质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定实验报告

质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定实

验报告

质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定

一、实验目的

1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法；

2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；

3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方法；

4.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法；

5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。

二、实验原理

(多聚酶链式反应)

在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。

PCR一次循环的具体反应步骤为：

A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。

B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温，与模板DNA互补退火形成部分双链。

C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。

2.质粒DNA的提取与制备 (1).碱裂解法：

染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异： A.高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性；

B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。 (2).离心层析柱：

A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；

B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；

C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。 3.质粒DNA的定量分析：

A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；

B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱: DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰

/A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度；A260/A280= DNA纯净

A260/A280 含RNA杂质，用RNA酶去除。

4.质粒DNA的酶切鉴定：

限制性内切酶是DNA重组操作过程中所使用的基本工

具。限制性内切酶能特异性地与一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列结合，或是与其附近的特异位点结合，并在结合位点切割双链DNA。

5.琼脂糖凝胶电泳：

琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。

DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应：不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系).

三、材料与方法：实验材料：

仪器：PCR仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管

材料：菌液【大肠杆菌DH5a菌株(pMD19-T质粒,含目的片段-绿色荧光蛋白GFP)】、无菌去离子水、2×Premix Taq、引物 2. 质粒DNA的提取与制备

仪器：恒温培养箱、台式离心机、离心层析柱、Eppendorf 管、微量加样枪、离心管材料：溶液 P1、溶液P2 (S2）、溶液P3、去蛋白液PE漂洗液WB、洗脱液EB 仪器：比色杯、紫外分光光度计、微量加样枪材料：蒸馏水、质粒ＤＮＡ 4.

质粒DNA的酶切鉴定

仪器：的EP管、微量加样枪

材料：无菌水、10×M酶切缓冲液Buf R、质粒DNA、Hind III (15U/ul)、EcoR I(12U/ul) 5.琼脂糖凝胶电泳仪器：凝胶电泳系统、凝胶成像系统

材料：电泳指示剂、Gelview、TBE、琼脂糖、DNA Marker 5000、电泳缓冲液

实验方法

准备目的DNA：菌液煮沸10min，冷冻，室温解冻后离心取上清液

2. 质粒DNA的提取与制备

将扩增后的基因用微量加样枪加到电泳仪的凝胶孔中将装有PCR反应体系的PCR反应管放入PCR仪上进行如下操作：①94℃预变性5分钟后开始以下循环②循环为94℃——30 秒，50℃——30 秒，72℃——1 分钟。循环为30次③72℃ 5 分钟④4 ℃保温将PCR反应管置台式离心机中瞬时离心取 ml PCR反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入：灭菌去离子水μl、2*Premix μl、引物1 (10 mol/L) 1μl、引物2 (10 mol/L) 1μl、菌液5μl 13000rpm x 1min，弃上清取培养物加入Eppendorf管中

加入250μl 溶液S1，吹打，使细菌沉淀分散，彻底悬

浮加入250μl 溶液S2，颠倒4～6次混匀，直到溶液变得清亮加入350μl 溶液S3，立即温和混匀6~8次。13000rpm离心10min，小心取上清液将吸附柱放于收集管中，将上一步所得上清液加入吸附柱中，13000rpm离心3min，弃滤液向吸附柱中加入700μl 漂洗液W2，13000rpm离心1min ，弃滤液；重复一遍加入500μl去蛋白液(W1)，13000rpm离心1min，弃滤液

3. 质粒DNA的定量

取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加50μl洗脱缓冲液(Eluent)，室温放置1min，13000rpm 离心1min洗脱质粒DNA， -20℃保存备用空柱13000rpm 离心1min，然后室温放置3min，使残留乙醇挥发再向比色皿加入2ul的质粒DNA，于紫外分光空白对照比色测定向比色皿加入98ul蒸馏水，进行Blank调零清洗比色皿：用微量加样枪向比色皿加入适量的蒸馏水刷洗，2~3次。并用滤纸擦拭干净

光度计上进行‘sample’测定，记录相关数据

质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定

一、实验目的

1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法；

2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；

3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方

法； 4.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法； 5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。

二、实验原理

(多聚酶链式反应)

在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。

PCR一次循环的具体反应步骤为：

A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。

B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温，与模板DNA互补退火形成部分双链。

C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。

2.质粒DNA的提取与制备 (1).碱裂解法：

染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异： A.高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性；

B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。 (2).离心层析柱：

A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶

液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；

B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；

C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。 3.质粒DNA的定量分析：

A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；

B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱: DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰

/A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度；A260/A280= DNA纯净

A260/A280 含RNA杂质，用RNA酶去除。

4.质粒DNA的酶切鉴定：

限制性内切酶是DNA重组操作过程中所使用的基本工具。限制性内切酶能特异性地与一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列结合，或是与其附近的特异位点结合，并在结合位点切割双链DNA。

5.琼脂糖凝胶电泳：

琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。

DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应：不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系).

