细菌的培养与分离技术

细菌的培养与分离技术

第九章细菌的培养与分离技术

一、单选题

1、在半固体培养基的穿刺线生长呈模糊或根须状，并使培养基变混浊的细菌的特点是（）。

A、动力试验阴性

B、生长旺盛

C、无鞭毛

D、动力试验阳性

E、有杂菌存在【正确答案】 D 【答案解析】半固体培养基用于观察细菌的动力，有动力的细菌除了在穿刺接种的穿刺线上生长外，在穿刺线的两侧均可见有浑浊或细菌生长的小菌落，呈模糊或根须状。

2、下列选项中不是无菌实验室所必须的的是（）。

A、无菌实验室应完全封闭

B、定期进行彻底消毒

C、进入无菌室应着隔离衣

D、不进行常见临床标本的分离

E、有超净工作台【正确答案】 E【答案解析】无菌实验室是细菌实验室内用于无菌操作的小室。其内部要求更为严格，具体要求①无菌室应完全封闭，人员出入应有两道门，其间应隔有缓冲区。②用前应以紫外线消毒30min，定期用乳酸或甲醛熏蒸，彻底消毒。③在无菌室中一般仅限于分装无菌的培养基及传染性强的细菌的接种，不进行有菌标本的分离及其他操作。④无菌室内应仅限操作人员进入，而且进入无菌室应着隔离衣和专用鞋，操作时戴口罩，随时保证室内的无菌状态。⑤条件有限的实验室，可用超净工作台代替无菌实验室进行相应的操作。超净工作台应选择垂直气流通风方式。无菌室应配备空调设备，保证不因室温而影响工作。

3、平板分区划线的目的是（）。

A、使细菌获得充分的营养

B、减少细菌间的相互抑制作用

C、获得足够的单个菌落

D、加快细菌的生长速度

E、利于细菌的大量生长【正确答案】 C【答案解析】在被检标本中，常混杂有多种细菌，平板划线分离的目的是使标本中混合的多种细菌在培养基表面分散生长，形成各自菌落。

4、关于分区划线分离法，错误的是（）。

A、适用于杂菌量较多的标本

B、一般分为四个区，将标本均匀涂布于第一区

C、自第二区开始，各区内依次进行连续划线

D、每一区划线均接触上一区的接种线1～2次

E、接种前以及接种完毕后，接种环要灭菌【正确答案】 E【答案解析】“接种前以及接种完毕后，接种环要灭菌”，是想表述在整个接种过程中只需要给接种环灭菌两次，但事实上应该在接种前后灭菌的基础上，每一次划分完一个区要进行下一区的划线时也需要进行灭菌。所以Ｅ选项是错误的。

5、厌氧培养法不包括（）。

A、厌氧罐培养法

B、气袋法

C、烛缸培养法

D、气体喷射法

E、厌氧手套箱培养法【正确答案】 C【答案解析】厌氧培养法适用于专性厌氧菌和兼性厌氧菌的培养。常用的厌氧培养法有：①疱肉培养基法；②焦性没食子酸法；③厌氧罐法；④气袋法；⑤厌氧手套箱法。

6、采集血培养标本时，采血量与肉汤培养基的比例哪一个最佳（）。

A、1:5

B、1:10

C、1:7

D、1:4

E、1:6【正确答案】 B【答案解析】血液培养用的培养瓶最好先在35℃中预温，再将血液接种于培养瓶（培养基容量:血液量＝10:1），培养瓶置35℃6～18h后，用肉眼观察其生长现象。

7、男性，数日前去游泳，后出现尿急、尿频、尿痛等症状，医生疑为细菌性尿道炎，采集清洁中段尿进行细菌检查。尿细菌定量培养，常用方法为（）。

A、平板分区划线法

B、穿刺培养法

C、倾注平板法

D、平板涂布法

E、平板连续划线法【正确答案】 C【答案解析】倾注平板法常用于测定牛乳、饮水和尿液等标本细菌数。

实训六 细菌的分离、移植及培养

实训六细菌的分离、移植及培养性状的观察 目的要求能利用不同的被检材料进行细菌的分离培养，观察细菌的培养特性，并会进一步移植培养。 仪器及材料温箱、病料、实验用菌种、营养琼脂培养基、肉渣汤(疱肉)培养基、接种环、酒精灯、烙刀、镊子、剪子等。 方法与步骤 (一)细菌的分离培养 1．平板划线分离法（视频四）平板划线是通过将被检材料连续划线而获得单个菌落，因而划线愈长，获得单个菌落的机会也愈多。具体操作步骤如下： (1)右手持接种环于酒精灯上烧灼灭菌，待冷。 (2)无菌操作取病料若为液体病料，可直接用灭菌的接种环取病料一环；若为固体病料，首先将烙刀在酒精灯上灭菌，并立即用其将病料表面烧烙灭菌，然后用灭菌接种环从烧烙部位插入组织中缓缓转动接种环，取少量组织或液体。 (3)左手持平皿，用拇指、食指及中指将皿盖打开一侧(角度大小以能顺利划线为宜，但以角度小为佳，以免空气中细菌污染培养基)。 (4)将已取被检材料的接种环伸入平皿，并涂于培养基一侧，然后自涂抹处成30～40°角，以腕力在平板表面轻轻地分区划线。 在细菌病诊断或药敏试验时，为了提高效率，常可将皿盖放于酒精灯附近，左手持培养基，使划线的平面与右侧台面的角度小于90°且在酒精灯附近，右手持接种环取病料连续划线。 (5)划线完毕，烧灼接种环，将培养皿盖好，用记号笔在培养皿底部注明被检材料及日期，倒置37℃温箱中，培养18～24h观察结果(实图6-1)。凡是分离菌应在划线上生长，否则为污染菌。 2．倾注分离法取3支融化后冷至50℃左右的琼脂管，用灭菌的接种环取一环培养物(或被检材料)移至第一管中，随即用掌心搓转均匀，再由第一管取一环至第二管，搓转均匀后，再由第二管取一环至第三管经同样处理后，分别倒入三个灭菌培养皿中，待凝固后，倒置于37℃温箱中培养24h观察结果。(实图6-2) (二)厌氧菌的分离培养厌氧菌的分离培养常用肉渣汤(疱肉培养基)培养法。先将试管倾斜，使培养基表面露出一点，然后接种被检材料或菌种，接种后将试管直立，即封闭液面。最后置37℃温箱中培养24～48h。 (三)细菌移植 1．斜面移植(实图6-3) (1)左手持菌种管及琼脂斜面管，一般菌种管放在外侧，斜面管放在内侧，两管口并齐，管身略倾斜，斜面向上，管口靠近火焰。 (2)右手拇指、食指及中指持接种环在酒精灯上烧灼灭菌。 (3)将斜面管的棉塞夹在右手掌心与小指之间，菌种管棉塞夹在小指与无名指之间，将二棉塞一起拔出。 (4)把灭菌接种环伸入菌种管内，挑取少量菌苔将其立即伸入斜面培养基底部，由下而上在斜面上弯曲划线，然后管口和棉塞通过火焰后塞好，接种环烧灼灭菌。

