原代肝细胞分离方法

原代肝细胞分离方法

体外培养肝细胞的关键是如何分离得到形态完整、体外代谢活性高的肝细胞. 自1953年Anderson[2]首创剪切法从肝脏分离肝细胞以来, 各实验室对肝细胞的分离方法进行了不断改进. 在众多方法中, 主要分为非灌流的方法和灌流的方法.

1.1 采用非灌流的方法

早期的研究一般通过非灌流这种简单的步骤分离肝细胞.

1.1.1 机械分离法:

机械分离法是利用机械剪切及强力吹打等物理手段来分离肝细胞的方法[3]. 张顶et al[4]在分离树鼩肝细胞的过程中, 首先将树鼩的肝脏剪成小块, 然后通过挤压、剪碎和震荡等机械手段, 使肝细胞从肝组织上脱落, 从而获得互相分离的肝细胞.

1.1.2 胰酶消化法:

胰酶消化法是利用胰酶来破坏肝细胞之间的桥连, 使肝细胞分离的一种方法.

Dulbecco et al[5]首次采用胰酶来分离猴肾细胞、大鼠肝细胞, 并运用到体外细胞的研究和培养中. 刘友平et al[6]利用该方法分离肝细胞时, 首先取出小鼠的肝组织用眼科剪剪碎至糊状, 然后用缓冲液充分清洗并加入胰酶进行消化. 待消化完全后用D-Hank's液清洗, 最后加入含有血清的培养液终止胰酶的作用, 得到消化彻底的细胞悬液.

1.1.3 胶原酶消化法:

胶原酶消化法是利用胶原酶来破坏细胞间的纤维成分, 使肝细胞分离的一种方法. 王

琳et al[7]在利用该方法分离新生小鼠肝细胞时, 首先将新生小鼠的肝脏剪成1 mm3组织块, 用无钙无镁的D-Hank's液反复冲洗后加入胶原酶进行消化. 最后用DMEM液终止胶原酶的作用, 得到肝细胞悬液.

1.2 采用灌流的方法

虽然非灌流的方法以其简单易行的特点得到了一定的应用, 但由于存在消化不完全、分离得到的肝细胞中多细胞团块存在的问题, 不能满足许多基础研究或临床应用的要求. 1969年, Berry和Friend[8]引入了肝脏灌流法, 灌流可以使消化液与肝组织更加充分地接触, 不仅提高了分离效率, 还使分离所得肝细胞的活力和数量大大提高.

1.2.1 离体胶原酶灌流法:

离体胶原酶灌流法是将离体灌注与胶原酶消化相结合的方法. 在使用该方法分离肝细胞时, 首先将动物肝脏取出, 于门静脉内置管或直接在获得的肝组织块的血管或切口内置管, 用预热的无钙无镁的D-Hank's液灌流. 然后换用胶原酶作持续灌流, 使肝细胞与间质分离. 最后用培养液终止胶原酶的消化作用, 过滤、离心、弃上清后得到肝细胞悬液.

1.2.2 Seglen两步灌流法（原位胶原酶灌注法）:

自从引入灌流法分离肝细胞以来, 许多学者根据不同的应用条件对灌流法进行了改良. 其中Seglen[10]经过一系列细致的研究, 创立了改良的Seglen两步灌流法, 这一方法已成为应用至今的标准的原代肝细胞分离方法. 两步灌流法主要是通过门静脉先后用含EDTA或EGTA缓冲液和胶原酶缓冲液进行灌注来分离肝细胞的方法. 许多学者在具体操作中, 不断改进两步灌流法的灌注条件, 目的在于进一步减少分离过程中肝细胞的损伤, 提高肝细胞的活率.

1.2.3 半原位胶原酶灌流法:

半原位胶原酶灌流法是我国学者彭齐容 et al[13]以Seglen法为基础建立的肝细胞分离技术. 俞红et al[14]在采用该方法分离乳猪肝细胞时, 首先用无钙无镁的D-Hank's液于门静脉进行原位灌注. 接着, 除保留门静脉以外, 离断肝脏血管并将肝脏移入无菌平皿中, 继续用胶原酶进行灌注使肝细胞与间质细胞分离. 最后钝性撕裂组织, 过滤洗涤后得到制备好的细胞悬液.

1.2.4 下腔静脉插管的逆向胶原酶灌注法:

下腔静脉插管的逆向胶原酶灌注法是在肝下腔静脉插管, 并结合逆向胶原酶灌注来分离肝细胞的方法[9]. 在采用该方法分离肝细胞时, 首先将灌注针逆向插入下腔静脉后固定, 门静脉开放做流出道. 接着用含EGTA或EDTA的灌注液进行灌注, 一段时间后再用含有Ca2+的胶原酶进行充分灌注. 灌流结束后, 将细胞过滤、清洗后得到制备好的肝细胞悬液.

1.2.5 Gerlach五步胶原酶灌流法:

在使用两步灌流法分离大的肝组织块时, 仍存在消化不完全的问题. 而Gerlach et al[15]在两步灌流法的基础上, 创立了联合门静脉和肝动脉的五步胶原酶灌流技术, 建立了一种高效的细胞分离方法

