基因芯片技术
基因芯片技术
2007-12-17
基因芯片技术及其研究现状和应用前
景
陈华友，崔振玲 (上海200062 华东师范大学生物系分子生物学实验室)
摘要：基因芯片技术是90 年代中期以来快速进展起来的分子生物学高新技术，是各学科交叉综合的崭新科学。其原理是采纳光导原位合成或显微印刷等方法，将大量DNA 探针片段有序地固化予支持物的表面，然后与已标记的生物样品中DNA 分子杂交，再对杂交信号进行检测分析，就可得出该样品的遗传信息。基因芯片技术目前国内外都取得了较大的进展，该技术可用于DNA 测序，基因表达及基因组图的研究，基因诊断，新基因的发觉，药物选择，给药个性化等等，因此为二十一世纪生物医药铺平道路，将为整个人类社会带来深刻广泛的变革，促进人类早日进入生物信息时代。
关键词：基因芯片；微阵列；基因诊断；药物选择生物芯片技术是随着" 人类基因组打算"(human ge nome project, HGP)的进展而进展起来的，它是90年代中期以来阻碍最深远的重大科技进展之一，它融微电子学、生物学、物理学、化学、运算机科学为一体的高度交叉的新技术，具有重大的基础研究价值，又具有明显的产业化前景。生物芯片技术包括基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片、以及元件型微阵列芯片、通道型微阵列芯片、生物传感芯片等新型生物芯片( 1)。本文要紧讨
论基因芯片技术，它为"后基因组打算"时期基因功能的研究提供了强有力的工具，将会使基因诊断、药物选择、给药个性化等方面取得重大突破，该技术被评为1998 年度世界十大科技进展之一。
1 差不多概念
基因芯片(gene chip)也叫DNA芯片、DNA微阵列(DNA microarray)、寡核苷酸阵列(oligo nucleotide array), 是指采纳原位合成(in situ synthesis)或显微打印手段，将数以万计的DNA 探针固化于支持物表面上,产生二维DNA 探针阵列,然后与标记的样品进行杂交,通过检测杂交信号来实现对生物样品快速、并行、高效地检测或医学诊断,由于常用硅芯片作为固相支持物,且在制备过程运用了运算机芯片的制备技术,因此称之为基因芯片技术。
2 技术差不多过程
2．1 DNA 方阵的构建选择硅片、玻璃片、瓷片或聚丙烯膜、尼龙膜等支持物,并作相应处理,然后采纳光导化学合成和照相平板印刷技术可在硅片等表面合成寡核苷酸探针;( 2)或者通过液相化学合成寡核苷酸链探针，或PCR技术扩增基因序列，再纯化、定量分析,由阵列复制器( arraying and replicating de vice ARD)，或阵列机(arrayer)及电脑操纵的机器人，准确、快速地将不同探针样品定量点样于带正电荷的尼龙膜或硅片等相应位置上,再由紫外线交联固定后即得到DNA 微阵列或芯片( 3)。
2．2 样品DNA 或mRNA 的预备。从血液或活组织中猎取的DNA/mRNA 样品在标记成为探针往常必须进行扩增提升阅读灵敏度。Mosaic Techno logies公司进展了一种固相PCR 系统，好于传统PCR技术，他们在靶DNA 上设计一对双向引物，将其排列在丙烯酰胺薄膜上，这种方法无交叉污染且省去液相处理的繁锁；Lynx T herapeutics公司提出另一个革新的方法，即大规模平行固相克隆（massively parallel solid-phase cloning）那个方法能够对一个样品中数以万计的DNA 片段同时进行克隆，且不必分离和单独处理每个克隆，使样品扩增更为有效快速（4）。
在PCR 扩增过程中，必须同时进行样品标记，标记方法有荧光标记法、生物素标记法、同位素标记法等。
2．3 分子杂交
样品DNA 与探针DNA 互补杂交要按照探针的类型和长度以及芯片的应用来选择、优化杂交条件。如用于基因表达监测，杂交的严格性较低、低温、时刻长、盐浓度高；若用于突变检测，则杂交条件相反（5）。芯片分子杂交的特点是探针固化，样品荧光标记，一次能够对大量生物样品进行检测分析，杂交过程只要30min。美国Nangon公司采纳操纵电场的方式，使分子杂交速度缩到1min,甚至几秒钟（6）。德国癌症研究院的Jorg Hoheisel等认为以肽核酸（PNA）为探针成效更好。
2．4 杂交图谱的检测和分析
用激光激发芯片上的样品发射荧光，严格配对的杂交分子，其热力学稳固性较高，荧光强；不完全杂交的双键分子热力
学稳固性低，荧光信号弱（不到前者的1/35~1/5）（2），不杂交的无荧光。不同位点信号被激光共焦显微镜，或落射荧光显微镜等检测到，由运算机软件处理分析，得到有关基因图谱。目前，如质谱法、化学发光法、光导纤维法等更灵敏'、快速，有取代荧光法的趋势。
3 应用
3．1 测序基因芯片利用固定探针与样品进行分子杂交产生的杂交图谱而排列出待测样品的序列，这种测定方法快速而具有十分诱人的前景。Mark chee等用含135000个寡核苷酸探针的阵列测定了全长为16.6kb的人线粒体基因组序列，准确率达99%（7）。Hacia 等用含有48000个寡核苷酸的高密度微阵列分析了黑猩猩和人BRCA1 基因序列差异，结果发觉在外显子11约3.4kb长度范畴内的核酸序列同源性在98.2%到83. 5%之间，提示了二者在进化上的高度相似性（8）。