痢疾杆菌分离与鉴定培训

痢疾杆菌的分离与鉴定 濮阳市疾病预防控制中心 许银怀 第一节概述 志贺菌属（Shigellae）细菌又称痢疾杆菌，引起人类及灵长类动物细菌性痢疾。 1899年由日本人志贺首先发现。 全球每年感染人次约为1.65亿，死亡110万，发病率、死亡率居感染性腹泻之首位。 发展中国家发病率较高，如阿根廷990.6／10万、印度972.3／10万；发达国家相对较低，如美国6～12／10万、德国2.7／10万、法国0.3／10万；我国上世纪50～80年代发病率在46.37～1018.93／10万之间。 近20年痢疾发病率在法定传染病中由第一位降至第三位，但在卫生状况不良的地区，发病率仍居高不下。 人群对细菌性痢疾普遍易感，各年龄组均可受到感染，5岁以下儿童发病率最高。 据估计，在临床就诊的腹泻病人中的5%～15%是志贺菌引起的，而因腹泻死亡病例中有75%是志贺菌感染造成的。 发展中国家福氏志贺菌最常见，发达国家以宋内志贺菌为主。美国

宋内志贺菌>75%，但在男-男性行为人群仍以福氏志贺菌常见。 鲍氏志贺菌最先在印度发现，除印度次大陆地区较为常见外，其它地区较为少见。 细菌性痢疾发病有明显的季节性，发病高峰为夏秋季，通常在7～9月份。 细菌性痢疾防治仍需探索、研究内容： 细菌性痢疾在不同地区、不同人群的发病强度、分布特征、病原学特点缺乏全面、准确的数据； 缺乏快速、简便的病原学诊断方法，细菌性痢疾漏诊和误诊现象普遍； 志贺菌耐药性谱的不断扩大，细菌性痢疾抗菌治疗难度加大； 洗手、母乳喂养、安全饮水、粪便无害化处理等行之有效的干预措施的落实需要强化； 目前所用痢疾菌苗免疫保护效果仍需进一步评价。 第二节病原学 一、抗原分类 志贺菌属细菌有菌体（O）抗原，某些新分离菌株有表面（K）抗原。 (一) 菌体（O）抗原 1.型特异性抗原：多糖，光滑型菌株主要抗原；分A、B、C、D 4个群及35个抗原型。 2.群特异性抗原：光滑型菌株次要抗原，主要存在于B群，籍此将菌型分

细菌分离培养及药敏试验方法及步骤

细菌分离培养方法及操作步骤 无菌取血液或脏器、淋巴结划线接种于鲜血琼脂平板或血清琼脂平面培养基、普通肉汤培养基，37℃恒温培养24 h，观察其生长特性。目前细菌分离培养的常用方法有平板划线分离法、加热分离法和实验动物分离法。 平板划线接种法 这是目前临床上最常用的分离接种方法。它可以从被检病料中通过划线可使细菌分离、分散生长而形成单个菌落（有利于从含有多种细菌的标本中分离出目的菌），以便挑选可疑菌落作纯培养加以鉴定。具体操作： 1、右手持接种环，在酒精灯上火焰灭菌； 图1 病料采集图2 接种环灭菌 2、待接种环冷却后，挑取被检料少许，左手持琼脂平板，以食指为支点，用拇指和无名指将平皿揭开一空隙。大约20℃时，迅速地将接种环轻轻地涂布在培养基的边缘。

3、在涂布处来回移动作曲线形划线接种。（注意：划线时，以腕力使接种环在琼脂平板表面划动，尽量不要划破培养基，划的线条要密，但不能重复旧线，以免培养物形成菌苔。） 图3 平板划线接种法 4、划线完毕，合上平皿盖，将琼脂平板倒置，放入37℃温箱内培养18－24小时。 注意：分离培养用的平板培养基应表面干燥，可于临用前置37℃孵育箱内30分钟，这样表面即干燥有利于分离培养，又使培养基预温，对培养某些较娇弱的细菌有利。

细菌药敏试验方法操作步骤 药敏试验是抗菌药使用以前必不可少的一个基本环节，一个正确的药敏结果能够科学的指导养殖户用药，减少抗菌素使用的盲目性，从而减少养殖户损失。在临床实际生产中具备重要意义。 1、在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。 图4 接种环划线 2、以无菌操作将灭菌的不锈钢小管（外径为4毫米、孔径与孔距均为3毫米，管的两端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培养基上打孔，将孔中的培养基用针头挑出，并以火焰封底，使培养基能充分的与平皿融合（以防药液渗漏，影响结果）。

细菌分离培养及移植

细菌分离培养及移植 在细菌学诊断中，分离培养是不可缺少的一环。分离培养的目的主要是在含多种细菌的病料或培养物中挑选出某种细菌。在分离培养时应注意：选择适合于所分离细菌生长的培养基、培养温度、气体条件等。同时应严格按无菌操作程序进行实验，并做好标记。 [目的要求] (1)掌握细菌分离培养的基本要领和方法。 (2)掌握厌氧菌培养的原理及其方法。 [实验材料] 菌种：大肠杆菌斜面、大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合培养肉汤等。 器械：剪刀、记号笔(以上小组共用)。 培养基：普通肉汤和普通琼脂斜面、普通琼脂和鲜血琼脂平板、酒精灯、接种环(以上每人一套)。 [需氧性细菌分离培养法] 1．划线分离培养法此法为常用的细菌分离培养法。平板划线培养的方法甚多，可按各人的习惯选择应用，其目的都是达到使被检材料适当的稀释，以求获得独立单在的菌落，防止发育成菌苔，以致不易鉴别其菌落性状。划线培养时须注意以下几点：

(1)左手持皿，用左手的拇指、食指及 中指将皿盖揭开呈20。左右的角度(角度愈小愈好，以免空气中的细菌进入皿中将培养基污染)。 (2)右手持接种环，从大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合培养肉汤中取少许材料涂布于培养基边缘，然后将接种环上多余的材料在火焰中烧毁，待接种环冷却后，再与所涂材料的地方轻轻接触，开始划线，方法如图(5-l)。 (3)划线前先将接种环稍稍弯曲，这样易和平皿内琼脂面平行，不致划破培养基。 (4)划线中不宜过多地重复旧线，以免形成菌苔。 (5)接种完毕，在皿底上作好菌名、日期和接种者等标记，平皿倒扣，置37℃培养。 2．纯培养的获得与移植法将划线分离培养37℃24h的平板从温箱取出，挑取单个菌落，经染色镜检，证明不含杂菌，此时用接种环挑取单个菌落，移植于琼脂斜面培养，得到的培养物，即为纯培养物，再作其他各项试验检查和致病性试验等。具体操作方法如下：

