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丙烯酰胺测定方法

《水质丙烯酰胺的测定固相萃取-高效液相色谱-质谱/质谱法》

编制说明

(送审稿)

《水质丙烯酰胺的测定高效液相色谱-质谱/质谱法》

标准编制组

2012年10月

目次

1 项目背景 (1)

1.1 任务来源 (1)

1.2 工作过程 (1)

2 标准制订的必要性分析 (1)

2.1 丙烯酰胺的环境危害.......................... .. (1)

2.2 相关环保标准和环保工作的需要 (2)

2.3 新建标准方法的优势 (2)

3 国内外相关分析方法实施情况与存在问题 (2)

4 标准制订的基本原则和技术路线 (3)

4.1 标准制订的基本原则 (3)

4.2 标准的适应范围和主要技术内容 (3)

4.3 标准制订的技术路线 (3)

5 方法研究报告 (5)

5.1 方法研究的目的 (5)

5.2 方法原理 (5)

5.3 试剂和材料 (5)

5.4 仪器和设备 (6)

5.5 样品 (6)

5.6 分析步骤............................. (7)

5.7 结果计算与表述 (9)

5.8检出限、精密度和准确度 (10)

5.9 质量保证和质量控制 (12)

6 方法验证 (12)

6.1 方法验证方案 (13)

6.2 方法验证过程 (13)

7 标准主要技术内容的解释 (13)

8 对实施本标准的建议 (14)

9 质量保证和质量控制 (14)

9.2 空白 (14)

9.2 加标 (14)

9.3 平行样 (14)

9.4 校准标准点 (14)

10 参考文献 (14)

《水质丙烯酰胺的测定高效液相色谱-质谱/质谱法》

编制说明

1. 项目背景

1.1 任务来源

《水质丙烯酰胺的测定高效液相色谱-质谱/质谱法》标准的制定工作,是按照陕西省质量技术监督局陕质监标【2011】第6号文《关于下达2011年第一批地方标准修制订计划的通知》规定起草的,由陕西省环境监测中心站负责制定,项目计划编号为25号。

1.2 工作过程

标准制定任务下达后,陕西省环境监测中心站立即成立了标准编制组。编制组在查阅国内外相关文献、标准的基础上,制定实施方案,进行开题论证。按照方案,进行了方法的条件优化实验,确定方法蓝本,然后在实验室内和实验室间进行方法的验证实验,最后,根据验证结果,完成标准(征求意见稿)的编制。

2. 标准制订的必要性分析

2.1 丙烯酰胺的环境危害

丙烯酰胺,分子式:C

3H

5

NO,分子量为71.08,为白色结晶固体,无气味,

熔点:84.5℃,饱和蒸汽压:0.21Kpa(84.5℃)。溶于水、乙醇、乙醚、丙酮等,但不溶于苯。丙烯酰胺是聚丙烯酰胺的单体,聚丙烯酰胺是一种水溶性高分子聚合物,主要应用于水的净化处理方面。

据统计,在发达国家水处理应用方面,美国占聚丙烯酰胺总用量的36%、西欧占35%、日本占49%;近年来,聚丙烯酰胺在我国水处理方面应用也越来越广泛,虽然聚丙烯酰胺被认为是无毒的,但其单体的毒性却是被肯定的;丙烯酰胺已被国家癌症中心(IARC)列为Ⅳ类致癌物,急性毒性实验证明丙烯酰胺有神经毒性、生殖、发育毒性,动物实验证明丙烯酰胺可导致遗传物质的改变和癌症的发生。在饮用水和地表水中,丙烯酰胺主要来源于使用有丙烯酰胺单体残留的聚丙烯酰胺絮凝剂。所以水中丙烯酰胺的分析是环境分析中的一项重要内容。

2.2 相关环保标准和环保工作的需要

由于丙烯酰胺对环境的危害较大,它已被我国列入水中优先控制的污染物。我国的《地表水环境质量标准》(GB3838-2002)规定丙烯酰胺的标准限值为0.0005mg/L。在环境分析中还没有建立相关的国家及地方标准分析方法。因此,建立快速、灵敏的水中丙烯酰胺的监测分析方法,对了解水环境的质量,保护水质环境安全,保障公众饮水安全,对人群健康的影响具有重要的意义。

2.3新建标准方法的优势

HPLC-MS/MS分析水样中的丙烯酰胺,其优势是:

(1)提高了分析效率。由于取样量少,大大缩短了分析时间。

(2)定性准确,在不能完全将干扰物质分离的情况下仍可以准确定性定量,扫描方式可以选择多反应监测(MRM);抗干扰能力非常强。

(3)检出限更低,三重四级杆质谱具有非常高的灵敏度,因此,检出限可达0.008μg/L,而GC方法检出限为0.15μg/L(取样量100ml水),HPLC方法检出限为0.1μg/L(取样量300mL)。

3. 国内外相关分析方法实施情况与存在问题

关于水中丙烯酰胺的测定,国外多采用气相色谱法、高效液相色谱法等方法进行测定;如美国EPA8032A用气相色谱法,前处理采用溴化衍生-液液萃取。EPA8316采用高效液相色谱法,但其主要检测对象为除水外的其它基质,而且方法检出限高达10μg/L。

国内关于水中丙烯酰胺的测定主要是气相色谱法,气相色谱-质谱法。《生活饮用水卫生规范》(中华人民共和国卫生部 2001)中,采用溴化衍生-液液萃取-气相色谱法测定饮用水中的丙烯酰胺;中华人民共和国出入境检验检疫行业标准《食品中丙烯酰胺的测定方法同位素内标法》(SN/T2096-2008)中使用气相色谱仪-质谱法。前处理采用石墨化碳黑层析柱净化,净化液中的丙烯酰胺经溴水衍生化后,用同位素标记的内标法,气相色谱-质谱联用仪检测。

以上GC和GC-MS测定丙烯酰胺,一般都需要经过繁琐的溴化衍生-液液萃取过程,测定周期长,复杂的前处理过程也造成方法精密度、准确度等性能不稳定;HPLC方法,定性能力差,检出限高。

4. 标准制订的基本原则和技术路线

4.1 标准制订的基本原则

(1)方法检出限和测定范围满足《地表水环境质量标准》(GB3838-2002)等相关环保标准和环保工作的要求。

(2)方法准确可靠、满足各项方法特性指标的要求。

(3)方法具有普遍适用性,易于推广使用。

(4)标准的格式按照《环境监测分析方法标准制修订技术导则》(HJ/T168-2010)、《标准化工作导则第1部分:标准的结构和编写》(GB/T 1.1-2009)的要求制定。

4.2 标准的适用范围和主要技术内容

(1)本标准规定了测定地表水及饮用水中丙烯酰胺的固相萃取-高效液相色谱-质谱/质谱法的范围、方法原理、试剂和材料、仪器和设备、样品、分析步骤、结果计算、准确度和精密度、质量保证和质量控制。

(2)本标准采用高效液相色谱-质谱/质谱法,侧重仪器分析条件的建立以及质量保证和质量控制,同时兼顾便捷、准确的可操作性。

4.3 标准制订的技术路线

本标准的制订是在查阅国内外相关文献的基础上,制定实验方案,进行实验室内的条件优化实验、验证试验后,编制标准的草稿,再通过实验室间的验证试验,完成标准(征求意见稿)的编制。通过在全省进行标准征求意见稿的意见征求、汇总、修订,完成标准送审稿的编制。陕西省质量技术监督局组织专家对标准送审稿进行评审,标准编制组根据评审意见,进行修改完善,最后形成标准报批稿。

技术路线图见下图。

丙烯酰胺测定方法

丙烯酰胺测定方法

丙烯酰胺测定方法

丙烯酰胺测定方法

丙烯酰胺测定方法

丙烯酰胺测定方法

丙烯酰胺测定方法

丙烯酰胺测定方法

丙烯酰胺测定方法

丙烯酰胺测定方法

5. 方法研究报告

5.1 方法研究的目的

(1)本标准适用于地表水和饮用水中丙烯酰胺的测定。

(2)通过本标准的制订,使该监测方法的检出限、精密度、准确度等满足地表水及饮用水等环境质量控制标准中对丙烯酰胺的测定要求。

我国的《地表水环境质量标准》(GB3838-2002)规定丙烯酰胺的标准限值为0.0005mg/L。制订后的标准中,按《环境监测分析方法标准制修订技术导则》(HJ168-2010)附录A要求测定方法检出限,丙烯酰胺的检出限为0.008μg/L,以4倍检出限作为测定下限,测定下限为0.032μg /L,测定下限可满足环境质量标准对丙烯酰胺的监测要求。

5.2 方法原理

本方法采用Sep-Pak AC2-Plus固相萃取小柱对水样中的痕量丙烯酰胺进行富集,使用甲醇洗脱,洗脱液浓缩至刚干为宜,迅速加1mL超纯水定容,过PTFE 一次性滤膜后,目标物经过HPLC分离进入三重四级杆质谱检测器,定性定量分析。

