细胞培养方法

细胞培养方法

一、预备工作

预备工作对开展细胞培育特别重要，工作量也较大，应赐予足

够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致试验失败或无法进行。预备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培育基与其他试剂

的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培育箱及其

他仪器的检查与调试，详细内容可参阅有关文献。

二、取材

在无菌环境下从机体取出某种组织细胞(视试验目的而定)，经

过肯定的处理(如消化分散细胞、分别等)后接入培育器血中，这一

过程称为取材。如是细胞株的扩大培育则无取材这一过程。机体取

出的组织细胞的首次培育称为原代培育。理论上讲各种动物和人体

内的全部组织都可以用于培育，实际上幼体组织(尤其是胚胎组织)

比成年个体的组织简单培育，分化程度低的组织与分化高相比之下，分化程度低的组织的简单培育，肿瘤组织比正常组织简单培育。取

材后应马上处理，尽快培育，因故不能立刻培育时，可将组织块切

成黄豆般大的小块，置4℃的培育液中保存。取组织时应严格保持

无菌，同时也要避开接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消

化道上皮细胞时简单带菌，为削减污染可用抗菌素处理。由组织并

分别分散细胞的方法可参阅有关文献。

三、培育

将取得的组织细胞接入培育瓶或培育板中的过程称为培育。如系组

织块培育，则直接将组织块接入培育器皿底部，几个小时后组织块

可贴牢在底部，再加入培育基。如系细胞培育，一般应在接入培育

器皿之前进行细胞计数，按要求以肯定的量(以每毫升细胞数表示)

接入培育器皿并直接加入培育基。细胞进入培育器皿后，马上放入

培育箱中，使细胞尽早进入生长状态。正在培育中的细胞应每隔肯

定时间观看一次，观看的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培育基的PH是否太酸或太碱(由酚红指示剂指示)，

此外对培育温度和CO2浓度也要定时检查。一般原代培育进入培育

后有一段埋伏期(数小时到数十天不等)，在埋伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。过了埋伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。细胞

长满瓶底后要进行传代培育，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到

三瓶连续培育。每传代一次称为"一代'。二倍体细胞一般只能传几

十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能

具有恶性性质，也可能仅有不死性(Immortality)而无恶性。培育正

在生长中的细胞是进行各种生物医学试验的良好材料。

四、冻存及复苏

为了保存细胞，特殊是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将

细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度－196℃，将细胞收集至冻

存管中加入含爱护剂(一般为二甲亚砜或甘油)的培育基，以肯定的

冷却速度冻存，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的

时间几乎是无限的。复苏一般采纳快融方法，即从液氮中取出冻存

管后，马上放入37℃水中，使之在一分钟内快速融解。然后将细胞

转入培育器皿中进行培育。冻存过程中爱护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、溶化速度等都对细胞活力有影响。

细胞培养方法

细胞培养方法 一、预备工作 预备工作对开展细胞培育特别重要，工作量也较大，应赐予足 够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致试验失败或无法进行。预备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培育基与其他试剂 的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培育箱及其 他仪器的检查与调试，详细内容可参阅有关文献。 二、取材 在无菌环境下从机体取出某种组织细胞(视试验目的而定)，经 过肯定的处理(如消化分散细胞、分别等)后接入培育器血中，这一 过程称为取材。如是细胞株的扩大培育则无取材这一过程。机体取 出的组织细胞的首次培育称为原代培育。理论上讲各种动物和人体 内的全部组织都可以用于培育，实际上幼体组织(尤其是胚胎组织) 比成年个体的组织简单培育，分化程度低的组织与分化高相比之下，分化程度低的组织的简单培育，肿瘤组织比正常组织简单培育。取 材后应马上处理，尽快培育，因故不能立刻培育时，可将组织块切 成黄豆般大的小块，置4℃的培育液中保存。取组织时应严格保持 无菌，同时也要避开接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消 化道上皮细胞时简单带菌，为削减污染可用抗菌素处理。由组织并 分别分散细胞的方法可参阅有关文献。 三、培育 将取得的组织细胞接入培育瓶或培育板中的过程称为培育。如系组

织块培育，则直接将组织块接入培育器皿底部，几个小时后组织块 可贴牢在底部，再加入培育基。如系细胞培育，一般应在接入培育 器皿之前进行细胞计数，按要求以肯定的量(以每毫升细胞数表示) 接入培育器皿并直接加入培育基。细胞进入培育器皿后，马上放入 培育箱中，使细胞尽早进入生长状态。正在培育中的细胞应每隔肯 定时间观看一次，观看的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培育基的PH是否太酸或太碱(由酚红指示剂指示)， 此外对培育温度和CO2浓度也要定时检查。一般原代培育进入培育 后有一段埋伏期(数小时到数十天不等)，在埋伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。过了埋伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。细胞 长满瓶底后要进行传代培育，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到 三瓶连续培育。每传代一次称为"一代'。二倍体细胞一般只能传几 十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能 具有恶性性质，也可能仅有不死性(Immortality)而无恶性。培育正 在生长中的细胞是进行各种生物医学试验的良好材料。 四、冻存及复苏 为了保存细胞，特殊是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将 细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度－196℃，将细胞收集至冻 存管中加入含爱护剂(一般为二甲亚砜或甘油)的培育基，以肯定的 冷却速度冻存，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的 时间几乎是无限的。复苏一般采纳快融方法，即从液氮中取出冻存 管后，马上放入37℃水中，使之在一分钟内快速融解。然后将细胞

