常用荧光染料的激发和发射波长

常用荧光染料的激发和发射波长

Fluoresce nt Dye (荧光Excitation （激发波长，Emissio n (发射波长染料）nm )nm )

Cy2 489 506 GFP(Red Shifted) 488 507

YO-PRO -1 491 509 YOYO -1 491 509 Calce in 494 517 FITC 494 518 FluorX 494 519 Alexa 488 490 520 Rhodami ne 110 496 520 ABI,5-FAM 494 522 Oregon Green ?500 503 522 Oregon Green ? 488 496 524 RlboGreen ? 500 525 Rhodam ine Gree n 502 527 Rhodami ne123 507 529 Magn esium Gree n 506 531 Calcium Gree n 506 533

TO-PRO ?-1 514 533 TOTO-1 514 533 ABI,JOE 520 548 BODIPY? 530/550 530 550

Dil 549 565 BODIPY?R 542 568 BODIPY?558/568 558 568 BODIPY?564/57O 564 570

Cy3 ? 550 570 Alexa ? 546 555 570 TRITC 547 572 Magn esium Orange ? 550 575 Phycoerythri n,R & B 565 575 Rhodam ine Phalloidin 550 575 Calcium Orange ? 549 576 Pyro nin Y 555 580 Rhodami ne B 罗丹明555 580 ABI,TAMRA 560 582

只供学习与交流

常用抗体标记荧光染料的特性及其应用

常用抗体标记荧光染料的特性及其应用 1、FITC：激发波长488nm，最大发射波长525nm。 1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪； 2）在流式细胞仪的FL1通道检测； 3）可用于荧光显微镜技术 4）荧光强度易受PH值影响，PH值降低时其荧光强度减弱。 2、Alexa Fluor 488：激发波长488nm，最大发射波长519nm。 1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪； 2）在流式细胞仪的FL1通道检测； 3）具有超乎寻常的光稳定性，非常适用于荧光显微镜技术； 4）在较宽的PH值范围内保持稳定（PH4～10）。 3、Cy3：激发波长488nm，最大发射波长570nm。 1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪； 2）在流式细胞仪的FL2通道检测； 3）适用于荧光显微镜技术； 4）为小分子染料，非常适合需小分子染料的流式细胞术，荧光强度低于P E。 4、Cy5：激发波长633/635nm，最大发射波长670nm。 1）其标记的抗体适用于所有配备633nm氩离子激光器的流式细胞仪； 2）在流式细胞仪的FL4通道检测；

3）适用于荧光显微镜技术； 4）同样为小分子染料，非常适合需小分子染料的流式细胞术，荧光强度低于APC。 5）与单核和粒细胞非特异性结合多，易出现假阳性结果。 5、PE：激发波长488nm，最大发射波长575nm。 1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪； 2）在流式细胞仪的FL2通道检测； 3）其荧光泯灭性强，不适用于传统的荧光显微镜技术，但适用于激光共聚焦显微镜技术。 6、PE-TR：激发波长488nm，最大发射波长615nm。 1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL3通道检测； 2）可适用于小功率激光器的流式细胞仪，也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪。 7、PE-Alexa Fluor 610：激发波长488nm，最大发射波长628nm。 1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL3通道检测； 2）荧光强度高； 3）可适用于小功率激光器的流式细胞仪，也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪。 8、PE-Alexa Fluor 647：激发波长488nm，最大发射波长668nm。 1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL4通道检测，BD细胞仪FL3通道检测； 2）不易湮灭；

常见荧光染料的激发波长及发射波长.

常用荧光染料的激发及发射波长 Fluorescent Dye(荧光染料Excitation(激发波长nmEmission发射波长nm Cy2TM489506 GFP(Red Shifted488507 YO-PRO TM-1491509 YOYO TM-1491509 Calcein494517 FITC494518 FluorX TM494519 Alexa TM488490520

Rhodamine110496520 ABI,5-FAM494522 Oregon Green TM500503522 Oregon Green TM488496524 RlboGreen TM500525 Rhodamine Green TM502527 Rhodamine123507529 Magnesium Green TM506531 Calcium Green TM506533 TO-PRO TM-1514533 TOTO?-1514533 ABI,JOE520548 BODIPY?530/550530550 Dil549565 BODIPY?TMR542568 BODIPY?558/568558568 BODIPY?564/570564570 Cy3TM550570 Alexa TM546555570

TRITC547572 Magnesium Orange TM550575 Phycoerythrin,R B565575 Rhodamine Phalloidin550575 Calcium Orange TM549576 Pyronin Y555580 Rhodamine B555580 ABI,TAMRA560582 Rhodamine Red TM570590 Cy3.5TM581596 ABI,ROX588608 Calcium Crimson TM590615 Alexa TM594590615 Texas Red?595615 Nile Red549628 YO-PRO TM-3612631 YOYO TM-3612631 R-Phycocyanin618642 C-Phycocyanin620648

常用荧光染料的激发和发射波长

常用荧光染料的激发和发射波长 Fluorescent Dye （荧光染料）Excitation （激发波长， nm ） Emission （发射波长， nm ） Cy2 489 506 GFP(Red Shifted) 488 507 YO-PRO -1 491 509 YOYO -1 491 509 Calcein 494 517 FITC 494 518 FluorX 494 519 Alexa 488 490 520 Rhodamine 110 496 520 ABI,5-FAM 494 522 Oregon Green 500 503 522 Oregon Green 488 496 524 RlboGreen 500 525 Rhodamine Green 502 527 Rhodamine123 507 529 Magnesium Green 506 531 Calcium Green 506 533 TO-PRO -1 514 533 TOTO-1 514 533 ABI,JOE 520 548 BODIPY 530/550 530 550 Dil 549 565 BODIPYR 542 568 BODIPY558/568 558 568 BODIPY564/570 564 570 Cy3 550 570 Alexa 546 555 570 TRITC 547 572 Magnesium Orange 550 575 Phycoerythrin,R & B 565 575 Rhodamine Phalloidin 550 575 Calcium Orange 549 576 Pyronin Y 555 580 Rhodamine B 罗丹明555 580 ABI,TAMRA 560 582 Rhodamine Red 570 590 581 596

