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Magainin和cecA_mil抗菌肽基因的密码子优化及在毕赤酵母中的高效表达

Magainin 和cecA 2mil 抗菌肽基因的密码子优化

及在毕赤酵母中的高效表达

张素芳1

 贾

1,2

 蔡梅红1 仇妍虹1 陈溥言

13

(1南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室 南京 210095

2沈阳农业大学动物医学院 沈阳 110161)

摘要 选用毕赤酵母偏爱密码子,设计合成了新型抗菌肽基因。所合成的magainin 基因和cecA 2

mil 杂合肽基因全长分别为101bp 和60bp ,并在其N 端引入kex2裂解位点,以保证表达抗菌肽具有天然N 端。其中,cecA 2mil 杂合肽基因根据cecropinA N 端第1~7个氨基酸残基、melittin N 端

第5~12个氨基酸残基所设计合成。基因分别克隆入pPICZ α2A 质粒,构建分泌型重组酵母表达

载体pPICZ α2A 2mag 和pPICZ α2A 2C M 。在AOX1(醇氧化酶)启动子调控下,类似天然抗菌肽大小的

magainin 及cecA 2mil 蛋白获得分泌表达,其表达量分别为105mg ΠL 和118mg ΠL 。初步抑菌活性测

定,显示两者对金黄色葡萄球菌及E .coli DH5

α有较好的抑杀活性。关键词 抗菌肽 基因改造 S OE 毕赤酵母 分泌表达收稿日期:2004202225 修回日期:20042052173通讯作者,电子信箱:aid @http://www.wendangku.net/doc/ffb435d7195f312b3169a5af.html

抗菌肽(antibacterial peptides ,ABP )是生物体产生的一种阳离子小肽,具有广谱抗菌活性[1,2]

,其作为广谱抗菌药物所具有的应用开发前景十分可观。相反,传统的从天然资源中提取的抗菌肽成本高、得率低、工序繁琐;合成肽则价格相当昂贵,也难以应用于临床。由于抗菌肽基因一般都比较小,故可以采用人工合成的方法来获得目的基因,再进行基因工程生产。美国马盖宁公司通过基因工程生产的magainin 类似物MSI 278,上世纪末就已进入

Ⅲ期临床实验阶段[3]

我们根据magainin 、cecropin 和milittin 的氨基

酸序列,选用毕赤酵母偏好密码子[4]

,兼顾大肠杆菌偏好性,消除潜在的糖基化位点,设计并合成了新型抗菌肽magainin 基因和cecA 2mil 杂合肽基因,其中后者是由cecropinA 成熟肽N 端1~7位氨基酸和milittin 成熟肽N 端5~12位氨基酸杂合而成的15肽。在基因合成过程中,我们尝试了S OE (gene splicing by overlap extension ,gene S OEing )和降落PCR (touchdown PCR )新方法。

由于抗菌肽本身对原核宿主菌的杀伤作用,不

适合在原核系统中直接表达,一般选用融合表达或真核表达。在此,我们选用Pichia pastoris 系统并成功表达了抗菌肽magainin 和杂合抗菌肽cecA 2mil 。

1 材料与方法

111 主要材料

E .coli DH5α为本实验室保存;Pichia pastoris 受体菌X 233(His

-

Mut +

)、表达载体pPICZ α2A 购自

Invitrogen 公司,指示菌金黄色葡萄球菌(C owan Ⅰ

)由河南农业大学王川庆教授惠赠。T4DNA ligase 、T4polynucleotide

kinase 、dATP 、pyrobest

T M

DNA

polymerase 、限制性内切酶购自T aK aRa 公司。Tricine 、S DS 2PAGE 低分子量Marker 购自生星生物

公司;Z eocin 购自Invitrogen 公司;其它试剂均为进口或国产分析纯产品。112 抗菌肽基因设计

根据magainin 、cecropin 和milittin 的氨基酸序列,选用毕赤酵母偏好密码子,利用DNAStar 、primer premier 软件设计了4个基因片段:F1、F2、F3和F4。

其中F1和F2扩增改造后的magainin 成熟肽基因,2个片段的3′端有18个bp 的互补序列,符合gene S OEing (gene splicing by overlap extension )的要求。F3