三、材料与方法：实验材料：

仪器：PCR仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管

材料：菌液【大肠杆菌DH5a菌株(pMD19-T质粒,含目的片段-绿色荧光蛋白GFP)】、无菌去离子水、2×Premix Taq、引物 2. 质粒DNA的提取与制备

仪器：恒温培养箱、台式离心机、离心层析柱、Eppendorf 管、微量加样枪、离心管材料：溶液 P1、溶液P2 (S2）、溶液P3、去蛋白液PE漂洗液WB、洗脱液EB 仪器：比色杯、紫外分光光度计、微量加样枪材料：蒸馏水、质粒ＤＮＡ 4.质粒DNA的酶切鉴定

仪器：的EP管、微量加样枪

材料：无菌水、10×M酶切缓冲液Buf R、质粒DNA、Hind III (15U/ul)、EcoR I(12U/ul) 5.琼脂糖凝胶电泳仪器：凝胶电泳系统、凝胶成像系统

材料：电泳指示剂、Gelview、TBE、琼脂糖、DNA Marker 5000、电泳缓冲液

实验方法

准备目的DNA：菌液煮沸10min，冷冻，室温解冻后离心取上清液

2. 质粒DNA的提取与制备

将扩增后的基因用微量加样枪加到电泳仪的凝胶孔中将装有PCR反应体系的PCR反应管放入PCR仪上进行如下操作：①94℃预变性5分钟后开始以下循环②循环为94℃——30 秒，50℃——30 秒，72℃——1 分钟。循环为30次③72℃ 5 分钟④4 ℃保温将PCR反应管置台式离心机中瞬时离心取 ml PCR反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入：灭菌去离子水μl、2*Premix μl、引物1 (10 mol/L) 1μl、引物2 (10 mol/L) 1μl、菌液5μl 13000rpm x 1min，弃上清取培养物加入Eppendorf管中

加入250μl 溶液S1，吹打，使细菌沉淀分散，彻底悬浮加入250μl 溶液S2，颠倒4～6次混匀，直到溶液变得清亮加入350μl 溶液S3，立即温和混匀6~8次。13000rpm离心10min，小心取上清液将吸附柱放于收集管中，将上一步所得上清液加入吸附柱中，13000rpm离心3min，弃滤液向吸附柱中加入700μl 漂洗液W2，13000rpm离心1min ，弃滤液；重复一遍加入500μl去蛋白液(W1)，13000rpm离心1min，弃滤液

3. 质粒DNA的定量

取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加50μl洗脱缓冲液(Eluent)，室温放置1min，13000rpm 离心1min洗脱质粒DNA， -20℃保存备用空柱13000rpm 离心1min，然后室温放置3min，使残留乙醇挥发再向比色皿加入2ul的质粒DNA，于紫外分光空白对照比色测定向比色皿加入98ul蒸馏水，进行Blank调零清洗比色皿：用微量加样枪向比色皿加入适量的蒸馏水刷洗，2~3次。并用滤纸擦拭干净

光度计上进行‘sample’测定，记录相关数据

质粒DNA的提取和纯化实验报告

质粒DNA的提取和纯化实验报告

实验一、质粒DNA的提取和纯化 一、实验目的： 1、学习并掌握碱裂解法小量制备质粒DNA的方法。 2、初步了解DNA纯化的原理。 二、实验原理 1、细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 2、质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。 3、碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 4、纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。 三、实验步骤 1、挑取单菌落接种到含Amp的LB液体培养基试管内（3.5ml/管） 2、将试管放入恒温震荡培养箱中，37℃，200r/min培养12-16h。 3、将菌落转入1.5ml离心管中（尽量倒满）1200r/min，离心30s（沉淀菌体） 4、重复一次第三步的过程 5、弃掉上清液并扣干，加入预冷的Solution1 100微升，剧烈震荡打散菌体