分子生物学常用荧光核酸染料

由于只需简单温和的物理方法（光照）激发和检测，荧光染料是研究生物学微观世界特别是核酸时最常用的示踪工具之一。这里的荧光核酸染料主要指能特异结合核酸并改变发光特性的化合物，DNA电泳后检测凝胶的EB大概是最为人熟知的荧光核酸染料吧。除了染胶，荧光核酸染料还可用于荧光原位杂交中作为常见的复染剂，它们能以非共价键的方式与DNA/RNA结合从而显示原位杂交中的细胞背景信息。根据它们能否穿透细胞膜进入活细胞体内，还可分为两大类：通透性核酸染料和非通透性核酸染料。生物通在此简单比较一下在分子生物学实验和细胞学实验中常用的荧光染料。 分子生物学常用荧光核酸染料 荧光核酸染料在分子生物学最常见的应用无疑是电泳凝胶染色，以及定量PCR。 EB EB（溴化乙锭）本身在紫外下不发光，能与单链、双链甚至三链DNA高效结合并发出明亮的橙色荧光。因其廉价且灵敏度高，一直是琼脂糖核酸电泳最常用的荧光染料。EB的使用非常简单方便，电泳结束后染色可获得最佳效果，也可以在制胶时加入进行前染。前染有利于节约时间，但是易出现条带变形拖尾等问题。EB-DNA结合物会导致染料的光漂白和DNA单链断裂，且具有潜在的诱变作用。虽说以前的实验室里总会有个别做起实验来“精神可嘉，行为可怕”的家伙，一时找不到手套他们敢徒手拿EB胶，但大多数人对EB还是“敬而远之”的，没事谁都不愿靠近实验室里跑胶、看胶那一块地方。偏偏对于搞分子生物学的人来说，跑胶就像吃饭一样平常，于是大家只能硬着头皮天天和EB打交道，盼望EB的替代品早点出现在实验室。生物通在此简单回顾一下这几年纷纷登场的EB替代品。 SYBR系列染料 说到EB的替代物，首先想到的是Invitrogen旗下Molecular Probes专利持有的SYBR系列。自1993年SYBR核酸染料推出以来，就因其灵敏度和易用性而迅速大受欢迎，成为明星产品之一。这一系列包括4种染料：SYBR Safe、SYBR Gold、SYBR Green I和SYBR Green II。

荧光分光光度法测定荧光素钠的含量

荧光分光光度法测定荧光素钠的含量 一、实验目的 1.学习荧光分光光度法测定荧光素钠的分析原理。 2.掌握荧光分光光度计的操作技术和测定荧光素钠的方法。 二、实验原理 荧光分析法，是以溶液中物质分子对光的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。 常温下，处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态分子，激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级，再以辐射跃迁的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。 在稀溶液中，荧光强度I F 与物质的浓度c 有以下的关系： 当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系： 这是荧光光谱法定量分析的理论依据。 三、仪器及试剂 1．仪器 960荧光分光光度计； LC-UV 紫外检测器； 微量进样器 2．试剂 ① 二氯荧光素（分析纯）； ② 荧光素钠 四、操作步骤 1.标准溶液配制 准确称取0.05g 二氯荧光素标样，配制成2500ml 溶液，则此溶液浓度为0.05μm/mL ，分别移取此溶液2.0ml 、4.0ml 、6.0ml 、8.0ml ，于25ml 容量瓶中，bc I I F εφ0303.2=Kc I F =

并用蒸馏水稀释至刻度，摇匀后，待测定各标准溶液的荧光强度。 2.荧光强度测定 (1)荧光光度计操作 开启220V稳压电源至220V； 打开主机电源开关。 检查氙灯电是否开启。 (2)二氯荧光素发光谱的绘制，参数设置如下： ①设定纵坐标 ②设定灵敏度； ③设定扫描速度； ④发射波长EMISSION Wavelength 250.0 nm； ⑤激发波长范围200-350 nm； ⑥将某一浓度的二氯荧光素标液置于试样池中； ⑦扫描得到激发光谱。 (3)标准溶液及样品的测定，参数设置如下： ①设定纵坐标 ②设定灵敏度； ③设定扫描速度； ④设定激发波长EXCITION Wavelength 496.0nm(从激发光谱曲线中)得到； ⑤发射波长范围EMISSION Wavelength 518nm； ⑥将1号标准溶液放入试样池中； ⑦扫描得到荧光光谱。 仪器开始扫描，得到1号标准溶液的荧光强度。其余4各标准溶液和样品液只要重复上述⑥⑦操作，就可以分别得到它们的荧光光谱。按各标液的荧光强度做出I-C工作曲线。 五、数据记录及计算 1.列表

关于荧光染(资料集合)

