桑叶多酚提取工艺的优化研究_沈维治

桑叶多酚提取工艺的优化研究

沈维治1，2，廖森泰*1，2，刘吉平1，邹宇晓2，李妍1，2

（1华南农业大学动物科学院，广州 510642；2广东省农业科学院蚕业

与农产品加工研究所，广东省农产品加工重点实验室，广州 510610）

摘要本文运用二次回归正交旋转组合设计法研究了乙醇浓度、料液比、pH值对桑叶多酚得率的影

响，建立了具有良好预测性能的提取条件数学模型，确定了最优提取条件。试验结果表明，在本试验

范围内对桑叶多酚得率影响作用大小的顺序为：pH值>料液比＞乙醇浓度。最优提取工艺条件为：溶剂

为70%的乙醇，料液比为1：40，pH为4，本条件下提取桑叶多酚含量为16.11mg/g。

关键词桑叶；多酚；二次回归正交旋转组合设计；提取工艺；优化

中图分类号文献标识码 A 文章编号

The Optimization study on extraction processe of Polyphenol

from Mulberry leaves

SHEN Wei-Zhi1,2 LIAO Sen-Tai1,2, LIU Ji-Ping1, ZOU Y u-Xiao2, LI Yan1,2

（1College of Animal Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China 2Institute of Sericulture and Agro-food Science and Technology,Guangdong Academy of Agriculture Sciences, Key Laboratory of Agro-food Science and Technology of Guangdong,Guangzhou 510610,China）Abstract By means of orthogonally rotational combination design, the effect of ethanol concentration, solid-liquid ratio, pH on the yield of mulberry leave polyphenol were researched . A quadric regression model of polyphenol yield was established, the model was significantly fit well and the optimum combination was obtained. The results indicated that the yield of mulberry leave polyphenol was affected obviously in decreasing order by pH , solid-liquid ratio, and ethanol concentration .The optimum condition for the extraction is as following: extracting solvent 70 percent ethanol, solid-liquid ratio 1:40, pH 4, the yield of polyphenol from mulberry leaves is 16.11mg/g.

Key words Mulberry leaves; Polyphenol; Orthogonally rotational combination design; Extraction processes;

optimum

桑叶为我国药典正式收录的中药材，富含多酚类物质，因其化学结构具有活泼的羟基氧，能在多酚氧化酶作用下终止生物体内自由基的链锁反应，起到清除自由基和消除自由基毒性的作用[1]，从而表现出抗衰老、抗辐射、防治肿瘤及增加机体免疫力等多种生物活性[2]。研究表明，桑多酚主要包括绿原酸、槲皮素、芸香苷等。本研究采用二次回归正交旋转组合设计，对桑多酚的提取工艺进行优化，为桑叶多酚的进一步开发利用提供理论依据。

1 材料和方法

资助项目：省科技厅社会发展攻关项目(编号2008A030101001)；广州市科技攻关项目（编号2007Z2-E0031）

作者简介：沈维治（1982 -），男，湖南，硕士研究生。

E-mail：skyforce12@https://www.wendangku.net/doc/fe18988667.html,

通讯作者：廖森泰，研究员，硕士生导师。

Tel：020-********；E-mail：liaost@https://www.wendangku.net/doc/fe18988667.html,

1.1 材料及主要仪器、试剂

桑叶于08年8月采自广东省农业科学院大丰基地，60 ℃烘干至恒重，粉碎，过60目筛，储藏备用。

仪器：UV-1700紫外分光光度计（日本岛津）；PHS-3C 精密pH 计（上海大普）；KS-300E Ⅱ型超声波清洗机（宁波海曙科生超声设备有限公司）；EYELA N-1001旋转蒸发仪(日本)。

试剂：乙醇，国产分析纯试剂；没食子酸；Folin 试剂。 1.2 试验方法

1.2.1 没食子酸标准溶液的配制和标准曲线的制作

采用Folin-Ciocalteu （福林-酚）法测定。准确称取10mg 没食子酸标准样品，先用少量乙醇溶解，再用蒸馏水定容至100mL ，配制成0.1mg/mL 溶液，分别取0、1.5、2、2.5、3、3.5、4ml 定容至25mL ，配制成浓度为0、4、6、8、10、12、14、16ug/mL 标准溶液。分别取1mL 标准溶液、1mL 福林-酚试剂、2mL10%Na 2CO 3，混匀，25℃反应1h ，测定在765nm 波长处吸光度。以浓度（ug/mL ）为X 轴，吸光度(A)为Y 轴，做标准曲线，得到回归方程为：y = 0.0407x - 0.0007（回归系数R 2 = 0.9991）。

1.2.2 桑叶总多酚的提取及含量测定

准确称取约2.0g 桑叶粉，置三角瓶中，按要求加入相应的一定浓度的溶剂，超声提取30min ，室温过滤，得到的滤液在温度60℃减压浓缩后用蒸馏水定容至25mL 容量瓶，稀释50倍后即为样品溶液。按标准曲线制作中的方法测定样品溶液的吸光度，利用回归方程计算出提取液总多酚的浓度C ，按下式计算桑叶总多酚含量。