初中八年级(初二)生物 实验四细菌的分离培养及培养性状的观察

实验四 细菌的分离培养及培养性状的观察 在细菌学检验中，细菌的分离培养是重要的基本技术之一。从混杂微生物中获得单一菌株纯培养的方法称为分离；纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细菌都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。分离培养的目的在于从被检材料中，或者从污染的众多杂菌中分离出纯的病原菌。细菌分离培养应先从被检材料或病料中分离培养单个菌落，然后钓取可疑菌落进行纯培养，再将纯培养物移植培养。 目的要求 1．学习、掌握需氧菌和厌氧菌分离培养的基本要领和技术。 2．了解细菌的菌落形态及其在各种培养基上的培养性状。 3．了解培养性状对细菌鉴别的重要意义。 4．掌握钓菌、纯培养及移植技术。 操作步骤 一．需氧性细菌分离培养法 1. 平板划线分离法 菌种被其他杂菌污染时或混合菌悬液常用平板划线法进行纯种分离，此法是借助将蘸有混合菌悬液的接种环在平板表面多方向连续划线，使混杂的微生物细胞在平板表面分散，经培养得到分散的由单个微生物细胞繁殖而成的菌落，从而达到纯化目的。 但划线分离的培养基必须事先倾倒好，需充分冷凝待平板稍干后才可使用；为便于划线，一般培养基不宜太薄，每皿约倾倒20 ml 培养基，培养基应厚薄均匀，平板表面光滑。划线分离主要有连续划线法（图4-1）和分区划线法（图4-2）两种。划线法示意图见图4-3。 （1）连续划线法 以无菌操作用接种环直接取 平板上待分离纯化的菌落。将菌种 点种在平板边缘一处，取出接种环， 烧去多余菌体。将接种环再次通过 稍打开皿盖的缝隙伸入平板，在平 板边缘空白处接触一下使接种环 冷却，然后从接种细菌的部位在平 板上自左向右轻轻划线，划线时平 板面与接种环面成30～40度角， 以手腕力量在平板表面轻巧滑动 划线，接种环不要嵌入培养基内划破培 养基，线条要平行密集，充分利用平板 表面积，注意勿使前后两条线重叠。划 线完毕，关上皿盖。灼烧接种环，待冷 却后放置接种架上。培 养皿倒置于适宜 的恒温箱内培养。培养后在划线平板上 观察沿划线处长出的菌落形态，涂片镜检为纯种后再接种斜面。 (2)分区划线法（四分区划线法） 取菌、接种、培养方法与“连续划线法”相似。分区划线法划线分离时平 图4-1连续划线法 图4-2分区划线法 图4-3 划线分离示意图

细菌的分离培养及培养性状的观察

实验四 细菌的分离培养及培养性状的观察 在细菌学检验中，细菌的分离培养是重要的基本技术之一。从混杂微生物中获得单一菌株纯培养的方法称为分离；纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细菌都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。分离培养的目的在于从被检材料中，或者从污染的众多杂菌中分离出纯的病原菌。细菌分离培养应先从被检材料或病料中分离培养单个菌落，然后钓取可疑菌落进行纯培养，再将纯培养物移植培养。 目的要求 1．学习、掌握需氧菌和厌氧菌分离培养的基本要领和技术。 2．了解细菌的菌落形态及其在各种培养基上的培养性状。 3．了解培养性状对细菌鉴别的重要意义。 4．掌握钓菌、纯培养及移植技术。 操作步骤 一．需氧性细菌分离培养法 1. 平板划线分离法 菌种被其他杂菌污染时或混合菌悬液常用平板划线法进行纯种分离，此法是借助将蘸有混合菌悬液的接种环在平板表面多方向连续划线，使混杂的微生物细胞在平板表面分散，经培养得到分散的由单个微生物细胞繁殖而成的菌落，从而达到纯化目的。 但划线分离的培养基必须事先倾倒好，需充分冷凝待平板稍干后才可使用；为便于划线，一般培养基不宜太薄，每皿约倾倒20 ml 培养基，培养基应厚薄均匀，平板表面光滑。划线分离主要有连续划线法（图4-1）和分区划线法（图4-2）两种。划线法示意图见图4-3。 （1）连续划线法 以无菌操作用接种环直接取 平板上待分离纯化的菌落。将菌种 点种在平板边缘一处，取出接种 环，烧去多余菌体。将接种环再次 通过稍打开皿盖的缝隙伸入平板， 在平板边缘空白处接触一下使接 种环冷却，然后从接种细菌的部位 在平板上自左向右轻轻划线，划线 时平板面与接种环面成30～40度 角，以手腕力量在平板表面轻巧滑 动划线，接种环不要嵌入培养基内划破培养基，线条要平行密集，充分利用平 板表面积，注意勿使前后两条线重叠。 划线完毕，关上皿盖。灼烧接种环，待 冷却后放置接种架上。培 养皿倒置于适 宜的恒温箱内培养。培养后在划线平板 上观察沿划线处长出的菌落形态，涂片 镜检为纯种后再接种斜面。 (2)分区划线法（四分区划线法） 取菌、接种、培养方法与“连续划 线法”相似。分区划线法划线分离时平 板分4个区，故又称四分区划线法。其中第4区是单菌落的主要分布区，故其划线面积应最图4-1连续划线法 图4-2分区划线法 图4-3 划线分离示意图

病原菌的分离培养和纯化

普通植物病理学 实验十七、病原菌的分离培养和纯化 一、目的要求 (1)了解分离与纯化微生物的基本原理及方法。 (2)掌握倒平板的方法和组织分离、稀释分离、平板划线分离的基本操作技术。 (3)掌握在平板、斜面及液体培养基上培养病原菌及观察其培养性状的方法。 二、基本原理植物病原菌的分离培养，是植物病理实验室工作中的基本技能。为了获得某微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件，即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而得到纯菌株。植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种。最常用的方法是组织分离法，而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离。病原细菌的分离方法以划线分离法为最常用，在有些情况下也采用稀释分离法。为了获得分离菌的纯培养，必须要进行分离菌的纯化，纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法。 三、材料、仪器与用具 1．材料(依当地情况进行选择，下列材料供参考) (1)稻瘟病叶、病节、病穗颈(pyricularia orycae)。 (2)玉米大斑病叶(exserohilum turcicum)。 (3)玉米弯孢菌叶斑病叶(curvularia lunata)。 (4)玉米小斑病叶(bipolaris maydis)。 (5)番茄灰霉病果(botrytis cinefca)。