原代细胞培养：原代肝细胞

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体外正常成人肝细胞分离培养的经验

?经验交流? 体外正常成人肝细胞分离培养的经验Ξ 马巧玉,郝　飞,王宇明,宋志强,刘国栋 (第三军医大学西南医院全军感染病中心,重庆400038) 摘　要:目的　为进一步研究病毒性肝炎免疫发病机制、临床治疗和疫苗研制提供最接近自然状态的理想细胞模型。方法　体外二步灌流法分离正常成人肝细胞并用1640培养液维持培养1个月以上。结果　分离较多量正常成人肝细胞可在体外存活1个月以上。结论　正常成人肝细胞可在体外被分离培养以供各种肝病基础和临床研究。 关键词:正常成人肝细胞;细胞模型 中图分类号:R44611文献标识码:B文章编号:167128348(2003)0921228202 各种肝脏疾病(特别是病毒性肝炎、原发性肝癌)在我国发病率高,无可靠治疗方法。因此,迫切需要在肝脏疾病的发病机制及治疗方面有所突破。近年来,国内外有许多关于用动物肝细胞、胎儿肝细胞及肿瘤细胞进行肝脏疾病研究的报道,但这些细胞与自然状态的成人肝细胞存在较大差别。我们在体外分离培养正常成人肝细胞,以期建立与自然状态最为接近、更适宜于进行肝脏疾病的发病机制和防治等研究的细胞模型。1　材料与方法 111　正常成人肝组织标本,共10例,其中取自意外死亡之3例成年男性(19、24、35岁),1例成年女性(27岁)肝脏;4例成年男性(42、47、55、62岁)胆囊结石或胆囊炎手术时肝脏活检标本;均无肝病史,临床生化和病理检查无异常发现;另有1例成年男性(36岁)肝脏血管瘤标本;2例成年男性(53、58岁)肝癌癌旁组织标本,各种肝炎病毒及AIDS标志物检测均阴性。112　小牛血清　由本校试剂中心提供,用前56℃×30min灭活补体。 113　主要试剂　(1)PRMI21640细胞培养基:购自美国GIB2 CO公司;(2)胶原酶、胰蛋白酶抑制剂:由美国SIGMA公司提供;(3)分散酶:购自德国宝灵曼公司。 114　实验方法 11411　正常成人肝细胞分离　采用体外灌流法分离正常成人肝细胞[1、2]。取上述成年人肝脏2～100g,将肝组织置于培养皿中,用37℃前灌流液自残存血管中反复灌注,至大部分肝脏呈现灰白色,用37℃,0105%的胶原酶(含011分散酶)反复注入残存血管,剪碎肝组织,37℃振荡,消化30min,三层无菌沙布过滤,450r/min×4min离心,弃上清,加入PRMI21640培养液混匀,450r/min×4min离心,弃上清,反复3次,最后用含10%小牛血清1640培养液(完全培养液)按细胞密度1×106ml 稀释后接种至25ml培养瓶和加爬片的24孔培养板,置于37℃,5%CO2培养箱孵育。 11412　正常成人肝细胞培养　24h后换液,弃去含漂浮细胞的培养液,按上述比例,加入PRMI21640培养液,此后每2～3d 更换完全培养液1次,维持培养1个月以上。于培养第10、20、30天分别计数肝细胞数,台盼蓝染色确定肝细胞存活率。2　结 果 211　细胞分离　由于肝组织为非全小叶标本,前灌液和胶原酶灌注仅可到达部分肝组织,分离效果较差,加入分散酶后可提高分离效率,分离后用台盼蓝染色显示肝细胞存活率约50%～90%。 212　细胞培养　4例胆囊手术后肝组织分离显示肝细胞少,台盼蓝染色显示肝细胞存活率60%,贴壁差(<50%),碎片多,分离培养1周内均放弃;肝血管瘤标本RBC多,肝细胞相对较少,贴壁差,分离后次日放弃;2例肝癌癌旁组织标本分离肝细胞较多,台盼蓝染色肝细胞存活率仅50%,生长差,贴壁少,细胞碎片迅速增多,于分离后3～4d放弃。4例意外死亡捐献的肝组织标本,分离细胞后用台盼蓝染色,肝细胞存活率约90%.24h后约70%～80%细胞贴壁,贴壁细胞前呈圆形,后呈多角形,单核,生长良好,加感染血清组与对照组细胞形态无明显差异。于培养第10、20、30天分别计数肝细胞数台盼蓝染色判断肝细胞存活率,结果见表1。 表1 正常成人肝细胞培养的计数、活力鉴定d肝细胞计数肝细胞存活率 10 6.79±0.21×105/ml>90% 20 5.56±0.24×105/ml>60% 30 4.47±0.32×105/ml>60% 3　讨 论 目前,在肝脏疾病特别是病毒性肝炎的研究中,用动物肝细胞、肿瘤细胞、人胎肝细胞等作为细胞模型最常见,但这些细胞模型与自然感染状态下的成人肝细胞是否有相似的感染方式、途径及生物学特性尚无定论。因此,我们建立了正常成人肝细胞分离培养的细胞模型,以期在最接近自然感染状况的情况下进一步研究肝疾病的发病机制、病理改变、临床治疗及疫苗效果。 目前分离肝细胞多采用二步灌流法。因为我们所取用肝组织为非全小叶标本,灌注时,灌注液不能到达部分肝组织,加之用胶原酶分离正常成人肝细胞效率较分离胎肝细胞、动物肝细胞低,手术中取活检肝组织标本小,分离肝细胞少,难以生长,肝血管瘤组织RBC太多,灌注时不易去除;肝癌癌旁组织均有慢性炎症,纤维化明显,分离培养有较大困难,但意外死亡捐献之肝细胞标本较大,献者年轻,肝脏纤维化程度低,均分离 Ξ基金项目:国家自然科学基金资助项目(39770682)

原代小鼠肝细胞制备

细胞培养室肝细胞原代培养标准操作规程 实验试剂 培养基：William’s E Medium(GiBCO 12551-032), 谷氨酰胺(GiBco 21051-024-100g)292mg/L，双抗（GiBco 15140-122 penicillin +10,000Units/mL, streptomycin +10,000μg /mL）5mL/500mL, 胰岛素(GiBCO 12585-014 4 mg/mL)8μg/mL, 地塞米松（中国药品生物制品检定所）5mg/L。 D-Hanks’液（CaCl2 0.55g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06g/L, Na2HPO4?7H2O 0.06g/L, NaHCO3 0.35g/L, 三蒸水溶解，NaHCO3调pH 7.2-7.4, 4℃保存） 0.05%胶原酶Ⅳ溶液(（Sigma C5138-1G） D-Hanks’液溶解, 0.22μm微孔滤膜过滤除菌, -20℃ 保存）) PBS预灌流溶液（NaCl 8.0g/L, KCl 0.2g/L, KH2PO40.2g/L, Na2HPO4?7H2O 1.56g/L, EDTA 0.1mM, 三蒸水溶解, NaHCO3调pH 7.2-7.4, 0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存） 鼠尾胶原（GiBCO A10483-01 20mL/ 瓶）（0.05 mg/ mL）用0.02M 的醋酸稀释,临用现配） 0.02M 的醋酸：115μL的醋酸(大于99%)用水稀释至100mL 0.05 mg/ mL-200μL鼠尾胶原（5 mg/ mL）用0.02M的醋酸稀释至20 mL Overlay(0.25 mg/ mL的Matrigel（BD 356237）(用William’s E Medium稀释，视具体批号而定稀释倍数，临用现配） Hanks’液（CaCl2 0.14g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06g/L, MgCl2?6H2O 0.10g/L, MgSO4.7H2O 0.10g/L, Na2HPO4?7H2O 0.09g/L, NaHCO3 0.35g/L, D-葡萄糖 1.0 g/L，三蒸水溶解，NaHCO3调pH 7.2附近，4℃保存） 实验仪器 CO2 恒温培养箱（日本SANYO 公司）； Sigma高速离心机； IX-51 型荧光倒置显微镜（日本尼康公司）； DHL-A电脑恒流泵（上海青浦沪西仪器厂）； 液相-质谱联用分析系统（LC/MS/MS）由美国Thermo系列四元泵、在线脱气机、自动进样器、以及Thermo Finnigan LTQ线性离子阱质谱检测器，系统工作软件为XcaLibur（美国）； Sigma5310离心机； ZHWY-103B多振幅轨道式恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）。 实验方法 实验准备