多酚含量（mg/g ）=1000

*g 50*25*C ）样品重量（，式中，C ：提取液总多酚的浓度(ug/mL) 。 1.2.3 单因素试验

以桑叶多酚提取率为考察指标，乙醇浓度为75%、料液比为1：25、pH 为6.0、提取次数为1次作为标准，调整其他因素，进行单因素试验。分别单独考察乙醇浓度（55%，65%，75%，85%，95%）、料液比（1：15，1：25，1：35，1：45）、pH 值（2.0，3.0，4.0，5.0，6.0）、提取次数（1次，2次，3次）对桑叶多酚提取率的影响。 1.2.4桑叶多酚提取工艺的优化试验

根据以上单因素试验结果，分别选取3因素3水平对超声波提取进行二次回归正交旋转组合设计试验，对桑叶总多酚提取条件进行优化，并按优化条件进行多酚提取。超声波提取桑叶总多酚正交实验因素与水平见表1。

表 1 因素与水平表

Table 1 Factors and levels

因素(Factors )

水平(Levels )

X 1 乙醇浓度（%） Ethanol concentration X 2 料液比 Solid-liquid ratio

X 3 pH 值 pH value 1

65 25 3.0 2 75 35 4.0 3

85 45

5.0

1.2.5验证试验

按原提取工艺流程在最优条件下进行验证试验，求得桑多酚的得率。

1.2.6 数据统计分析

采用SAS v8.0 专业版统计分析软件对获得的数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 没食子酸标准曲线

没食子酸标准曲线见图1。

图1 没食子酸标准工作曲线

Fig.1 The standard working curve of Gallic acid

2.2 单因素试验结果

2.2.1 乙醇浓度对桑多酚的影响

分别用不同的乙醇浓度(55%，65%，75%，85%，95%)提取桑叶总多酚，试验结果如图2所示，在55%-75%浓度范围内随着乙醇浓度的升高桑叶总多酚的提取率逐渐提高，当乙醇浓度达到75%左右时达到最高的提取率，随着乙醇浓度的进一步升高而呈现下降趋势，因此确定桑叶多酚提取的乙醇浓度为75%左右。

图2 乙醇浓度对多酚得率的影响

Fig.2 Effect of ethanol concentration on the yield of polyphenol

2.2.2 料液比对提取效果的影响

分别用不同的液料比( 1∶15，1∶25，1∶35，1∶45)进行桑叶总多酚提取试验，结果如图3所示，在液料比为1∶35时提取率最高。

2.2.3 pH值对提取得率的影响

考察不同的pH值(2，3，4，5，6)对桑叶总多酚提取得率的影响。试验结果如图4所示，pH 值在3到4之间提取效率最高，因为原始pH为6左右，从试验的操作出发，正交试验时选pH=4

为中心点。

图3 料液比对多酚得率的影响

Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the yield of polyphenol

图4 pH值对多酚得率的影响

Fig.4 Effect of pH on the yield of polyphenol

2.2.4 提取次数对提取得率的影响

分别考察提取次数（1次、2次和3次）对桑叶总多酚提取得率的影响，试验结果如图5所示，提取3次的得率最高，但提取1次、2次和3次的结果相差不大，从生产成本和试验的操作出发，正交试验时以提取1次为宜。

图5 提取次数对桑叶多酚提取效果的影响

Fig.5 Influence of the extraction times on the the yield of polyphenol from mulberry leaves

2.3 桑叶多酚提取工艺的优化

实验组合及结果列于表2，建立桑叶多糖提取率回归方程。

表2 试验设计及结果

Table 2 Experimental design and results

处理编号X1 乙醇浓度（%）X2 料液比X3 pH值多酚含量（mg/g）Treatment no. Ethanol concentration Solid-liquid ratio pH value Yield of polyphenol

1 -1（65）-1（1：25）0（4）10.69

2 -1（65）1（1：45）0（4）12.68

3 1（85）-1（1：25）0（4）12.98

4 1（85）1（1：45）0（4）14.61

5 0（75）-1（1：25）-1（3）12.11

6 0（75）-1（1：25）1（5）9.86

7 0（75）1（1：45）-1（3）12.78

8 0（75）1（1：45）1（5）12.93

9 -1（65）0（1：35）-1（3）11.54

10 1（85）0（1：35）-1（3）13.79

11 -1（65）0（1：35）1（5）10.87

12 1（85）0（1：35）1（5）11.5

13 0（75）0（1：35）0（4）16.36

14 0（75）0（1：35）0（4）16.61

15 0（75）0（1：35）0（4）16.09

2.3.1 提取工艺条件优化数学模型的建立及检验

根据表2结果，计算各项回归系数。以这些回归系数建立多酚提取率与乙醇浓度、料液比、pH 值3个因子的数学回归模型：

Y=16.35333+0.88875*X1+0.91875*X2-0.6325*X3-1.802917*X1*X1-0.0925*X1*X2-0.405*X1*X3-1. 807917*X2*X2+0.6*X2*X3-2.625417*X3*X3