(6)黄瓜菌核病果(sclerotinia sclerotiorum)。 (7)黄瓜细菌性角斑病叶(pseudomonas syringaepv．1achrymans)。 (8)水稻白叶枯病叶(xanthomonas campestms 。 (9)大豆细菌性斑点病叶(pseudomonas syringaepv．glycinea)。 (10)白菜软腐病叶(erudnia carotovora subsp．carotovora)。 2．培养基pda培养基；肉膏蛋白胨培养基；加寄主组织煎汁的培养基等。 3．仪器与用品超镜工作台、培养箱、培养皿、吸管、吸水纸、三角玻璃棒、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲(针)、接种环(铒)、70％酒精、0．1％升汞、酒精灯、火柴、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉、铝锅等。0．1％升汞溶液配制：升汞1e 浓盐酸2．5ml 蒸馏水1000ml。先将升汞溶于盐酸中，待充分溶解后，再加水稀释。升汞是剧毒药物，在操作时应特别小心。 四、实验操作 (一)病原真菌的分离 1．组织分离法按照以下步骤进行： (1)取灭菌培养皿一个，置于湿纱布上，在皿盖上用玻璃铅笔注明分离日期、材料和分离人的姓名。提示：为了保证无菌操作，应注意下面几点：工作前最好将所需的物品都放在超净工作台内，工作中临时去取容易带来杂菌；保证工作人员自身的洁净，工作前用肥皂洗手；无菌操作前还要用70％酒精擦拭双手；工作中，特别在使用无菌操作间时，呼吸要轻，不要说话。 (2)用无菌操作法向培养皿中加入25％乳酸1--2滴(可减少细菌污染)，然后将融化而冷至60c 左右的pda培养基倒人培养皿中，每皿倒10--15ml，轻轻摇动使之成平面。凝固后即成平板培养基。提示：加入25％乳酸1～2滴，可基本保证平板上不出现污染细菌苗落。除乳酸外，在培养基中加入适当的抗菌素抑制细菌的生长，也是常用的方法。加青霉素(20μg／ml)可以抑制g+细菌生长；加多黏霉素b(5．0μg／ml)可以抑制g—细菌生长；加链霉素(40μg／ml)或氯霉素(50μg／ml)可以抑制大部分细菌的生长。除了氯霉素可在灭菌前加入外，其他抗菌素都应在灭菌后并冷却到45c左右(以手背触三角瓶感到烫，但尚可以忍耐为宜)’时加

实验四细菌的分离培养及培养性状的观察

实验四细菌的分离培养及培养性状的观察 在细菌学检验中，细菌的分离培养是重要的基本技术之一。从混杂微生物中获得单一菌株纯培养的方法称为分离；纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细菌都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。分离培养的目的在于从被检材料中，或者从污 1 2 连续划线，使混杂的微生物细胞在平板表面分散，经培养得到分散的由单个微生物细胞繁殖而成的菌落，从而达到纯化目的。但划线分离的培养基必须事先倾倒好，需充分冷凝待平板稍干后才可使用；为便于划线，一般培养基不宜太薄，每皿约倾倒20ml培

养基，培养基应厚薄均匀，平板表面光滑。划线分离主要有连续划线法（图4-1）和分区划线法（图4-2）两种。划线法示意图见 图4-3。 （1）连续划线法 将菌 取出接 养后在划线平板上观察沿划线处长出的菌落形态，涂片镜检为纯 种后再接种斜面。 (2)分区划线法（四分区划线法） 取菌、接种、培养方法与“连续划线法”相似。分区划线法

划线分离时平板分4个区，故又称四分区划线法。其中第4区是单菌落的主要分布区，故其划线面积应最大。为防止第4区内划线与1、2、3区线条相接触，应使4区线条与1区线条相平行，这样区与区间线条夹角最好保持120度左右。先将接种环蘸取少量菌在平板上1区划3-5条平行线，取出接种环，左手关上皿盖， 2次平 . 至约 分摇匀后，自第一管取一接种环内容物至第二管，以同样方法自第二管移种至第三管。然后分别倾注一个已灭菌的平皿，凝固后倒转置于37℃温箱内培养24h。结果多数细菌在琼脂内生长成菌落，仅少数菌落出现在表面，通常第一个平板内的菌落数较多而

密集，第二、三个平板则逐渐减少，可见单个菌落。 3.芽胞需氧菌分离培养法 如果被检材料中可疑有带芽孢的细菌，可先将被检材料加少量生理盐水或肉汤，置于80℃水浴箱中维持15～20分钟，或85℃加热10分钟，再进行培养。材料中若有带芽孢的细菌仍可存活而 而对 放入灭菌乳钵或组织匀浆器内，加3～5倍量无菌生理盐水制成混悬液，吸取一定量混悬液注射（肌肉、腹腔、皮下或静脉）入易感实验动物,待实验动物死后，取其脏器，常可分离到纯的病原菌。例如，疑有猪丹毒杆菌存在的病料，可注射于鸽体，鸽死后，再

细菌鉴定学习

现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌,请你鉴定其革兰氏染色反应.你 怎样运 传统的细菌革兰氏染色法操作繁琐，初学者不易掌握，寻找一种简便方法。方法：玻璃片上将细菌与碱液混合，用接种环或接种针往上挑，观察有无丝状物出现，我们把它叫作“细菌拉丝实验”。结果：用本法鉴别细菌革兰氏染色性质，G＾－菌有丝状物出现，即拉丝实验阳性，G＾＋菌无丝状物，拉丝实验阴性经过对照使用，本法具有快速，准确，简便，结果易判断，成本低廉等优点，值得推广应用。 由于细菌细胞壁的结构不同，革兰氏染色法可使有的细菌染上初染的的紫色，为革兰氏阳性细菌，有的细菌染上复染的的红色，为革兰氏阴性细菌。大肠杆菌是革兰氏阴性菌，染色后为红色，细菌形态为短小的杆状，单个存在。枯草杆菌是革兰氏阳性菌，染色后为紫色，细菌形态为杆状，比大肠杆菌大，可排成链状的，有的菌体里有椭圆芽孢（无色）或在视野中有散在的芽孢。 实验十肠杆菌科 肠杆菌科(Enterobacteriaceae)是一大群寄居于人和动物肠道中、生物学性状相似的革兰阴性杆菌。多数为肠道的正常菌群，但在机体免疫力低下或寄居部位发生改变时可引起感染。根据其生化反应、血清学试验、DNA同源性等可将肠杆菌科分为120多个菌种，其中与医学密切相关的有埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属等。 一、大肠埃希菌 大肠埃希菌(E. coli)俗称大肠杆菌，是寄居于人和动物肠道的正常菌群。当机体抵抗力下降、该菌侵入肠外组织或器官，可引起急性炎症或继发感染；有些血清型可引起腹泻。从水和食品中检出较多大肠杆菌时，可判断它们已被粪便污染。因此，大肠杆菌常被作为饮水、牛乳及食品的卫生学检测指标。 （一）形态与培养特性 【材料与方法】 1．大肠杆菌革兰染色标本片。 2．大肠杆菌普通琼脂平板、SS平板、中国蓝平板、伊红美蓝(EMB)平板培养物。 【结果】 1．大肠杆菌为革兰阴性、中等大小杆菌，两端钝圆或稍弯曲，呈分散排列。 2．菌落特征(表10-1)。 表10-1 大肠杆菌在普通琼脂平板及选择鉴别培养基上的菌落特征 培养基菌落特征 普通琼脂平板圆形，中等大小，灰白，整齐，光滑菌落 SS平板呈红色 中国蓝平板呈蓝色 伊红美蓝平板呈紫黑色，有金属光泽 （二）生化反应 【材料与方法】 1．取大肠杆菌、产气杆菌分别接种于葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖发酵管，37℃培养24h，观察结果。 2．取大肠杆菌、产气杆菌分别接种于双糖铁培养基，37℃培养24h，观察结果。 3．靛基质产生、甲基红、VP、枸橼酸盐利用试验(IMViC试验)，见实验四。 【结果】