关于荧光染料（资料集合） ●人肉眼对光源波长的颜色感觉 红色770-622 nm 橙色622~597 nm 黄色597~577 nm 绿色577~492 nm 蓝靛色492～455nm 紫色455～350nm ●理想的荧光染料一般具有以下几个特点： 1.具有高的光子产量，信号强度高； 2.对激发光有较强的吸收，降低背景信号； 3.激发光谱与发射光谱之间距离较大，减少背景信号的干扰； 4.易与被标记的抗原、抗体或其他生物物质结合而不影响被标记物的特异性； 5.稳定性好，不易受光、温度、PH、标本抗凝剂和固定剂的影响。 ●染料在生物化学中最早的应用是直接对切片进行染色，然后进行观察。随着生物技术、计算机技术以及荧光光谱测定技术的不断发展，许多染料尤其是荧光染料在细胞检测、肿瘤基因蛋白分析、毒物分析、临床医疗诊断等方面得到了广泛的应用。 荧光染料泛指吸收某一波长的光波后能发射出另一大于吸收光波长的光波的物质。利用荧光染料进行抗体标记分析在现代生物免疫学领域中应用广泛，并逐步显示出明显的优越性。 下面简要介绍应用于标记抗体的荧光染料及其种类： 1.荧光素类染料，包括异硫氰酸荧光素(FITC)、羟基荧光素(FAM)、四氯荧光素(TET)等及其类似物。这是一类具有较多苯环的化合物。应用最广泛的是FITC(如图为FITC标记的组织荧光图)，在488nm 处由氩离子激光激发，发射525nm的蓝绿色荧光。FITC能够与各种抗体蛋白结合，并在碱性溶液中稳定呈现蓝绿色荧光。 2.罗丹明类染料，包括红色罗丹明（RBITC）、四甲基罗丹明（TAMRA）、罗丹明B（TRITC）等。TRITC在550nm处被激发可发射出570nm的黄色荧光。 3.Cy系列菁染料，菁染料通常有两个杂环体系组成，包括Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7及其类似物。 4.Alexa系列染料，它是由MolecularProbes开发的系列荧光染料。其激发光和发射光光谱覆盖大部分可见光和部分红外线光谱区域，应用广泛。以高亮度、稳定性、仪器兼容性、多种颜色、pH值不敏

各类荧光素的发射激发波长

Ｐｒｏｂｅ　Ｅｘ（ｎｍ）　Ｅｍ（ｎｍ）　ＭＷ　Ｎｏｔｅｓ　 Ｒｅａｃｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ｐｒｏｂｅｓ　 Ｈｙｄｒｏｘｙｃｏｕｍａｒｉｎ　３２５　３８６　３３１　Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｅｓｔｅｒ　 Ａｍｉｎｏｃｏｕｍａｒｉｎ　３５０　４４５　３３０　Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｅｓｔｅｒ　 Ｍｅｔｈｏｘｙｃｏｕｍａｒｉｎ　３６０　４１０　３１７　Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｅｓｔｅｒ　 Ｃａｓｃａｄｅ　Ｂｌｕｅ　３７５；４００　４２３　５９６　Ｈｙｄｒａｚｉｄｅ　 Ｌｕｃｉｆｅｒ　ｙｅｌｌｏｗ　４２５　５２８ ＮＢＤ　４６６　５３９　２９４　ＮＢＤ－Ｘ　 Ｒ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ　（ＰＥ）　４８０；５６５　５７８　２４０　ｋ ＰＥ－Ｃｙ５　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ　４８０；５６５；６５０　６７０ ａｋａ　Ｃｙｃｈｒｏｍｅ，　Ｒ６７０，　Ｔｒｉ－Ｃｏｌｏｒ，　Ｑｕａｎｔｕｍ　Ｒｅｄ　ＰＥ－Ｃｙ７　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ　４８０；５６５；７４３　７６７ ＡＰＣ－Ｃｙ７　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ　６５０；７５５　７６７ ＰｈａｒＲｅｄ　 Ｒｅｄ　６１３　４８０；５６５　６１３ ＰＥ－Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ　 Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　４９５　５１９　３８９　ＦＩＴＣ；　ｐＨ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　 ＦｌｕｏｒＸ　４９４　５２０ ５８７　（ＡＰ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）　 ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ　５０３　５１２ ＴＲＩＴＣ　５４７　５７２　４４４　ＴＲＩＴＣ　 Ｘ－Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　５７０　５７６　５４８　ＸＲＩＴＣ　 Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ　Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　Ｂ　５７０　５９０ ＰｅｒＣＰ　４９０　６７５ Ｐｅｒｉｄｉｎｉｎ　ｃｈｌｏｒｐｈｙｌｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ

荧光染料

荧光染料简介 荧光定义 荧光染料会发出荧光，所谓荧光是指物质分子吸收紫外光后发出的可见光荧光以及吸收波长较短的可见光后发出的波长较长的可见光荧光。 荧光发生机理 每个分子具有一系列严格的分立能级，室温下物质分子大部分处于"基态"，当这些物质在光的照射下吸收光能后，进入新的状态，称为"激发态"。处于"激发态"的分子是不稳定的，它可以通过以10-9-10-7秒的极短时间内发射光量子回到基态。这一过程称为荧光发射， 也就是发光。 激发光谱和发射光谱 任何发荧光的物质分子都具有两个特征光谱--激发光谱和荧光发射光谱。 在测定时，用以激发荧光的吸收光谱，一般称为荧光物质的激发光谱，它是指相对于不同激发波长的辐射所引起物质发射某一波长荧光的光谱。 荧光发射光谱简称为发射光谱，是指某一波长激发光引起物质发射不同波长荧光的光谱。 荧光效率和荧光强度 分子能产生荧光必须具备两个重要的条件，一是物质的分子必须具有吸收一定频率光能的基团--生色团，二是必须具有能产生一定光量子的荧光团。 而物质发射荧光的能力用荧光效率表示。荧光效率为荧光团发射荧光的光量子数与生色团吸收的光量子数的比值称。 荧光效率往往小于1。如罗丹明B的乙醇溶液的荧光效率为0.97；荧光素的水溶液的荧光强度为0.65，荧光效率与物质结构有关，还与所处的环境紧密相关。而对于某种荧光 物质在特定的环境下它的荧光效率是固定的。 在一定范围内，激发光越强，荧光也越强。即荧光强度（发射荧光的光量子数）等于吸收光强度乘以荧光效率。 提高荧光强度的根本方法 选择适当强度的光源作为荧光物质的激发光源，和选择适合于被检荧光物质选择性吸收的光谱滤光片作为激发滤光片，是提高荧光强度的根本方法。许多染料的最大吸收峰并不是 紫外光，而是在400nm-500nm的蓝绿光，所以紫外光不是这些染料的最佳激发光源，可 见光才是这些染料的最佳光源。 常用荧光色素波长