实验结果方差分析见表3。

表3 试验结果方差分析

Table 3 Variance analysis of test results

变异来源自由度平方和均方比值F 显著水平P

Source of variation Degree of

freedom

Sum of square mean square Value of F Significant level

X1 1 6.319013 6.319013 69.03887 0.000413 **

X2 1 6.752813 6.752813 73.77838 0.000353 **

X3 1 3.20045 3.20045 34.96677 0.00197 **

X1*X1 1 12.00188 12.00188 131.1275 0.0001 **

X1*X2 1 0.034225 0.034225 0.373928 0.567603

X1*X3 1 0.6561 0.6561 7.168272 0.043959 *

X2*X2 1 12.06854 12.06854 131.8558 0.0001 **

X2*X3 1 1.44 1.44 15.73283 0.010674 *

X3*X3 1 25.45039 25.45039 278.0602 0.0001 ** 模型Model 9 61.67925 6.85325 74.87572 0.0001 **

误差Error 5 0.457642 0.091528

总变异Total 14 62.13689

注：*为0.05水平上显著，**为0.01水平上显著

方差分析显著性检验结果表明：该模型模型项（P＜0.01）回归显著，R2=0.9926，表明该模型与实验拟合较好，自变量与响应值线性关系显著，可以用于桑叶多酚超声提取的理论预测。在P=0.05显著水平剔除不显著项，得到优化后的方程为：

Y=16.35333+0.88875*X1+0.91875*X2-0.6325*X3-1.802917*X1*X1 -0.405*X1*X3-1.807917*X2*X2+0.6*X2*X3-2.625417*X3*X3 2.3.2 试验因子间交互效应分析

从回归系数的显著性检验可以看出，乙醇浓度(X1 )与pH 值(X3 )、料液比(X2 )与pH 值(X3 )的互作效应对桑叶多酚提取率影响明显，对其分别作响应面图（图6和图7），从图6可知，在所设计的实验条件范围内，增加乙醇浓度和pH 值都可增加多酚提取率，二者交互作用表现为提取率的增大。从图7可知，当料液比或pH 在较低水平时，随着料液比或pH 的增加桑叶多酚含量都表现为先增大后减少。

图6 乙醇浓度和pH 值对多酚提取率的交互作用

Fig.6 The interaction of ethanol concentration and pH to the extraction rate of polyphenol

图7 料液比和pH 值对多酚提取率的交互作用

Fig.7 The interaction of solid-liquid ratio and pH to the extraction rate of polyphenol

2.4 各因素的重要性分析

对各因素的重要性分析采用贡献率法：

设各F(j)，F(ij)，F(jj)。 令各因素对指标的贡献率可表示为：

1

1,1,2, (2)

j j ij jj i i j

j m δδδ==?=++=∑

据表3均方比F ，可知乙醇浓度、料液比、pH 值对提取率得贡献率分别为△1=2.40815，△2=2.4471，△3=2.86625，因为△3＞△2＞△1，所以对提取率作用的大小依次为：pH 值>料液比＞乙醇浓度。

2.5 回归方程的模拟寻优

结合回归模型的数学分析可以得到模型的极值点：乙醇浓度为70%，料液比为1：40，pH值为4，此时模型预测的最大响应值为16.36mg/g。为了证实预测结果，采用上述最优条件进行多酚的提取，实际测得多酚含量为16.11mg/g，与理论值十分接近，进一步验证了数学回归模型的合理性。

3 结论

3.1 建立了提取条件（溶剂为70%的乙醇，料液比为1：40，pH为4）对桑叶多酚得率Y影响的优化数学回归模型为：Y=16.35333+0.88875*X1+0.91875*X2-0.6325*X3-1.802917*X1*X1 -0.405*X1*X3-1.807917*X2*X2+0.6*X2*X3-2.625417*X3*X3。

3.2 桑叶多酚的最优提取条件为：乙醇浓度为70%，料液比为1：40，pH值为4，在此条件下提取的桑叶多酚含量为16.11mg/g，比柴建萍等[3]报道的不同桑树品种多酚含量平均高10倍以上，比刘春莲等[4]和刘咏等[5]报道的不同品种不同部位桑叶中多酚含量稍高。可见，不同品种间桑叶多酚的含量差异以及提取制备方法的不同，都会对结果产生影响。

3.3 分析了双因素交互作用对多酚提取的影响，通过贡献率法计算表明在试验范围内各因子对桑叶多酚提取率作用的大小依次为pH值>料液比＞乙醇浓度。

参考文献（References）

[1]杨贤强,等.茶多酚生物学活性的研究[J].茶叶科学,1993,13(1):51-59.

[2]安徽农学院..茶叶生物化学[M].北京:农业出版社,1980.

[3]柴建萍,谢道燕.不同桑叶品种资源多酚及黄酮类物质测定[J].蚕桑通报,2007,38(3):15-16.

[4]刘春莲,李东升,刘尔军.不同品种不同部位的桑叶中多酚和黄酮类物质含量[J].安徽农业科学,1999,27(4):356,402.

[5]刘咏,行春丽,成战胜等.从桑叶中提取多酚、黄酮和多糖的优化试验[J].林产化工通讯,2005,39(1),10-13.