实验四 细菌、真菌、放线菌的分离与培养

实验报告 课程名称：环境微生物学实验实验类型：综合实验 实验项目名称：微生物的分离与培养与菌落观察 学生姓名：专业：环境工程学号： 同组学生姓名： 指导老师： 实验地点：实验日期：2018 年 10月16日 一、实验目的和要求 1.掌握微生物接种培养技术 2.掌握微生物分离纯化技术 3.学习并掌握放菌落形态结构的观察方法，认识并理解它们的形态特征。 二、实验内容和原理 土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现具有重要价值微生物的主要菌源。在不同土壤中，各类微生物的数量千差万别。为了分离获得某种微生物,需要预先制备不同稀释度的菌悬液，并添加相应的抗生素抑制不需要的微生物，例如，添加链霉素25~50U/mL抑制细菌;添加0.5%重铬酸钾液或制霉素50 U/mL 抑制霉菌。通过10倍稀释以及平板分离、平板涂布和平板划线等操作，微生物可在平板上分散成单个的个体，经过适宜条件培养，单个个体可形成单个菌落。挑取单个菌落转接至新鲜平板上，即可使目的菌种纯化。 1.菌种的分离纯化：从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离 与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分 离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“单一性”，防止其他微生物的 混入。 2.平板涂布法：因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且 采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微 生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。用途上，一般多用于从菌种的纯化;优点是可 以观察菌落特征，对混合菌进行分离;但不能计数 3.平板划线法：最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表 面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落 的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。用途一般多用于筛选菌株。一般用 于平板培养基的回收率计数。优点是可以计数，可以观察菌落特征。缺点是吸收量较少，较麻烦，平板不于燥效果不好，容易蔓延。如果菌液密度天的话，长不出单菌落。 4.稀释倒平板法：稀释倒平板法是将细菌与液态的培养基混合后倒入培养皿再冷却凝固，使样品中 的微生物细胞充分分散开，使其均匀分布于平板中的培养基内。经培养后，单个细胞及聚在一起 的细胞可以生长繁殖，形成一个肉眼可见的菌落，统计菌落数目，即可用以评价样品中的微生物 的数量。所以细菌在培养基的内部和表面都有,适合厌氧型微生物。 5.菌种保藏：菌种保藏是将微生物的菌种经长时间的保存，不污染其它杂菌，及可保持其形态特征 和生理性状，减少变异，防止衰老，以便于将来使用。保藏菌种一-般是选用它的休眠休，如孢 子;芽孢等等，并且要创造一一个低温;干燥; 缺氧;避光和缺少营养的环境条件，以利于休眠体 能长期地处于休眠状态。对于不产孢子的微生物，应使其新陈代谢处于最低状态，又不会死亡，

实验四 细菌的划线分离与培养

实验四细菌的划线分离与培养 一、实验前要说明的几点问题 点名,查看学生出勤情况。总结上次作业，提出作业中出现的问题并讲解。 二、板书部分 （一）目的要求 1.掌握需氧菌分离培养的基本要领。 2.了解厌氧菌的分离培养原则及方法。 （二）实验容 1.用普通琼脂平板做一次划线分离培养。 2.用普通肉汤做一管大肠杆菌的移植培养。 3.用普通琼脂斜面做一管金黄葡萄球菌的移植培养。 4.用划线法进行真菌的分离培养（示教） （三）作业 1.为什么要进行细菌的分离培养？ 2.进行分离培养应注意哪些事项？ 3.细菌分离培养的方法有哪些？（重点叙述平板划线法） 4.叙述真菌的划线分离方法。 三、实验容 主要容有分离培养及目的、注意事项、分离培养的方法、真菌的培养方法、患病动物病料中分离培养、钓菌、移植。 1.什么是分离培养及目的：分离培养是细菌学检验的基本技术之一。分离培养之目的，在于从被检材料中由多种细菌里分离出一种细菌。 2.注意事项： 1）分离培养前应考虑所分离的细菌的特性，选择适合其生长需要的培养基（需氧还是厌氧、营养的要求高还是不高、培养温度等）等。例如：链球菌在普通琼脂不长，要加血清或血液。大肠杆菌和葡萄球菌要求较低，普通的培养基即可生长。 2）防止污染。分离培养的整个过程要严格无菌操作。培养基和一切用具必

须彻底灭菌；操作时必须靠近火焰；操作完毕后，禁止再让培养基接触外界空气。 3）防止接种器械过热，很容易杀死分离培养的细菌，如接种环在烧灼灭菌后，不能立即钓取细菌材料，应在酒精灯旁凉凉；另外还应注意防止已钓取菌料的接种环，不慎通过火焰而将细菌杀死。 4）初代分离时发现有多种细菌，观察找到目的菌落，再拿一肉汤培养基纯化培养。然后在接种实验动物，作成凝集抗原，做血清学鉴定，。还可以反过来做抹片染色观察。 3.分离培养的方法： 主要分需氧菌的分离培养方法、厌氧菌的分离培养方法和需要CO菌的培养分离方法。 1）需氧菌的分离培养法 （1）平板划线法：划线后有单个菌落，便于观察菌落的形态、溶血性等。方法左手拿琼脂平板，使其与水平面成45。角；右手拿铂金耳，使之与水平面平行，靠近酒精灯火焰操作。将接种环于酒精灯火焰中灼烧灭菌，待其冷却后，蘸取欲检材料少许，注意不要划破琼脂，不要划得太疏，以免造成浪费，不要重复划线，以免形成菌苔。划线方法：方格划线、蛇形划线、区域划线、交叉划线，选择其中一种进行划线。划毕，将接种环烧灼灭菌，于皿底用蜡笔标记被检材料名称及日期，倒转置恒温箱中培养。 思考题：方格划线哪个地方会长出单个菌落比较多？ （2）倾注法：不常用，这里不做介绍 2）厌氧菌的分离培养方法 厌氧菌生长繁殖的环境不能有游离氧的存在。故在培养厌氧菌时，必须创造一个厌氧环境，一般以降低氧的力或保持减低的氧力为原则。目前应用于厌氧菌的分离方法颇多，现就其中较简便且常用的几种方法介绍如下： （1）焦性没食子酸法利用焦性没食子酸在碱性溶液能大量地吸收氧的原理进行厌氧培养。通常100cm3空间用焦性没食子酸1g，10%氢氧化钠或氢氧化钾10ml。具体方法有下列有平板培养法、干燥器培养法。平板培养法是将厌氧菌划线接种于适宜的琼脂平板，取一小团直径约2cm的脱脂棉，置于平皿盖的面中央，其上滴加10%氢氧化钠溶液约5ml；在靠近脱脂棉的一侧放置焦性没食子酸约

细菌分离纯化及鉴定protocol

细菌分离纯化培养及鉴定protocol 样品菌株分离： 准备工作 1用报纸将平板包好（约12个一包）灭菌后放入烘箱烘干，最好隔夜； 2按照培养基的配方配制好液体培养基后，调pH值（注意灭菌后培养基pH会略有升高），其中一定体积液体培养基中加入1.5%的琼脂后，倒入锥形瓶并用滤膜封好待灭菌。注意培养基的体积总量不能超过锥形瓶的三分之二，约一半左右；剩余液体培养基加入试管中，每支5ml（其中3ml用于保种，2ml用于提取菌株基因组DNA），用胶塞封好，与加入琼脂的锥形瓶一起灭菌； 3将无菌超净台打开紫外灯灭菌约20分钟，将灭好菌的培养基放置冷却到不烫手后，在超净台中操作倒入到已烘干的培养皿中，每块板中倒入约20ml，厚度约为培养皿的1/3~1/2之间。倒好后的培养皿叠放在超净台内，待培养皿中培养基冷却凝固之后即可使用。暂时不用的，可先用封口膜封好并标记好培养基名称存放好。4在培养皿上写清样品名称，标注日期，姓名。用枪加入100uL液体样品到培养皿上，尽量把培养皿托平，将涂布玻棒插入酒精中取出在酒精灯外焰灼烧完全，待冷却后，在酒精灯下将液体涂布均匀（最好涂布至培养基将液体全部吸收）。 5将涂好的培养皿正置培养2小时后，用封口膜封好，倒置培养。

定时观察平板，描述菌落的颜色、形状，记录菌落数并拍摄照片。划线分离纯化： 1待涂布好的培养皿上长出单菌落后，用挑取同一培养皿中不同颜色、不同形状的菌落进行划线分离纯化，挑取的菌落用记号笔标出。 2将接种针在酒精灯外焰灼烧完全，稍冷却后，在平板上进行Z字形三个方向划线。 3若在新板上又长出新菌落，再次分离划线 4划线需做至少2－3次，直至菌落完全纯化（纯化步骤很关键） 保种： 1 将已纯化的细菌用灭菌的牙签蘸取接种入试管内（注意要取单菌落），摇床150r/min， 28℃培养，直到其生长至指数期 2在2ml冻存管（预先灭菌并烘干）中加入1ml 30%甘油（甘油预先配置好灭菌后待用），再加入1ml上述1中的菌液，盖紧管盖，混匀后在管壁做好样品标记和日期，同时在实验记录本上做好记录3以上每个样做三管，做好记录，放入冷存盒，放入－80度冰箱内，记录存放位置。 4将同一试管内剩余的2ml细菌培养液加入到灭过菌的2ml试管中待提取DNA。 DNA的提取：可采用细菌基因组DNA抽提试剂盒或手提的方法进行

细菌的分离与培养

细菌的分离与培养 实验目的： 掌握在各种培养基上的接种方法并观察生长现象。 实验材料： 菌种、普通琼脂平板、肉汤培养基、半固体培养基、斜面培养基、接种环、接种针、酒精灯。实验内容： 一、平板划线接种法（分离培养法） 原理：通过在平板上划线，将混杂的细菌在琼脂平板表面充分的分散开，使单个细菌能固定在一点上生长繁殖，形成单个菌落，以达到分离纯种的目的。若需从平板上获取纯种，则挑取一个单个菌落作纯培养。 用途：分离出纯种细菌，以利作纯培养。 课时安排：2课时 操作方法（三区划线法）： 1、右手拿接种环，烧灼冷却后，取菌液一环。 2、左手抓握琼脂平板（让皿盖留于桌上），在酒精灯火焰左前上方，使平板面向火焰，以免空中杂菌落入，右手将已沾菌的接种环在琼脂表面密集而不重叠的来回划线，面积约占整个平板的1/5-1/6，此为第一区。划线时接种环与琼脂呈30-40度角轻轻接触，利用腕力滑动，切忌划破琼脂。 3、接种环上多余的细菌可烧灼（每划完一个区域是否需要烧灼灭菌视标本中含菌量多少而定），待冷后，在划线末端重复2-3根线后，再划下一区域（约占1/4面积），此为第二区。 4、第二区划完后可不烧灼接种环，用同样方法划第三区，划满整个平皿。 5、划线完毕，将平板扣入皿盖并作好标记，置37℃温箱孵育18-24小时观察琼脂表面菌落分布情况，注意是否分离出单个菌落，并记录菌落特征（如大小、形状、透明度、色素等）。 二、液体培养基接种法 用途：凡肉汤、蛋白胨水，各种单糖发酵均用此法接种。可以观察细菌不同的生长性状、生化特性以供鉴别之用。 操作方法： 右手执笔式握住接种环，灭菌冷却后取单个菌落。 1、左手拇指、食指、中指托住液体培养基之下端，右手小指和无名指（或手掌）拔取试管塞，将管口移至火焰上旋转烧灼。 2、将沾菌的接种环移入培养基管中，在液体偏少侧接近液面的管壁上轻轻研磨，沾取少许液体与之调和，使菌液混合于培养基中（图5）。 3、管口通过火焰，塞好试管塞，将接种环灭菌后放下，经37℃温箱孵育18-24小时，取出观察生长情况。 三、半固体穿刺接种法 用途：观察细菌动力，保存菌种。方法： 1、以无菌操作用接种针挑取单个菌落，立即垂直插入培养基中心至接近管底处循原路退回。 2、管口通过火焰，塞上棉塞，接种针灭菌后放下。试管置37℃温箱孵育18-24小时，取出后对光观察穿刺线上细菌生长情况：细菌有无向周围扩散生长，穿刺线是否清晰等。 图5 液体（左）及半固体（右）培养基接种法 四、斜面培养基接种法 用途：常用于扩大纯种细菌及实验室保存菌种。

细菌的分离培养技术

细菌的分离培养技术 一、常用培养基的制备 （一）肉膏汤培养基 (broth medium) 1、成分牛肉浸膏3～5g　蛋白胨10g　氯化钠5g　蒸馏水1000ml 2、制法 (1)于1000ml蒸馏水中加入上述成份，混合加热溶解。 (2)调整pH为7.4～7.6，煮沸3～5min，用滤纸过滤。 (3)分装于适当容器内，高压灭菌103.43Kpa 20min ,置阴暗处或冰箱中贮存备用。 3、用途供一般细菌培养之用，亦可制备糖发酵管及琼脂培养基用。 （二）肉浸汤培养基(infusion medium) 1、成分 ⑴新鲜牛肉(去脂绞碎)500g　蛋白胨10g ⑵氯化钠5g　蒸馏水1000ml 2、制法 (1)取新鲜牛肉(兔肉)除去肌键、肌膜及脂肪，切成小块后用绞肉机绞碎或用刀剁碎，置于 糖瓷或铝制锅中，每500g碎肉加水1000ml混合后置冰箱中过夜。 (2)次日取出肉浸液，搅拌均匀，煮沸30min并常搅拌以免沉淀烧焦。如蛋白质已凝固， 即停止加温，补足失去水分。 (3)用纱布或绒布挤压过滤，使所有肉汁尽量挤出，再用脱脂棉滤入大三角烧瓶内。 (4)在滤液中加入蛋白胨(10g/L)、氯化钠(5g/L)，再加热使其全部溶解。 (5)调整pH至7.6～7.8，煮沸10min，以滤纸过滤。 (6)分装三角烧瓶，塞好棉塞，再用厚纸将瓶口扎好，高压灭菌103.43KPa 20min，冷却 后置阴暗或冰箱中保存备用。 3、用途 供作基础培养基用，营养较肉膏汤好。一般营养要求不高的细菌均能生长。 （三）普通琼脂培养基(agar medium) 1、成分

牛肉浸膏3～5g　蛋白胨10g　氯化钠5g　琼脂20～25g 蒸馏水1000ml 2、制法 ⑴将上述成分置于三角烧瓶中，煮沸使其溶解(须防止外溢)，并补足由于蒸发失去的水分。 ⑵趁热调整pH至7.6，以绒布过滤，分装试管或烧瓶内，高压灭菌103.43KPa 15min。 ⑶琼脂斜面培养基制法：高压灭菌后，趁琼脂尚未凝固前，将其分装在已灭菌的试管内，斜放在台面上，待凝固后即成琼脂斜面培养基。 琼脂平板培养基制法：经高压灭菌后的培养基冷却至50～55℃时，打开瓶口棉塞，将琼脂倒入已灭菌的平皿内(直径9cm 的平皿约需培养基20ml)，待凝固后即成琼脂平板培养基。平板培养基制成后，通常都是倒置的，这种放置既便于取放，又有利于避免水分蒸发，以及保持无菌状态。普通琼指培养基亦可用市售的营养琼脂粉制备。取4.5g营养琼脂粉加蒸馏水100ml，高压蒸汽灭菌后倾注平皿即成。 3、用途供一般细菌培养用，并可作无糖培养基。 （四）半固体琼脂培养基(soft agar medium) 1、成分 ⑴牛肉浸液(或牛肉膏汤)100ml ⑵琼脂0.25～0.5g 2、制法 ⑴将琼脂加于肉浸液中，加热溶化。 ⑵以绒布过滤并分装试管，每管约1～1.5ml。 ⑶高压灭菌103.43KPa 20min后，直立放置，待凝固后即成高层培养基，保存备用。 3、用途保存一般菌种用，并可观察细菌的动力。 （五）血液琼脂培养基(blood agar medium) 1、配方一： ⑴成分： ①普通琼脂培养基100ml ②脱纤维羊血(兔血)8～10ml ⑵制法 ①将高压灭菌后的普通琼脂培养基(pH7.6)加热融化。

细菌的分离及注意事项

2.注意事项：1）分离培养前应考虑所分离的细菌的特性，选择适合其生长需要的培养基（需氧还是厌氧、营养的要求高还是不高、培养温度等）等。例如：链球菌在普通琼脂不长，要加血清或血液。大肠杆菌和葡萄球菌要求较低，普通的培养基即可生长。2）防止污染。分离培养的整个过程要严格无菌操作。培养基和一切用具必须彻底灭菌；操作时必须靠近火焰；操作完毕后，禁止再让培养基接触外界空气。3）防止接种器械过热，很容易杀死分离培养的细菌，如接种环在烧灼灭菌后，不能立即钓取细菌材料，应在酒精灯旁凉凉；另外还应注意防止已钓取菌料的接种环，不慎通过火焰而将细菌杀死。4）初代分离时发现有多种细菌，观察找到目的菌落，再拿一肉汤培养基纯化培养。然后在接种实验动物，作成凝集抗原，做血清学鉴定，。还可以反过来做抹片染色观察。 3.分离培养的方法：主要分需氧菌的分离培养方法、厌氧菌的分离培养方法和需要CO菌的培养分离方法。1）需氧菌的分离培养法（1）平板划线法：划线后有单个菌落，便于观察菌落的形态、溶血性等。方法左手拿琼脂平板，使其与水平面成45。角；右手拿铂金耳，使之与水平面平行，靠近酒精灯火焰操作。将接种环于酒精灯火焰中灼烧灭菌，待其冷却后，蘸取欲检材料少许，注意不要划破琼脂，不要划得太疏，以免造成浪费，不要重复划线，以免形成菌苔。划线方法：方格划线、蛇形划线、区域划线、交叉划线，选择其中一种进行划线。划毕，将接种环烧灼灭菌，于皿底用蜡笔标记被检材料名称及日期，倒转置恒温箱中培养。2）厌氧菌的分离培养方法厌氧菌生长繁殖的环境不能有游离氧的存在。故在培养厌氧菌时，必须创造一个厌氧环境，一般以降低氧的张力或保持减低的氧张力为原则。目前应用于厌氧菌的分离方法颇多，现就其中较简便且常用的几种方法介绍如下：（1）焦性没食子酸法利用焦性没食子酸在碱性溶液内能大量地吸收氧的原理进行厌氧培养。通常100cm3空间用焦性没食子酸1g，10%氢氧化钠或氢氧化钾10ml。具体方法有下列有平板培养法、干燥器培养法。平板培养法是将厌氧菌划线接种于适宜的琼脂平板，取一小团直径约2cm 的脱脂棉，置于平皿盖的内面中央，其上滴加10%氢氧化钠溶液约5ml；在靠近脱脂棉的一侧放置焦性没食子酸约0.5g,注意暂勿使两者接触，立即将已接种好的平板覆盖于平皿盖上，，迅速用融化的石蜡密封平皿边缘周围。封毕，轻轻摇动平皿，使被氢氧化钠溶液浸湿的脱脂棉与焦性没食子酸接触，然后置37℃恒温箱中培养之。干燥器培养法是于干燥器底部放入氢氧化钠溶液适量，然后再放入2-3个略高于液面的玻璃圆柱（如链霉素小瓶），将适量焦性没食子酸用纸或纱布包好，放置于圆柱上面，使暂勿与氢氧化钠接触，然后放下隔板，将已接种的培养皿或试管置于隔板上，待一切准备好后，将盖盖好密封，并轻轻摇动干燥器，使焦性没食子酸落入氢氧化钠溶液中。（2）高层琼脂柱摇震培养分离法取长约15cm，直径约5mm的玻璃棒一支，一端塞以小木塞，另一端塞以棉花塞，高压灭菌备用；加热融化一管适合分离厌氧菌用的琼脂培养基，待冷却至50℃左右，接入少许经适当稀释的待分离的培养物或含菌材料，充分摇震均匀；在琼脂凝固前，迅速以无菌滴管吸取上述已接种的琼脂培养基，注入上述（1）准备好的玻璃管内，置恒温箱中培养。（3）连二亚硫酸钠法将已接种的平板或斜面培养基，置于一玻璃干燥器内（预先测出体积），按每1000ml容积称取连二亚硫酸钠（又称保险粉）和无水碳酸钠各4g，并分别研细均匀，临用前混合置于一平皿内，放在培养基上层，然后将盖盖严，用凡士林密封，置37℃恒温箱中培养。2）二氧化碳培养法少数细菌如布氏杆菌（牛型），在含有10%二氧化碳的环境下生长良好。要创造这样的环境，常用的方法为烛缸法。将接种的培养基置玻璃干燥器或其他可以密闭的玻璃缸内，于其内点燃一小段蜡烛，加上盖（盖边涂凡士林以防漏气），约一分钟左右蜡烛熄灭，此时缸内氧气已被耗尽，缸内所含二氧化碳约10%。注意蜡烛勿太长，而且不宜靠近缸壁，以免因局部玻璃过热而破裂。凡士林不能太多也不能太少，多了盖子滑落，少了则封口不严。

病原细菌的分离与鉴定

病原细菌的分离与鉴定.txt24生活如海，宽容作舟，泛舟于海，方知海之宽阔；生活如山，宽容为径，循径登山，方知山之高大；生活如歌，宽容是曲，和曲而歌，方知歌之动听。病原细菌的分离与鉴定 发布日期：2009-05-09 浏览次数：827 字号：[ 大中小 ] 一、实验目的 系统学习兽医临床病原细菌的分离与鉴定技术，促进学生系统掌握各类病原细菌的基本特性与实验诊断技术，增强学生应用所学知识解决生产实践过程中的传染病的诊断和防控问题的能力，为预防、控制和消灭畜禽病原微生物，保障畜牧业生产的健康发展服务。 二、知识背景 细菌分离是细菌学检验中的极其重要的环节。正确的分离有助于很快得到可疑的致病菌，对疫病的诊断与防控至关重要。在细菌分离时应注意的事项： 1．病料采集 （1）病料的种类主要决定于疫病的性质，一般方法为： ①全身感染→血液及内脏； ②局部感染→病患部位； ③特殊病例→特殊处理。特殊情况的正确处理与操作者的专业知识有很大关系。无论全身或局部感染，均应采含菌最多或病变明显的组织 （2）病料的采集时间也应特别注意： ①活体病料→应考虑病原在疾病发展过程中部位的变化； ②患畜死后→应立即采集病料，越早越好。 2．无菌操作 无菌操作是指在微生物研究过程中，既要避免各种外界的微生物进入操作对象又要杜绝操作对象污染周围环境的操作技术。 无菌操作是对微生物学工作者最基本的要求，必须经过严格训练才能形成无菌操作素养。不论何种情况下，头脑中都应该有这个概念。 无菌操作贯穿于整个分离过程，例如：病料的采集、器材的准备、具体的操作。所用器械及物品均应事先灭菌备用，金属器具包装后高压灭菌或煮沸30min，玻璃器皿可高压灭菌也可

细菌分离及鉴定的实验方案

从土壤里分离及鉴定细菌的实验方案 1实验材料：新鲜土壤。 a)培养基：灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基；高氏一号培养基；马铃薯蔗糖培养基； 细菌半固体培养基；淀粉培养基；葡萄糖酵解培养基；乳糖酵解培 养基；LB培养基 b)试剂：草酸铵结晶紫染液、番红复染液等各种染料以及卢戈氏碘液、95% 乙醇、5%孔雀绿水溶液、无菌水等 c)仪器：有玻璃珠100ml三角瓶（1）、培养皿（50套）、试管（20支）、移液 管（3支）、烧杯、玻璃棒、载玻片、盖玻片、光学显微镜、涂布棒、U 型管、德汉氏小管、酒精灯、漏斗、接种环、滤纸、棉塞、牛皮纸、无 菌操作台、灭菌锅、纱布，电子天平、记号笔，火材等 相关培养基的配方:

1.1实验总流程 1土壤取样：

2制备土壤稀释液： 2.1. 称取土壤1g，放入99mL无菌水的三角瓶中，振荡20min，即为稀释10-2的土壤悬液。 2.2. 另取装有9mL无菌水试管5支，用记号笔分别编上10-3、10-－4、10-5、10-6。取已稀释成10-2的土壤液，振荡后静止0.5min，用无菌吸管吸取1mL土壤悬液加入10-3的无菌水的试管中，并在试管内轻轻吹吸数次，使之充分混匀，即成10-3土壤稀释液。同法依次连续稀释至10-4、10-5 、10-6,10-7土壤稀释液。 在土壤稀释过程中，需换用不同的吸管（或枪头） 3倒平板富集培养 3.1 按照配方分别在三种培养基上富集培养，每一个稀释梯度每一个培养做三个平行实验。 3.2吸取稀释液 取一吸管，以无菌操作法分别吸取10-4、10-5、10-6,10-7土壤稀释液0.1mL，加在已制好的平板培养基上。 3.3涂板 用玻璃刮铲将稀释液在培养机上充分混匀铺平，倒置于恒温箱培养。 3.4计算出每克土壤中细菌的数量。 细菌数=某一培养皿内真菌的菌落数×该培养皿接种液的稀释倍数即得 4分离 4.1配置LB培养基