造血干细胞分离培养方法

一造血干细胞分离 （一）小鼠骨髓采集与单个核细胞悬液的制备 1 HES(羟乙基淀粉)沉淀法 抽取髓液500 m L按4∶1比例加入HES，自然沉降红细胞后，分离上清。4℃400 g离心10 min得细胞沉淀物，以1 %白蛋白盐水液洗涤细胞2次。 2 percoll液密度梯度离心法 ①按体积比为(1.5～2)∶1在骨髓液中加入淋巴细胞分离液。4℃,1 5 00 r / min，离心20 min。取单个核细胞层，以1%白蛋白盐水液洗涤3次。 ②取鼠股骨和胫骨, 在两头关节处切开骨骼, 反复用培养基冲洗骨髓腔, 随后小心地逐滴将细胞悬液加在淋巴细胞分离液上, 2 000 r / min 离心20 min。吸取离心后相交液面处的白色细胞层即为单个核细胞。 3 Ficoll分离法 方法一在15ml分离管中加7.5ml比重为1.017的Ficoll液，缓慢移入等量骨髓细胞悬液，整体平衡后低温离心2000r/min×20min,吸取白细胞层，用RPMI1640液亲清洗后离心2000r/min×10min,取白细胞层加RPMI1640液到10ml制成造血干细胞悬液样本。 方法二取无菌离心管1支，预先添加3mlFicoll(与骨髓细胞悬液体积1:1)，用滴管取单细胞悬液3ml，沿离心管壁小心缓慢叠加于分离液面上，注意保持清楚的界面，室温下水平离心2000rpm×20分钟，（后续在冰上进行）用毛细吸管插到云雾层，小心吸取单个核细胞，置入另一短中管中，加入5倍以上体积的磷酸缓冲液PBS，1500rpm×10分钟，L-DMEM 洗涤细胞两次，每次以1000r/min离心10min，去上清液。（除第一步的室温离心外，其余为低温离心）。 取骨髓细胞悬液的方法是：取出大鼠腿骨将肌肉尽可能剔除，并用PBS缓冲液冲洗干净。在超净台中腿骨浸泡在PBS缓冲液中5min，之后在两头关节处切开骨骼, 反复用PBS 缓冲液冲洗骨髓腔，从而得到骨髓细胞悬液。 （二）Linc-- kit+造血干细胞的分离纯化。 去除Lin+细胞( 负筛选) : 带有生物素的混合抗体标记成熟细胞; 抗生物素的磁珠吸附抗体标记的成熟细胞, 包括T , B淋巴细胞、粒细胞、巨噬细胞以及它们的定向前体细胞; 细胞通过磁场不被柱子吸附的包括造血干细胞和骨髓间质干细胞。收集CD117+细胞( 正筛选)：带有CD117抗体的磁珠吸附CD117+细胞, 细胞通过磁场被柱子吸附的CD117+细胞(具体操作步骤参照M iltenyi公司MACS手册)。 （三）根据细胞表面CD34+抗原进行分离纯化 流式细胞仪检测骨髓CD34+细胞：取50μL细胞悬液, 加入2.5μL CD45- FITC和10μL CD34- PE充分混合, 避光孵育15 min。以PBS液洗涤并加多聚甲醛固定液450μL固定, 上机检测。

原代肝细胞培养

原代肝细胞培养 原代肝细胞培养 1．实验材料 灌流液：NaCl、KCl、NaH2PO4.2H2O、Na2HPO4.H2O、NaHCO3、HEPES、EDTA、Glucose （国药或阿拉丁）。 消化液：Collagenase IV（Yeasen，翊圣生物，产品货号：40510ES60，100 mg ，279￥）、CaCl2。 Percoll：Percoll（GE Healthcare，17-0891-02）我买的是分装的100ml，450￥的17-0891-01-1。麻醉剂：10%水合氯醛。 实验器材：200目细胞筛、20ml 注射器、头皮针、手术剪3把、手术镊3把（实验前灭菌），细胞培养皿2个，离心机，实验前备冰盒及水浴锅，鼠板及大头针（实验前酒精及紫外消毒）。 2. 实验前准备 1) 灌流液 Perfusion Solution NaCl KCl NaH2PO4.2H2O Na2HPO4.H2O NaHCO3 HEPES EDTA Glucose 离子）。用前37℃温育。 每只老鼠消耗15ml灌流液。 2）消化液 100× CaCl2：560mg CaCl2，加入10 ml PBS/ ddH2O，分装-20℃保存。10× CollagenaseIV：100 mgCollagenaseIV粉末溶于20 mlDMEM（无血清），0.22 uM滤膜过滤除菌，每管1.5ml分装。 消化液：13.5 mlDMEM（无血清）加入150 μl100× CaCl2（终浓度5 mM），再加入1.5 ml10× CollagenaseIV（终浓度0.5 mg/ml），于37℃温育。 每只老鼠消耗15ml消化液。 3）40%Percoll g/L 8.0 0.4 0.078 0.151 0.35 2.380 0.19 0.9 调节pH 7.2-7.4，配好后过滤除菌。（不能高压灭菌，其中含葡萄糖及HCO3- 16.2 ml 100%percoll原液，加入1.8 ml10×PBS，再加入27ml 1×PBS，得45 ml。（等渗溶液） 每只老鼠消耗5-6 ml40%Percoll。