5.3 试剂和材料

5.3.1除非另有说明,分析时均使用符合国家标准的HPLC-MS专用试剂和高纯水。

5.3.2 甲醇

HPLC级。

5.3.3 甲酸

HPLC-MS专用。

5.3.4 0.45μm一次性PTFE微孔滤膜

水系。

5.3.5 固相萃取小柱

SampliQ C18 ODS 500mg/6mL 固相萃取小柱;

Oasis○R HLB 6cc(150mg) 固相萃取小柱;

Sep-Pak AC2-Plus固相萃取小柱。

5.3.6丙烯酰胺标准溶液,ρ=1000.0mg/L

市售有证丙烯酰胺标准溶液,浓度为ρ=1000.0mg/L,介质为甲醇,在4℃冰箱中保存。

5.3.7 丙烯酰胺标准贮备溶液,ρ=1.0mg/L

准确吸取丙烯酰胺标准溶液(5.3.5)100μL于100mL容量瓶中,用纯水稀释至标线,在4℃冰箱中保存。

5.4 仪器和设备

5.4.1 高效液相色谱-质谱/质谱联用仪(三重四极杆质谱)。

5.4.2 色谱柱的选用。

选用反相ODS柱即十八烷基硅烷化学键合相色谱柱,规格150mm(柱长)×2.1mm(内径),5.0μm(粒径)。

5.5 样品

5.5.1 样品采集及保存

样品应采集在棕色玻璃容器中。采样前用待测水样将样品瓶清洗2~3次。采样后,水样应充满样品瓶并加盖密封,置于4℃冰箱内避光保存。

5.5.2 样品制备

5.5.2.1 关于取样量的选择

由于HPLC-MS/MS具有极低的检出限,因此取用10mL水样进行固相萃取等前处理步骤,即满足定性定量要求。

5.5.2.2 固相萃取条件的优化

饮用水及地表水中的丙烯酰胺采用直接进样法就能满足分析需要,但实验发现,大部分地表水及饮用水对丙烯酰胺具有基质抑制效应,加标回收率仅能达到50%左右;而且随着加标浓度增大抑制效应越明显;因此,如果不考虑基质抑制作用,就会大大低估水中丙烯酰胺的浓度,故需要考虑固相萃取法对样品进行前处理。

5.5.2.3 固相萃取小柱及洗脱溶液选择

A.固相萃取小柱的选择

本实验采用SampliQ C18 ODS 500mg/6mL,Oasis○R HLB 6cc(150mg),Sep-Pak AC2-Plus三种固相萃取小柱(5.3.5),先用10mL甲醇(5.3.2),再用10mL

水对其活化,留5mL水浸泡固相萃取小柱15min后上样过柱富集,小柱吹干后,用10mL甲醇(5.3.2)洗脱,洗脱液氮吹至干,加1mL超纯水定容,过0.45μm 一次性微孔滤膜(5.3.4)过滤,上机测定。从萃取效果来看,用Sep-Pak AC2-Plus 柱萃取样品加标回收率能达到70%以上,而其它两种都低于5%。因此本实验选择Sep-Pak AC2-Plus萃取小柱,见表1。

表1 不同萃取小柱对加标水样的回收率比较

丙烯酰胺测定方法

B.洗脱液用量的选择

分别用2mL、4mL、6mL、8mL、10mL、12mL、15mL的甲醇对富集的目标物进行洗脱,结果发现,随着洗脱液用量的增加回收率越高,当洗脱液用量大于10mL 时,回收率达到最高,且相差不大,为了节约氮吹时间,提高效率并保证回收率,本实验洗脱剂用量选择为10mL。

5.6 分析步骤

5.6.1 有关色谱-质谱条件

5.6.1.1 流动相条件选择

分别使用水-甲醇、5mmol/L乙酸铵水溶液-甲醇、5mmol/L乙酸铵-0.1%甲酸水溶液-甲醇、0.1%甲酸水溶液-甲醇等做流动相,发现用0.1%甲酸水溶液-甲醇梯度洗脱,灵敏度高,峰对称性好,见标准色谱图1,流动相梯度洗脱程序见表1。

丙烯酰胺的保留时间为1.63min。

丙烯酰胺测定方法

表2 流动相梯度洗脱程序

丙烯酰胺测定方法

5.6.1.2 质谱条件优化

离子化模式:电喷雾电离正离子模式(ESI+);质谱扫描方式:多反应监测(MRM),母离子(Parent)(m/z):72.375 子离子(Product)(m/z):55.487 碰撞能量(Collision Energy):11V 管状透镜电压(Tube lens):65V 鞘气(Sheath gas):35psi 辅助气(Auxiliary gas):10arb 毛细管温度(Capiliary Temperature):350℃分辨率(FWHM):0.70。