细胞培养的方法与步骤

细胞培养的方法与步骤 1．开紫外灯前先擦超净台，台内紫外30分钟，室内紫外10分钟。同时将放在4℃内的培养液提前放置到室温。（可放在抽屉中，防止紫外照射） 换液 2．先将培养液打开（开一层烧一层），放置在酒精灯旁。 3．将细胞从培养箱中拿出，进超净台前先要喷酒精。 4．打开培养瓶，烧瓶口，而后弯脖朝后，倒液，注意瓶口不要残留液体，若有残液要用纱布擦净。 5．倒培养液（之前要烧瓶口），注意量（5ml）不要再瓶口有残留液体是烧瓶口，否则碳化的培养液会对细胞的生长有毒害作用。 6．倒一瓶封一瓶，迅速放平，培养瓶口拧紧后再松一下，放入培养箱中。 传代 2．拿出细胞，开口，烧，倒液。 3．（5ml大枪加3ml）用PBS洗2~3遍（洗净血清，放置血清钝化胰酶）。 4．胰酶消化，37℃5分钟（时间可自控）。消化程度是细胞不能滑落，要吹落。500微升胰酶（4×，1%）+1.5mlPBS→工作浓度0.25%（此时要用大枪）。 5．（大枪）加入3mlDMEM完全培养液终止消化，用吸管缓慢吹打壁上的细胞（不要让吸管的嘴端接触到瓶壁） 6．将混合物吸入离心管，加封口膜，离心500g 5分钟（此时洗去胰酶）在此期间PBS 洗培养瓶3遍，PBS一定要吸净，否则加入培养液后会产生沉淀（培养瓶要重复使用，至少100次） 7．倒掉上清，此时动作要轻或用大枪吸，加入3mlDMEM完全培养液重悬细胞，用吸管吹掉（再洗，清除胰酶）。 8．离心完毕，加入3ml新鲜培养液，再次吹打（约50~100下，视细胞情况而定），防止起泡沫，至细胞单个，圆球状为宜。 9．在培养瓶中加入新鲜培养液4ml，将吹打起来的细胞分配至各培养瓶中（量依需要而定）。80微升，100微升都可以。 冻存 8．在冻存管中加入200微升冻存液，在离心管中加入1000微升冻存液，吹打（防止起泡），移入冻存管中，此段时间不宜过久（DMSO对细胞伤害很大）。 9．封口膜封紧冻存管，可多封几层，用胶布缠紧，只缠一层就行，然后写字。 10．放在4℃30分钟。 11．放在冰水混合物中10分钟。 12．-20℃中放置1~2小时（经验值是不超过1.5小时） 13．-70℃中过夜，（最多可存放7~8个月） 14．放入液氮。 注意：传代前一天换液（可换可不换） 冻存前一天换液（必换） 血清灭活: 56℃30分钟水浴。

细胞培养方法

细胞株(系)细胞复苏 (1)戴手套，从液氮罐中取出冷冻管。 (2)迅速放入38℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化。 (3) 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。然后在无菌下取出细胞。冻存管用75%酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液注入离心管中，再滴加10ml培养液。 (4)在1000r/min速度下离心5～10分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度1×109/L，置37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。若细胞密度较高，及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中，并加入培养基贴壁培养12～24小时后，充去上清，换入新鲜培养基继续培养。加入的培养液的量依冻存的细胞数量，如果冻存数量为106，则稀释10倍使细胞达到105即可。 注意事项 在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动安瓿或冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段(-5～0℃)。这样复苏的冻存细胞存活率高，生长及形态良好。然而，由于冻存的细胞还受其他因素的影响，有时也会有部分细胞死亡。此时，可将不贴壁、飘浮在培养液上(已死亡)的细胞轻轻倒掉，再补以适量的新培养液，也会获得较为满意的结果。 细胞换液 （1）贴壁细胞（包括半贴壁细胞的换液） 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。

常规细胞培养方法

常规细胞培养方法 传代培养法 原理 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 材料和试剂 1. 细胞：贴壁细胞株 2. 试剂：0.25％胰酶、1640培养基（含10％小牛血清） 3. 仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶、吸管、废液缸等 操作步骤 1. 吸除培养瓶内旧培养液。 2. 向瓶内加入胰蛋白酶和EDTA混合液少许，以能覆满瓶底为限。 3. 置温箱中2~5分钟，当发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即终止消化。 4. 吸除消化液，向瓶内注入Hanks液数毫升，轻轻转动培养瓶，把残余消化液冲掉。注意加Hanks液冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动的细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用Hanks液冲洗，直接加入培养液。 5. 用吸管吸取营养液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。 6. 计数板计数后，把细胞悬液分成等份分装入数个培养瓶中，置温箱中培养 无菌操作注意事项 1. 操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。 2. 点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。 3. 操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。 4. 不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。 5. 瓶子开口后要尽量保持45℃斜位。 6. 吸溶液的吸管等不能混用。 无菌操作体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。即便使用设备完善的实验室。若实验者粗心大意，技术操作不规范,也会导致污染。因而．为在一切操作中为最大可能的保证无菌．每一项工作都必须做到有条不紊和完全靠。 【培养前准备】在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。这可以避免开始实验后．囚物品不全往返拿取而增加污染机会。 【操作野消毒】无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面—次(拖布要专

【高中生物】细胞培养一般方法

【高中生物】细胞培养一般方法 1.玻璃吸管和玻璃培养瓶的消毒:1)高压蒸汽灭菌15分钟以上;2)干烤消毒140度2小时以上; 2.首先清洁无菌台，然后用75%酒精擦拭，用紫外线照射40分钟以上；各种培养皿辐照3小时以上； 3.培养基(ph7.2)和血清配制好后要做无菌试验:将血清按10%加入培养基内,用无菌的玻璃离心管或玻璃瓶取完全培养基5-10ml置培养箱内培养2-3天,肉眼见无浑浊或沉淀等异物.分装后置-20度保存; 4.消化液（pH7.8）或其他添加的液体用高压蒸汽灭菌或用一次性无菌过滤器过滤灭菌，然后分装到支架中-20度储存； 5.各种炒娴囊禾甯次率庇ρ咭”呷诨?否则有的液体(特别是培养基)容易产生沉淀. 如果培养箱暴露在紫外线下超过6小时，则至少每月一次，在暴露在紫外线下后用清水擦拭 7.进入操作时应注意先清洗双手及手腕,然后用75%酒精擦拭,操作时注意无菌台内空间层次.手及物品不要在暴露的瓶口上方来往,如果数量较多,培养瓶应放在与酒精灯平行地方便于操作,瓶与瓶之间应相隔一定的距离,开瓶(盖)时应先用75%酒精反复擦拭或用灯烧,开开后应用灯先烧口,然后烧盖.用完后同样操作.整个操作过程尽量在无菌台靠里面一点. 恢复： 1.应遵守慢冻快融的原则.先将水温锅调至37-37.5度,取出冻存的细胞迅速放入后交细胞面浸至水面以下不断摇动至融化. 2.在无菌台上，将完整的培养基加入50ml的小培养瓶中，约5ml，然后用无菌吸管从冷冻管中取出细胞，放入培养室，轻轻摇动，使细胞均匀，然后放入培养箱中培养 传代: 1.贴壁细胞： 对于贴壁细胞应先吸(倒)尽培养基,吸的越干净越好,以免中和后加入的消化液,使强度减弱.50ml培养瓶加入消化液约0.6ml,按此比例进行消化,(根据配制强度经验),晃动使消化液铺均匀置37度培养箱约2分钟,镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后,轻轻振动瓶底使细胞全部脱落,加入2-3ml完全培养基后 高中三年级