3．2 基因表达水平的检测。
用基因芯片进行的表达水平检测可自动、快速地检
测出成千上万个基因的表达情形。Sche na等采纳拟南芥基因组内共45个基因的cDNA 微阵列（其中14 个为完全序列， 3 1个为EST）,检测该植物的根、叶组织内这些基因的表达水平，用不同颜色的荧光素标记逆转录产物后分不与该微阵列杂交，经激光共聚焦显微扫描，发觉该植物根和叶组织中存在26 个基因的表达差异，而参与叶绿素合成的CAB1 基因在叶组织较根组织表达高500倍。（9）Schena等用人外周血淋巴细胞的
cDNA 文库构建一个代表1046 个基因的cDNA 微阵列，来检测体外培养的T 细胞对热休克反应后不同基因表达的差异，发觉有5 个基因在处理后存在专门明显的高表达，1 1 个基因中度表达增加和 6 个基因表达明显抑制。该结果还用荧光素交换标记对比和处理组及RNA 印迹方法证实（10）。在HGP 完成之后，用于检测在不同生理、病理条件下的人类所有基因表达变化的基因组芯片为期不远了（11）。
3．3 基因诊断
从正常人的基因组中分离出DNA 与DNA 芯片杂交就能够得出标准图谱。从病人的基因组中分离出DNA 与DN A 芯片杂交就能够得出病变图谱。通过比较、分析这两种图谱，就能够得出病变的DNA 信息。这种基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏锐、经济、平行化、自动化等特点，将成为一项现代化诊断新技术。例如，Affymetrix 公司，把P53 基因全长序列和已知突变的探针集成在芯片上，制成P53 基因芯片，将在癌症早期诊断中发挥作用。又如，Heller等构建了96个基因的cDNA 微阵，用于检测分析风湿性关节炎（R A）有关的基因，以探讨DNA芯片在感染性疾病诊断方面的应用（12）。现在，肝炎病毒检测诊断芯片、结核杆菌耐药性检测芯片、多种恶性肿瘤有关病毒基因芯片等一系列诊断芯片逐步开始进入市场。基因诊断是基因芯片中最具有商业化价值的应用。
3．4 药物选择如何分离和鉴定药的有效成份是目前中药产业和传统的西药开发遇到的重大障碍，基因芯片技术是解决这一障碍的有效手段，它能够大规模地选择、通用性强，能够从
基因水平讲明药物的作用机理，即能够利用基因芯片分析用药前后机体的不同组织、器官基因表达的差异。如果再用m R NA 构建 c DNA 表达文库,然后用得到的肽库制作肽芯片,则能够从众多的药物成分中选择到起作用的部分物质。或者,利用RNA 、单链DNA 有专门大的柔性，能形成复杂的空间结构，更有利与靶分子相结合，可将核酸库中的RNA 或单链D NA 固定在芯片上，然后与靶蛋白孵育，形成蛋白质-RNA 或蛋白质-DNA 复合物，能够选择特异的药物蛋白或核酸，因此芯片技术和RNA 库的结合在药物选择中将得到广泛应用。在查找HIV 药物中，Jellis 等用组合化学合成及DNA 芯片技术选择了654536 种硫代磷酸八聚核苷酸，并从中确定了具有X XG4XX 样结构的抑制物，实验表明，这种选择物对HIV 感染细胞有明显阻断作用。（13）生物芯片技术使得药物选择，靶基因鉴不和新药测试的速度大大提升，成本大大降低。基因芯片药物选择技术工作目前刚刚起步，美国专门多制药公司已开始前期工作，即正在建立表达谱数据库，从而为药物选择提供各种靶基因及分析手段。这一技术具有专门大的潜在应用价值。
3．5 给药个性化
临床上，同样药物的剂量对病人甲有效可能对病人乙不起作用，而对病人丙则可能有副作用。在药物疗效与副作用方面，病人的反应差异专门大。这要紧是由于病人遗传学上存在差异，如药物应答基因，导致对药物产生不同的反应。例如细胞色素P450 酶与大约25%广泛使用的药物的代谢有关，如果病人该酶的基因发生突变就会对降压药异喹胍产生明显的副作用，大
约5%~10%的高加索人缺乏该酶基因的活性。现已弄清晰这类基因存在广泛变异，这些变异除对药物产生不同反应外，还与易犯各种疾病如肿瘤、自身免疫病和帕金森病有关。如果利用基因芯片技术对患者先进行诊断，再开处方，就可对病人实施个体优化治疗。另一方面，在治疗中，专门多同种疾病的具体病因是因人而异的，用药也应因人而异。例如乙肝有较多亚型，HBV 基因的多个位点如S, P及C基因区易发生变异。若用乙肝病毒基因多态性检测芯片每隔一段时刻就检测一次，这对指导用药防止乙肝病毒耐药性专门有意义。又如，现用于治疗AIDS 的药物要紧是病毒逆转录酶RT和蛋白酶PRO的抑制剂，但在用药3-12月后常显现耐药，其缘故是rt、pro 基因产生一个或多个点突变。Rt基因四个常见突变位点是Asp67^Asn、Lys7XArg、Thr 215—Phe Tyr和Lys219^ Glu,四个位点均突变较单一位点突变后对药物的耐受能力成百倍增加（14）。如将这些基因突变部位的全部序列构建为DNA 芯片，则可快速地检测病人是这一个或那一个或多个基因发生突变，从而可对症下药，因此对指导治疗和预后有专门大的意义。
此外，基因芯片在新基因发觉、药物基因组图、中药物种鉴定、DNA 运算机研究等方面都有庞大应用价值。
4 基因芯片国内外现状和前景
自从1996 年美国Affymetrix 公司成功地制作出世界
上首批用于药物选择和实验室试验用的生物芯片，并制作出芯片系统（15），此后世界各国在芯片研究方面快速前进，持续有