蒸发器温度(Vaporizer Temperature):450℃极性:正

喷雾电压(Spray Voltage)(V):3500

5.6.1.3 进样量选择

由于质谱为质量型检测器,进样量越大,响应值越高,因此,加大进样量能

最大限度的提高方法检出限,但进样量过大会加大色谱峰的拖尾;分别选择5μL、10μL、25μL、50μL、100μL进样量上机测定,实验证明,50uL进样量响应值高,且峰对称性好,而进样100μL时,峰拖尾严重。因此,进样量选择50μL。

5.6.2 标准曲线建立

将丙烯酰胺标准贮备液(5.3.6)用甲醇(5.3.2)逐级稀释,最后用纯水配制浓度分别为0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16、20μg/L的使用液,以峰面积对浓度作线性回归分析,回归方程见表3,标准曲线见图2。

表3 丙烯酰胺标准曲线测定

丙烯酰胺测定方法

丙烯酰胺测定方法

图2 丙烯酰胺标准曲线

5.6.3 每次分析前用中间浓度的标准溶液作常规校准试验和空白试验:采用和样品分析相同的试剂和步骤,制备全程序空白溶液,并做为日常的质控手段。

5.7 结果计算与表述

5.7.1 制定的标准中采用以样品的保留时间和标样的保留时间相比及特征离子来定性。用作定性的保留时间窗口宽度以当天测定标样的实际保留时间变化为基

准。

5.7.2 制定的标准中采用外标标准曲线法按式(1)来定量水中丙烯酰胺的浓度。

ρ=(Y -α)V t/(K×V s)(1)

式中:ρ———水样中丙烯酰胺的浓度,μg/L;

Y ———水样中丙烯酰胺的峰面积;

α———校准曲线截距;

V

———洗脱液浓缩定容后的体积,mL;

t

V

———水样体积,mL;

s

K ———校准曲线斜率。

5.8 检出限、精密度和准确度

5.8.1 检出限

按照《环境监测分析方法标准制修订技术导则》(H168-2010)要求,方法分别测定空白加标浓度为0.02μg/L的水样8份,剔除离群值后,统计8份水样的标准偏差S,此时检出限MDL=S×2.998。具体数据及结果见表2。

表2 检出限测试数据

平均值 (μg/L)

5.8.2 室内精密度和准确度测定

(1)精密度测定

取某地地表水10mL,各七份,分别加入一定量的标准物质,按样品步骤进行测定,计算其相对标准偏差,见表3。

表3.精密度测试数据

平均值 (μg/L)

(2)准确度测定

取两个不同水样(饮用水和地表水),各七份,分别加入一定量的标准物质,按样品分析步骤测定其回收率,分析结果见表4。

表4 实际样品加标测试数据

丙烯酰胺测定方法

说明:

(1)测定均值X 计算公式为: n

X

X n

i i

∑==

1

(2)标准偏差S 计算公式为: ()

1

1

2

--=

∑=n X Xi S n

i

(3)相对标准偏差RSD 计算公式: 100

X

S RSD % (4)加标回收率=(加标试样测定值-试样测定值)/加标量×100%

5.8.3 室间精密度和准确度测定 (1)精密度测定

在饮用水中分别加入一定量丙烯酰胺标准溶液制得水样1和水样2,由西省环境监测中心站、西安市环境监测站、渭南市环境监测站、宝鸡市环境监测站、汉中市环境监测站、商洛市环境监测站等6个实验室分别对其进行6次测定,水样1实验室内相对标准偏差为:5.6%-9.1%,实验室间相对标准偏差为:6.3%,重复性限为:0.006μg/L ,再现性限为:0.008μg/L ;水样2实验室内相对标准偏差为:6.7%-11.7%,实验室间相对标准偏差为:2.8%。重复性限:0.403μg/L ,再现性限:0.403μg/L 。

(2)准确度测定

在饮用水中分别加入一定量丙烯酰胺标准液而制得水样1和水样2,由其6个实验室分别对其进行6次加标回收率测定,水样1加标回收率在70.0%-97.5%之间,加标回收率最终值为80.8%±9.3%;水样2加标回收率在73.0%-98.0%之间,加标回收率最终值为83.0%±4.6%。(实验数据详见各实验室验证报告) 5.9 质量保证和质量控制(QA/QC )