细胞培养的基本步骤

细胞培养的基本步骤 细胞培养是一项重要的生物学技术，通过体外培养细胞系或原代培养细胞，可以研究细胞生物学特性、进行药物筛选和细胞治疗等。以下是细胞培养的基本步骤： 1. 培养皿或细胞瓶的准备：选择合适的细胞培养皿或细胞瓶，通常使用一次性塑料培养皿或细胞瓶，根据不同的细胞类型选择适当的大小和形状。用肥皂水清洗，再用无菌水冲洗，最后在超净工作台中用无菌滤纸吸干。 2. 培养基的配制：准备含有营养物质和缓冲系统的培养基，常用的有DMEM、RPMI-1640、MEM等，将培养基加入无菌容器中，根据细胞类型和实验需求加入适量的胎牛血清、horse serum、氨基酸、葡萄糖等，最后用高压蒸汽灭菌。 3. 细胞的接种：将体外培养的细胞或原代培养的细胞从冻存管中取出，在超净工作台中用胰蛋白酶消化液消化，轻轻吹打成单细胞悬液，浓度约为1×10cells/mL。将一定量的细胞悬液接种到培养皿或细胞瓶中，尽量分散均匀。 4. 细胞的饲养：将接种有细胞的的培养皿或细胞瓶放入二氧化碳培养箱中，在含有5%-10%的CO2、95%-90%的空气环境中培养。培养过程中定期观察细胞生长情况，每天更换一次培养基，根据需要加入适量的胰蛋白酶消化液。 5. 细胞的观察：在显微镜下观察细胞形态和生长情况，记录细

胞密度和活力等指标。定期拍照记录细胞的生长过程。 6. 细胞的传代：当细胞密度达到一定范围时，需要将细胞进行传代培养。在超净工作台中用胰蛋白酶消化液消化细胞，将培养皿或细胞瓶中的细胞尽量分散成单细胞悬液。将适量的细胞悬液接种到新的培养皿或细胞瓶中，放入二氧化碳培养箱中培养。 7. 细胞的冻存：将需要长期保存的细胞进行冻存，冻存液通常含有保护剂、DMSO等成分。将冻存管放入液氮罐中保存。 8. 细胞的计数：定期对细胞进行计数，用血球计数板或细胞计数仪进行计数，根据细胞密度和活力等指标评估细胞的生长状态和活力。 9. 细胞的活力检测：通过MTT比色法、台盼蓝染色法、流式细胞术等方法检测细胞的活力或死亡情况，进一步分析细胞生长特性和药物敏感性等。 总之，细胞培养需要严格的无菌操作和适宜的培养条件，定期观察和记录细胞的生长情况，及时进行传代和冻存等操作，以保证细胞的生长状态和活力。

各类细胞培养大全

【总结】各类细胞培养方法总结大全 消化法原代培养兔胸主动脉平滑肌细胞 用DMEM配0.2%的1型胶原酶（用20的血清的DMEM配可能更好，有类似文献），分装于青霉素小并，每并2-3ml。1只免的胸主动脉置于1 瓶消化液中消化，消化约10几个小时（消化程度的把握要体会），离心后，接种（若见细胞量大，成功把握大），绝对静置3天（没必要看，看多了无益），8天可传代。 犬胸主动脉平滑肌贴块法——方法成熟，比消化法好控制的多。 1、取材过程要快，取好放4度储存的D-hanks液带入超净台，不然先天不足； 2、块大小密度影响不是很大（尽量小），关键是边缘要尽量整齐，选用快刀快剪； 3、一定要贴牢，翻瓶时间个人不一，有3－5小时的，也有贴块直接翻瓶的，关键还是贴牢，另外在贴牢的基础上尽量早接触培液，可以在剪块的时候加少量培液略湿润，镊子夹块到培养瓶后，用吸管之类的细长工具将块均匀铺好，加刚好覆盖组织块的培养液量（25cm2培养瓶大概2ml），半小时到一小时内就可翻瓶，动作要轻，从培养瓶一角试着翻，如果块飘起，则再过会翻； 4、贴块无内膜外膜面之分，亦无需刮除内膜，若内膜面向下，会有少量内皮细胞爬出组织块，但只要平滑肌细胞一旦爬出来，内皮细胞生长自然不占优势，会因为平滑肌细胞大量爬出、增殖而漂起来，换液可洗掉，另外传代可纯化平滑肌细胞。 5、培液Gibco的DMEM（高糖4500mg/L）加四季清新生牛血清20%。 建议用1次性培养瓶，成功机会大于玻璃瓶。成功后再小心过度成玻璃瓶。块愈小愈好。用新刀，快，损伤小。全过程越短越好。组织块的边缘不齐整也不是什么很关键的问题，最重要的是组织块要尽量小，尽量能剪成小米粒大小；另外就是组织块要贴牢，其关键就是培养液可以在6小时后翻瓶的时间再加，这样就可以避免组织块贴不牢而悬浮起来的尴尬了。 人脐静脉内皮细胞的体外培养、鉴定及形态观察 1.标本采集在无菌条件下于健康产妇分娩后立即取新生儿脐带，挤出脐带血管中的血液，放入装有含青链霉素的PBS液瓶中，2h之内行脐静脉内皮细胞培养。 双抗：青霉素100u/ml; 链霉素100μl/ml PBS：KCl 0.2 g/L, KH2PO4 0.24 g/L, NaCl 8.0g/L, Na2HPO4?7H2O 1.56g/L或Na2HPO4 1.44 g/L。在800ml蒸馏水中加入上述质量物质，用盐酸调节溶液的pH值至7.4，加水定容至1L，高压蒸汽灭菌20分钟，室温保存。 2.原代血管内皮细胞的获取与培养按Jaffe等人〔1〕的方法加以改进。在无菌条件下取新生儿脐带，剪去钳痕和凝血块阻塞部分，找到脐静脉。一端插上带有胶管的玻璃管结扎固定，经胶管接注射器，用生理盐水灌洗。待脐静脉内的残血除净后，用37℃PBS，冲洗两次，将另一端用铁夹夹闭，向脐静脉内灌注0.25%胰蛋白酶8～10ml，夹闭胶管放入已灭菌的大平皿中。37℃孵育12min，在此期间经常翻动脐带使酶溶液在血管内流动以促使内皮细胞均匀与酶接触。取出脐带后轻轻挤压管壁，将含有内皮细胞的胰蛋白酶注入50ml锥形离心管中，加入小牛血清2ml终止酶反应。再以30ml PBS冲洗管腔，流出液一并入离心管，1000r/min 离心10min，弃上清，加入含有10%小牛血清的DMEM [或IMDM(Dibco)？]培养液，充分混合制成细胞悬液。取0.1ml细胞悬液在血细胞计数板计数。最后调细胞数，以1×105/ml 接种至24孔培养板中，每孔1ml。置于5%CO2，37℃静止培养24h更换培养液，以除去未贴壁的细胞。以后每隔2d换液1 次，以维持细胞的营养和内环境的稳定。