实验二 阳性重组质粒的抽提及双酶切鉴定

实验二阳性重组质粒的抽提及双酶切鉴定 实验目的：练习质粒的抽提及双酶切的实验过程，熟悉相关操作。 实验材料及设备 pMD-T重组质粒；内切酶Xba I 及Pst I；10×M Buffe r；琼脂糖；电泳仪及电泳所需试剂。 实验步骤 A 大肠杆菌的扩繁及质粒DNA碱裂解法抽提 挑取筛选平板上的白色菌落， 接种到5ml LB液体培养基(含100μg/ml Amp)中， 37℃振荡培养约12小时至对数生长后期 ↓ 取培养液倒入2 ml eppendorf管中，4℃下12000 rpm离心2分钟，去上清 ↓ 沉淀中加入150 μl溶液I（50 mmol/L 葡萄糖,25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0),10mmol/L EDTA (pH8.0)）， 剧烈振荡使菌体悬浮，室温下放置5分钟 ↓ 加入250 μl新配制的溶液II (0.2 mol/L NaOH, 1％SDS, 临用前配制) 盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次， 以混匀内容物(千万不要振荡)，室温下放置5分钟 ↓ 加入180 μl预冷的溶液III （5 mol/L KAc 60ml, 冰醋酸11.5ml, H2O 28.5ml, 定容至100ml , 并高压灭菌） 盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒，使沉淀混匀 ↓ 冰浴10分钟，4℃下12000rpm离心10分钟 ↓ 上清液移入干净eppendorf管中，计算体积 ↓ 加入各1/2体积的Tris-饱和酚以及氯仿/异戊醇(24：1)，混匀 20℃下12000 rpm离心10分钟，取上清, 计算体积 ↓ 加等体积的氯仿/异戊醇（24：1），12000 rpm离心10分钟 ↓ 将上清移入干净eppendorf管中，计算体积 ↓ 加入2倍体积的无水乙醇 ↓ 混匀后置于-20℃冰箱中30分钟

《分子生物学》质粒DNA的提取与鉴定实验报告

质粒DNA的提取与鉴定 实验日期2020年5月14日室温25°C 成绩 一、实验报告摘要 【实验题目】 质粒DNA的提取与琼脂凝胶电泳鉴定 【实验目的】 1、掌握质粒提取原理和各种试剂的作用。 2、掌握琼脂糖凝胶电泳原理和操作。 二、实验原理 1、质粒： 质粒是独立存在于染色体外，能自主复制并能稳定遗传的一种环装双链DNA，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中。细菌质粒是应用最多的质粒类群，在细菌细胞内利用宿主细胞的复制机构复制质粒自身的DNA 2、琼脂糖凝胶电泳： 琼脂糖凝胶电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段的标准方法之一，该技术操作简便，快速。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至近50kb的DNA。此外，直接用低浓度的核酸染料进行染色，可确定DNA在凝胶中的位置。琼脂糖凝胶通常采用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。 三、操作要点：

（1）质粒DNA的提取 1、收取细菌：将4mL细菌培养液分为2次加入2mL的塑料离心管(子弹头)内，每次以12000r/min离心1min(注意平衡)弃去上清液。 2、加入100uL用冰预冷的溶液I，用移液枪将细菌沉淀打散成为悬浮液。(溶液I放置冰中) 3、加入200uL溶液II，盖紧盖口，翻转离心管5次，充分混合内容物，避免振荡，将离心管置于冰上。 4、加入150uL用冰预冷的溶液III，盖紧盖口，翻转离心管，温和摇匀直至粘稠状的细菌裂解物出现，置于冰上5分钟。(溶液放置冰中) 5、用微量离心机12000r/min离心5分钟。取上清液移到另一离心管。 6、加入等量的酚:氯仿(1:1)混合液，轻轻混匀，12000r/min离心7分钟，将上清液收集到新的离心管中。 7、加入2倍体积100%乙醇沉淀DNA，轻轻混匀，1200 0r/min离心5分钟，弃去上清液，倒置在滤纸上干燥，漓尽液体。 8、用1m170%乙醇洗涤DNA沉淀，按照步骤7去除上清液，空气干燥10min。 9、用50uL的无菌水溶解质粒DNA 。 （2）琼脂凝胶电泳分离鉴定 1，制胶。将电泳缓冲液和琼脂糖在微波炉中熔化，混匀，冷却至55°C，加入EB染料，倒入已封好的凝胶灌制平台上，插上样品梳。 2.加入10u1的6x加样缓冲液到DNA样品，混匀，然后用移液器取50u1样品加入样品孔中。(不要漫出加样孔) 3.接通电极，在120V电压下进行电泳20min-30min 。 4.当加样缓冲液中的溴酚兰迁移至足够分离DNA片段 的距离时，关闭电源。 5.已染色的凝胶可以直接在紫外透射仪上观察或照相 四、实验结果： 成功分离DNA片段，能看到超螺旋质粒和单缺口质粒的条带。