方法根据HPLC-MS/MS 定性、定量分析特点和分析过程技术关键点,从空白干扰消除、仪器性能、校准曲线检查等几个方面制订了质量保证和质量控制的建议和要求。本次制定的标准,将QA/QC 单独列为方法的一个主要内容。

6. 方法验证

6.1 方法验证方案

6.1.1 参与方法验证的实验室基本情况

按照《环境监测分析方法标准制修订技术导则》(HJ 168)和《国家环境污染物监测方法标准制修订工作暂行要求》(环科涵[2009]10号)的要求,组织6家实验室进行验证,陕西省环境监测中心站、西安市环境监测站、宝鸡市环境监测站、渭南市环境监测站、汉中市环境监测站、商洛市环境监测站。根据影响方法精密度和准确度的主要因素和数理统计学的要求,编制方法验证报告,验证数据主要包括精密度、准确度等。

6.1.2 方法验证方案

方法检出限:按照《环境监测分析方法标准制修订技术导则》(H168-2010)要求,方法分别测定空白加标浓度为0.02μg/L的水样8份,剔除离群值后将各自的8次测定结果计算其标准偏差S,此时检出限MDL=S×2.998。

方法的测定下限:参照HJ168-2010,以4倍方法检出限确定为本方法目标物的测定下限。

方法精密度和准确度:取某地地表水10mL,各六份,分别加入一定量的标准物质,按样品步骤进行测定,计算其相对标准偏差。

加标回收率:取10mL水样各6份,加入标准品使其浓度为0.040μg/L、2.000μg/L,进行全程序分析,剔除离群值后将测定结果分别计算平均值、标准偏差、相对标准偏差、加标回收率等。

6.2 方法验证过程

6.2.1 首先,通过筛选确定方法验证单位。按照方法验证方案准备实验用品,与验证单位确定验证时间。在方法验证前,参加验证的人员应熟悉和掌握方法原理、操作步骤及流程。方法验证过程中所用的试剂和材料、仪器和设备及分析步骤应符合方法相关要求。

6.2.2 具体《方法验证报告》见附一。

6.3 方法验证结论

本方法确定的4倍检出限为目标物的测定下限。方法精密度和准确度统计结果能满足方法性能指标要求。

7. 标准主要技术内容的解释

除在第5章和第6章中已经做出的解释以外,对标准各条款还需补充做出的解释。

8. 对实施本标准的建议

本标准使用高效液相色谱-质谱/质谱法,由于具有高灵敏度、定性定量准确等优点,在环境监测行业具有广阔的应用前景。

通过本标准的制定,使我省地表水和饮用水中丙烯酰胺环境分析方法有一个统一的规范化的技术准则和依据,以确保分析结果的重复性、再现性、准确性、可比性、推动我省环境监测工作的不断发展。

9. 质量保证和质量控制

9.1 空白

全程序空白:每分析一批(20个)样品必须有一个全程序空白。

9.2 加标

9.2.1 每分析一批(20个)样品必须有一个空白加标;组分回收率在70%~120%之间;

9.2.2 每分析一批(20个)样品必须有一个加标样品,组分回收率在70%~120%之间。

9.3 平行样

每分析一批(20个)样品必须有一个平行样,平行样品误差在10%以内。9.4 校准标准点

每间隔20个样品或一个批次(此批次小于20个样品)必须进行标准溶液校准,以便重新校正保留时间及窗口。标准溶液得到的相应因子与初次校准的响应因子相对偏差应在10%以内。

10. 参考文献

[1]中华人民共和国地表水环境质量标准,GB3838-2002,2002

[2]生活饮用水卫生规范,GBT 5750-2001,2001

[3]食品中丙烯酰胺的测定方法同位素内标法,SN/T2096-2008,2008

[4]U.S.EPA 8032A Acrylamide by gas chromatography

[5] U.S.EPA 8316 Acrylamide,Acrylonitrile and acrolein by high

performance liquid chromatography(HPLC)

[6] 水质采样样品的保存和管理技术规定,GB/T12999-1991,1992

[7] 张凌云,刘波,徐荣等.液相色谱-串联质谱法测定饮用水中的丙烯酰胺.

环境化学,2010,29(1):151-152

[8] 杨丽莉,王美飞等.水中丙烯酰胺气相色谱测定方法研究.中国环境监测,

2012,28(1):46-49

[9] 李宗来,何琴等.液质法测定饮用水中丙烯酰胺时应对水体基质干扰的办

法,环境化学,2012,31(4):563-564