主要荧光素一览表

（1）荧光素类 Fluorescein 标准荧光素（Reference standard）之一,在其基础上进行结构改造,可产生一系列荧光素衍生物。 Fluorescein适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，有相对高的荧光吸收，较好的荧光产率以及良好的水溶性。标记蛋白时通常不会产生蛋白沉淀。 与其他荧光素类衍生物一样，Fluorescein具有光淬灭率高，pH敏感性强与发射波谱宽的缺点。 主要应用于聚焦激光扫描微阵列（Confocal laser scanning microscopy）和流式细胞计应用（Flow cytometry）。 FITC 异硫氰酸荧光素，Fluorescein isothiocyanate，是荧光素衍生物的一种，5-FITC较6-FITC更经常使用。 FITC的异硫氰酸基能与氨基反应，可用于标记氨基修饰DNA，一旦形成，产物极为稳定。适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，Abs/Em=492/519nm（pH=）。与蛋白的结合力也强。 FITC具有荧光素衍生物的普遍特性。在水中易变坏，不能长久保存。 FITC-Oligo 广泛用于杂交探针；FITC-多肽用于Edman降解蛋白测序；FITC也经常被用于蛋白电泳检测（即使是毛细管电泳）和荧光能量激发转移测试。 FAM 羧基荧光素，Carboxyfluorescein，是荧光素衍生物的一种，5-FAM较6-FAM更经常使用。 Carboxyfluorescein-5-succimidyl ester，即5-FAM（NHS）广泛存在于荧光标记试剂盒。 与FITC相比，FAM与氨基反应更快，产物也更稳定，但FITC结合蛋白的量更大且进程更易于控制。 FAM也适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，Abs/Em=492/518nm（pH=），具有荧光素衍生物的普遍特性，在水中稳定。 5-FAM主要应用于DNA自动测序中，标记其中的d/ddCTP（PE公司），也经常用于PCR产物定量，核酸探针等。

流式细胞所用试剂配置及荧光特性

、流式细胞术常用试剂 1、10％NaN 3：将 10gNaN3 溶解于 100ml 蒸馏水中，室温保存；活体实验或在辣根过氧化 酶反应中可不使用 NaN 3。 2、 3％ BSA/PBS ： 100ml PBS 中加入 3g BSA ，使之溶解，再加入 0.2ml 10％的 NaN 3。 3、500mmol/L EDTA ：将 186g EDTA?Na 2?2H 2O 溶解于 400ml 蒸馏水中，用 NaOH 将 PH 调 至 8.0 ，补充蒸馏水至 500ml ，分装，高压灭菌，室温保存。 4g 多聚甲醛溶于100ml PBS ，加入数滴 NaOH ，在通 PH 至 7.4，使用前新鲜配制。 5、消化液： 0.25％胰蛋白酶（用培养液或 PBS 配制）或 0.25％胰蛋白酶与 0.02％ EDTA 的 混合液。 6、红细胞裂解液： NH 4CI 4.16g , KHCO 3 0.5g , EDTA?2Na 0.02g ，溶于 100ml 水中，调 PH 至 7.2，补充蒸馏水至 500ml ， 4 度储存，使用时需恢复至室温。 7、流式细胞抗体稀释剂： 0.1mmol/L PBS 液（PH 7.4）+ 1 % BSA + 0.1% Na 2N 3。 8、常用细胞破膜 剂： PBS 液（PH 7.4） + 1% FBS （或 BSA ） + 0.1% NaN 3+ 0.1% saponin （Sigma 的效果不错） 。 9、流式细胞染色洗涤液：含 2%的 BSA 、 0.1%NaN3 的 PBS （PH 7.4）。 10、PI 染液（保存液，10务用于细胞周期和凋亡检测）：10mg PI 溶于10ml PBS ,加入2mg 无DNA 酶的RNA 酶，4度保存备用。应用时，10倍稀释，每管加 0.3ml ?0.5ml PI 染液。 11、Hanks 液的配制（BSS ，主要用于培养液、稀释剂和细胞清洗液，不能单独作为细胞、 组织培养液） 原液 A NaCl 160g MgSO 4?7H 2O 2g KCl 8g MgCl?6H 2O 2g CaCl 2 2.8g 溶于 1000ml 双蒸水 原液 B 1） N a 2HPO 4?12H 2O 3.04g KH 2PO 4 1.2g 葡萄糖 20.0g 溶于 800ml 双蒸水 2） 0.4%酚红溶液：取酚红 0.4g 置玻璃研钵中，逐滴加入 0.1N NaOH 并研磨，直至完全溶 解，约加入 0.1N NaOH 10ml 。将溶解的酚红吸入 100ml 量瓶中，用双蒸水洗下研钵中残留 的酚红4、4％多聚甲醛：在磁力搅拌下，将 风柜中于 60 度加热，使其溶解，调整

