脂肪酶的概述及应用
脂肪酶得概述与应用
一脂肪酶概述、
脂肪酶(Lipase,甘油酯水解酶)隶属于羧基酯水解酶类,能够逐步得将甘油三酯水解成甘油与脂肪酸。脂肪酶存在于含有脂肪得动、植物与微生物(如霉菌、细菌等)组织中。包括磷酸酯酶、固醇酶与羧酸酯酶。脂肪酸广泛得应用于食品、药品、皮革、日用化工等方面脂肪酶广泛得存在于动植物与微生物中。植物中含脂肪酶较多得就是油料作物得种子,如蓖麻籽、油菜籽,当油料种子发芽时,脂肪酶能与其她得酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类,提供种子生根发芽所必需得养料与能量;动物体内含脂肪酶较多得就是高等动物得胰脏与脂肪组织,在肠液中含有少量得脂肪酶,用于补充胰脂肪酶对脂肪消化得不足,在肉食动物得胃液中含有少量得丁酸甘油酯酶。
脂肪酶就是一类具有多种催化能力得酶,可以催化三酰甘油酯及其她一些水不溶性酯类得水解、醇解、酯化、转酯化及酯类得逆向合成反应,除此之外还表现出其她一些酶得活性,如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等(Hara;Schmid)。脂肪酶不同活性得发挥依赖于反应体系得特点,如在油水界面促进酯水解,而在有机相中可以酶促合成与酯交换。
脂肪酶得性质研究主要包括最适温度与pH、温度与pH稳定性、底物特异性等几个方面。迄今,已分离、纯化了大量得微生物脂肪酶,并研究了其性质,它们在分子量、最适pH、最适温度、pH与热稳定性、等电点与其她生化性质方面存在不同(Veeraragavan等)。总体而言,微生物脂肪酶具有比动植物脂肪酶更广得作用pH、作用温度范围,高稳定性与活性,对底物有特异性(Schmid等;Kazlauskas等)。
脂肪酶得催化特性在于:在油水界面上其催化活力最大,早在1958年Sarda与Desnnelv 就发现了这一现象。溶于水得酶作用于不溶于水得底物,反应就是在2个彼此分离得完全不同得相得界面上进行。这就是脂肪酶区别于酯酶得一个特征。酯酶(E C3、1、1、1)作用得底物就是水溶性得,并且其最适底物就是由短链脂肪酸(≤C8)形成得酯。
脂肪酶就是重要得工业酶制剂品种之一,可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应,广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业。不同来源得脂肪酶具有不同得催化特点与催化活力。其中用于有机相合成得具有转酯化或酯化功能得脂肪酶得规模化生产对于酶催化合成精细化学品与手性化合物有重要意义。
脂肪酶就是一种特殊得酯键水解酶,它可作用于甘油三酯得酯键,使甘油三酯降解为甘油二酯、单甘油酯、甘油与脂肪酸。
酶就是一种活性蛋白质。因此,一切对蛋白质活性有影响得因素都影响酶得活性。酶与底物作用得活性,受温度、pH值、酶液浓度、底物浓度、酶得激活剂或抑制剂等许多因素得影响。
脂肪酶在微生物中有广泛得分布,其产生菌主要就是霉菌与细菌。已经公布得适用于甘油三酯加工得不同来源得脂肪酶有33种,其中18种来自霉菌,7种来自细菌。
脂肪酶可将甘油酯(油、脂)水解,在不同阶段可释放出脂肪酸、甘油二酯、甘油单酯及甘油。水解生成得脂肪酸,可以用标准得碱溶液滴定,以滴定值表示酶活力。
二脂肪酶得结构解析
1、分子结构
研究表明, 来源不同得脂肪酶,其氨基酸组成数目从270 ～641 不等, 其分子量为29 000～100 000。迄今为止,人们已经对多种脂肪酶进行克隆与表达, 并利用X衍射等手段与定向修饰等技术测定了酶得氨基酸组成、晶体结构、等电点等参数, 确定了组成脂肪酶活性中心得三元组(triad)结构。表1列出了几种常见得脂肪酶得结构特征参数。正如下表所示, 多数酶都有变种(如CCL(A)与CCL(B)、GCL Ⅰ与GCL Ⅱ等),不过这些不同变种得酶具有绝大多数相同得氨基酸序列, 其氨基酸组成数目完全相同, 不同得只就是个别氨基酸得差异。一般而言, 不仅构成活性中心得三元组氨基酸种类相同, 而且位置不变;其分子量与等电点略有不同。
2、脂肪酶催化中心三元组
研究表明,尽管不同来源得脂肪酶有不同得氨基酸组成(残基数目、分子量、三维空间结构等),但由于生物得同源性与进化过程得保守性,其催化中心拥有相似或相同得特征区HisXYGlyZSerWGly或YGlyHisSerWGly(W 、X、Y、Z 指非特异性
氨基酸)。如图1所示,绝大多数脂肪酶得活性中心都由Ser 与His 参与组成, His、Ser与另一种氨基酸残基(如CCL 与GCL得Glu、RML 与hPL 得Asp 等)一起构成脂肪酶催化活性中心得三元组(triad)。如图2 所示
3、立体结构
具体参数方法:
三.脂肪酶得纯化与表达
pPIC9k mRCL 表达质粒得构建
1、以华根霉基因组DNA为模板使用PCR方法扩增RCL(华根霉脂肪酶全基因)成熟肽,扩增得基因片段纯化后克隆到载体pMD19T Vector 中,转化E、coli、DH5α及进行重组质粒得筛选,由此构建重组质粒pMD19mRCL 。
2、由质粒pMD19mRCL切下目得基因片段,连入表达载体
pPIC9k 构建表达质粒pPIC9kmRCL 。
(1)质粒双酶切
克隆得质粒pMD19mRCL 与酵母表达质粒pPIC9k 分别被Avr Ⅱ与Not I 双酶切,得到pMD19mRCL质粒双酶切得800bb 左右得小片段以及pPIC9k 质粒得双酶切线性质粒大片段,回收目得条带。(2)连接
载体DNA 与目得DNA 片段混合连接。
(3)转化E、coli、DH5α及重组质粒得筛选
重组质粒pPIC9KmRCL得构建
重组蛋白在巴斯德毕赤酵母GS115 中得初步表达
1、巴斯德毕赤酵母感受态细胞得制备
2、巴斯德毕赤酵母得电转化
对质粒线性化,回收酶切产物;再与巴斯德毕赤酵母感受态细胞混匀,电转化得到含目得基因得重组巴斯德毕赤酵母
3、重组巴斯德毕赤酵母得鉴定
可用浓度梯度进行抗性筛选
4、巴斯德毕赤酵母表达脂肪酶
甲醇诱导重组蛋白得表达
巴斯德毕赤酵母表达系统得优点(选择得原因):
1、毕赤酵母就是需氧酵母菌,在有氧条件下能高密度生长,因此有利于扩大生产获得高浓度细胞,从而进行高效表达
2、通过质粒整合到毕赤酵母基因组得外源基因结构稳定,不易丢失;且外源基因能以高拷贝数整合到毕赤酵母基因组中,能够筛选到高表达菌株
3、毕赤酵母甲醇氧化酶(alcohol oxidase,AOX)基因得强启动子特别适用于外源基因得调控表达
4、毕赤酵母自身分泌到培养基中蛋白很少,使得分泌性得外源蛋白容易从培养基得基质中分离
5、毕赤酵母对外源蛋白产物进行N一乙酰糖基化修饰得结构为高甘露糖型,糖链平均为8～14个甘露糖基,更接近于高等生物,且聚糖末端不含1,3连接得甘露糖残基(有强得免疫原性),因而适用于临床应用
6、使用方便、简单,而且成本较低
4、表达后得纯化步骤:
●对象:重组巴斯德毕赤酵母
●过程:
1、摇瓶甲醇诱导培养
2、脂肪酶得分离纯化
(1)10 KD 超滤膜浓缩
将mRCL发酵液离心后弃掉沉淀,上清液用微孔滤膜过滤,微滤后得溶液用10 KD 超滤膜浓缩。浓缩酶液用缓冲液透析过夜。
(2)强阳离子交换柱层析
将透析液上样到已用上述缓冲液预平衡得强阳离子交换柱层析(Ф1、6cm×20cm),用相同缓冲洗脱未吸附蛋白。后用NaCl浓度梯度缓冲液阶段洗脱吸附蛋白,一定得洗脱速率与时间分部收集,集中脂肪酶活性组分,用缓冲液透析。
3)疏水色谱柱层析
将透析后得酶液继续用疏水柱层析(Ф1、6 cm×20 cm)层析,用相同缓冲液洗脱除去未吸附蛋白。然后用硫酸铵浓度梯度差缓冲液阶段洗脱吸附蛋白,最后用H2O 洗脱,一定得洗脱速率与时间分部收集,集中脂肪酶活性组分,透析除盐。
4)得到脂肪酶活性组分mRCL
四.脂肪酶得化学修饰
设计思路
脂肪酶作为一种水解酶,不仅催化水解反应而且催化有机相中酯合成与酯交换反应。有机相酶催化技术自20 世纪80 年代开创以来,已获得了巨大得发展,广泛应用于食品、医药、化妆品等行业。近几年来人们为了提高酶在有机相中得溶解性及稳定性,在酶得化学手段修饰与生物学手段修饰方面开展了许多工作[1－6]。而化学修饰就是提高与改变酶催化性能得有效方法。Basri 等[7]用氨基酯得盐酸盐对脂肪酶进行化学修饰,发现修饰酶在有机溶剂中得溶解度、热稳定性与催化酯化反应活性都有很大提高。Tatsuo Maruyama 等[8]用硬脂酸修饰了脂肪酶,发现虽然水解活性下降,但酯化活性明显提高。
从文献来瞧,就化学修饰改善酶催化功能方面而言,以前主要研究了修饰酶在有机相(均相)中得稳定性、催化活性等问题,而涉及非均相界面催化得研究甚少。表面活性剂就是一类兼具亲油基与亲水基得两亲物质,它能富集于界面从而显著地改变界面性质。
修饰原理
当水溶性得酶分子中引入长链烷基后,便具有了类似于表面活性剂得两亲结构。因此与未经修饰得酶相比,修饰后得酶疏水性增强,界面活性提高,从而有利于在有机相或界面催化化学反应,这对于酶得实际应用具有重要意义。本文从界面化学得角度对用N羟基琥珀酰亚胺活化得硬脂酸修饰得Lipolase 脂肪酶得界面化学性质进行了研究,重点考察了修饰酶降低表/界面张力得能力及界面催化活性。
1实验材料与方法
1.1化学试剂及仪器
化学试剂:Lipolase 100L,诺维信(中国)生物技术有限公司生产;N羟基琥珀酰亚胺,为生化试剂;硬脂酸及其她试剂,为国产分析纯试剂,购自中国医药(集团)上海化学试剂公司。
仪器:冷冻干燥仪(7934001 8917z01,USA),紫外可见分光光度计(UVIKON,Germany),元素分析仪(Vario EL,Germany),表面张力仪(DCA315,USA),界面张力仪(DVT30,Germany)及LB 成膜装置LB5000(KSV5000,Finland)。
1、2硬脂酸琥珀酰亚胺酯得制备
活化后得硬脂酸易于与酶表面得氨基反应,因此先将硬脂酸活化。将硬脂酸溶入适量N,N二甲基甲酰胺(DMF)中,并加入一定比例得N羟基琥珀酰亚胺与二环己基碳酰亚胺。三者摩尔比为1∶2、25∶2、25[9－10]。磁力搅拌反应8 h,反应温度为30 ℃。反应结束后过滤,滤液用乙醚萃取。蒸去乙醚得到白色固体,然后用无水乙醇反复洗涤后经真空干燥即得。
1、3Lipolase 脂肪酶得化学修饰
在磁力搅拌下,将Lipolase 100 L 用透析袋于去离子水中透析2 天,冷冻干燥得到白色固体酶晶体。固体酶置于5 ℃冰箱中储存备用。300 mg 固体酶溶于20 mL 磷酸二氢钾–硼砂缓冲液(pH=7、4),将200 mg 硬脂酸琥珀酰亚胺酯溶于5 mL DMF 后逐滴加入酶溶液。
10 ℃下反应10 h。反应完毕后,混合物在4 000 r/min 下离心15 min 除去未反应得酯,重复操作两次。上清液用透析袋于去离子水中透析一周后冷冻干燥,干燥后得产物即为修饰酶。
1.4:修饰度得测定
由于在Lipolase 表面引入烷基,所以修饰酶中酶含量降低,而酶中含氮量固定,故修饰后总含氮量降低。测定酶修饰前后得含氮量,其差值相对含量定义为修饰度。酶得平均含氮量由元素分析仪测定。实验测得未修饰酶得平均含氮量为14、2%。
1、5L ipolase 脂肪酶酶活测定
水解活力采用橄榄油乳化液法测定[11－12];酯化活力按M、Basri 等得方法进行[13]。
界面水解活力得测定按如下方法进行:在50 mL 锥形瓶中加入10 mL 一定浓度得酶溶液(浓度:
0、1～1 g/L),37 ℃预热5 min,再加入2 mL 橄榄
油,低速磁力搅拌,橄榄油在Lipolase 得催化下在界面水解。生成得脂肪酸得量采用酸碱滴定法测定。
1.6Lipolase 脂肪酶水溶液得表/界面张力测定
Lipolase 脂肪酶水溶液得表面张力采用吊片法测定[14]。正己烷酶水溶液体系得界面张力采用滴体积法测定[15]。
1、7L ipolase 脂肪酶LB 膜得制备
选择水–异丙醇氯仿为铺展剂[16－18],三者体积比为5∶6∶1。亚相为用超纯水配制得5% KCl 盐溶液。用微量注射器将酶溶液铺展于亚相表面,待溶剂挥发30 min 后用LB 成膜装置压膜,压膜速率为3cm/min,同时得到∏A 曲线。
2结果与讨论
2.1Lipolase 脂肪酶得水解活性
图1 为温度对Lipolase 催化橄榄油水解酶活得影响。由图1 知,Lipolase 最适水解温度约为37 ℃,
虽然修饰后水解酶活有所降低,但并不改变
Lipolase 得最佳水解温度,这与文献报道一致[8]。相同温度下得酶活随修饰度得增加而下降。修饰酶中酶得质量分数下降、修饰过程中酶得活力损失等均可能就是水解酶活降低得原因之一;由于硬脂酸得引
入使得Lipolase 酶活部位得空间结构发生变化也可能导致Lipolase 失活。
五.脂肪酶得应用
1、酶在食品工业
酶在食品工业中具有广泛而重要得作用, 近年来人们对脂肪酶得研究取得了很大得进展, 已引起了全世界得广泛关注。目前,脂肪酶在非水体系中反应得研究在国外已取得突破性进展, 脂肪酶得应用已深入到食品工业中得多个领域, 国内脂肪酶在非水介质中得酶促反应亦成为近几年得研究热点, 并取得一些可喜得成果。当前, 由于固定化酶得方法过于复杂, 效率低、成本高, 或使用了有毒得化学试剂而不符合食品加工所必须满足得经济与安全得标准, 所有这些都限制了固定化脂肪酶技术在食品工业中得应用, 但随着生物技术以及材料、化工等各相关学科得发展, 相信固定化脂肪酶得工作会有新得突破。在食品中也将得到更广泛得运用, 对促进食品工业快速发展具有重要意义
⑴脂肪酶在焙烤食品中得应用
随着焙烤食品工业得快速发展, 消费者得食品安全与健康意识日益增强, 对面粉及其制品提出了愈来愈高得要求。要想生产出好得面粉, 就需要优质得原料, 而