(完整版)质粒DNA的提取、纯化与鉴定

分子生物学实验报告 题目：质粒DNA的提取、纯化与鉴定 姓名：学号：班级：时间： 一、实验目的： 1.学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理。 2.学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。 3.学习并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法。 4.掌握碱变性提取发的原理及各种试剂的作用。 5.掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。 二、实验原理： 1.质粒DNA的提取——碱变性提取法： 提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。EB-氯化铯密度梯度离心法，主要适合于相对分子质量与染色体DNA相近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质粒DNA多为超螺旋构型等优点，但提取成本高，需要超速离心设备。少量提取质粒DNA还可用沸水浴法、Wizard法等，沸水浴法提取的质粒DNA中常含有RNA，但不影响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及连接反应等。 碱变性法提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。 在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。当用pH值4.6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。溶于上清的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase A将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。 2.凝胶电泳进行DNA分离纯化： 电泳(electrophoresis)是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极方向移动的现象。各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因电离子的大小形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可

质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定

一、实验目的 1、掌握PCR基因扩增的原理和操作方法； 2、掌握碱裂解法提取质粒的方法； 3、了解紫外吸收法检测DNA浓度和纯度的原理、方法； 4、学习水平式琼脂糖凝胶电泳操作。 二、实验原理 1.PCR： PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以DNA为模板，特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外复制DNA 的过程。 ①延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链； ②变性：加热使模板DNA在高温下90℃-95变性，双链解链； ③退火：降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。 2. 质粒DNA的提取与定量——碱裂解法： A、基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异； B、高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA变性；

C、当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心形成沉沉淀去除。 D、定量检测原理：物质在光的照射下会产生对光的吸收效应； 而且物质对光的吸收是具有选择性的； 各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱。 3.酶切鉴定：利用限制性内切酶。 4、琼脂糖凝胶电泳： A、琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度； B、DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动； C、DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系)。 三、材料与方法： (一)、材料 1、样品： 菌液(大肠杆菌DH5a菌株)、引物、2*Premix Taq、灭菌离子水、含pMD19-T质粒的大肠杆菌DH5α 2、试剂： LB培养基、AXYGEN试剂盒(溶液S1、S2、S3、去蛋白液W1、漂洗液W2、洗脱液EB)、电泳指示剂、Gelview、TBE、琼脂糖、DNA Marker 500、无菌水、10*M酶切缓冲液Buf R、HindⅢ(15U/ul)、EcoR I (12U/ul) 3、仪器与器材： PCR仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管、凝胶电泳系统、凝胶成像系统、

质粒DNA提取方法与原理

质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用 细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和 SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA 发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。 一、试剂准备 1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。1M Tris-HCl (pH 8.0）1 2.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。 任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液。50 mM葡萄糖最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达 10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。 NaOH也使DNA变性，但只是个副产物，在溶液3加入后其中的醋酸和NaOH中和，质粒DNA恢复活性 2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置。 这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向 micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS 也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为 SDS也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS 呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合（象对待女孩子一样），不然基因组DNA也会断裂。基因组 DNA 的断裂会带来麻烦。 3.溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存备用。 溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质。最容易产生的误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀。如果你这样怀疑，往1%的 SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系。如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被

质粒DNA的提取及其琼脂糖凝胶电泳实验报告

一、实验名称：质粒DNA的提取与纯化，DNA琼脂糖凝胶电泳 二、实验原理： 1.质粒DNA的提取： 质粒是一类存在于几乎所有细菌等微生物中染色体之外（细胞质中）呈游离状态的双链、闭环的DNA分子，能够自主复制和稳定遗传，以超螺旋形式存在，是最常用的基因克隆载体。除质粒外，大肠杆菌中还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂质等物质，因此需要裂解细胞并除去蛋白质和染色体DNA等物质才能分离纯化出质粒DNA。分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。本实验使用碱裂解法，即利用SolutionⅠ、Ⅱ、Ⅲ三种溶液分离提取质粒DNA.其原理如下。 （1）碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA的原理： 碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA之间变性与复性的差异来分离质粒DNA，达到分离提纯质粒DNA的目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，线性的DNA因氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的大部分氢键会被断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链相互缠绕，不会完全分离。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA复性，恢复其天然构象，以可溶状态存在于液相中；而线性的染色体DNA由于两条互补链彼此已完全分开、分子量大、结构复杂而相互缠绕形成不溶性网状结构。与不稳定的大分子RNA、变形的蛋白质以及细菌碎片等一起沉淀而被除去。进一步用酚、氯仿使蛋白质变性去除蛋白质杂质，然后用无水乙醇沉淀，即可获得纯化的质粒DNA。SolutionⅠ、Ⅱ、Ⅲ三种溶液以及无水乙醇沉淀DNA的具体作用和原理如下。 （2）四种溶液作用及原理： ①Solution I的作用：悬浮大肠杆菌菌体，增加溶液的粘度，维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，在溶液I中加入EDTA，是要把大肠杆菌细胞中的二价金属离子都螯合掉，从而起到抑制DNA酶对DNA的降解和抑制微生物生长的作用。另外也可保证溶菌酶活性。 ②Solution II的作用：提供碱性条件，pH高达12.6，使大肠杆菌瞬间裂解，促使染色体DNA和质粒DNA变性。所含离子型表面活性剂十二烷基酸钠（SDS）可使细胞膜、核膜发生破裂，充分溶解膜蛋白。同时，磺酸基与蛋白质形成复合物而变形沉淀。 ③Solution III的作用：为KAc-HAc缓冲液。该溶液所含有的高浓度钾离子与溶液体系中的十二烷基磺酸钠发生反应形成十二烷基磺酸钾，从而将与之结合的绝大部分大肠杆菌蛋白质以及很长的基因组DNA一起沉淀，与质粒分离开来；另外溶液III所含有的醋酸中和溶液Ⅱ的强碱性，使pH降至中性，因为长时间的碱性条件会打断DNA；基因组DNA一旦发生断裂，只要是50-100kb大小的片段，就没有办法再被PDS共沉淀，这样就跟质粒DNA共存了。而且在整个质粒DNA 的提取过程中，沉淀DNA时用无水乙醇及在高盐、低温条件下进行都是为了用化学或物理手段将基因组DNA分子和蛋白质发生变性、在体系中的溶解度降低，较充分的分离提纯出实验所需的质粒DNA