临床级干细胞分离培养

临床级干细胞分离培养等产业化关键技术研发 一、项目背景和意义： 作为生物技术最新的研究领域，干细胞的发现和干细胞技术的发展为人类疾病的治疗提供了独特的视角、方法和手段，为人类疾病治疗提供了新的希望和曙光，必将引起一场医学的革命。干细胞的重要性奠定了其在医药卫生、科技产业和国防等领域内的重要地位，因此干细胞的研究开发和应用是人类的健康工程，预期在未来几年内会有更大的飞跃。尤其是近年来，干细胞研究的进程和产业化速度大大加快。干细胞的产业化是指依托于干细胞采集、储存、研发、移植、治疗等产品或服务以满足人类各种治疗和应用目的的行业种类的总称，干细胞产业已成为一个生机无限的经济增长点，蕴含着巨大的利润空间，是21世纪最有前景的朝阳产业。 临床级干细胞的分离与扩增是干细胞产业化过程中的重要环节。什么样的干细胞能从体外培养进入临床疾病治疗？这就需要建立一个临床级干细胞的标准，它可以极大促进干细胞临床疾病治疗的研究和发展。目前干细胞治疗研究中开展最广泛的两类细胞是造血干细胞和间充质干细胞。对于造血干细胞，目前全世界已经建立了很多脐带血库来保存造血干细胞，并已得到广泛的应用。而间充质干细胞的建库和临床应用才刚刚起步，目前已初步应用于治疗血液病（与造血干细胞共移植）、心脏病、脊髓损伤和多种自身免疫性疾病等，并取得了一定进展。在间充质干细胞治疗同种异基因造血干细胞移植后发生

的GVHD方面，美国Osiris公司已完成了III期临床试验。间充质干细胞具有广泛的应用前景，但是，迄今为止仍没有一个国际公认的能够用于分离和鉴定间充质干细胞的表面标志，这造成了制剂细胞成分不均匀、质量难以控制等困难。 因此，开发特异性分离间充质干细胞的新方法是进一步推动间充质干细胞临床应用的必然趋势。按照临床应用的标准开发骨髓、脂肪、脐带等间充质干细胞的特异性分离纯化工艺，建立临床用间充质干细胞的制备工艺技术标准程序对于间充质干细胞的未来应用具有重大的推动作用。 二、项目目标 1. 总体目标： 建立临床级干细胞标准、开发临床级干细胞分离与培养工艺以及建立临床用间充质干细胞的制备工艺技术标准程序等。 2.具体技术指标： 建立1项成体干细胞的临床级分离纯化的关键技术、标准化操作程序和质控标准，实现间充质干细胞治疗产品生产的标准化、规模化运行，质量达到临床应用标准。 三、主要研究内容： 针对干细胞临床应用中所面临的分离、培养、扩增等关键问题，重点确定与国际接轨的临床级干细胞的标准，建立多种临床级干细胞的分离纯化和培养新技术，为实现干细胞产业化奠定基础。

原代肝细胞

原代肝细胞分离培养与方法 肝细胞的分离和培养是体外组合性生物人工肝研究的基础，但单纯机械分离法对肝细胞损伤较大，分离后的肝细胞体外培养的难度亦较大，方法复杂，成本较高 体外培养肝细胞的关键是如何分离得到形态完整、体外代谢活性高的肝细胞. 1 非酶分离细胞法 1．1 直接分离法：麻醉或处死动物后，取出肝脏，剪成小块，通过机械方法(挤压、剪碎、震荡、吹打)得到单个细胞，多与 EDTA螯合法、灌注法相结合，即先用 EDTA溶液进行充分的灌流，再剪成组织小块，然后用各种机械的方法分离得到肝细胞。该方法操作简单、流程短，不需要复杂仪器和昂贵的胶原酶。但实验操作对细胞的损伤大，尤其是造成细胞表面蛋白不可逆的机械性损伤，导致细胞的获得率和存活率较低。 1．2 组织块培养法：用麻醉剂 (乙醚、戊巴比妥纳等 )将动物麻醉或直接断头处死，取出肝脏，用缓冲液充分洗涤后，剥离肝被膜，将其剪成 1 mm。的组织小块，充分洗涤后，以 0．5 cm的间隔接种于培养器皿中(25 m L的培养瓶中可接种 3O块 )，先加入少量的培养基，静置培养 12～ 24 h后再加入足量的培养基。该操作过程短，污染少，损伤小，细胞成活率很高而成本低。但纯度不高，且形成典型上皮细胞层所需时间较长，在细胞爬出后还需剔除组织块，易造成二次污染。可能是因为成年动物的结缔组织比新生动物的结缔组织致密，肝细胞难以迁出，故此法多用于 1～ 6 d的新生动物或动物胚胎。 2．离体肝脏酶消化分离法 2．1 胰蛋白酶、胶原酶消化法：麻醉或处死动物后，取出肝脏，用缓冲液充分洗涤后，剥离肝被膜，将其剪成 1 mm。的组织小块，充分洗涤后，在 37℃下用胰酶或 (和)胶原酶消化，待消化物成蓬松的絮状物后加入培养基终止消化，吹打均匀后经 200目不锈钢网筛过滤后，离心、重悬即可获得肝细胞。胶原酶只消化细胞间质而对肝细胞机械性损伤较小，也能较完整地保存膜蛋白¨7]，分离效果好。肝细胞产率高、损伤小，且保持特异性功能的时间长。但胶原酶价格比较昂贵，成本高。胰蛋白酶既消化细胞问质又消化细胞本身，操作简单，价格便宜，但胰酶消化的条件极难把握而使该法未被广泛应用 L8．9_。 2．2 胰蛋白酶、胶原酶消化的组织块法：处死小鼠，无菌分离肝脏，置 D-Hanks液中，冲洗肝脏至灰白色，将肝脏剪成 1 mm。的组织块，在 37℃下用胰酶或(和)胶原酶消化后，加人培养基终止消化，自然沉降后，取下层组织块，再用培养基洗涤数次即可将肝组织块贴壁于培养瓶中，每个培养瓶放组织块 30~35块，加少许培养基。该法分离效果、纯度较单纯的组织块法好，且细胞从组织块爬出时间相对短。但消化酶的用量和时间不易控制：消化过度，形成的絮状组织块不能分离；消化不充分，酶没有发挥其作用[10~12]。 2．3 在体肝脏酶灌注法 2．3．1 Seglen灌注法：即经典的二步胶原酶灌注法。两步灌注即经门静脉以无钙缓冲液和胶原酶恒流、恒温灌注，这是目前国际上公认的方法。首先用不含 Ca 的离子螯合剂(EDTA等)移走肝组织中的 Ca ，从而打破固定细胞的细胞桥粒样结构；再用胶原酶进行蛋白分解

