瘤病人血液标本采集及处理。 负责人： 操作流程： 1.仪器设备： 高速低温离心机、－80℃冰箱。 2.材料与试剂： 试剂：10×红细胞裂解液（Cat NO:420301；试剂企业：Biolegend） 胎牛血清（100ml；试剂企业：天津康源生物技术有限企业） DMEM(500ml；试剂企业:Thermo Cat NO:SH30033.01B) DMSO(100ml；试剂企业: 材料：4ml血清真空采血管(黄盖无抗凝剂) 4ml血浆真空采血管(紫盖含抗凝剂) 移液器、50ml离心管、1ml冻存管、吸头等 3.样本采集： 3.1分离血清 3.1.1血清管(黄盖无抗凝剂)，标本于4℃，3300rpm离心10分钟。 3.1.2吸取血清分装于1.5ml 冻存管内，每管300 µl，分装4管，若 血清量较多，则将剩余血清所有加入最终一种冻存管中。 3.1.3贴条形码标签，-80℃储存。 3.2分离血浆

3.2.1血浆管(紫盖含抗凝剂)，标本于4℃，3300rpm离心10分钟。 3.2.2吸取血浆分装于1.0ml 冻存管内，每管300 µl，分装4管，若血浆量较多，则将剩余血清所有加入最终一种冻存管中。 3.2.3贴条形码标签， -80℃储存。 3.2.4采血管扣紧管盖，放存旁边，准备下一步分离有核细胞旳操作。 3.3分离有核细胞 按每4ml全血需要配制40ml用量稀释红细胞裂解液。 3.3.1取50ml离心管, 加36ml去离子水，加4ml红细胞裂解液混匀。 3.3.2用移液器将分离血浆后剩余血液转移至装有裂解液离心管中，轻轻颠 倒混匀，室温静置10min（观测裂解效果合适延长裂解时间，液体展现透明状为宜）。 3.3.3于4℃，800g离心5min，吸去上清，加入4mlDMEM轻轻吹打混匀 沉淀。 3.3.4于4℃，800g离心5min，吸去上清。 3.3.5将4ml细胞冻存液（400µlDMSO＋3600µl胎牛血清；血液和冻存液体积比为1:1）加入离心管里，轻轻吹打混匀，按1ml分装到4个冻存管里。 3.3.6贴条形码标签，放入细胞程序降温盒-80℃冰箱过夜，第二天转入液氮罐保留。 注：细胞冻存液应当新鲜配制，胎牛血清：DMSO=9:1

血液、细胞、组织基因组DNA提取试剂盒步骤

血液、细胞、组织基因组DNA提取试剂盒步骤 血液、细胞、组织基因组DNA提取试剂盒步骤 使用前请先在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。 1. 处理材料 a. 如提取材料为血液，可直接使用200ul新鲜、冷冻或加入各种抗凝剂的血液，不足200ul可加入缓冲液GA补足； 注意：如需处理更大体积血液，如300ul-1ml，可按以下步骤操作：在样品中加入3倍体积红细胞裂解液（例如300ul血液加入900ul 红细胞裂解液），颠倒混匀，室温放置5min，期间再颠倒混匀几次。10000rpm(~11500×g)离心1min（若离心机最高转数不允许，可3000rpm(~3400×g)离心5min），吸去上清，留下白细胞沉淀，加200ul缓冲液GA，振荡至彻底混匀。 b. 如果处理血样为禽类、鸟类、两栖类或更低级生物的抗凝血液，其红细胞为有核红细胞，因此处理量5-20ul，可加入缓冲液GA补足200ul后进行下面的裂解步骤； c. 贴壁培养的细胞应先处理为细胞悬液，然后10000rpm(~11200×g)离心1min，倒尽上清，加200ul缓冲液GA，振荡至彻底悬浮； d．动物组织（脾组织用量应少于10mg）应先打碎处理为细胞悬液，然后10000rpm(~11200×g)离心1min，倒尽上清，加200ul缓冲液GA，振荡至彻底悬浮； 注意：如果需要去除RNA，可加入4ul RNase A(100mg/ml)溶液（客户自备，目录号：RT405-12），振荡15s，室温放置5min。 2. 加入20ul Proteinase K，混匀。 a. 提取血液基因组时，只需加入Proteinase K混匀，即可继续进行下一步。 b. 提取细胞基因组时，只需加入Proteinase K混匀，即可继续进行下一步。