重组质粒DNA的提取及酶切鉴定

实验七重组质粒DNA的提取及酶切鉴定 【实验原理】 分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。 本实验采用SDS碱裂解法提取重组质粒DNA，十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。 限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。限制性内切酶识别序列长度一般为4～8个呈回文序列的特异核苷酸对。由于限制性内切酶的切割特性不同，分子生物学中主要用到Ⅱ型限制性内切酶（切割位置在识别序列内部）。 对质粒进行酶切，通过跑胶观察片段大小，从而鉴定质粒。 【实验步骤】 本次实验所用的质粒提取试剂盒为天根的质粒小提试剂盒，操作步骤按说明书进行。 1. 吸附柱中加500ul 平衡液(BL)，12000rpm离心1min ，弃收集管中的液体。 2.取1.5ml菌液至2ml离心管中，12,000rpm离心1min，弃上清。 3. 加250ul solution Ⅰ（P1），vortex。 4. 加250 solution Ⅱ（P2），上下颠倒混匀。操作时间不能超过5min 注：此步骤不宜超过5 min。 5. 加350 solution Ⅲ（P3），立即颠倒混匀几次。12000rpm离心10min。 6. 吸取上清加入吸附柱中，尽量不要吸出沉淀12000rpm离心1min ，弃收集管中的液体。注：此时4℃离心不利于沉淀沉降。 7. 加入600μL漂洗液（PW）于离心吸附柱中，12000rpm离心1min ，倒掉废液。 8. 重复上一步， 9. 空管离2min。将吸附柱放入1.5ml离心管中，在超净台中晾5min。10. 将700 μl的Rinse B加入Spin Column中，12,000 rpm离心30 sec，弃滤液。 10. 滴加50ul elution buffer（EB）至膜中央，室温放置2min后，12000rpm离心1min。离心管中即为纯化后的质粒。 11.构建重组质粒酶切体系，限制性内切酶反应一般在灭菌的15 ml PCR离心管中进行。 在冰浴上建立酶切反应体系（20 μl）

质粒DNA的提取、酶切与鉴定

实验二十一质粒DNA的提取、酶切与鉴定 一、质粒DNA的提取 [原理]分离质粒DNA的方法包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。 本实验采用碱变性法抽提质粒DNA，是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA 的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。当以pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液去调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 [试剂] 1.溶液I： 50mmol/L葡萄糖、10mmol/L EDTA、25mmol/L Tris-HCl pH8.0;用前加溶菌酶4mg/ml。 2.溶液II： 200mmol/L NaOH 、1% SDS。 3.溶液III： pH4.8醋酸钾缓冲液（60 ml 5mol/L 醋酸钾、11.5ml冰醋酸、28.5ml 蒸馏水） 4.TE缓冲液pH8.0 5.含RNaseA的TE缓冲液：TE缓冲液含20μg/ml RNaseA。 6.苯酚：氯仿（1：1，v/v）：酚需在160℃重蒸，加入抗氧化剂8-羟基喹啉，使体积分数为0.1%，并用Tris-HCl缓冲液平衡两次。氯仿中加入异戊醇，氯仿/异戊醇为24：1（v/v）。 7.1×LB溶液 8.100μg/ml氨苄青霉素 [器材] 1.TGL-16型台式高速离心机