常用的五种动物细胞培养方式

一、半连续式培养 1.半连续式培养又称为重复分批式培养或换液培养。采用机械搅拌式生物反应器系 统，悬浮培养形式。在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变。这种类型的操作是将细胞接种一定体积的培养基，让其生长至一定的密度，在细胞生长至最大密度之前，用新鲜的培养基稀释培养物，每次稀释反应器培养体积的1/2~3/4，以维持细胞的指数生长状态，随着稀释率的增加培养体积逐步增加。或者在细胞增长和产物形成过程中，每隔一定时间，定期取出部分培养物，或是条件培养基，或是连同细胞、载体一起取出，然后补加细胞或载体，或是新鲜的培养基继续进行培养的一种操作模式。剩余的培养物可作为种子，继续培养，从而可维持反复培养，而无需反应器的清洗、消毒等一系列复杂的操作。在半连续式操作中由于细胞适应了生物反应器的培养环境和相当高的接种量，经过几次的稀释、换液培养过程，细胞密度常常会提高。 2.半连续式特点： ·培养物的体积逐步增加； ·可进行多次收获； ·细胞可持续指数生长，并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平，培养过程可延续到很长时间。该操作方式的优点是操作简便，生产效率高，可长时期进行生产，反复收获产品，可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。在动物细胞培养和药品生产中被广泛应用。 二、连续式培养 1.连续式培养是一种常见的悬浮培养模式，采用机械搅拌式生物反应器系统。该模 式是将细胞接种与一定体积的培养基后，为了防止衰退期的出现，在细胞达最大密度之前，以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基；同时，含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，以保持培养体积的恒定。理论上讲，该过程可无限延续下去。

培养细胞的方法

培养细胞的方法 培养细胞是生物学研究中的一项重要技术，它可以为细胞生物学、生物医学和生物工程等领域的研究提供有力支持。本文将介绍几种常用的细胞培养方法，并讨论其原理及应用。 一、原代细胞培养法 原代细胞培养法是指从组织或器官中分离出的未经传代的细胞在培养基中进行培养。其步骤主要包括组织或器官的消化、细胞的分离、细胞的培养和传代。原代细胞培养法适用于研究细胞的生长、增殖、分化及其功能等方面的问题。 二、细胞株培养法 细胞株培养法是指将一种或多种细胞经过一系列的培养和传代使其获得一定的纯度和稳定性，形成细胞株后进行培养。其步骤主要包括细胞的分离、筛选、传代和培养等。细胞株培养法适用于研究细胞的遗传、生理学、药理学和毒理学等方面的问题。 三、三维细胞培养法 三维细胞培养法是指将细胞以三维结构进行培养，模拟体内环境，提高细胞的生物学活性和细胞外基质的组织结构。其常用的方法包括胶体滴定法、支架培养法和生物印迹法等。三维细胞培养法适用于研究细胞-细胞相互作用、细胞-基质相互作用以及组织工程学等方面的问题。

四、细胞凋亡研究的培养方法 细胞凋亡是指细胞在一定条件下自发性死亡的过程，是维持机体稳态和组织发育的重要机制。细胞凋亡的研究对于肿瘤治疗和新药开发具有重要意义。常用的细胞凋亡研究培养方法包括细胞凋亡检测、凋亡相关蛋白的表达和信号通路的研究等。 五、细胞培养的常见问题及解决方法 在细胞培养过程中，常常会遇到一些问题，如细胞的污染、细胞的死亡和细胞的分化等。针对这些问题，可以采取一些常见的解决方法，如细胞的消毒、细胞的培养条件优化和细胞的分化抑制等。 六、细胞培养的应用前景 细胞培养技术在生物学、医学和工程学等领域具有广阔的应用前景。在生物学方面，细胞培养可用于研究细胞的生长、增殖和分化等。在医学方面，细胞培养可用于疾病的诊断、药物的筛选和治疗方法的研究等。在工程学方面，细胞培养可用于生物工程和组织工程的研究和应用等。 细胞培养是一项重要的实验技术，通过不同的培养方法可以满足不同研究的需求。未来随着科学技术的不断发展，细胞培养技术将在更广泛的领域得到应用，并为科学研究和医学进步提供更多的支持。