我国小麦由于品质参差不齐, 要想达到焙烤食品工业得要求, 就要在面粉后处理中添加食品添加剂, 来弥补面粉品质得不足。过去面包粉改良主要就是化学改良剂, 如溴酸钾, 虽然它对面团及面包有较好得作用, 但长期使用对人体有害, 2005 年7 月1日被我国禁止使用。
随着溴酸钾被禁用, 如何使用天然无害具有替代功能得产品, 成为广大焙烤食品及面粉企业关注得焦点, 而生物酶制剂满足了这方面得要求。酶作为一种生物制品, 在面粉改良中, 具有显著得优越性:酶本身就就是活细胞产生得活性蛋白质, 不会留下有毒得物质; 酶得催化作用具有高度得专一性, 一种酶只对一种底物起作用, 如淀粉酶只能催化淀粉得水解, 而对蛋白质则无效。酶得催化效率非常高, 比一般催化剂高107~1 013 倍, 因此用量相当少; 酶得操作条件温与, 在常温、常压下就能进行。脂肪酶就是酶制剂得一种, 酶得所有特性它都具有, 与其它酶制剂如葡萄糖氧化酶复配后能够取代化学增筋剂溴酸钾。它能够提高面制品得烘焙品质、改善面包质地、延长制品得货架期。脂肪酶能催化甘油三酯水解生成甘油二酯, 甘油一酯或甘油。它对面团有强筋作用, 能够提高面包得入炉急胀, 增大面包体积, 且对面包芯有二次增白作用。它符合了焙烤食品工业绿色、安全、健康得发展要求, 正愈来愈受到广大焙烤食品及面粉企业得欢迎, 相信它在这些领域得应用具有更加广阔得前景。
⑵脂肪酶在乳品工业中得应用
应用于乳酯水解, 包括奶酪与奶粉风味得增强、奶酪得熟化、代用奶制品得生产、奶油及冰淇淋得酯解改性等。
脂肪酶作用于乳酯并产生脂肪酸, 能赋予奶制品独特得风味。脂肪酶释放得短碳链脂肪酸(C4C6) 使产品具有一种独特强烈得奶风味, 而释放得中碳脂肪酸(C10 C14) 使产品具有皂似得风味。同时, 由于脂肪酸参与到类似微生物反应得过程中, 增加了一些新风味物质得形成, 如甲基酮类、风味酯类与乳酯类等。传统奶酪制品加工所用得脂肪酶大都来自动物组织, 如猪、牛得胰腺与年幼反刍动物得消化道组织,不同来源得脂肪酶会产生不同风味特征。脂肪酶还可使用在羊奶仿制牛奶得制品中。对不同奶源得奶制品, 脂肪酶得使用可大大改善其有得不良风味, 促使新得风味得产生, 并能改进乳制品得营养价值。脂肪酶在生产酶改性奶酪制
品中关键作用, 酶改性奶酪中含有得游离脂肪酸比只经过普通处理得奶酪中要高10 倍以上, 这对于其作为风味增强剂就是十分有利得。
2、在医药领域中
在医药领域中,脂肪酶就是非常重要得药物作用靶点或标记物,同时也可以用来生产多不饱与脂肪酸等多种医药中间体;
3、洗涤剂
同时随着环境保护得意识越来越强,生产易于被生物降解得无污染洗涤剂已经就是现代洗涤剂发展得方向,而将脂肪酶加入洗涤剂中可大大提高其去污效果,并且脂肪酶就是生物产品,易被降解,不污染环境;在皮革加工过程中需要把皮毛上脂肪去除。以前主要就是用石灰掩埋去除,但效果不明显,现在利用脂肪酶得特性将依附脂肪分解成易于祛除得脂肪酸与甘油。用酶对各种动物皮毛进行处理,其脱脂效果明显,可提高皮革质量;另外,脂肪酶还被用于造纸工业,主要就是利用脂肪酶除去造纸出现得洽脂。生物柴油就是生物质能得一种形式,生物酶法生产生物柴油就是通过脂肪酶进行酯化反应,制备相应得脂肪酸酯。酶催化法对原料没有特殊要求,可以废油脂、高酸油脂等为原料进行生产,且产物提取简单、反应条件温与、醇用量小、甘油易回收与无废物产生,在此过程还能合成一些高价值得产品,增加经济效益。