2.1.5ml塑料离心管 3.离心管架 4.微量移液器 5.常用玻璃器皿 [操作步骤] 1.培养细菌将带有质粒pUC19的大肠杆菌接种于5ml含100μg/ml氨苄青霉素的1×LB中，37℃培养过夜。 2.取液体培养菌液1.5ml置塑料离心管中，10 000r/min离心lmin，去掉上清液。加入150μl溶液I，充分混匀，在室温下放置10min。 3.加入200μl新配制的溶液II，加盖后温和颠倒5~10次，使之混匀，冰上放置2min。 4.加入150μl冰冷的溶液III，加盖后温和颠倒5~10次，使之混匀，冰上放置10min。 5.用台式高速离心机，10 000r/min离心5min，将上清液移入干净的离心管中。 6.向上清液中加入等体积酚/氯仿（1：1，v/v），振荡混匀，转速10 000r/min，离心2min，将上清液转移至新的离心管中。 7.向上清液加5mol/LNaCl至终浓度为0.3mol/L，混匀，再加入2倍体积无水乙醇，混匀，室温放置2min，离心5min，倒去上清乙醇溶液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 8.加0.5ml 70%乙醇，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥。 9.加入50μl含RNase A 20μg/ml的TE缓冲液溶解提取物，室温放置30min以上，使DNA充分溶解待用或置-20℃备用。 二、质粒DNA 的限制性内切酶酶切及琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定 [原理]限制性内切核酸酶（也可称限制性内切酶）是在细菌对噬菌体的限制和修饰现象中发现的。细菌内同时存在一对酶，分别为限制性内切酶（限制作用）和DNA甲基化酶（修饰作用）。它们对DNA底物有相同的识别顺序，但生物功能却相反。 Ⅱ型限制性内切酶，具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸顺序的

质粒DNA 酶切鉴定

实验五质粒DNA的微量提取及酶切鉴定 字体: 质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外，能够自主复制的环形双链DNA 分子。 一、质粒DNA的提取，它们都包括三个基本的步骤：细菌的生长和质粒的扩增；菌体的收集裂解；质粒DNA的分离和纯化。 1、细菌的生长和质粒的扩增 从琼脂培养基平板上挑取一个单菌落，接种到含适当抗生素的液体培养基中培养。对于高拷贝的质粒（pUC系列）来说，只要将培养物放到标准的LB或TB培养基中生长到对数晚期，就可以大量提取质粒，而不必选择性地扩增质粒DNA。但对于拷贝数较低的质粒（如pBR322）来说，则需在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行选择性扩增。因为氯霉素可以抑制宿主菌的蛋白质合成，从而阻止了细菌染色体的复制，但是质粒则仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续上升。 （问题：提取质粒时，对于不同拷贝的质粒，应如何进行细菌的培养？为什么？）2、细菌的收集、裂解和质粒DNA的分离 细菌的收集可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采取多种方法，包括用非离子型去污剂、有机溶剂或碱处理及加热处理等。 质粒分离的基本原理是利用宿主菌（一般是大肠杆菌菌株）DNA与质粒DNA之间的两种主要性质差异： a.大肠杆菌的染色体较一般的载体质粒DNA大得多。 b.从细胞中提取得到的大肠杆菌DNA主体是变性的线性分子，而大多数质粒DNA 是共价闭合的环状分子。 利用溶菌酶和加热处理的方法，使细菌的线状染色体DNA变性，通过离心，可以使染色体DNA和变性蛋白质、RNA分子一起沉淀下来，而质粒分子仍留于上清中。问题1：某些大肠杆菌的菌株不能用加热的方法裂解。 （1）易产生多糖的如大肠杆菌菌株，如HB101和TG1等。尤其是HB101的一些变种和衍生物，在用去污剂或加热裂解时可释放处相对大量的糖，从而影响质粒的纯化，抑制多种限制性内切酶的活性。 （2）表达内切核酸酶A的大肠杆菌菌株（endA+），如HB101。因为煮沸不能完全灭活内切核酸酶A，以后在Mg2+存在下温育（如用限制酶消化）时，质粒DNA 会被降解。但通过一个附加步骤（用酚：氯仿进行抽提）可易避免此问题。 3、质粒DNA的纯化 纯化质粒DNA的方法很多，通常使用的方法都是利用了质粒DNA相对较小和共价闭合环状这两个基本性质。多年来，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心一直是制备大量质粒DNA的方法，然而该过程既昂贵又费时，为此发展了许多代替方法，其中主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析、分级沉淀（聚乙二醇和LiCI 分级沉淀法）等分离质粒DNA和宿主DNA的方法。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚抽提、RNA酶消化和酒精沉淀等简单步骤除去残余蛋白和RNA，达到纯化的目的。