流式细胞仪检测小鼠外周血CD4+和CD8+

流式细胞仪分别检测小鼠外周血CD4+和CD8+ 采血 【实验】实验鼠16管/天*2，每个样本100ul+30ul肝素钠 【空白】【CD4+】【CD8+】正常鼠，第一天实验取300ul+90ul肝素钠 步骤 1）30ul肝素钠溶液处理100ul全血 2）取抗凝血100ul加入到标记好的流式管内，【实验】16管/天，每管加入2ul FITC Rat Anti-Mouse CD4（0.5mg/ml）和5ul PE Rat Anti-Mouse CD8a （0.2mg/ml）除样品管外，第一天需外加三管对照 ●【空白】（正常鼠全血100ul） ●【CD4+】（正常鼠全血100ul+2ul FITC Rat Anti-Mouse CD4（0.5mg/ml））●【CD8+】（正常鼠全血100ul+5μL PE Rat Anti-Mouse CD8a（0.2mg/ml））4）避光放置30min 5）加入红细胞裂解液2mL（此处用量至少68ml，两次破红136ml），轻轻吹打混匀，室温避光反应15min，以1500rpm离心5min，弃上清（观察破红效果，建议重复一次） 6）加2mL PBS混匀后，1500rpm离心5min，弃上清 7）细胞沉淀加入500ul PBS重悬后上机

流式细胞仪分别检测小鼠外周血IFN-γ和IL-4（三色） 采血 【实验】实验鼠，16管/天*2，每个样本100ul+30ul肝素钠 【空白】【CD4】【IFN-γ】【IL-4】正常鼠，第一天实验取400ul+120ul肝素钠 步骤 1.全血刺激培养 100ul 全血+100ul 含刺激物的RPMI 1640完全培养液，于37℃、5% CO2 中孵育4h，计时器计时，手机计时每小时轻轻颠倒混匀一次 2.裂解红细胞 将上述液体转移到流式管内（200ul），加入红细胞裂解液2mL（此处用量至少80ml，两次160ml），轻轻吹打混匀，室温避光15min（观察破红效果，建议重复一次）1500rpm离心5min，留沉淀 每管中加入2ml 染色缓冲液混合均匀，1500rpm，5min离心，留沉淀 3.细胞表面抗原的染色（CD4） ●【CD4】【实验】管各加FITC anti-mouse CD4（0.5mg/ml）2 ul+染色缓冲液 98 ul ●【IFN-γ】【IL-4】【空白】加入100ul染色缓冲液 室温避光15min后，每管中加入2ml染色缓冲液混合均匀，1500rpm，5min离心，弃上清，留沉淀 4.固定和透化细胞 每管中加入500ul 固定/透化剂（棕瓶），充分混匀，避光20min，1500rpm离心5min，弃上清，留沉淀 加2ml 1×BD Perm/wash TM Buffer，避光10min，1500rpm，离心5min，弃上清，留沉淀 5.胞内细胞因子的染色（IFN-γand IL-4） ●【CD4】【空白】100ul Perm/wash TM Buffer ●【IFN-γ】95ul Perm/wash TM Buffer + 5uL PE anti-mouse IFN-γ（0.2mg/ml） ●【IL-4】95ul Perm/wash TM Buffer + 5uL PE Rat Anti-Mouse IL-4（0.2mg/ml） ●【实验】5ul PE anti-mouse IFN-γ（0.2mg/ml）+ 5ul PE Rat Anti-Mouse IL-4 （0.2mg/mL）+90ul Perm/wash TM Buffer 30min避光孵育。加入2ml 1×BD Perm/wash TM Buffer，室温避光孵育10min，1500rpm，5min。弃上清，加入500ulPBS重悬细胞后上机检测

流式常用试剂配制

流式常用试剂配制

一、流式细胞术常用试剂 1、10％NaN3：将10gNaN3溶解于100ml蒸馏水中，室温保存；活体实验或在辣根过氧化酶反应中可不使用NaN3。 2、3％BSA/PBS：100ml PBS中加入3g BSA，使之溶解，再加入0.2ml 10％的NaN3。 3、500mmol/L EDTA：将186g EDTA•Na2•2H2O 溶解于400ml蒸馏水中，用NaOH将PH调至8.0，补充蒸馏水至500ml，分装，高压灭菌，室温保存。 4、4％多聚甲醛：在磁力搅拌下，将4g多聚甲醛溶于100ml PBS，加入数滴NaOH，在通风柜中于60度加热，使其溶解，调整PH至7.4，使用前新鲜配制。 5、消化液：0.25％胰蛋白酶（用培养液或PBS 配制）或0.25％胰蛋白酶与0.02％EDTA的混合液。

6、红细胞裂解液：NH4Cl 4.16g，KHCO3 0.5g，EDTA•2Na 0.02g，溶于100ml水中，调PH至7.2，补充蒸馏水至500ml，4度储存，使用时需恢复至室温。 7、流式细胞抗体稀释剂：0.1mmol/L PBS液（PH 7.4）＋1％BSA＋0.1％Na2N3。 8、常用细胞破膜剂：PBS液（PH 7.4）＋1％FBS （或BSA）＋0.1％NaN3＋0.1％saponin（Sigma 的效果不错）。 9、流式细胞染色洗涤液：含2％的BSA、0.1％NaN3的PBS（PH 7.4）。 10、PI染液（保存液，10×，用于细胞周期和凋亡检测）：10mg PI溶于10ml PBS，加入2mg 无DNA酶的RNA酶，4度保存备用。应用时，10倍稀释，每管加0.3ml～0.5ml PI染液。 11、Hanks液的配制（BSS，主要用于培养液、