肝细胞原代培养实验方案

原代培养肝细胞就是肝细胞移植、生物人工肝得最佳生物材料。长期以来, 国内外众多学者对肝细胞分离方法、培养条件进行了大量得研究 , 但要获得高活率、功能好得肝细胞,至今仍非易事。早期主要用非酶法分离肝细胞,包括机械法( 如匀浆法) 及螯合法、机械法对肝细胞损伤大, 细胞活率低; 螯合法就是用可结合 Ca2＋、M g２＋得螯合剂(如枸橼酸盐或ＥDＴＡ) 分离肝细胞,但螯合剂单独使用效果不好 ,常需与酶法结合使用。后期逐渐改为酶消化法分离肝细胞 ,包括胶原酶消化法、胰蛋白酶消化法。后者对酶浓度及作用时间要求十分严格, 且由于胰蛋白酶就是一种强蛋白质消化酶, 对肝细胞膜破坏严重 , 因而易造成肝细胞死亡 , 导致分离失败。胶原酶消化法对肝细胞损伤较小, 虽然肝细胞膜在消化过程中也会受到损害, 但经培养后可完全修复。胶原酶在消化肝得同时解除了细胞间接触抑制或活化了潜在得蛋白激酶、生长因子或受体, 使肝细胞能逐渐适应消化分离过程中所发生得细胞内、外环境及细胞间得各种改变。这些改变对离体肝细胞修复、生长及其功能有重要得促进作用,有利于肝细胞得培养。这种适应性改变恰恰就是机械分离法所没有得。因此 ,要获取理想得肝细胞,酶消化这一重要环节不可缺少。 Seglｅｎ二步灌注法为经典得胶原酶消化法,但所需设备较复杂,胶原酶消耗量大。本研究在其基础上略加改进、作者认为 ,采用胶原酶消化法 ,胶原酶得用量、作用时间及作用条件就是分离成功与否得关键。胶原酶得浓度过高 ,作用时间难以控制; 浓度过低 ,

则作用时间过长、细胞活率降低、事先用无Ｃa2 +、M g2+得灌注液进行预灌注, 去除 Cａ2+依赖性粘附因子,使桥粒断裂; 然后用含 Ca2+得胶原酶消化 ,胶原酶得作用需要 Ca2＋得活化 , 在 5 mmoｌ/ＬCa２+浓度下 ,用浓度为 5０0 mg/ L 得胶原酶 37 ℃条件下消化１5 mｉn 最佳。在进行肝细胞洗涤、离心、重悬等纯化操作时 ,温度需保持在０～ 4 ℃。肝细胞分离时, ｐH 值宜维持在 7 。 4 左右, 不低于７。 2 ,最高不超过７。 6 , 否则将对肝细胞造成很大损伤、在肝灌注液中加入适量得小牛血清或者牛血清白蛋白,可以维持细胞代谢与液体渗透压, 提高肝细胞成活率、此外,门静脉插管应迅速置入,灌注速度必须保持一致。 培养板预处理及培养液选择采用铺过胶原得新培养板与没有铺过胶原得新培养板 ,铺过胶原得老培养板培养肝细胞比较 , 发现肝细胞在铺过胶原得新培养板中长势更好、新得培养板使用 Sigm a公司提供得胶原铺胶 ,置于 37℃恒温箱中过夜后使用。过去选择含 8％胎牛血清得Ｗ E作培养基 ,效果不错 , 但WＥ价格昂贵 ,我们试着采用含 10%胎牛血清得RPM 1６４0培养基 , 并在其中加入胰岛素 , 地塞米松等生长因子 , 肝细胞生长好。肝细胞得接种密度对其以后得生长状况有很大得影响 : 密度太小 ,细胞不易生长; 密度太大 , 肝细胞增殖受到抑制 , 培养板中缺少足够得空间供细胞伸展、当细胞密度为 5×1０５ / m ｌ左右时 ,试剂及仪器主要试剂 : 胰岛素、高血糖素、转铁蛋白、表皮生长因子、地塞米松、Ⅳ型胶原酶、锥虫蓝等购自美国 Sig ma 公司。鼠尾胶为

人表皮干细胞的分离培养

人表皮干细胞的分离培养 【摘要】目的探索人表皮干细胞原代培养方法。方法将皮肤标本进行分离，用DispaseⅡ酶消化表皮皮片后，重悬细胞，接种于铺有Ⅳ型胶原的培养瓶进行培养。表皮干细胞的鉴定采用免疫细胞化学技术检测其表面标记物β1整合素、CK19的表达。对表皮干细胞与角质形成细胞的克隆形成情况进行比较。结果倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长状况良好，表皮干细胞β1整合素及CK19角蛋白染色阳性。表皮干细胞克隆形成率高于角质形成细胞（P＜0.05）。结论采用本方法进行人表皮干细胞的培养较为理想。 【Abstract】Objective The present research was performed to find primary cell culture method of human epidermal stem cells. Methods The skin samples were isolated by Dispase Ⅱ，the cells were seeded in culture flask which was dealed with type IV collagen. The epidermal stem cells were identified by immunocytochemical technique for the detection of integrin β1 and CK19. The cell clone formation of epidermal stem cells and keratinocyte were compared. Results Cell morphology was observed under microscope and good growth status inverted，epidermal stem cells were positive reaction to integrin β1 and CK19 antibody. Epidermal stem cell clone formation rate is higher than that of keratinocytes （P＜0.05）.Conclusion Our results indicate that the method was effective for culture human epidermal stem cells. 【Key words】Epidermal stem cell；Culture；Identification 表皮干细胞具有无限增殖的能力，在组织工程皮肤的研究中具有重要的作用，本文就表皮干细胞的原代培养进行探讨。 1 材料与方法 1. 1 主要试剂DMEM培养基（dulbecco’s modified eagle medium，DMEM），单克隆抗体β1整合素，单克隆抗体CK19，Ⅳ型胶原，DispaseⅡ酶，胎牛血清（FBS），表皮细胞生长因子，0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）。 1. 2 实验设备CO2恒温培养箱，无菌超净工作台，倒置相差显微镜，普通光学显微镜。 1. 3 方法 1. 3. 1 原代培养严格无菌操作，切取5×5 mm2左右的皮肤标本，标本源自本院4月龄自愿引产胎儿包皮，切取前分离皮下组织，将分离得到的皮肤组织用含青-链霉素的PBS冲洗3次，切成小皮块后置于含 2.5 mg/ml DispaseⅡ酶的DMEM培养基中4℃过夜，培养基中含有青霉素（100 U/ml）及链霉素（100 μg/ml），第二天分离表皮和真皮层，收集表皮皮片，37℃条件下0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化15 min，胎牛血清终止消化，轻轻吹打，200目

小鼠原代肝细胞培养

一种改良的小鼠原代肝细胞培养方法 1材料与方法 1.1动物 2～4周龄BALB/C小鼠，雌雄不限（湖北省防疫站动物房提供）。 1.2试剂 D-hank's液； 消化液Ⅰ：含1 g/L胰蛋白酶、10 g/L聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyroli done, PVP)及0.3 g/L EDTA(武汉中健公司提供)； 消化液Ⅱ：含2 g/L胶原酶Ⅳ（上海华美生物工程公司提供）及10 g/L PVP； 基础培养液为DMEM，另含青霉素100u/ml、链霉素100 μg/ml、50 mmol/L HEPES、30 g/L谷氨酰胺（武汉中健公司提供）； 小牛血清（BS，GIBCO公司提供）； 培养基内其他因子：胰岛素5 μg/ml 、转铁蛋白5 μg/ml (上海华美生物工程公司产品)、促甲状腺素释放因子10－6 mol/L（Sigma公司产品）、促肝细胞生长因子20 μg/ml、氢化可的松10－6 mol/L（广东阳江制药厂产品）。 1.3鼠肝组织块培养 1）断头处死动物，置于75%酒精浸泡2-3分钟，无菌分离肝组织后均在冰浴下操作。2）肝组织用4℃D-hank's液（PBS）或不含BS的培养液洗净血污，剥除包膜及纤维成分； 3）将肝组织切为约1mm3小块，再用上述液体尽量洗去残留血污，最后一次清洗后800r/min离心4 min，弃上清， 4）加入消化液Ⅰ（5-6倍体积），37℃孵育12 min，再用培养液洗3次以清除胰酶。5）将消化好的肝组织块贴于25cm2培养瓶中，加少许含100 ml/L BS培养液置37℃、5% CO2条件下2～3h后再补充6 ml含100 m l/L BS培养液。待细胞长出生长晕后改为50 ml/L BS培养液。 1.4鼠肝细胞单层培养 动物和肝组织处理同上，加入消化液Ⅱ，置4℃过夜消化，去除消化液加含100 ml/L BS培养液，用滴管轻轻吹打成细胞悬液，经200目尼龙筛网过滤后用培养液洗2次，4 ℃50 g离心4 min，收集肝细胞，台盼蓝活细胞计数>80%,按5×105/ml密度接种，于37℃、5% CO2条件下培养，待细胞贴壁生长后改为50ml/L BS培养液。 或者： 1）断头处死动物，置于75%酒精浸泡2-3分钟，无菌分离肝组织后均在冰浴下操作。2）肝组织用4℃D-hank's液（PBS）或不含BS的培养液洗净血污，剥除包膜及纤维成分； 3）将肝组织切为约1mm3小块，再用上述液体尽量洗去残留血污，最后一次清洗后800r/min离心4 min，弃上清， 4）加入消化液Ⅰ（5-6倍体积），37℃孵育20 min，每隔5min振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离； 5）加入3-5mL含血清培养液以终止胰酶消化作用； 6）用100目筛网过滤，除去未消化的大组织块； 7）再次离心5min，弃上清； 8）加入无血清培养液5mL，冲散细胞，再离心一次，弃上清； 9）加入含血清培养液1-2mL（视细胞数量），血球计数板计数； 10）将细胞调整到5*105/mL左右，转移至6孔培养板中，37℃、5% CO2条件下培养。

原代肝细胞分离方法

原代肝细胞分离方法 体外培养肝细胞的关键是如何分离得到形态完整、体外代谢活性高的肝细胞. 自1953年Anderson[2]首创剪切法从肝脏分离肝细胞以来, 各实验室对肝细胞的分离方法进行了不断改进. 在众多方法中, 主要分为非灌流的方法和灌流的方法. 1.1 采用非灌流的方法 早期的研究一般通过非灌流这种简单的步骤分离肝细胞. 1.1.1 机械分离法: 机械分离法是利用机械剪切及强力吹打等物理手段来分离肝细胞的方法[3]. 张 顶et al[4]在分离树鼩肝细胞的过程中, 首先将树鼩的肝脏剪成小块, 然后通过挤压、剪碎和 震荡等机械手段, 使肝细胞从肝组织上脱落, 从而获得互相分离的肝细胞. 1.1.2 胰酶消化法: 胰酶消化法是利用胰酶来破坏肝细胞之间的桥连, 使肝细胞分离的一种方法. Dulbecco et al[5]首次采用胰酶来分离猴肾细胞、大鼠肝细胞, 并运用到体外细胞的研究和培 养中. 刘友平et al[6]利用该方法分离肝细胞时, 首先取出小鼠的肝组织用眼科剪剪碎至糊状, 然后用缓冲液充分清洗并加入胰酶进行消化. 待消化完全后用D-Hank's液清洗, 最后加入含有血清的培养液终止胰酶的作用, 得到消化彻底的细胞悬液. 1.1.3 胶原酶消化法: 胶原酶消化法是利用胶原酶来破坏细胞间的纤维成分, 使肝细胞分离的一种方法. 王琳et al[7]在利用该方法分离新生小鼠肝细胞时, 首先将新生小鼠的肝脏剪成1 mm3组 织块, 用无钙无镁的D-Hank's液反复冲洗后加入胶原酶进行消化. 最后用DMEM液终止胶原酶的作用, 得到肝细胞悬液. 1.2 采用灌流的方法 虽然非灌流的方法以其简单易行的特点得到了一定的应用, 但由于存在消化不 完全、分离得到的肝细胞中多细胞团块存在的问题, 不能满足许多基础研究或临床应用的要求. 1969年, Berry和Friend[8]引入了肝脏灌流法, 灌流可以使消化液与肝组织更加充分地接触, 不仅提高了分离效率, 还使分离所得肝细胞的活力和数量大大提高. 1.2.1 离体胶原酶灌流法: 离体胶原酶灌流法是将离体灌注与胶原酶消化相结合的方法. 在使用该方法分离肝细胞时, 首先将动物肝脏取出, 于门静脉内置管或直接在获得的肝组织块的血管或切口内置管, 用预热的无钙无镁的D-Hank's液灌流. 然后换用胶原酶作持续灌流, 使肝细胞与间质分离. 最后用培养液终止胶原酶的消化作用, 过滤、离心、弃上清后得到肝细胞悬液. 1.2.2 Seglen两步灌流法（原位胶原酶灌注法）: 自从引入灌流法分离肝细胞以来, 许多学者根据不同的应用条件对灌流法进行了改良. 其中Seglen[10]经过一系列细致的研究, 创立了改良的Seglen两步灌流法, 这一方法已成为应用至今的标准的原代肝细胞分离方法. 两步灌流法主要是通过门静脉先后用含EDTA或EGTA缓冲液和胶原酶缓冲液进行灌注来分离肝细胞的方法. 许多学者在具体操作中, 不断改进 两步灌流法的灌注条件, 目的在于进一步减少分离过程中肝细胞的损伤, 提高肝细胞的活率. 1.2.3 半原位胶原酶灌流法:

干细胞分离培养步骤

家兔BMSC分离培养步骤 1.麻醉、备皮、消毒、铺巾：取1只4-5周龄新西兰幼兔，速眠新肌肉注 射(0．1～0．2mL／kg)麻醉。仰卧固定于操作台上，褪毛，备皮，2%碘酒、75%酒精（或碘伏）常规消毒，铺洞巾(洞巾孔洞应控制在lcm左右，以利于减少污染)。 2. 在双侧踝关节处环形剪开皮肤，再纵行剪开皮肤至骶尾部，分离肌肉、 筋膜等软组织至见骨膜，电锯离断踝关节、膝关节及髋关节，获取家兔股骨和胫骨（桡骨）,置于装有PBS液的无菌盒内。（亦可从髂前上棘穿刺抽取骨髓） 3．用PBS液体清洗骨组织3-4遍，去除杂物、血迹后，在超净工作台上，无菌条件下剥离骨周围的肌肉软组织，用眼科剪从股骨和胫骨的干骺端打开骨髓腔，用含有适量肝素( 625 U/mL)的DMEM 液冲洗骨髓腔，收集冲洗液约 6 ～ 8 mL。吸管反复吹打后，1 500 r/min，离心5 min，弃上清。加入 DMEM 培养基重悬，将上述细胞重悬液按照1∶ 1 的比例缓慢滴加到密度为 1. 073 g/mL 的PercoⅡ分离液中，1 500 r / min 离心 20 min。离心后管内容物分为 3 层，收集中间乳白色云雾状的单个核细胞层，加入 DMEM 培养液稀释混匀，1 500 r/min 离心 5 min，洗涤 2 ～ 3 次，去除多余的脂肪细胞及组织液。用含双抗的 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 培养基重悬细胞，以 2. 0 × 10^5个/cm2的细胞密度接种于25cm^2培养瓶中，置于37 ℃，5%、饱和湿度的孵箱中培养。 4. 48小时后首次半量换液，去除浮物及其它非贴壁细胞（如造血干细胞），后每隔3天换液一次。 5. 7-10天后，待细胞融合长满至80%以上时用0.25%胰蛋白酶消化传代。 经过第一次传代后，骨髓间充质干细胞大约能占60%左右，并且呈漩涡状生长；一般经过3次左右传代后，骨髓间充质干细胞大约能占90%左右。

肝细胞原代培养实验方案

原代培养肝细胞是肝细胞移植、生物人工肝的最佳生物材料。长期以来, 国内外众多学者对肝细胞分离方法、培养条件进行了大量的研究 , 但要获得高活率、功能好的肝细胞,至今仍非易事。早期主要用非酶法分离肝细胞 ,包括机械法( 如匀浆法) 及螯合法。机械法对肝细胞损伤大, 细胞活率低; 螯合法是用可结合 Ca2+ 、M g2 +的螯合剂(如枸橼酸盐或 EDTA) 分离肝细胞,但螯合剂单独使用效果不好 ,常需与酶法结合使用。后期逐渐改为酶消化法分离肝细胞 ,包括胶原酶消化法、胰蛋白酶消化法。后者对酶浓度及作用时间要求十分严格, 且由于胰蛋白酶是一种强蛋白质消化酶, 对肝细胞膜破坏严重 , 因而易造成肝细胞死亡 , 导致分离失败。胶原酶消化法对肝细胞损伤较小 , 虽然肝细胞膜在消化过程中也会受到损害, 但经培养后可完全修复。胶原酶在消化肝的同时解除了细胞间接触抑制或活化了潜在的蛋白激酶、生长因子或受体, 使肝细胞能逐渐适应消化分离过程中所发生的细胞内、外环境及细胞间的各种改变。这些改变对离体肝细胞修复、生长及其功能有重要的促进作用 ,有利于肝细胞的培养。这种适应性改变恰恰是机械分离法所没有的。因此 ,要获取理想的肝细胞,酶消化这一重要环节不可缺少。 Seglen 二步灌注法为经典的胶原酶消化法,但所需设备较复杂 ,胶原酶消耗量大。本研究在其基础上略加改进。作者认为 ,采用胶原酶消化法 ,胶原酶的用量、作用时间及作用条件是分离成功与否的关键。胶原酶的浓度过高 ,作用时间难以控制 ; 浓度过低 ,则作用时间过长、细胞活率降低。事先用无Ca2 +、M g2+的灌注液进行预灌

注, 去除 Ca2+依赖性粘附因子 ,使桥粒断裂; 然后用含 Ca2+的胶原酶消化 ,胶原酶的作用需要 Ca2+的活化 , 在 5 mmol/LCa2 +浓度下 ,用浓度为 500 mg/ L 的胶原酶 37 ℃条件下消化 15 min 最佳。在进行肝细胞洗涤、离心、重悬等纯化操作时 ,温度需保持在 0 ～4 ℃。肝细胞分离时, pH 值宜维持在 7 . 4 左右, 不低于 7 . 2 ,最高不超过 7 . 6 , 否则将对肝细胞造成很大损伤。在肝灌注液中加入适量的小牛血清或者牛血清白蛋白,可以维持细胞代谢和液体渗透压, 提高肝细胞成活率。此外,门静脉插管应迅速置入,灌注速度必须保持一致。 培养板预处理及培养液选择采用铺过胶原的新培养板与没有铺过胶原的新培养板 ,铺过胶原的老培养板培养肝细胞比较 , 发现肝细胞在铺过胶原的新培养板中长势更好。新的培养板使用 Sigm a公司提供的胶原铺胶 ,置于 37℃恒温箱中过夜后使用。过去选择含 8%胎牛血清的 W E作培养基 ,效果不错 , 但 WE价格昂贵 ,我们试着采用含 10%胎牛血清的 RPM 1640培养基 , 并在其中加入胰岛素 , 地塞米松等生长因子 , 肝细胞生长好。肝细胞的接种密度对其以后的生长状况有很大的影响 : 密度太小 ,细胞不易生长 ; 密度太大 , 肝细胞增殖受到抑制 , 培养板中缺少足够的空间供细胞伸展。当细胞密度为 5×105 / m l左右时 ,试剂及仪器主要试剂 : 胰岛素、高血糖素、转铁蛋白、表皮生长因子、地塞米松、Ⅳ型胶原酶、锥虫蓝等购自美国 Sig ma 公司。鼠尾胶为自行配制。Williams E 培养液、胎牛血清购自美国 Gibco 公司。BT01-100 蠕动泵( 保定格