质粒DNA的提取、纯化与鉴定

姓名宿智新学院生命科学学院班级 11级生工2班科目分子生物学实验学号 201100140155 第 8 组 质粒DNA的提取、纯化与鉴定 摘要：本实验利用碱变法从大肠杆菌DH5α（E.coli DH5α）中提取pUC19质粒，旨在学习并掌握质粒DNA提取的原理、纯化和检测方法及琼脂糖凝胶电泳技术。同时通过对质粒DNA的提取、纯化过程及电泳图谱的分析，探讨碱变法提取高质量质粒DNA的关键步骤及影响所提质粒纯度和量的相关因子。 关键词：碱变法质粒电泳 实验目的： 1.学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理。 2.学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。 3.学习并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法。 4.掌握碱变性提取发的原理及各种试剂的作用。 5.掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。 实验原理： 1.质粒DNA的提取——碱变性提取法： 提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。EB-氯化铯密度梯度离心法，主要适合于相对分子质量与染色体DNA相近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质粒DNA多为超螺旋构型等优点，但提取成本高，需要超速离心设备。少量提取质粒DNA还可用沸水浴法、Wizard法等，沸水浴法提取的质粒DNA中常含有RNA，但不影响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及连接反应等。 碱变性法提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。 在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。当用pH值4.6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。溶于上清的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase A将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。

质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定实验报告

质粒 DNA 的提取、定量、酶切与PCR 鉴定 一、实验目的 1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒 DNA 的方法； 2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法； 3.学习并掌握紫外吸收检测 DNA 浓度和纯度的原理和方法； 4.学习并掌握 PCR 基因扩增的实验原理和操作方法； 5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。 二、实验原理 1.PCR(多聚酶链式反应 ) 在 DNA 聚合酶催化下，可以 DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，以 dNTP 为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制DNA ，使目的 DNA 按 2n方式呈指数形式扩增。 PCR一次循环的具体反应步骤为： A. 变性：加热反应系统至95℃，使模板 DNA 在高温下完全变性，双链解链。 B. 退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（ 35－70℃, 一般低于模板 Tm 值的 5℃ 左右），与模板DNA 互补退火形成部分双链。 C. 延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在Taq 酶作用下，以dNTP 为原料，引物为复 制起点，模板 DNA 的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。 2.质粒 DNA 的提取与制备 (1). 碱裂解法： 染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性存在差异： A. 高碱性条件下，染色体DNA 和质粒 DNA 均变性；

B. 当以高盐缓冲液调节其pH 值至中性时，变性的质粒DNA 复性并保存在溶液中，染色体 DNA 不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。 (2). 离心层析柱： A. 硅基质膜在高盐、低 pH 值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA ，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质； B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除； C.低盐，高 pH 值的洗脱缓冲液将纯净质粒 DNA 从硅基质膜上洗脱。 3.质粒 DNA 的定量分析（紫外分光光度法）： A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性； B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱 : DNA 分对波长 260nm 的紫外光有特异的吸收峰 蛋白质对波长 280nm 的紫外光有特异的吸收峰 碳水化合物对 230nm 的紫外光有特异的吸收峰 C. A260/A280 及 A260/A230 的比值可以反应DNA 的纯度； A260/A280=1.8DNA 纯净 A260/A280<1.8表示样品中含蛋白质（芳香族）或酚类物质 A260/A280>1.8含 RNA 杂质，用 RNA 酶去除。 4.质粒 DNA 的酶切鉴定： 限制性内切酶是DNA 重组操作过程中所使用的基本工具。限制性内切酶能特异性地与 一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA 序列结合，或是与其附近的特异位点结合，并 在结合位点切割双链DNA 。

实验3质粒DNA的酶切鉴定

实验三质粒DNA的酶切鉴定 南京大学生命科学院 一、实验目的 1、学习和掌握限制性内切酶的特性 2、学习酶解的操作方法，初步理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具 3、进一步熟练掌握琼脂糖凝胶电泳的方法 二、实验原理 限制性核酸内切酶是一种工具酶，这类酶的特点是能够识别双链DNA分子特异性核酸序列，并能在这个特异性核苷酸序列内切断DNA双链，形成一定长度和顺序的DNA 片段。限制性核酸内切酶是体外剪切基因片段的重要工具，与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定。 寄主控制的限制与修饰现象 限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。各种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限制性酶对修饰过的DNA不能起作用。这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。 限制性核酸内切酶的类型及特性 按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同，分为三类： 第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。 第二类(II型)限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10