为正义链序列,F4为反义链序列,2个片段经过磷

第24卷第7期

中 国 生 物 工 程 杂 志

CHI NA BI OTECH NO LOGY

2004年7月

酸化、退火后,形成两端带有Eco RⅠ、XbaⅠ粘性末端的cecA2mil杂合肽序列。

113 基因合成

F1、F2片段长度分别为59bp、56bp,F3、F4长度均为63bp,由上海博亚合成。

11311 magainin基因的S OE合成 应用S OE法,以F1、F2片段互为模板互为引物进行PCR扩增,合成magainin成熟肽基因。为了保证S OE合成的特异性,我们采用了降落(touchdown,T D)PCR技术进行优化。T D2PCR反应条件:10×PCR Bu ffer (Mg++free)510μl,MgCl2(25mm olΠL)310μl,dNTP (10mm olΠL)110μl,F1、F2(100pm olΠL)各110μl, T aK aRa Ex Taq T M015μl,灭菌超纯水3815μl,总体积50μl,混匀,瞬间离心,进行T D2PCR。94℃预变性2min,进入T D2PCR循环:94℃30s,退火温度从65℃降至50℃,每循环1min,每一个循环降低015℃, 72℃1min,共30个循环后温度降至50℃,再在最适退火温度55℃的条件下进行15个循环。最后72℃延伸7min,取T D2PCR产物10μl,2%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统下观察并记录拍照。11312 cecA2mil杂合肽基因的合成 F3、F4片段进行5′端磷酸化,退火,以合成cecA2mil杂合肽基因。

(1)合成基因片段F3、F4的磷酸化 磷酸化体系如下:10×T4PNK Bu ffer510μl,dATP(10mm olΠL) 110μl,T4PNK210μl,F3(100pm olΠL)或F4(100pm olΠL)1510μl,灭菌超纯水27μl,反应体系共50μl,混匀,37℃水浴1h。75℃5min以灭活T4PNK酶,后转入退火操作。

(2)合成基因片段F3、F4的退火 取上述磷酸化产物等比例混合,置于85℃水浴锅温育1min后,关闭水浴锅电源,自然冷却至室温后取出,-20℃保存备用。

114 序列测定

基因工程操作根据文献[5]进行。Magainin PCR产物经PCR产物纯化试剂盒(R oche)纯化后,直接进行XhoⅠ、XbaⅠ双酶切,定向插入酵母表达载体pPICZα2A中,构建magainin重组质粒;CecA2mi 磷酸化退火产物通过Eco RⅠ、XbaⅠ位点插入pPICZα2A。缺失酶切位点鉴定阳性的质粒命名分别为pPICZα2A2Mag、pPICZα2A2C M,送T aK aRa公司测序。

115 抗菌肽重组酵母表达体系的建立及诱导表达X233感受态的制备、酵母的电击转化、重组酵母表型鉴定及筛选,均按Invitrogen公司提供的Pichia pastoris操作手册进行。

116 重组表达抗菌肽的T ricine2SDS2PAGE 重组magainin抗菌肽的分子量约为216kDa, cecA2mil的分子量为119kDa,理论上,分子量低于15kDa的多肽在常规Tris2甘氨酸电泳系统中难以得到理想的电泳分辨率[6]。在此,我们使用Tricine (三羟甲基氨基甘氨酸)代替甘氨酸作为终止离子,并增加电泳缓冲液的摩尔浓度,使重组magainin多肽得到了较好的分辨率及带型。

117 重组抗菌肽抑菌活性的初步测定

抑菌活性测定采用琼脂孔穴扩散法:将处于对数生长期的金黄色葡萄球菌(C owanⅠ)悬浮液(A

600 =0163)15μl,与55℃的LB固体培养基25ml混匀后铺平板,等其凝固后,用高压过的打孔器(直径5mm)打孔,滴加40μl待测表达上清的浓缩样品, 37℃培养过夜,以同体积同倍浓缩的pPICZα2A空载体转化酵母表达蛋白为阴性对照。

2 结 果

211 基因设计

设计的magainin、cecA-mil基因的碱基序列如图1、图2所示。所合成的Magainin基因全长101bp,包括23个氨基酸的编码序列(包括起始密码子和终止密码子),基因N端设有Eco RⅠ、Xho Ⅰ识别序列,C端设有XbaⅠ识别序列。