人骨髓间充质干细胞的贴壁分离与体外培养

万方数据

ＩＳＳＮ１６７３—８２２５ＣＮ２１．１５３９／Ｒ赵凌云，等人骨髓间充质干细胞的贴壁分离与体外培养ｗｗＭ．ｚｇｌｃｋｆ，ｃｏｍｋｆ２３３８５０８３＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ ０引言 骨髓间充质干细胞是具有形成骨、软骨、脂肪、神经和成肌细胞能力的多种分化潜能的细胞亚群，取材方便，易于体外扩增，可进行自体移植，而不存在组织配型和免疫排斥的问题，被认为是骨组织工程中最佳的种子细胞。本实验目的在于建立一种可行的骨髓间充质干细胞取材和分离扩增的培养方法。 １材料和方法 设计：开放性实验。 单位：解放军济南军区总医院脊髓修复科。 材料：实验于２００６—０２／１２在解放军济南军区总医院脊髓修复科完成。骨髓来源于解放军济南军区总医院脊髓修复科收治的脊髓完全性损伤患者，对本实验均知情同意。基础培养液由含体积分数为０．１５胎牛血清和低糖仪一ＭＥＭ配置。低糖ｄ－ＭＥＭ培养基（Ｈｙｃｌｏｎｅ）；淋巴细胞分离液（密度１．０７７ｇ／ｍＬ，上海试剂二厂生产）；胰蛋白酶，胎牛血清（Ｇｉｂｉｃｏ）；Ｃ０２培养箱（上海力申科学仪器有限公司，ＨＦ９０）；生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司，ＨＦｓａｆｅ一１２００／ｃ）；倒置显微镜（Ｌｅｉｃａ）；离心机（ＪＯＵＡＮＢ４ｉ多功能台式机）。 设计、实施、评估者：设计、实施为第一作者，评估为第二、三作者，均经过系统培训，未使用盲法评估。 方法： 骨髓间充质干细胞的分离及传代培养：在无菌条件下，以含５ｍＬ肝素钠生理盐水的２０ｍＬ注射器，于患者髂后上棘穿刺抽取骨髓组织６ｍＬ，移入含５ｍＬ肝素钠生理盐水的试管内，混匀，而后沿管壁缓慢加入含１０ｍＬ淋巴细胞分离液的离心管中，２０００ｒ，ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，小心吸取界面层细胞，用Ｄ—Ｈａｎｋｓ平衡盐溶液洗２次，２０００ｒ／ｍｉｎ离心８ｍｉｎ，加入基础培养液，血细胞计数板计数，调整细胞的浓度，将细胞悬液按１０９—１０１０Ｌ－１接种于培养瓶，放置３７℃、体积分数为０．０５的Ｃ０２饱和湿度孵箱中培养。于培养后的两三天更换培养液，并用Ｄ－Ｈａｎｋｓ平衡盐溶液冲洗２次，以去除未贴壁的造血细胞，以后每３ｄ换液一次，进一步去除未贴壁的细胞。观察细胞生长情况，待细胞融合成片、长满培养瓶底部后，用质量浓度为２．５ｇ／Ｌ的胰蛋白酶流过所有细胞表面，盖好瓶盖，将培养瓶放在倒置显微镜下观察，发现细胞变圆，部分脱壁，控制消化时间不超过３ｍｉｎ，立即加入２ｍＬ有血清培养液终止消化，用弯头吸管轻轻吹打细胞生长区域，吹打过程中不要用力，结束后再用少量培养液漂洗一遍，然后加入适 ５６５０量培养液计数，分别接种在新的培养瓶内。 骨髓间充质干细胞的生长曲线的绘制：取第３代生长状态良好的细胞，用质量浓度为２．５ｇ／Ｌ的胰蛋白酶消化制成细胞悬液，接种至２４孔培养板，３孔／组，细胞１×１０４／孔，每孔加入培养液１ｍＬ，放置３７℃、体积分数为０．０５的Ｃ０２孵箱中培养。以细胞数为纵坐标，时间为横坐标，绘制细胞生长曲线。 骨髓间充质干细胞贴壁率的测定：取第３代生长状态良好的细胞，用质量浓度为２．５ｇ／Ｌ的胰蛋白酶消化制成细胞悬液，接种至２４孔培养板，３孔／组，细胞１×１０４／孔，每孔加入培养液１ｍＬ，放置３７℃、体积分数为０．０５的Ｃ０２孵箱中培养，每隔２ｈ进行细胞贴壁率检测。 主要观察指标：①骨髓间充质干细胞的形态学观察。②骨髓间充质干细胞的生长曲线。③骨髓间充质干细胞的贴壁率。 统计学分析：由第一作者采用ＥＳＡ４．０软件进行统计处理，数据以娃ｓ表示。 ２结果 ２．１骨髓间充质干细胞的形态学观察倒置显微镜下，骨髓间充质干细胞接种１ｄ即贴壁，２ｄ时贴壁细胞较多。经冲洗和换液去除悬浮细胞后，贴壁细胞继续培养３ｄ开始增殖，伸展为椭圆型、短梭型、多角型及不规则型等（图１）。至１４ｄ细胞密集在集落中心，基本铺满瓶底，第３～５代细胞呈均匀一致的长梭型，排列成旋涡状或放射状（图２）。 图１原代培养的骨髓间充质干细胞贴壁后３ｄ开始增殖，伸展为椭圆型、短梭型、多角型及不规则型等（倒置显微镜，ｘ２０） ２．２骨髓间充质干细胞的生长曲线骨髓间充质干细胞传代后３ｄ内处于潜伏期，３ｄ后进入生长期，７ｄ后进入平台期。第３代骨髓间充质干细胞生长曲线见图３。 Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１２００。Ｓｈｅｎｙａｎｇ１１０００４ｋｆ２３３８５０８３＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ ｗｗｗ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｍ 　万方数据