细胞培养基本方法

细胞培养基本方法 细胞培养是一种用于研究与维持细胞生长的技术，它在生物学、医学、药理学等领域都有广泛的应用。细胞培养的基本方法包括细胞的复苏、换液、传代和冻存。 1.细胞复苏： 细胞复苏是指从冻存样品中复苏细胞的过程。首先，将冻存样品取出，快速解冻在37℃预热的培养基中；然后，将解冻的细胞转入带有适宜营 养物的培养基中；最后，将培养皿放入培养箱中，维持细胞在适宜的环境 中生长。 2.细胞换液： 细胞培养的过程中，细胞的新陈代谢产生代谢产物和废物，需要定期 进行培养基的换液。此外，培养基中的营养物质也会逐渐消耗殆尽。因此，细胞培养的基本方法之一就是进行定期的换液。换液时，首先抽取培养基 中的细胞和悬浮物，然后用新鲜的培养基代替旧的培养基。这个过程确保 了细胞在新的培养基条件下继续生长和繁殖。 3.细胞传代： 细胞传代是指将培养物中过密的细胞进行分离和分散，以保持其正常 生长状态。细胞传代可以延长细胞的寿命，并减少细胞的突变和电解质失 衡风险。传代要求使用一种含有酶类消化细胞间粘附的液体，例如胰酶或 胎牛血清。首先，将胰酶加入细胞培养皿中，使细胞间粘附的连接被破坏；然后，用培养基洗涤细胞，停止胰酶反应；最后，将细胞转入新的培养皿中，添加新鲜的培养基。

4.细胞冻存： 细胞冻存是为了保存细胞，并随时用于后续的实验或研究。冻存细胞时，首先需要将细胞从培养皿中收集，并将其转移到含有冻存液（常用的 是含有甘油和细胞培养基的混合液）的离心管中。然后，使用冷冻冰箱或 液氮罐将离心管快速冷冻，使细胞保存。冻存后的细胞可以在以后的任何 时间点解冻和使用。 总结起来，细胞培养的基本方法包括细胞的复苏、换液、传代和冻存。这些方法都是为了维持细胞的生长和健康状态，并为后续的实验和研究提 供细胞资源。细胞培养技术已经成为生物学和医药研究的重要工具，为我 们深入了解细胞生物学和疾病机制提供了极大的便利。

细胞培养的步骤和方法

细胞培养的步骤和方法 细胞培养是一种重要的实验技术和研究手段，可以用于研究细胞的生物学特性、生理代谢、信号转导、分化和增殖等。一个成功的细胞培养实验需要遵循一系列步骤和方法。本文将介绍10条关于细胞培养的步骤和方法，并展开详细描述。 一、选择适当的培养基和细胞系 选择适当的培养基对于细胞培养的成功至关重要。不同种类的细胞需要不同的培养基来支持其正常生长和生存。在选择培养基时应注意添加生长因子、激素、血清、抗生素等物质的种类和浓度，以及pH值、温度等因素。选择合适的细胞系也是非常重要的。不同的细胞系有不同的生长特性，适宜的细胞系可以提高细胞培养的效率和成功率。 二、消毒实验室设备和培养物品 在进行细胞培养前，应仔细消毒实验室设备和培养物品，以防止细菌、真菌和病毒等污染。常用的消毒方法包括紫外线辐射、70%乙醇喷雾消毒、高压蒸汽灭菌等。如果不经常清洁和消毒实验室，很容易引入外部细胞，对细胞的培养和实验结果产生影响。 三、准备细胞培养所需的物品和试剂 在进行细胞培养前需要准备一系列的物品和试剂，包括培养基、培养皿、移液器、无菌滤纸、细胞分离液、细胞传代液、显微镜干片等。在使用这些物品和试剂时，需要注意消毒和无菌操作，避免污染和感染。 四、细胞孵育 细胞培养需要在特定条件下进行，比如适宜的温度和湿度、含氧气和二氧化碳的环境等。在孵育细胞时，需要将培养皿放置在细胞培养箱中，保持稳定的生长环境。同时需要定时检查细胞的状态和生长情况，以及培养基和滤纸的状态，及时更换和添加。 五、细胞分离 细胞分离是细胞培养中一个重要的步骤，可以将细胞从培养皿中分离出来，方便进一步的研究。细胞分离可以通过化学和机械方法实现。化学方法包括使用谷胱甘肽、胰蛋白酶、胰蛋白酶-EDTA等消化酶，机械方法包括手动刮取、离心、过滤等。在进行细胞分离前需要确保培养皿没有污染和细胞不存在过多的死亡或脱落。 六、细胞计数和检测

细胞生物学中最常用的5种细胞培养技术

细胞生物学中最常用的5种细胞培养技术细胞生物学是研究细胞结构、功能、分类、发育以及细胞在生命过程中的相互关系等方面的学科。在细胞生物学中，细胞培养技术是非常重要的一项技术，它可以在无菌的条件下培养、保存细胞，并且可以进行细胞的分离、纯化、鉴定、增殖、转染、诱导分化等操作，为细胞生物学的相关研究提供了基础。 下面将介绍细胞生物学中最常用的5种细胞培养技术。 一、传统细胞培养技术 传统细胞培养技术是指利用培养皿、培养基、培养室等基础设施进行培养的技术。该技术可以较好地维持细胞在体外的生长状态，使细胞克隆化、鉴定、扩增、分化或合成合适的基质，为多种生物学研究提供了必要技术手段。 在传统的细胞培养技术中，涉及到的主要设备和试剂有：组织细胞均一器、离心机、洗涤机、常规培养基、游离胰酶、胎牛血清等。

此外，对控制环境影响也有严格的要求，如细胞培养应在静态的无菌条件下进行，避免各种污染的发生。 二、悬浮细胞培养技术 悬浮细胞培养技术是指通过将细胞放入含有细胞培养基的培养器中，维持细胞在悬浮状态下进行培养的一种技术。悬浮细胞培养技术的研究对象包括动物细胞、植物细胞和微生物等。 在悬浮细胞培养技术中，涉及到的主要设备和试剂有：旋转培养器、搅拌培养器、细胞培养基、血清替代物、培养室等。 在进行悬浮细胞培养的同时，需要注意对培养环境进行有效控制，确保培养过程无杂质、无致病微生物的入侵。此外，控制培养器内悬浮颗粒的所占比例、含氧量和温度等因素也是进行悬浮细胞培养的重要技术手段之一。 三、三维细胞培养技术

三维细胞培养技术是指通过结构性的材料基质，将单个细胞或 者成簇的细胞培养为3D的立体结构，使其能够模拟生物体内的细 胞环境并进行培养的一种技术。与传统2D平面细胞培养技术相比，三维细胞培养技术更能反应生物体内的细胞环境，对有些细胞生 长的形态、功能和表达特性的研究也更有优势。 在三维细胞培养技术中，涉及到的主要设备和试剂有：支架材料、重量材料、培养基、细胞培养器等。 四、体外循环系统技术 体外细胞循环系统技术是指通过植入支架、人工血管和人工心 脏等装置，构建出有效的仿生微小环境，使细胞在仿生环境中共 同生长、交流、细胞间作用的一种细胞培养技术。该技术能够更 有效地将细胞培养到特定生长状态，并使特定细胞在一个仿生环 境中实现生长、扩增和生产等等巨大的潜力。目前一些医学领域 的修复与再生技术已开始在多层细胞工程组织的构建中尝试使用 该技术。 在进行细胞培养的时候，把研究重点从细胞单元上放大到组织 器官水平，是未来研究领域的重点。

常见的细胞培养方式

六、常见细胞的培养方式 1885年，W Roux尝试使组织离体培养，被认为是组织细胞培养技术的萌芽；1907年Harrison和1912年Carrel开始把组织培养作为一种方法，用于研究离体动物细胞的培养，标志着细胞培养技术(Cell culture technology)的诞生。细胞培养是指从体内组织取出细胞膜，模拟体内生存环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖并维持结构和功能的一种培养技术。目前细胞培养方式主要 包括以下三种： 6.1 贴壁培养 贴壁培养主要适用于贴壁依赖性细胞．此类需要相互依赖，需贴附于不起化学作用的物质(玻璃或塑料等无活性物质)的表面生长、生存和维持，并最终在附着面生长至单层，铺满平面时便会发生接触抑制．大多数 动物细胞，包括非淋巴组织的细胞和许多异倍体体系的细胞属于这一类型，他们需要附着于适量正电荷的 固体或半固体的表面胜仗。 6.2 悬浮培养 来源于血液、淋巴组织的细胞，及许多肿瘤细胞（包括杂交瘤细胞）和某些转化细胞等属于悬浮培养型细胞，细胞为非贴壁依赖性细胞，无需支撑面，细胞或细胞聚集体悬浮于液体培养基中增殖．悬浮培养是大 规模细胞培养的理想方式，可采用类似于微生物的方法进行悬浮培养。 6.3 固定化培养 动物细胞较微生物脆弱，易受剪切力等的影响，而细胞固定化技术可较好的保护细胞免受机械力及环境变 化的影响，提高细胞的耐受力，促使细胞高密度培养，提高目的产物的产率。在传统的固定化酶技术中， 常采用戊二醛、聚丙烯酰胺、聚氨酯等作为固定化细胞载体。但在动物细胞培养中，一般使用较温和的固 定方法，如吸附、包埋、中空纤维或胶囊化等，具有剪切力低、传递效果好和抗污染能力强、细胞生长密 度高、产物易于收集和分离纯化等特点． 由于所培养的细胞的不同，固定化培养的方式也有不同，一般对于贴壁依赖性细胞通常采用胶原包埋，而 对于非贴壁依赖性细胞则常用海藻酸钙包埋。常用的细胞固定化的方法主要有吸附、共价贴附、离子/共价交联、包埋和微囊化等。 6.3.1 吸附 6.3.1.1 多孔陶瓷 KC.Biologicals公司开发了一种完全自动化的细胞培养系统。该系统的核心是陶质矩形蜂窝状生物反应器。反应器构型是一圆筒内装置有许多陶质矩形通道的蜂窝状圆柱体。通道长30cm，截面积是长方形，约为1mm2，壁厚0.12mm，可提供4.25m2 的生长表面积。这种结构的生物反应器，既可用于培养悬浮生长的细胞，又 可用于培养贴壁依赖性细胞。 6.3.1.2 微载体 传统的贴壁依赖性细胞的培养通过静止或转瓶等培养来获得，操作繁复，且耗费空间及人力．1967年，VanWezel首次提出了“微载体”培养系统，经过几十年的研究改进，微载体培养技术现已广泛应用于动 物细胞的培养，是当前贴壁依赖型细胞大规模培养的主要方法，兼具有平板培养和悬浮培养的有点；能够 使得细胞处在相对均一的环境，温度、pH、CO2等均等得到很好的控制。较传统的单层细胞培养，大大增

细胞培养方法

细胞 一细胞培养 （一）原代培养 ○1胰蛋白酶消化法 1.将组织块用PBS清洗3遍，去除表面血污，移入新的培养皿中用弯头剪剪至1mm3（糊状）后用PBS清洗三遍（洗至PBS澄清透明） 2.吸去PBS液，将组织块移入15ml离心管中，加入组织块两倍体积预热至37℃的0.25%含EDTA的胰蛋白酶，在37℃水浴中作用20分钟，每隔五分钟摇晃一下 3.加入两倍体积的含血清的培养基终止消化，将消化后的组织块用细胞筛过滤，取过滤液于离心管中，1000r/min离心5分钟 4.离心后吸去上清液，加入5ml含10%胎牛血清和1%双抗的培养基，轻轻吹打混匀，细胞计数，调至约5×105个/ml，每个培养皿（6㎝培养皿）加入5ml含细胞的培养基，上下左右移动混匀 5.放入37℃，5%CO2的培养箱中培养 6.24h后，观察细胞贴壁情况，更换培养基，继续培养，2-3天更换一次培养基 7.代细胞融合率达80%-90%时进行传代培养 ○2组织块法 1. 将组织块用PBS清洗3遍，去除表面血污，移入新的培养皿中用弯头剪剪至1mm3（糊状）后用PBS清洗三遍（洗至PBS澄清透明） 2.将组织块转移至培养皿中，每个组织块保持一定间距 3.向培养皿中缓慢加入培养基至刚好没过组织块，小心放入37℃，5%CO2的培养箱中培养 4.24h后，观察贴壁情况，并补加新培养基 仪器：6㎝培养皿、弯头剪、15ml离心管、50ml离心管、5ml移液枪、1ml移液枪、5ml枪头、1ml枪头、废液瓶、酒精棉球、离心机、水浴锅、倒置显微镜、细胞培养箱 试剂：PBS缓冲液、0.25%EDTA-胰蛋白酶、DMEM （高糖）培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素混合液（双抗）

细胞培养的操作步骤

细胞培养的操作步骤 一、原代培养及其操作步骤 原代分离细胞培养是指从供体内取出组织后,经机械以及消化分离成单个细胞或单一型细胞群,使之在体外模拟人体生理环境,在无菌、适当温度和一定的营养条件下,生存、生长和繁殖;原代培养细胞常有不同的细胞成分,生长缓慢,但是更能代表所来源的组织细胞类型和表达组织的特异性特征;利用原代细胞培养做各种实验,如药物测试、细胞分化及病毒学方面的试验效果很好;其操作步骤如下; 1.剪切组织先将所取得的组织,用D-Hanks或Hanks液清洗,以去除表面血污,并用手术镊去除黏附的结缔组织等非培养所需组织;再次清洗后,用手术刀将组织切成若干小块,移入青霉素小瓶或小烧杯中,加入适量缓冲液,用弯头眼科剪,反复剪切组织,直到组织成糊状,约1mm3大小;静置片刻后,用吸管吸去上层液体,加入适当的缓冲液再清洗一次; 2.消化分离消化分离的目的是将细小的组织块消化分离成细胞团或分散的单个细胞,以利于进一步的培养,常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶; 3.培养细胞悬液用计数板进行细胞计数;用培养液将细胞数调整为2～5×105 cells ／ml,或实验所需密度,分装于培养瓶中,使细胞悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜;置CO2培养箱内,5％CO2,37℃静置培养;一般3～5d,原代培养细胞可以黏附于瓶壁,并伸展开始生长,可补加原培养液量1／2的新培养液,继续培养2～3d后换液,一般7～14d可以长满瓶壁,进行传代; 4.注意事项 1无菌操作：细菌或霉菌污染是培养失败的常见原因,必须加强各个环节的无菌操作观念,以预防为主,一旦污染,一般很难消除; 2培养液：所用的培养液必须满足细胞生存和生长的必要条件;由于细胞来源的动物种类、组织类型不同,对培养液的要求有一定的差异,必要时可用预实验的方法选择适当的培养液; 3小牛血清：小牛血清对于维持培养细胞的生存和促进细胞增殖起着关键性作用;可选择多种不同批号的小牛血清进行小样分析;一旦确定某一厂家的某一批号小牛血清后,就保持应用至实验完成; 4胶原酶溶液：必须新鲜配制,贮存时间过长即使是-20℃低温保存,也将影响消化效力,导致消化时间过长,细胞损伤增加;

细胞培养技术

细胞培养技术 细胞培养技术是一种重要的生物技术手段，可用于研究 细胞的生理、代谢和分子机制，了解疾病的发病过程，开发新药物和生物制品等。本文将从细胞培养的基本原理、培养条件、培养方法及其应用等方面来介绍细胞培养技术。 1. 细胞培养的基本原理 细胞培养基本上是将有机体的一部分组织或细胞分离出来，放在独立的培养容器（如培养皿、培养瓶）中，以固体、液体或半固体培养基为基础，模拟生物体内的环境，通过提供适当的营养、温度、湿度和气氛等条件，使细胞在体外生长、分化和繁殖，维持其生命活动。细胞培养的基本原理包括以下几个方面： (1) 提供适当的培养基 细胞培养基是细胞培养的重要条件之一，它要求有营养 成分的成份、酸碱度、适当的温度和湿度等。细胞培养基主要分为无血清培养基和含血清培养基两种。无血清培养基可以避免血清的批次差异，降低了培养过程中的变异性，但无血清培养基更贵，对细胞生长的影响程度更大且对培养稳定性的要求更高。在实际应用中，血清培养基仍然是最常用的培养基。 (2) 控制氧气供应 细胞在生长过程中需要充足的氧气和营养物质供应。氧气，作为呼吸作用中的最终受体，在细胞生长、异化和化学诱导中，也扮演了重要的角色。Highmoreet al.（1978）根据 细胞所需氧的需求程度将细胞分为三种类型，即耗氧型、耐氧

型和厌氧型。在细胞培养的过程中，要根据不同的需求，合理控制氧气供应，以满足细胞的生长需求。 (3) 提供适当的温度和湿度 细胞定植能力、增殖速度和产生生化反应等都受到温度和湿度的影响。在常温下，细胞生长速度相对较慢，而在适当的温度下，细胞生长速度会加快，并且会增加细胞代谢产生的热量。湿度是影响细胞生长的另一个重要因素，不适当的湿度会影响培养液中溶液中的渗透压和细胞内液体平衡，导致细胞死亡。 (4) 增加营养和生长分子的供应 细胞生长、分化和繁殖与大量的物质变换和反应有关。给予细胞必需的营养物质和生长分子，能够促进细胞的生长和增殖，并在一定程度上控制细胞的分化和功能表达。常用的基础培养液中包含有机成分（如氨基酸、葡萄糖、维生素）、矿物质（如钾、钠、钙、镁等）和蛋白质和激素等。同时，还需要适当的添加提供必要保护物质，如抗氧化剂、氨基酸等。 2. 细胞培养的基本条件 细胞培养需要注意一些基本条件，如增加培养基的含氧量、保证培养容器的严密性、控制培养温度和湿度、防止污染等。 (1) 营养物质 培养物要求营养物质富足，以满足细胞的各种需要。 (2) pH值 培养液中的pH值必须保持在设定范围内，才能维持营养物质的稳定性，防止细胞死亡。 (3) 氧气含量 氧气含量对细胞的生长和繁殖有明显的影响。一般情况

细胞培养的方法

细胞培养的方法 细胞培养技术是现代生物医学研究不可或缺的重要手段之一。通过体外培养，可以使 生物细胞在一定条件下不断增殖和分化，为生物学研究提供了很多便利。但是细胞培养方 案的选择和操作方法的正确性直接影响到细胞的生长繁殖、存活率和细胞的完整性等方面，正确选择和掌握细胞培养的方法技巧对于研究的准确性和实验结果的可比性具有重要意义。下面列出了10条关于细胞培养的方法，并展开详细描述。 1.选择合适的培养基 培养基选择是影响细胞培养成败的重要因素之一。不同类型的细胞需要不同类型的培 养基，包括基础培养基、添加物、生长因子等，还需要注意是否含有过期物质。要注意的是，不同细胞系对不同的药物和会造成细胞的损伤，因此在选择不同的培养基时需要谨 慎。 2.正确的培养箱与培养环境 细胞需要适合的培养环境来生长，如适当的氧气水平、恰当的温度等。使用排除有害 气体和杂质的培养环境和培养设备，如无菌操作台、高效过滤器、CO2培养箱，有助于维 持细胞的健康和生长状态。 3.消毒操作 细胞培养实验应进行无菌操作。在无菌条件下进行培养可以防止细菌和真菌的污染， 保障实验的重复性和可比性，因此对工具、培养器具、培养基等进行彻底的消毒和灭菌操 作是不可缺少的。 4.细胞的接种密度与平衡生长 细胞接种的密度应根据细胞类型进行调整。密度过低会使细胞生长缓慢，过高则会导 致过度分裂和明显的细胞死亡。细胞密度的平衡生长可以通过掌握合适的培养时间和更换 新的培养基来维护。 5.细胞的观察与鉴定 观察和鉴定细胞是正确选择细胞培养方法的前提。需要仔细观察并记录细胞的生长、 形态、颜色、大小和产物的形成等特征，并比对标准细胞特征和应用目的，从而确定细胞 的种类和质量。 6.细胞分离的方法

细胞培养的方法及优缺点

细胞培养的方法及优缺点 细胞培养是指将细胞从动物或植物体内取出，然后在适宜的人工环境中生长的过程。细胞可以在培养前直接从组织中取出并通过酶或机械方法进行解离，也可以来源于已建立的细胞系或细胞株。 原代培养及其操作步骤 原代分离细胞培养是指从供体内取出组织后，经机械以及消化分离成单个细胞或单一型细胞群，使之在体外模拟人体生理环境，在无菌、适当温度和一定的营养条件下，生存、生长和繁殖。原代培养细胞常有不同的细胞成分，生长缓慢，但是更能代表所来源的组织细胞类型和表达组织的特异性特征。利用原代细胞培养做各种实验，如药物测试、细胞分化及病毒学方面的试验效果很好。 原代细胞也并不是非要分离，如果经费允许可以豪购。 操作步骤如下 1、剪切组织：先将所取得的组织，用D-Hanks或Hanks液清洗，以去除表面血污，并用手术镊去除黏附的结缔组织等非培养所需组织。再次清洗后，用手术刀将组织切成若干小块，移入青霉素小瓶或小烧杯中，加入适量缓冲液，用弯头眼科剪，反复剪切组织，直到组织成糊状，约1mm3大小。静置片刻后，用吸管吸去上层液体，加入适当的缓冲液再清洗一次。 2、消化分离：消化分离的目的是将细小的组织块消化分离成细胞团或分散的单个细胞，以利于进一步的培养，常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶。 3、培养：细胞悬液用计数板进行细胞计数。用培养液将细胞数调整为（2～5）×105 cells／ml，或实验所需密度，分装于培养瓶中，使细胞悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜。置CO2培养箱内，5％CO2，37℃静置培养。一般3～5d，原代培养细胞可以黏附于瓶壁，并伸展开始生长，可补加原培养液量1／2的新培养液，继续培养2～3d后换液，一般7～14d可以长满瓶壁，进行传代。 传代培养及其操作步骤 原代细胞培养成功以后，需要进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足或密度过大，营养障碍，影响细胞生长。细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶中培养的过程称之为传代培养。传代细胞允许培养的细胞扩增(形成细胞株)，可以进行细胞克隆，易于保存，但可能丧失一些特殊的细胞和分化特征。传代细胞形成细胞株的最大利处在于提供了大量持久的实验材料，便于实验。 细胞株也是可以购买的。 1、操作步骤： （1）吸掉或倒掉培养瓶内旧培养液。 （2）向瓶内加入胰蛋白酶液和EDTA混合液少量。以能覆盖培养瓶底为宜。 （3）置37℃孵箱或室温（25℃温度）下进行消化，2~5min后把培养瓶放在倒置显微镜下进行观察，当发现胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即中止消化。 （4）吸出消化液，向瓶内加入Hanks液少量，轻轻转动培养瓶，把残留消化液冲掉，然后再加培养液。如果仅使用胰蛋白酶消化，在吸除胰蛋白液后，可直接加入少量含血清的培养液，终止消化。 （5）使用弯头吸管，吸取瓶内培养液，按顺序反复轻轻吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形

细胞培养基本方法

细胞培养基本方法 细胞培养是基于体外环境中的人工维持细胞生长和分裂的技术。它是 细胞生物学研究和生物医学领域的重要工具。细胞培养的基本方法包括选 择细胞系、培养细胞、传代细胞等步骤。下面将详细介绍细胞培养的基本 方法。 其次，培养细胞是细胞培养的核心步骤。培养细胞需要提供适宜的培 养基和生长因子。培养基是细胞在培养过程中所需的营养物质和环境因素 的混合物。常用的培养基包括DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）、RPMI-1640（Roswell Park Memorial Institute 1640 medium）等。培养基中的营养物质包括碳水化合物、氨基酸、维生素、微量元素等，它们为细胞提供能量和构建细胞结构的物质。生长因子是一类具有促进细 胞增殖和分化的生物活性物质，如胰岛素样生长因子、表皮生长因子等。 在培养细胞时，需要将细胞放入含有培养基和生长因子的培养皿中，并提 供适宜的培养条件（如37°C的恒温箱和5% CO2的培养箱）。 最后，传代细胞是细胞培养的重要步骤。传代是指细胞在体外培养过 程中不断进行细胞分裂和生长的过程。细胞的传代可以扩增细胞数量，并 保持细胞的稳定性。传代细胞的方法一般有机械分离法和酶解法两种。机 械分离法是利用离心、剪切力或刮刀等方法将细胞从培养皿上分离下来， 酶解法是将细胞培养在含有蛋白酶、胰蛋白酶等消化酶的溶液中，使细胞 与培养皿分离。传代细胞的频率一般为1:3或1:4，即将细胞从一个培养 皿传到3或4个新的培养皿中。 细胞培养的基本方法还包括细胞检测和培养条件的管理。细胞检测是 通过不同方法（如细胞计数、细胞活力检测、细胞形态观察等）对培养细