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Magainin和cecA_mil抗菌肽基因的密码子优化及在毕赤酵母中的高效表达

Magainin 和cecA 2mil 抗菌肽基因的密码子优化

及在毕赤酵母中的高效表达

张素芳1

 贾  

1,2

 蔡梅红1 仇妍虹1 陈溥言

13

(1南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室 南京 210095

2沈阳农业大学动物医学院 沈阳 110161)

摘要 选用毕赤酵母偏爱密码子,设计合成了新型抗菌肽基因。所合成的magainin 基因和cecA 2

mil 杂合肽基因全长分别为101bp 和60bp ,并在其N 端引入kex2裂解位点,以保证表达抗菌肽具有天然N 端。其中,cecA 2mil 杂合肽基因根据cecropinA N 端第1~7个氨基酸残基、melittin N 端

第5~12个氨基酸残基所设计合成。基因分别克隆入pPICZ α2A 质粒,构建分泌型重组酵母表达

载体pPICZ α2A 2mag 和pPICZ α2A 2C M 。在AOX1(醇氧化酶)启动子调控下,类似天然抗菌肽大小的

magainin 及cecA 2mil 蛋白获得分泌表达,其表达量分别为105mg ΠL 和118mg ΠL 。初步抑菌活性测

定,显示两者对金黄色葡萄球菌及E .coli DH5

α有较好的抑杀活性。关键词 抗菌肽 基因改造 S OE  毕赤酵母 分泌表达收稿日期:2004202225 修回日期:20042052173通讯作者,电子信箱:aid @http://www.wendangku.net/doc/ffb435d7195f312b3169a5af.html

  抗菌肽(antibacterial peptides ,ABP )是生物体产生的一种阳离子小肽,具有广谱抗菌活性[1,2]

,其作为广谱抗菌药物所具有的应用开发前景十分可观。相反,传统的从天然资源中提取的抗菌肽成本高、得率低、工序繁琐;合成肽则价格相当昂贵,也难以应用于临床。由于抗菌肽基因一般都比较小,故可以采用人工合成的方法来获得目的基因,再进行基因工程生产。美国马盖宁公司通过基因工程生产的magainin 类似物MSI 278,上世纪末就已进入

Ⅲ期临床实验阶段[3]

我们根据magainin 、cecropin 和milittin 的氨基

酸序列,选用毕赤酵母偏好密码子[4]

,兼顾大肠杆菌偏好性,消除潜在的糖基化位点,设计并合成了新型抗菌肽magainin 基因和cecA 2mil 杂合肽基因,其中后者是由cecropinA 成熟肽N 端1~7位氨基酸和milittin 成熟肽N 端5~12位氨基酸杂合而成的15肽。在基因合成过程中,我们尝试了S OE (gene splicing by overlap extension ,gene S OEing )和降落PCR (touchdown PCR )新方法。

由于抗菌肽本身对原核宿主菌的杀伤作用,不

适合在原核系统中直接表达,一般选用融合表达或真核表达。在此,我们选用Pichia pastoris 系统并成功表达了抗菌肽magainin 和杂合抗菌肽cecA 2mil 。

1 材料与方法

111 主要材料

E .coli DH5α为本实验室保存;Pichia pastoris 受体菌X 233(His

-

Mut +

)、表达载体pPICZ α2A 购自

Invitrogen 公司,指示菌金黄色葡萄球菌(C owan Ⅰ

)由河南农业大学王川庆教授惠赠。T4DNA ligase 、T4polynucleotide

kinase 、dATP 、pyrobest

T M

DNA

polymerase 、限制性内切酶购自T aK aRa

Magainin和cecA_mil抗菌肽基因的密码子优化及在毕赤酵母中的高效表达

公司。Tricine 、S DS 2PAGE 低分子量Marker 购自生星生物

公司;Z eocin 购自Invitrogen 公司;其它试剂均为进口或国产分析纯产品。112 抗菌肽基因设计

根据magainin 、cecropin 和milittin 的氨基酸序列,选用毕赤酵母偏好密码子,利用DNAStar 、primer premier 软件设计了4个基因片段:F1、F2、F3和F4。

其中F1和F2扩增改造后的magainin 成熟肽基因,2个片段的3′端有18个bp 的互补序列,符合gene S OEing (gene splicing by overlap extension )的要求。F3

为正义链序列,F4为反义链序列,2个片段经过磷

第24卷第7期

中 国 生 物 工 程 杂 志

CHI NA BI OTECH NO LOGY

2004年7月

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