常用染料的激发与发射

常用染料的激发与发射 Company Document number：WUUT-WUUY-WBBGB-BWYTT-1982GT

常用荧光染料的激发和发射波长

荧光染料的使用 吖啶橙：吖啶橙是最经典的灵敏的荧光染料，它可对细胞中的DNA和RNA同时染色而显示不同颜色的荧光，DNA呈绿色荧光，RNA呈橙红色荧光。EB:染色DNA和RNA 荧光素双醋酸酯(FDA)：FAD本身无荧光,无极性,可透过完整的原生质膜。一旦进入原生质体后,由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出入原生质膜，因此有活力的细胞能产生荧光,无活力的原生质体不能分解FAD无荧光产生。 5mgFDA溶于1ml丙酮中,避光4℃下贮存,使用时取贮存液加入L甘露醇中.使用时,使最终浓度为%。荧光染料Ho33342和若丹明123:活细胞双荧光染色观察细胞核和线粒体。一般的生物染料不能穿透细胞膜，只有当细胞被固定后改变了细胞膜的通透性，染料才

能进入细胞内。但有些活体染料能进入活细胞，并对细胞不产生毒性作用。荧光染料Ho33342和若丹明123都是活体染料。Ho33342能与细胞中DNA进行特异的结合，若丹明123能与线粒体进行特异的结合。采用两种荧光染料的混合染液可对一个活细胞的核和线粒体同时染色。 荧光组化实验中应注意的几个问题：1．每种荧光染料，均有自己的最适PH值，此时荧光最强。当pH改变时，不仅荧光强度减弱，而且波长将有所改变，因此荧光检测时要在一定的PH值的缓冲液中进行。2．一放荧光染色在20℃以下时荧光比较稳定，温度升高常出现温度猝灭。3．在荧光观察中，常因激发光的增强而使样品荧光很快衰竭，造成观察和照相困难。为此最好用能量小的长波长光进行观察，需照相时再适当增强激发光。4．一般荧光染液的浓度在万分之一以下，甚至亿万分之一，也能使标本着色。在一定的限度内，荧光强度可随荧光素的浓度增加而增强，但超过限度，荧光强度反而下降， 这是由于荧光分子间的缔合而使自身荧光猝灭所致。

常见荧光素

常见荧光素： （1）异硫氰酸荧光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC) ：FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。有两种异构体，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。 （2）四乙基罗丹明 (rhodamine, RB200) ：RB200为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存。最大吸收光波长为 570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈现橘红色荧光。 （3）四甲基异硫氰酸罗丹明 (tetramethyl rhodamine isothiocynate, TRITC)：TRITC为罗丹明的衍生物，呈紫红色粉末，较稳定。最大吸收光波长为 550nm，最大发射光波长为620nm，呈现橙红色荧光，与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。因其荧光淬灭慢，也可用于单独标记染色。（4）镧系：镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3）、铽（Tb3）、铈（Ce3）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3 应用最广。Eu3螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。 （5）藻红蛋白（P-phycoerythrin，PE）：PE是在红藻中所发现的一种可进行光合作用的自然荧光色素，分子量为240kD的蛋白，最大吸收峰为564 nm，当使用488 nm激光激发时其发射荧光峰值约为576 nm，对于单激光器的流式细胞仪来说，推荐使用585±21nm的带通滤光片，双激光器的流式细胞仪推荐使用575±13nm的带通滤光片。FL2探测器检测PE。 （6）多甲藻叶绿素蛋白（peridinin chlorophyll protein，PerCP）：PerCP 是在甲藻和薄甲藻的光学合成器中发现的，是一种蛋白复合物，分子量约为 35kD，最大激发波长的峰值在490nm附近，当被488nm氩离子激光激发后，发射光的峰值约为677nm。FL3探测器检测PerCP。 （7）碘化丙啶（ propidium iodide，PI）：可选择性地嵌入核酸（DNA、RNA）的双螺旋碱基对中。在对DNA染色时，需用RNase对细胞进行处理，以排除RNA

常用染料的激发与发射(20201127111621)

常用荧光染料的激发和发射波长

备注：发射波长的颜色及频率

荧光染料的使用 吖啶橙：吖啶橙是最经典的灵敏的荧光染料，它可对细胞中的DNA和RNA同时染色而显示不同颜色的荧光，DNA呈绿色荧光，RNA呈橙红色荧光。EB:染色DNA和RNA 荧光素双醋酸酯(FDA): FAD本身无荧光,无极性,可透过完整的原生质膜。一旦进入原生质体后，由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出入原生质膜，因此有活力的细胞能产生荧光，无活力的原生质体不能分解FAD无荧 光产生。5mgFDA溶于1ml丙酮中，避光4C下贮存，使用时取贮存液加入L甘露醇中. 使用时,使最终浓度为％荧光染料HO33342和若丹明123:活细胞双荧光染色观察细胞核和线粒体。一般的生物染料不能穿透细胞膜，只有当细胞被固定后改变了细胞膜的通透性，染料才能进入细胞内。但有些活体染料能进入活细胞，并对细胞不产生毒性作用。荧光染料HO33342和若丹明123都是活体染料。Ho33342能与细胞中DNA进行特异的结合，若丹明123能与线粒体进行特异的结合。采用两种荧光染料的混合染液可对一个活细胞的核和线粒体同时染色。 荧光组化实验中应注意的几个问题：1.每种荧光染料，均有自己的最适PH值，此 时荧光最强。当pH改变时，不仅荧光强度减弱，而且波长将有所改变，因此荧光检测时要在一定的PH值的缓冲液中进行。2. 一放荧光染色在20C以下时荧光比较稳定，温度升高

常出现温度猝灭。3．在荧光观察中，常因激发光的增强而使样品荧光很快衰竭，造成观察和照相困难。为此最好用能量小的长波长光进行观察，需照相时再适当增强激发光。4．一般荧光染液的浓度在万分之一以下，甚至亿万分之一，也能使标本着色。在一定的限度内，荧光强度可随荧光素的浓度增加而增强，但超过限度，荧光强度反而下降，这是由于荧光分子间的缔合而使自身荧光猝灭所致。

常见细胞核荧光染料

细胞核常用荧光染料有： 吖丫啶橙(Acridine Orange , AO )、溴化乙锭(Ethidium Bromide , EB )和碘化丙啶(Propidium Iodide , PI ) , DAPI 、Hoechst 染料、EthD III 、7-AAD 、RedDotl 、 2等等。 透膜的染料如下： AO :具有膜通透性，能透过细胞膜，将核 DNA 和RNA 分别染成绿色和红色，因此使细胞核呈绿色或黄绿色荧光。 EB : —种高度灵敏的荧光染色剂，在标准 302nm 处激发出橙红色信号。 DNA 的染色灵敏度要高于EB 和PI ，荧光强度比Hoechst 低，但光稳定性高于Hoechst Hoechst 染料：蓝色一类在显微观察中标记 DNA 的荧光染料，最常见的两种是 Hoechst33342和Hoechst33258。这两种染料都在紫外350nm 处被激发，在 461nm 处最大发射光附近发射青/蓝色荧光。与DAPI 相比，Hoechst33342加有乙基，具有更强的亲脂性，因此能更好的透过完整的细胞膜，并且细胞毒性更 小。 RedDot 1染料：红色，超强的细胞核选择性，其光谱相似于 Draq?5和Draq?7。RedDot?染料可被几种常见的激光激发并可在远红外区激发荧光。 RedDot? 的红色近红外荧光有效的与其他常用荧光探针区分开来。 不透膜的染料，如下: PI 作为红色荧光复染剂首选，PI 经常与Calcein-AM 或者FDA 等荧光探针合用，区分死/活细 EthD III 、7-AAD 、RedDot 2 :不能透过细胞膜，但能将坏死细胞区分开来；更适合凋亡坏死实验的检测; 细胞核荧光染料(PI DAPI Hoechst33342 ) 细胞核荧光染料PI 碘化丙啶(简称PI )是一种常用的细胞核荧光染色剂。它不能透过完整的细胞膜，但 PI 能透过凋亡中晚期的细胞和死细胞的膜 而将细胞核 染红，PI 在绿色光(540nm 波长)的激发下，会在600nm (红色光)处发出明亮的荧光，与细胞核中的DNA 结合的PI 发出的荧光，与未结合的PI 相比，强 度会增强 20-30 倍。40016Propidium iodide(PI)100mg40017Propidium iodide, 1.0mg/1mL solution in waterlOmL 碘化丙啶英文名： Propidium iodide, Propidium diiodide; PI 分子式：C27H34I2N4 分子量：668.39外观：红棕SF 末应用：DNA 染色染色原理： 碘化 丙啶(PI)是一种溴化乙啶的类似物，它在 嵌入双链DNA 后释放红色荧光。尽管PI 不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。 PI 经常被用来与 Calcein-AM 或者FDA 等荧光化合物一起使用，能同时对活细胞和死细胞染色。 光谱性质：PI-DNA 复合物的激发和发射波长分别为535nm 和615nm 。染色 过程：1.用PBS 或适当的缓冲液制备10?50小 的PI 溶液。a) 2.将1/10培养基体积的PI 溶液加入到细胞培养基中。b) 3 .在37 C 培养细胞10-20分 钟。4.用PBS 或合适的缓冲液洗涤细胞两次。 5.用535nm 激发波长，615nm 发射波长的滤光器的荧光显微镜观察细胞。 a)由于PI 可能具有致癌性， 请小心操作。b)也可以用1/10浓度的PI 缓冲液代替培养基。 保存条件：4C 避光保存 对人体有刺激性，请注意适当防护 DAPI 即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，是一种能够与DNA 中大部分A , T 碱基相互结合的荧光染料，常用与荧光显微镜观测。因为 DAPI :蓝色一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，其与 DNA 结合后可以产生比 DAPI 自身强20多倍的荧光，而与单链DNA 结合无荧光的增强。 DAPI 对双链 PI :不同通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。

荧光染料基础知识大全

荧光染料基础知识大全 益阳纺织染整团队今天 荧光显微镜技术的基本原理是借助荧光剂让细胞成分呈现高度具体的可视化效果，比如在目的蛋白后面连一个通用的荧光蛋白—GFP。在组织样本中，目的基因无法进行克隆，则需要用免疫荧光染色等其他技术手段来观察目的蛋白。为此，就需要利用抗体，这些抗体连接各种不同的荧光染料，直接或间接地与相应的靶结构相结合。此外，借助荧光染料，荧光显微镜技术不只局限于蛋白质，它还可以对核酸、聚糖等其他结构进行染色，即便钙离子等非生物物质也可以检测出来。 1免疫荧光 (IF) 在荧光显微镜技术中，可以通过两种方式观察到你的目的蛋白：利用内源荧光信号，即通过克隆手段，用遗传学方法将荧光蛋白与目的蛋白相连；或利用荧光标记的抗体特异性结合目的蛋白。 有些生物学问题采用第二种方法会更有用或更有必要。比如，组织学样品无法使用荧光蛋白，因为通常来说，标本都是从无法保存荧光蛋白的生物体中获取。此外，当有一个有功能的抗体可用时，免疫荧光法会比荧光蛋白技术快很多，因为后者必须先克隆目的基因再将DNA转染到适当的细胞中。 荧光蛋白的另一项劣势在于其本身属于蛋白质。因此，细胞内的这些荧光蛋白具有特定的蛋白质特性，其会导致附着的目的蛋白质发生功能紊乱或出现误释的情况。然而，荧光蛋白技术仍然是观察活细胞的首选方法。 免疫荧光法利用了抗体可以和相应抗原特异性结合的这个特性，对此它还有两种不同的表现形式。最简单的方式是使用可与目的蛋白相结合的荧光标记抗体。这种方法被称为“直接免疫荧光法”。 在很多情况下，我们可以利用两种不同特性的抗体。第一种抗体可以结合目的蛋白，但其本身并未进行荧光标记（一抗）。第二种抗体本身就携带荧光染料（二抗），并且可以特异性结合一抗。这种方法被称为“间接免疫荧光法”。 这种方法存在诸多优势。一方面，它会产生放大效应，因为不只一个二抗可以与一抗相结合。另一方面，没有必要始终用荧光染料标记目的蛋白的每个抗体，但可以使用市售荧光标记的二抗。免疫荧光中广泛使用的荧光染料包括FITC、TRITC 或一些Alexa Fluor?染料，下文均有提及。 2FITC 和TRITC 异硫氰酸荧光素(FITC) 是一种有机荧光染料，目前，这种荧光染料仍用于免疫荧光和流式细胞术中。在495/517 nm 处，该染料会产生激发/发射峰值，并可借助异硫氰酸盐反应基团与不同抗体结合，该基团可以和蛋白质上的氨基、巯基、咪唑、酪氨酰、羰基等基团相结合。 而它的基本成分——荧光素，其摩尔质量为332 g/mol，常被用作荧光示踪剂。FITC(389 g/mol) 是用于荧光显微镜技术的首批染料，且其被当成Alexa Fluor?488 等后续荧光染料的发端。该染料的荧光活性取决于它的大共轭芳香电子系统，而该系统受蓝色光谱中的光所激发。

常用荧光染料的激发和发射波长

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常用荧光染料的激发和发射波长Fluorescent Dye （荧 光染料）Excitation （激发波长， nm ） Emission （发射波长， nm ） Cy2 489 506 GFP(Red Shifted) 488 507 YO-PRO -1 491 509 YOYO -1 491 509 Calcein 494 517 FITC 494 518 FluorX 494 519 Alexa 488 490 520 Rhodamine 110 496 520 ABI,5-FAM 494 522 Oregon Green 500 503 522 Oregon Green 488 496 524 RlboGreen 500 525 Rhodamine Green 502 527 Rhodamine123 507 529 Magnesium Green 506 531

Calcium Green 506 533 TO-PRO -1 514 533 TOTO-1 514 533 ABI,JOE 520 548 BODIPY 530/550 530 550 Dil 549 565 BODIPY?R 542 568 BODIPY?558/568 558 568 BODIPY?564/570 564 570 Cy3 550 570 Alexa 546 555 570 TRITC 547 572 Magnesium Orange 550 575 Phycoerythrin,R & B 565 575 Rhodamine Phalloidin 550 575 Calcium Orange 549 576 Pyronin Y 555 580 Rhodamine B 罗丹明555 580 ABI,TAMRA 560 582 Rhodamine Red 570 590

二氯荧光素最大激发波长和最大发射波长的测定(1)

二氯荧光素最大激发波长和最大发射波长的测定 实验室地点：3411 实验时间安排 9.20（第5周星期二） 8:30—10:00 第3组 10:00—11:30 第4组 9.21（第5周星期三） 14:30—16:00 第5组 16:00—17:30 第6组 9.22（第5周星期四） 8:30—10:00 第7组 9.23（第5周星期五） 14:30—16:00 第1组 16:00—17:30 第2组 实验指导 一、实验目的 1．掌握二氯荧光素最大激发波长和最大发射波长的测量方法； 2．学会辩别荧光物质的分子荧光峰和拉曼散射峰； 3．熟悉岛津RF-5301（日立F-4500）荧光分光光度计的定性扫描方法及定性测量软件数据处理操作。 二、实验原理 任何荧光物质都具有激发光谱和发射光谱。由于斯托克斯位移，荧光发射波长总是大于激发波长。 在一定光源强度下，若保持激发波长ex λ不变，扫描得到的荧光强度与发射波长em λ的关系曲线，称为荧光发射光谱，它表示在所发射的荧光中各种波长组分的相对强度；反之，保持em λ不变，扫描得到的荧光强度与ex λ的关系曲线，则

称为荧光激发光谱，它可以反映不同波长激发光引起荧光的相对效率。由于各种不同的荧光物质有它们各自特定的荧光发射波长值，所以，可用它来鉴别各种荧光物质。在一定条件下，荧光强度与物质浓度成正比，这是荧光定量分析的基础。荧光分析的灵敏度不仅与溶液的浓度有关，而且与紫外光照射强度及所选测量波长等因素有关。 同一荧光物质的分子荧光发射光谱曲线的波长范围（和最大发射波长）不因它的激发波长值的改变而位移，由于这一荧光特性，如果固定荧光发射波长（λem），然后改变激发波长（λex），并以荧光强度F对激发光波长λex绘图即获得激发光谱曲线，从中能确定最大激发波长（λex）。反之，固定激发波长值，测定不同发射波长时的荧光强度，即得荧光发射光谱曲线和最大荧光发射波长值。 三、仪器和试剂 1、仪器荧光分光光度计（岛津RF-5301，日立F-4500）。它的主要技术指标如下：测量波长范围：220-900 nm，（200-900 nm）、光源：脉冲氙灯、测量模式：激发光谱，发射光谱，波长同步光谱，测量方式：定性、定量、三维扫描、荧光动力学 四面通石英比色皿一个（10mm x 10mm）、25 mL具塞比色管、移液管、吸耳球、洗瓶、吸水纸 2、试剂 (1) 二氯荧光素标准溶液 a 储备标准液(25mg/mL): 称取0.0125g 二氯荧光素（A.R），用0.01mol·L－1 NaOH溶液溶解后移入500mL容量瓶中并用0.10 mol·L－1 NaOH稀释至刻度。 b 工作标准液(0.10 mg/mL):取上述储备溶液10.00mL于一500mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度摇匀，配制成0.50mg/mL溶液。再移取0.50mg/mL溶液10.00mL于一50mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度摇匀。 （2）1.0mol·L－1 NaOH

主要荧光素一览表教学内容

主要荧光素一览表

（1）荧光素类 Fluorescein 标准荧光素（Reference standard）之一,在其基础上进行结构改造,可产生一系列荧光素衍生物。 Fluorescein适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，有相对高的荧光吸收，较好的荧光产率以及良好的水溶性。标记蛋白时通常不会产生蛋白沉淀。 与其他荧光素类衍生物一样，Fluorescein具有光淬灭率高，pH敏感性强与发射波谱宽的缺点。 主要应用于聚焦激光扫描微阵列（Confocal laser scanning microscopy）和流式细胞计应用（Flow cytometry）。 FITC 异硫氰酸荧光素，Fluorescein isothiocyanate，是荧光素衍生物的一种，5-FITC较6-FITC更经常使用。 FITC的异硫氰酸基能与氨基反应，可用于标记氨基修饰DNA，一旦形成，产物极为稳定。适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，Abs/Em=492/519nm（pH=9.0）。与蛋白的结合力也强。 FITC具有荧光素衍生物的普遍特性。在水中易变坏，不能长久保存。 FITC-Oligo 广泛用于杂交探针；FITC-多肽用于Edman降解蛋白测序；FITC也经常被用于蛋白电泳 检测（即使是毛细管电泳）和荧光能量激发转移测试。 FAM 羧基荧光素，Carboxyfluorescein，是荧光素衍生物的一种，5-FAM较6-FAM更经常使用。 Carboxyfluorescein-5-succimidyl ester，即5-FAM（NHS）广泛存在于荧光标记试剂盒。 与FITC相比，FAM与氨基反应更快，产物也更稳定，但FITC结合蛋白的量更大且进程更易于控制。 FAM也适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，Abs/Em=492/518nm（pH=9.0），具有荧光素衍生物的普遍特性，在水中稳定。

常见细胞核荧光染料

细胞核常用荧光染料有： 吖啶橙（Acridine Orange，AO）、溴化乙锭（Ethidium Bromide，EB）和碘化丙啶（Propidium Iodide，PI），DAPI、Hoechst染料、EthD III、7-AAD、RedDot1、2 等等。 透膜的染料如下： AO：具有膜通透性，能透过细胞膜，将核DNA和RNA分别染成绿色和红色，因此使细胞核呈绿色或黄绿色荧光。 EB：一种高度灵敏的荧光染色剂，在标准302nm处激发出橙红色信号。 DAPI：蓝色一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，其与DNA结合后可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光，而与单链DNA结合无荧光的增强。DAPI对双链DNA的染色灵敏度要高于EB和PI，荧光强度比Hoechst低，但光稳定性高于Hoechst。 Hoechst染料：蓝色一类在显微观察中标记DNA的荧光染料，最常见的两种是Hoechst33342和Hoechst33258。这两种染料都在紫外350nm处被激发，在461nm处最大发射光附近发射青/蓝色荧光。与DAPI相比，Hoechst33342加有乙基，具有更强的亲脂性，因此能更好的透过完整的细胞膜，并且细胞毒性更小。 RedDot 1染料：红色，超强的细胞核选择性，其光谱相似于Draq?5 和Draq?7。RedDot?染料可被几种常见的激光激发并可在远红外区激发荧光。RedDot? 的红色近红外荧光有效的与其他常用荧光探针区分开来。 不透膜的染料，如下： PI：不同通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。PI作为红色荧光复染剂首选，PI经常与Calcein-AM或者FDA等荧光探针合用，区分死/活细胞。 EthD III、7-AAD、RedDot 2：不能透过细胞膜，但能将坏死细胞区分开来；更适合凋亡坏死实验的检测； 细胞核荧光染料（PI DAPI Hoechst33342） 细胞核荧光染料PI碘化丙啶（简称PI）是一种常用的细胞核荧光染色剂。它不能透过完整的细胞膜，但PI能透过凋亡中晚期的细胞和死细胞的膜而将细胞核染红，PI在绿色光（540nm波长）的激发下，会在600nm（红色光）处发出明亮的荧光，与细胞核中的DNA结合的PI发出的荧光，与未结合的PI相比，强度会增强20-30倍。40016Propidium iodide(PI)100mg40017Propidium iodide, 1.0mg/1mL solution in water10mL 碘化丙啶英文名：Propidium iodide, Propidium diiodide; PI 分子式：C27H34I2N4 分子量：668.39 外观：红棕SF末应用：DNA染色染色原理：碘化丙啶(PI)是一种溴化乙啶的类似物，它在嵌入双链DNA后释放红色荧光。尽管PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。PI经常被用来与Calcein-AM或者FDA等荧光化合物一起使用，能同时对活细胞和死细胞染色。光谱性质：PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为535nm和615nm。染色过程：1．用PBS或适当的缓冲液制备10～50μM的PI溶液。a) 2．将1/10培养基体积的PI溶液加入到细胞培养基中。b) 3．在37℃培养细胞10-20分钟。4．用PBS或合适的缓冲液洗涤细胞两次。5．用535nm激发波长，615nm发射波长的滤光器的荧光显微镜观察细胞。a) 由于PI可能具有致癌性，请小心操作。b) 也可以用1/10浓度的PI缓冲液代替培养基。保存条件：4℃避光保存对人体有刺激性，请注意适当防护