CecA2mil基因全长60bp,包括15个氨基酸的编码序列和终止密码子,基因N端、C端分别设有Eco RⅠ、XbaⅠ粘性末端,并在基因的N端引入毕赤酵母K ex2蛋白酶裂解位点。

212 基因合成及克隆鉴定

F1、F2互为模板互为引物进行T D2PCR扩增,扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳,可观察到大小约为101bp的单一条带(图3)。F3、F4经磷酸化退火形成大小约60bp的cecA2mil基因,两端带有Eco R Ⅰ、XbaⅠ粘性末端。

49中 国 生 物 工 程 杂 志第24卷

Magainin和cecA_mil抗菌肽基因的密码子优化及在毕赤酵母中的高效表达

图1 设计合成的抗菌肽m againin 基因的核苷酸序列

Fig.1 The DNA sequence of the designed and synthetic

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Magainin和cecA_mil抗菌肽基因的密码子优化及在毕赤酵母中的高效表达

m againin gene

F1、F2:synthetic olig o deoxyribonucleotides ,the shadowed region is restriction site of K ex2signal cleavage ;

the boxed region is restriction sites of Eco R Ⅰ、

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Xba Ⅰ

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and Xho Ⅰ

 

图2 设计合成的ceca 2mil 杂合肽基因的核苷酸序列

Fig.2 The DNA sequence of the designed and synthetic cecA 2mil fused peptide gene

F3,F4:synthetic olig o deoxyribonucleotides ,the shadowed region is restriction site of K ex2signal cleavage ;

the boxed region is restriction sites of Eco R Ⅰand Xho Ⅰ

 

图3 m againin 基因的T D 2PCR 扩增

Fig.3 The amplification of m againin gene by T D 2PCR

1:DNA m olecular weight marker D L2000;2:PCR products

of magainin gene

 

213 序列测定结果

经T aK aRa 测序,所合成基因序列与设计序列完全一致。214 重组抗菌肽的T ricine 2SDS 2PAGE 结果

在Tris 2Tricine 电泳系统中,重组表达抗菌肽得到较理想的电泳分辨率和带型(图4)。215 重组抗菌肽抑菌活性的初步测定

初步测定结果显示,重组magainin 对革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌有较好的杀菌活性,抑菌直径

为1155cm ,但对革兰氏阳性的E .coli DH5α杀菌活性相对要弱,抑菌直径为1125cm ;重组杂合抗菌肽

cecA 2mil 对革兰氏阳性菌、阴性菌均有较好的杀伤

效果,对金黄色葡萄球菌和DH5

α的抑菌直径分别为1150cm 和1175cm ,如图5所示。

图4 重组抗菌肽的T ricine 2SDS 2PAGE

Fig.4 The tricine 2SDS 2PAGE of the recombinant

antib acterial peptide

1:negative contrast Pichia pastoris X 233ΠPPICZ α2A ;2:recombination Pichia pastoris X 233ΠpICZ α2A 2M ag ;3:recombination Pichia pastoris X 2

33ΠpICZ α2A 2C M

 

5

9第7期

张素芳等:Magainin 和cecA 2mil 抗菌肽基因的密码子优化及在毕赤酵母中的高效表达

Magainin和cecA_mil抗菌肽基因的密码子优化及在毕赤酵母中的高效表达

图5 重组抗菌肽的抑菌活性测定

Fig.5 Detection of the antib acterial activity of recombinant antib acterial peptides

A:Against E.coli DH5α,B:Against Staphylococcus aureus

Am p:AMP control(100μgΠml);1:recombinant hybrid peptide cecA2mil;2:negative contrast of P BS(011m olΠL);3:recombinant antibacterial peptide magainin;4:the contol of supernatant of Pichia pastoris X233ΠpICZα2A

 

3 讨 论

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)由于兼具原核表达系统的高表达量和真核表达系统可进行蛋白翻译后修饰、加工及折叠的优点,在表达外源活性蛋白中倍受青睐。

关于抗菌肽的表达研究,目前存在一个问题:不论是在微生物中表达,还是在植物、昆虫中表达,表达量都偏低,这成了抗菌肽走向产业化的限制因素。抗菌肽若要走向产业化,必须建立其高效表达体系和快速纯化系统。

影响外源基因表达水平的因素很多,而密码子的选择是左右表达量的参数之一,基因表达水平与嗜好密码子的使用程度之间存在强的相关性。在此,为了提高抗菌肽在毕赤酵母中的表达效率,我们对magainin和cecA-mil基因进行了密码子优化,采用毕赤酵母偏好密码子进行了基因全序列人工合成。同时,由于天然N端对抗菌肽的生物活性有决定性作用,为了保证所表达的抗菌肽具有天然N端,我们在抗菌肽基因的N端均加上α信号肽K ex2裂解酶识别序列。

在对抗菌肽基因进行密码子优化及合成时,我们采用了S OE技术。亦即重叠区扩增基因拼接法,是利用末端互补、重叠延伸的原理,将2个或多个基因片段进行体外拼接的一种简单、快速基因重组技术[7~9]。重叠区的最适长度目前尚无定论,但以所合成引物长度的三分之一为宜。引物总长度,以其T m值来计算,应控制在50bp左右较好。一般,重叠区至少有15~20bp,引物总长度为50bp左右。2个片段进行重叠延伸反应时,引物浓度较普通PCR体系高,Mg++浓度则适当降低。在本实验中,除了常规优化方法外,还引入了降落PCR技术,在较佳条件下,成功地获得了magainin和cecA2 mil抗菌肽基因。

通过这些改造措施,我们构建并获得了抗菌肽magainin和cecA2mil的酵母高效分泌表达菌株。初步的抗菌活性测定结果显示,2种重组抗菌肽对指示菌株均具有明显的杀菌活性。对抗菌肽基因进行修饰和密码子优化,除了可以提高重组抗菌肽的表达量、确保抗菌活性外,还可以避免部分专利的限制,这是建立具有自主知识产权的新产品所必需考虑的因素。

虽然和工作浓度的氨苄青霉素相比,2种抗菌肽的抑菌直径相对较小,但无残留、不会诱导耐药性产生的特点,使其在食品防腐、和动物饲料添加剂等方面具有很好的应用前景。而且,所表达的抗菌肽经过表达优化、系统纯化后,表达效率、抑菌活性又进一步得到了提高,除了对葡萄球菌、大肠杆菌显示有抗菌活性外,对其它革兰氏阳性菌以及革兰氏阴性菌也具有明显的杀菌活性。

参考文献

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antibacterial peptide from hem ocyanin of the freshwater cray fish

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69中 国 生 物 工 程 杂 志第24卷

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Laboratory M anual.New Y ork :C old S pring Harbor Laboratory Press ,1995.33~40

Codon Optimization of Antibacterial Peptide Magainin and CecA 2mil G ene and Over 2expression in Pichia pastoris

ZH ANG Su 2fang 1

 J I A Y un

1,2

 C AI Mei 2hong 1 QI U Y an 2hong 1 CHE N Pu 2yan

1

(1K ey Laboratory of Animal Disease Diagnosis and Immunology ,M inistry of Agriculture at Nanjing Agricultural University ,Nanjing 210095,China )

(2Department of Veterinary M edicine ,Shenyang Agricultural University ,Shenyang 110161,China )

Abstract Using the preferential condon of Pichia pastoris ,tw o novel antibacterial peptide 2magainin gene 101bp

in length and hybrid peptides cec 2mil gene 60bp length and incorporating cecropin (1~7amino acid coding segment in N terminal )and milittin (5~12amino acid coding segment in N terminal ),were designed and synthesized.Especially a K ex2signal cleavage site was fused in 5′end of the antibacterial peptide genes.The m odified antibacterial

peptide genes respectively cloned into the pPICZ α2A vector to construct the recombinant expression vectors pPICZ α2A 2

mag and pPICZ α2A 2C M ,and trans formed into yeast host strain X 233.Under the control of the prom oter AOX1(alcohol

oxidase 1),the magainin and cecA 2mil proteins with a similar m olecular weight to native antibacterial peptides was expressed in supernatant ,the secretion reach 105mg ΠL and 118mg ΠL.Both of recombinant antibacterial peptides

showed potent antibacterial activity against Staphylococcus aureus and E .coli DH5

α.K ey w ords Antibacterial peptide G enetic m odification S OE (gene splicing by overlap extension ,gene S OEing ) Pichia pastoris Secretion expression

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