重组质粒的酶切鉴定及PCR实验

重组质粒的酶切鉴定及PCR实验 一、【实验目的】 1、酶切鉴定重组质粒插入片段的大小； 2、学习和掌握PCR反应的基本原理和操作技术，了解引物设计的基本要求。 二、【实验原理】 1、PCR反应基本原理 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物 结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的 基因扩增放大几百万倍。 PCR反应原理图 2、PCR反应体系与反应条件

(1) 标准的PCR反应体系

①PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子 ②镁离子浓度总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5mmol/L ③底物浓度 dNTP以等摩尔浓度配制，20～200umol/L ④TaqDNA聚合酶 2.5U(100ul） ⑤引物浓度一般为0.1 ～ 0.5umol/L ⑥反应温度和循环次数 变性温度和时间95℃，30s 退火温度和时间低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃ 延伸温度和时间72℃，1min/kb(10kb内） Tm值=4(G+C) +2(A+T) 循环次数：一般为25 ～ 30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。 3、PCR的循环参数 (!)预变性（Initial denaturation） 模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要，建议加热时间参考试剂说明书，一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。 （2）循环中的变性步骤 循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可缩短该步骤时间。变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。 （3）引物退火（Primer annealing） 退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR 的特异性有较大影响。 （4）引物延伸 引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略。延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在 1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。 （5）循环数 大多数PCR含25-40循环，过多易产生非特异扩增。 （6）最后延伸 在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。 三、【实验步骤】 1、重组质粒的酶切、电泳检测 （1）按下表进行加样后置于37℃水浴锅中反应1h

质粒的提取酶切 实验报告

实验一质粒的提取酶切 实验目的 掌握质粒小量快速提取法。用琼脂糖凝胶电泳法鉴定其纯度。 实验原理 质粒是一种染色体外的稳定遗传因子。大小在1~200kb之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子。主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。他可独立游离在细胞质内，也可整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能却赋予宿主细胞的某些表型。 采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（SDS）可使细胞壁裂解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。用酒精沉淀洗涤，可得到质粒DNA。 在细胞内，共价闭环DNA（cccDNA）常以超螺旋形式存在。若两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫作开环DNA（ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度都快，因此在本实验中，质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。 限制性内切酶是一种工具酶，这类酶的特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA的双链，形成一定长度和顺序DNA片段。EcoR I和Bgl II的识别序列和切口是： EcoR I：G↓AATTC Bgl II: A↓GATCT G，A等核苷酸表示酶的识别序列，箭头表示酶切口。限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口，就能产生多少酶切片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。用已知分子量的线状DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，就可以粗略推测分子形状相同的未知DNA的分子量。

重组质粒酶切鉴定及PCR实验

重组质粒的酶切鉴定及PCR实验 一．实验目的 1．检验重组质粒的插入片段的大小 2．学习PCR技术的使用 二．实验原理 （一）重组质粒酶切鉴定 将含有外源DNA的转化子的E.coliDH5α菌株进行培养，并用试剂盒提取其质粒DNA，将所提取的DNA用切pUC19质粒的同一种限制性内切酶进行切割以验证所插入的外源DNA的大小。 （二）PCR PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应是1986 年由Kallis Mullis 发现。这项技术已广泛地应用于分子生物学各个领域，它不仅可用于基因分离克隆和核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析等方面。本次实验旨在通过学习和掌握PCR反应的基本原理和实验技术，以验证重组质粒插入片段大小。 1.聚合酶链式反应原理 PCR是一种利用两种与相反链杂交并附着于靶DNA两侧的寡核苷酸引物，经酶促合成特异的DNA 片段的体外方法。反应过程由高温变性，低温退火和适温延伸等几步反应组成一个循环，然后反复进行，使目的的DNA 得以迅速扩增。置待扩增DNA 于高温下解链成为单链DNA 模板，人工合成的两个寡核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合，DNA聚合酶在72℃将单核苷酸从引物3'端开始掺入，沿模板5'—3'方向延伸，合成DNA 新链。由于每一循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，所以PCR 产物以指数方式增加，经25—30次周期之后，理论上可增加109倍，实际上可增加107倍。 PCR 技术具有操作简便、省时、灵敏度高特异性强和对原始材料质量要求低等优点，但由于所用的TaqDNA 聚合酶缺乏5'—3'核酶外切酶活性，不能纠正反应中发生的错误核苷酸掺入，估计每9000个核苷酸会导致一个掺入错误，但是错误掺入的碱基有终止链延伸的作用倾向，使得错误不会扩大。 2．PCR的反应动力学 PCR技术类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA 的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR 扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA