转基因抗虫棉
转基因抗虫棉的研究进展
摘要：综述了转基因抗虫棉的研究进展，包括抗虫基因的研究、载体构建技术的研究、转化技术的研究及存在的问题等，并展望了转基因抗虫棉未来发展前景。关键词：转基因抗虫棉花研究进展
引言
棉花生长周期长、虫害多，造成的损失非常严重。据统计，在转基因抗虫棉商品化之前，全球每年用于防治棉花虫害的费用高达20亿美元，约占所有农作物防虫费用的四分之一。[1]传统的化学农药防治棉铃虫不仅费用高，且已引发了棉虫的抗药性，同时化学杀虫剂的过量使用也带来了环境污染的问题，而转基因植物所产生的杀虫蛋白主要是通过抑制害虫消化等生理功能而达到抗虫的目的。与施药防治棉田害虫相比，转基因技术具有较多优势：不会在土壤和地下水中造成残留；不会被雨水冲刷流失；对非靶标生物无毒性；保护作用无盲区；减少农药及用工投入[2]等。雪花凝集素（Gulanthus nivalis agglutinin gene，GNA）是第一个转入重要作物、并对刺吸式口器害虫有抗性的基因，转GNA的水稻可降低害虫的存活率，阻止害虫的发育[3]。另外烟草阴离子过氧化物酶[4]、昆虫几丁质酶基因[5]也被用于抗虫基因工程的研究。迄今为止在棉花抗虫基因工程研究领域，最成功的例子是苏云金芽孢杆菌Bt杀虫基因的应用，其次是蛋白酶抑制剂基因。另外，凝集素、α-淀粉酶抑制剂、胆固醇氧化酶等转基因抗虫植物的研究也取得了进展，所以利用基因工程技术培育转基因抗虫棉受到了各国的高度重视。自1996年商品化种植转基因作物开始，全球转基因植物的种植面积已由1996年的170万hm2猛增到2008年的1.25亿hm2，增长了73倍，2008年全球市场价值已达75亿美元，约占全球商业种子市场的22%，其市场价值优势明显，转基因产业得到了蓬勃发展，尤其在发展中国家。印度Bt棉2002年引入，连年种植面积快速增加，至2008年达760万hm2，产量翻番，曾经是全球棉花产量很低的国家，现已成为棉花出口国。转基因棉回报率高，生产成本低，市场需求大，到2005年我国通过国家审定的转基因抗虫棉品种已增至26个[6]，到2007年我国转基因抗虫棉种植面积已达380万hm2，占全国棉花种植面积的69%。农业生物技术应用国际服务组织（ISAAA）发布的报告显示，2007年转基因作物种植面积增加了12%，达到了1.143亿hm2，成为过去五年来种植面积增加第二快的一年。[7] 2008年至2010年，我国新型转基因抗虫棉培育和产业化全面推进，新培育36个抗虫棉品种，累计推广1.67亿亩，实现效益160亿元，国产抗虫棉市场份额达到93%，有效控制了棉铃虫危害，彻底打破了国外抗虫棉的垄断地位。这是我国转基因生物新品种培育重大专项取得的成就之一。我国转基因技术研究与应用取得了显著成效：获得一批具有重要应用价值和自主知识产权的基因，培育一批抗病虫、抗逆、优质、高产、高效的重大转基因生物新品种，为我国农业可持续发展提供强有力的科技支撑。
然而，随着转基因抗虫棉在世界范围的发展，也不断涌现出一些问题，如棉花质量问题，抗虫性持久问题，对生态环境安全问题等，本文综述了转基因抗虫棉的研究进展，包括抗虫基因的研究、载体构建技术的研究、转化技术的研究及存在的问题等，并展望了转基因抗虫棉未来发展前景。
1.几种抗虫基因的介绍
1.1 Bt基因
Bt基因是苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）的简称，它是一种革兰氏阳性菌，在地球上分布十分广泛。Bt基因是抗虫棉中研究最多、进展最快、应用最广泛的一类基因，它对鳞翅目昆虫有专一杀伤作用。大部分Bt杀虫蛋白具有杀虫专
一性和高度选择性，所以对植物和包括人在内的动物没有毒害，而且是环境可以接受的。这种芽孢杆菌的杀虫特性在于它在形成芽孢时产生一种杀虫晶体蛋白（insecticidal crystal protein，ICP）或（δ-内毒素）[8,9]转Bt基因棉的毒素能在棉株内持续表达，使得棉铃虫在棉花的整个生长期都受到Bt毒蛋白的高压选择，因而减少了农药用量约60%，减少劳动力投入7%，转基因抗虫棉花比一般棉花平均提高单产10%，扣除种子成本和价格因素，每公顷增收可达到1250元[10]Bt
基因的种类很多，但获得转基因抗虫棉的Bt基因仅有Cry1A（b）、Cry1A（c）、Cry1A等少数几种。Bt基因对棉铃虫、红铃虫、玉米螟等害虫有较高的抗性。[7]天然Bt基因在转基因植物中表达很低[Vaeck et al. 1987，Fischhoff et al. 1987]，故多采用人工合成的方法对Bt基因进行改造以获得能在植物高校表达的杀虫基因。如：Perlak等[13]按照双子叶植物优化密码子，以化学合成方法合成了衍生于Bt kurstaki HD-1、Cry1A（b）和HD-73、Cry1A（c）的嵌合基因，其3′端的1/2序列被缺失，且改变了部分保守序列的密码子。所得到的基因序列包含相当于编码615氨基酸序列的1845bp。将基因导入棉花后，其中杀虫蛋白质表达量为天然Bt基因表达量的50 ~100倍。郭三堆等[14]设计并合成了适于在植物中表达的苏云金芽孢杆菌GFM crylA Bt杀虫基因，构建了可在植物中高效表达杀虫基因的表达载体pGBI4AB，通过农杆菌介导法和花粉管通道法导入棉花，研制成功了单价抗虫棉，并在1997年开始了商品化，至2001年单价抗虫棉累计推广了73.33多万hm2。美国孟山都公司也研制成功转Bt杀虫基因的抗虫棉并先于我国进行了大规模商品化。转Bt基因抗虫棉的成功研制与大面积推广和应用，促进了高科技生产商品化趋势，降低了棉农和政府的投资风险，取得了显著的生态、社会和经济效益。
1.2蛋白酶抑制剂基因
蛋白酶抑制剂（PI）是一类可以抑制蛋白酶水解活性的蛋白质，小到由十几个氨基酸、大到由几百个氨基酸组成。根据蛋白酶抑制剂所抑制蛋白酶的性质，可将其分为4大类：丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂、金属羧肽酶抑制剂和天冬氨酰蛋白酶抑制剂。目前所发现的植物来源的蛋白酶抑制剂均属于前3种类，其中在抗虫植物基因工程中，研究最深入的是丝安酸蛋白酶抑制剂。如豇豆胰蛋白酶抑制剂基因，大豆胰蛋白酶抑制剂基因，马铃薯蛋白酶抑制剂I基因和II基因，番茄蛋白酶抑制剂I基因和II基因等，作为杀虫基因已被广泛而深入的进行了研究。[1]抗虫性较为理想的是豇豆胰蛋白酶抑制剂(cowpea trypsin inhibitor, CpTI) [15]。它是由设立在尼日利亚的国际热带作物研究所(IITA)从几千份豇豆资源材料中筛选到的一份抗豆象虫甲的材料——TVtrz027中得到的。[16]可抑制昆虫的消化作用，并引发一系列生理反馈作用，如干扰昆虫蜕皮过程，降低免疫功能，或使肽类激素产生不足等，最终导致昆虫死亡。[17] Hilder等[18]及刘春明等[19]分别报道分离并克隆了CpTI的cDNA，Hilder等[Hilder V. A.，Gatehouse1987]首先获得了转cptI基因的烟草植株。李燕娥等[21]和陈宛新等[22]分别将豇豆胰蛋白酶抑制剂CpTi基因和修饰过的CpTi基因导入棉花，获得了具有明显抗虫能力的转基因植株。与Bt毒蛋白基因相比．CPTI基因的抑制作用靶是昆虫酶的活性位点．具有杀虫范围广、效果稳定等特点；其次是害虫耐受性极小，因为它作用于昆虫消化酶最为保守的部位；再者，目前应用的蛋白酶抑制剂基因，主要源于植物，其转基因产品更易于公众接受。然而，蛋白酶抑制剂基因在抗虫上的问题也不容忽视，这就是它要求在转基因棉花中有较高的表达量，才能实现抗虫性；在某些情形下，还要求组织或器官特异表达。但由于PI基因往往需要大量表达才能产生明显的抗虫效果，因而转PI基因棉还没有在生
产中得到推广和应用。[23]
1.3 植物凝集素基因
在抗虫植物基因工程研究中，植物凝集素也占有重要地位。植物凝集素是一类具有特异糖结合的活性蛋白，可分为7个蛋白质家族。其中4个较大的家族分别是豆科凝集素、2型核糖体失活蛋白、几丁质结合凝集素以及单子叶甘露糖结合凝集素。目前熟知的大多数凝集素都分别属于这四个家族。尤其是雪花莲凝集素（Galanthus navies agglutinin，GNA），是从石蒜科植物雪花莲中分离的甘露糖结合凝集素，实验结果表明：它有一些特殊的生物学特性。如对动物反转录病毒（包括HIV）具有抑制作用[24]，可凝聚兔血红细胞，但不能凝聚人的血红细胞；能抑制大鼠小肠中大肠杆菌的繁殖（Pusztai et al.1993）；可对棉蚜这种同翅目害虫具有控制作用。[1]
其杀虫机理即植物凝集素被昆虫摄食后会在昆虫食道中释放，与消化道围食膜上的糖蛋白结合，抑制营养物质的正常吸收；同时还可在昆虫消化道内诱发病灶，使昆虫因消化道感病而死亡。[26]
棉蚜是棉花的另一个主要害虫，随着抗棉铃虫转基因棉花的普遍种植，棉蚜的危害逐渐加重。因此，利用转基因技术获得抗蚜棉花品种已成为棉花抗虫育种的新课题。有些具有抗虫性，特别是对蚜虫等同翅目害虫有极强的抗杀作用。将来源于小麦胚芽凝集素基因导入陆地棉后，转基因T
代能显著抑制棉铃幼虫和
2
棉蚜的生长发育[27]；菊芋凝集素基因对棉蚜也具有一定的抗性[28]。目前，国内外的研究者已开始这方面的工作，并获得了转基因植株[29]，可望在不久的将来培育出抗蚜棉花新品种。
1.4 其它抗虫基因
除Bt基因、CpTI基因被人们广泛用于抗虫基因工程外。人们还在分离克隆其他抗虫基因，如a一淀粉酶抑制基因，用于抑制糖分的消化和分解，使昆虫得不到足够的营养和能量而死亡；蝎毒素、脱皮激素、昆虫病毒等基因，使昆虫吞食转基因植物后生长发育畸形。神经肽基因，使昆虫神经调节混乱而死亡。人们在研究中还发现，在芽孢形成前的营养生长阶段，可分泌和产生一种非 -内毒素的杀虫营养蛋白，即Vip（vegatative insecticidal protein）蛋白，被称为第二代杀虫蛋白。Vip蛋白可与敏感昆虫表皮细胞、尤其是柱状细胞相结合，造成细胞崩解，伴随着肠道严重受损，使昆虫迅速死亡。胆固醇氧化酶（choleterol oxidase，Cho）基因也被称为第二代抗虫基因，其表达的产物是一类新型杀虫剂。在链霉菌属（streptomyces）、短杆菌属（Brevibacterium）、假单胞菌属（Pseudomonas）、红球菌属（Schizopylium）等细菌中均发现有胆固醇氧化酶。David等（1994）从streptomyces A19249中分离得到胆固醇氧化酶基因（choM）。生物测试结果表明：胆固醇氧化酶对棉铃象甲（boll weevil）及烟青虫（tobacco budworm）有明显的毒杀作用，有效作用浓度与Bt杀虫晶体蛋白类似。
另外，人们还进行核糖体失活蛋白、脂肪氧化酶、慈茹蛋白酶基因等控制基因的分离、修饰和导人棉株中的尝试，以期培育出遗传背景更具有多样性的、多种基因控制的抗虫基因工程棉。[31,32]
2.抗虫基因栽体的构建
分离得到的抗虫基因一般不能直接使用．必须对其进行分子重组和修饰，把目的的基因、启动子、报告基因。终止子及加强子等整合到合适的载体上(一般采
用农杆菌Ti质粒)。其中关系到基因工程成败的是启动子。所谓启动子是指一段可与RNA聚合酶及其他一些影响转录的反式因子结合而准确有效地起始转录的DNA序列。目前，包括棉花在内的大多数植物基因工程所采用的启动子都是花椰菜花叶病毒的GMV 35s启子，它比原来广泛采用的l9s启动子的功效强50倍。另一个植物基因工程中常用的启动子是从农杆菌Ti质粒的胭脂碱(NopaIine)合成酶基因上分离出来的NOS启动子。但功效不如CaMV35s。常用的报告基因有氯霉素乙酰转移酶(CAT)、新霉素磷酸转移酶(NeT-11)和葡萄苷酸酶(GUS)基因。
尽管有报道称．加强子在抗虫棉的基因工程中作用不显著，但研究其它参与表达调控的各种因子或元件仍受到普遍重视。另外，还有一些特定序列能提高基因的转录速率和加工效率，如一些基因表达调控的修饰序列。如Kozak（1989）发现的Kozak序列、5'UTR（从mRNA5'端转录起始位点至翻译起始位点之间的序列）和3'UTR（从mRNA的翻译终止子（UAA，UAG，UGA）下游到poly（A）的一段序列）以及Ω序列（一段富集TTAAC序列）等在棉花基因工程实践中，应用最多的是来源于T-DNA的nos终止子。
现已建立起以Ti质粒为基础的各种基因转移载体，如中间载体、双元载体及含有CaMV35S启动子的混台载体系统，这些载体系统的发展为各种外源基因顺利导人细胞和稳定表达创造了条件。[33]郭三堆等对35S启动子进行了改造，将Q和Kozak序列片段连接到质粒pG2E35SP上来，人工设计合成了命名为UT的多联终止密码子序列，获得重组质粒pGUT。同时在3’端加入多聚腺苷酸序列(PPSS)和3’端加工序列NGTGTTNN(其中N可代表A、T、G、C中的任何一种碱基)以提高杀虫基因mRNA的稳定性，可使基因的表达水平提高3O~6O倍。获得了定名为pGBI4AB的重组质粒。构建出植物高效表达载体pGB I 1214ABC-双价杀虫基因植物表达载体。
[34]
此外，mRNA不稳定序列的存在使得mRNA不稳定，翻译效率低，从而导致外源杀虫基因在棉花中的表水平很低，故应尽量避免这些不稳定序列在基因编码区及3'端的存在。
2.抗虫基因的转化方法
植物遗传转化(及再生)是进行植物遗传操作的一个重要环节，对抗虫棉的基因工程而言，它甚至是一个制约因素。因此，建立有效的遗传转化系统是利用植物基因工程获得植物新品种的基本前提。
2.1 农杆菌质粒介导法
土壤农杆菌是一种能侵染多种双子叶植物的细菌，它体内含有一些很大的质粒，统称Ti质粒。在Ti质粒上有一段DNA，称为T-DNA，土壤农杆菌(Agrobacterium)有二个种：根癌农杆菌(A．tumefaciens)和发根农杆菌(A．ri．hizogenes)，。它们均能向植物细胞转移其质粒上的一段DNA即T-DNA，T-DNA上含有一些致瘤基因。使被侵染的植物产生肿瘤。即冠瘿瘤。T-DNA可整合到植物细胞核基因组中，并能稳定遗传。其方法是将植物外植体浸泡在含经修饰和组装的n 或Ri质粒的农杆菌溶液中过夜，使农杆菌侵染植物组织；然后，把外植体取出冲净置于含抗菌素的选择培养基上培养，诱导外植体再生植株。由于目的基因同时连接有抗抗菌素的选择标记基因(如NPT-II等)．凡能在选择培养基上出愈者．就表明目的基因被整合到植物细胞的核基因组中。农杆菌质粒介导法的优点在于可靠性强、效率高，但只有外植体能再生的职子叶植物才能采用。
农杆菌介导的遗传转化是目前植物基因工程研究中最常用的方法，[贾士荣，王志兴.农杆菌介导的植物遗传转化[J].36]。Horsch等[37]最早尝试了通过农杆菌介导法转化植物。Perlak等（1990）将Bt抗虫基因导入棉花，得到了抗虫转基因棉花，使转基因棉花的研究工作走向了实际应用阶段。国外主要利用农杆菌介导转化棉花，所用的外植体包括叶、下胚轴、叶柄、根。在国内，山西省农业科学院棉花所陈志贤和李燕娥等人利用农杆菌介导法成功地进行了棉花基因转化的尝试[38,39]。在我国目前审定的一些转基因抗虫棉品种中，GK95-1就是通过农杆菌介导法导入成功的。
2.2 花粉管途径导入法
这是由周光宇(1978，1988)最先提出并设计的技术一外源DNA直接导人受体的花糟管途径导人法，即在植物白花受精一段时间后，把DNA(总DNA或含目的基因载体)注入受体花器，使其沿花粉管通道进入胚囊，从而转化受精细胞或早期胚细胞。黄骏麒等(1981、1988、1990)、吴小月(1984，1990)和于元杰等(1991)先后用该技术将种内、种间、属间和科间的外源DNA成功地导入受体棉株，并获得一些有价值的遗传变异。谢道昕等(1991)用该方法将带有Bt毒蛋白基因的重组Ti 质粒直接导入陆地棉，获得转基因棉花植株。倪万潮（1998）等也用此法将Bt 基因导人泗棉3号和中棉12，并获得大量抗虫植株，同时对花粉管通道法转基因抗虫棉外源基因的整合方式进行了研究。[40]
花粉管途径导人技术的优点是：简便易行，避免了植物再生的困难，对数量性状的转化较为有效；不足是：导人重复数大，转化机理尚未完全明了，转化体检测存在一定困难。
该技术的建立开创了整株植物基因转化的新途径。经过多年不断的技术改进和完善，目前，该技术日趋成熟，在我国农作物基因改良中发挥着重要作用。并逐渐引起了国外同行的关注。
花粉管通道法的植物遗传转化技术的机理仍有待进一步的研究，尤其是注射的外源基因在植物染色体基因组中整合的机制，尚未见相关的研究报道。但已明确基因进入受精胚囊的通道。
2.3 粒子轰击法
粒子轰击法，又称基因枪法。最先由康奈尔大学T M Klein等(1987)发明的外源基因直接导入植物细胞的方法。其方法是将带有目的基因的基因载体裹在金属(钨)微粒上，以高密度金属微粒加速轰击目标组织，当逾越发射器与目标组织间的金属网屏时，金属粒子受阻基因载体进入目标组织，再通过组织培养获得转基因植株。据说美国A．gracetus公司是采用该方法把Bt基因导入棉花的。该方法的受体不受植物种类、器官等限制，特别用于农杆菌不能感染的单子叶植物，但可靠性较差、转化频率较低。
2．4其它转化技术
用于植物转基因工程的转化技术通常还有PEG介导转化法，PEG(聚乙二醇)最早用于植物原生质体融合的研究。1982年Kren等首次用PEG法将外源DNA导入植物原生质体研究，开创了植物基因工程的PEG转化。其作用机理是，在二价阳离了(Ca2+、Mg2+、Mn2+ )存在的条件下，促进原生质体吸收外源DNA。EI-Hiatemy 等利用PEG法将Bt毒蛋白基因导入海岛棉吉扎7O的子叶原生质体中，用转化原生质体培养获得的愈伤组织喂养害虫，24小时后死亡率显著高于对照，说明Bt毒蛋白基因已被导入棉花细胞并得到表达。
其他还有许多植物基因导人方法，如电穿孔法、病毒介导转化法、超声波法、
微注射法、脂质体法等，这些方法各有千秋，但很少用于棉花抗虫基因工程研究。
3.复合抗虫基因转基因棉花的研制
为防止棉铃虫对单价转基因棉产生抗性，许多研究者尝试了用双价甚至多价抗虫基因研制转基因抗虫棉。
在国内多家科研及育种单位的密切合作下，我国科学家开展了双价抗虫棉的创新研究。1999年，郭三堆等[41]将人工合成的GFM Cry1A和经过修饰的CpTi高效双价杀虫基因导入陆地棉品种，首次获得了双价转基因抗虫棉株系。抗虫鉴定表明，抗性好的株系棉铃虫幼虫校正死亡率大于96%。王伟等[42]利用根癌农杆菌介导法将含有豌豆外源凝集素（pea lectin，P Lec）基因和大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂（soybean Kunitz trypsin inhibitor，SKTI）基因的双价抗虫基因植物表达载体导入到多个陆地棉栽培品种中。抗虫测试结果表明，转基因棉株对棉铃虫幼虫具有较强的抗性。[43]而郭洪年等[44]将Cry1A+APT-B基因导入棉花，获得了抗棉铃虫90.0% 99.7%且农艺性状优良的9个双价抗虫棉纯合品系。蝎毒是一种富含生物活性的多肽物质，其中有一类神经毒素专一作用于昆虫而对哺乳动物无害或毒性很小。将东亚钳蝎毒昆虫特异性神经毒素基因BmKITS与几丁质酶基因构建成双价抗虫基因导入棉花后，获得的转基因棉花具有抗虫特性。[45] 李燕娥等[46]用菊芋凝集素HTA基因和尾穗苋凝集素ACA基因转化棉花，获得的转化植株对棉蚜有明显抗性
试验表明，双价抗虫转基因棉抗虫效果显著，不但可以有效延缓昆虫对抗虫棉产生抗性, 而且可增强抗虫性。另外, 双价抗虫棉对大龄抗性棉铃虫的杀虫活性、抑制其体重增长、化蛹和羽化等方面的作用均显著强于单价抗虫棉,这项创新性的研究成果保持了我国抗虫棉研究的国际先进地位, 其核心技术于2001年获得中国专利[47，48]我国现已开始大面积试种双价转基因棉花。转双价抗虫棉的研制成功，对减少农药施用，保护人类赖以生存的环境，实现农业可持续发展，将产生巨大而深远的影响。
复合性状转基因作物资源利用效率高，能满足农民和消费者的多重需求，发展势头迅猛，在美国、加拿大、澳大利亚等10国迅猛发展，至2007年美国78%的棉花均是复合性状，故它是转基因作物的发展趋势。
4.转基因抗虫棉存在的问题与展望
尽管转基因棉花育种已取得很大的成就，但仍存在着一些问题。主要表现在：（1）抗虫强度不够理想．棉花生长中后期抗虫性减弱，而棉铃虫危害的严重时期恰逢棉株生长后期。[49]现有研究抗虫性衰减据说与植株根部分泌物特别是总糖量相关[50]
（2）我国目前生产上大面积种植的仍是第一代单Bt基因抗虫棉，害虫易对其产生抗性，因抗虫棉品种抗性单一，缺少具有广谱抗性的品种，也缺少高品质纤维棉花的品种。
（3）周期长。棉花再生植株的获得需要经过愈伤组织的诱导和增殖、胚状体的发生、胚的萌发和生根成苗等复杂阶段，而且每一阶段都需要特定的条件；转化植株经检测确定后，还需要进行大田试验和有用性状的遗传性鉴定才能推广和生产，这需要很长时间。
（4）转化效率低。基因型是影响农杆菌转化率的一个重要因素，由于受基因型限制再加上外源基因的导入降低了棉花愈伤组织的诱导率和分化率。这一问题在很大程度上影响了棉花转基因技术的发展。
（5）缺乏有重要应用价值的目的基因。
（6）抗黄蒌病育种进展缓慢。
（7）转基因棉的安全性。已有研究证实转基因抗虫棉存在潜在的生态风险，比如抗虫转基因棉花大面积的推广和应用可能导致对非靶标生物产生伤害、标记基因水平转移和抗虫基因漂移等。[23,51]大量研究表明Bt毒素在土壤中能够存留较长的一段时间,且不易被土壤微生物分解,[52]并有可能随着转Bt基因植物的不断种植而积累,进而增加其向土壤生物体进行基因转移的生态风险性。[53]大田实际的情况和室内的结果却有很大的差异,Graham 等,Saxena 及Stotzky 等未能检出毒蛋白[54,55]，认为残留在田中的Bt毒蛋白的量很低,生物活性也不足以达到能检测到的水平。[56]
转基因产品的食品安全性评价是全球关注的热点问题,人们担心Bt 毒蛋白会对动物和人体引起不良后果,但已经进行的研究很少。目前研究均未发现Bt 毒蛋白会对动物产生不利影响。但长期饲养是否有慢性毒性或对后代有影响需进一步研究[57,58]。
（8）我国转基因安全监管远远落后
转基因棉花的市场监管问题，市场上转基因品种，标签标注混乱,不法商贩将非转抗虫基因棉当转基因抗虫棉销售，或者将转基因抗虫棉当非转基因抗虫棉销售等现象，转基因棉花市场监管混乱，棉农自身对转基因棉认识不足，导致棉农对产品质量缺乏信任。我国相关的法规、标准制定落后，有待完善。对于转基因生物控制源头，如试验、环境投放、档案管理处罚较轻，较其巨大的商业价值和对环境的潜在威胁，现行法规震慑力不足。从事植物基因工程究和开发的部分人员缺乏必要的相关法律法规知识，质量安全意识淡薄，在缺乏相应的安全设施和措施的情况下就在开展实验研究，对农业转基因生物应用的后果不能进行长期的、不间断的跟踪研究，无法对基因工程的风险进行科学判断，同时，在现有的农业生产条件下，不能有效地采取相应的防控措施[19]。这直接导致转基因产品与非转基因产品市场混乱，农民甚至不关心自己种的是不是转基因品种，在缺乏必要的检测监管下，厂家对加工的产品知道是否为转基因产品也就不得而知了。需加大转基因安全监管经费的投入我国农业转基因产品的市场检测还在起步阶段，甚至有些省份还未开展过转基因市场调查，很多省份只有省级检测机构才设有这项业务。[7]
总之，利用基因工程手段培育作物品种是农业发展的新方向．从保持生态平衡、食物链的稳定以及减少环境污染、降低生产成本等目的出发，赋予棉花以自身的抗虫能力是最为理想的防治虫害策略，将会对棉花品种改良起着积极的促进和推动作用。而我国抗虫棉的研究已经达到了国际先进水平,因此, 在我国抗虫棉研究的基础上应继续在广谱和长效抗虫、抗病、抗除草剂、抗逆、提高附加值以及突破育种技术手段等方面开展广泛深入的研究, 不断提升我国转基因抗虫棉研究的整体水平。
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转基因抗虫棉
转基因抗虫棉的研究进展 摘要：综述了转基因抗虫棉的研究进展，包括抗虫基因的研究、载体构建技术的研究、转化技术的研究及存在的问题等，并展望了转基因抗虫棉未来发展前景。关键词：转基因抗虫棉花研究进展 引言 棉花生长周期长、虫害多，造成的损失非常严重。据统计，在转基因抗虫棉商品化之前，全球每年用于防治棉花虫害的费用高达20亿美元，约占所有农作物防虫费用的四分之一。[1]传统的化学农药防治棉铃虫不仅费用高，且已引发了棉虫的抗药性，同时化学杀虫剂的过量使用也带来了环境污染的问题，而转基因植物所产生的杀虫蛋白主要是通过抑制害虫消化等生理功能而达到抗虫的目的。与施药防治棉田害虫相比，转基因技术具有较多优势：不会在土壤和地下水中造成残留；不会被雨水冲刷流失；对非靶标生物无毒性；保护作用无盲区；减少农药及用工投入[2]等。雪花凝集素（Gulanthus nivalis agglutinin gene，GNA）是第一个转入重要作物、并对刺吸式口器害虫有抗性的基因，转GNA的水稻可降低害虫的存活率，阻止害虫的发育[3]。另外烟草阴离子过氧化物酶[4]、昆虫几丁质酶基因[5]也被用于抗虫基因工程的研究。迄今为止在棉花抗虫基因工程研究领域，最成功的例子是苏云金芽孢杆菌Bt杀虫基因的应用，其次是蛋白酶抑制剂基因。另外，凝集素、α-淀粉酶抑制剂、胆固醇氧化酶等转基因抗虫植物的研究也取得了进展，所以利用基因工程技术培育转基因抗虫棉受到了各国的高度重视。自1996年商品化种植转基因作物开始，全球转基因植物的种植面积已由1996年的170万hm2猛增到2008年的1.25亿hm2，增长了73倍，2008年全球市场价值已达75亿美元，约占全球商业种子市场的22%，其市场价值优势明显，转基因产业得到了蓬勃发展，尤其在发展中国家。印度Bt棉2002年引入，连年种植面积快速增加，至2008年达760万hm2，产量翻番，曾经是全球棉花产量很低的国家，现已成为棉花出口国。转基因棉回报率高，生产成本低，市场需求大，到2005年我国通过国家审定的转基因抗虫棉品种已增至26个[6]，到2007年我国转基因抗虫棉种植面积已达380万hm2，占全国棉花种植面积的69%。农业生物技术应用国际服务组织（ISAAA）发布的报告显示，2007年转基因作物种植面积增加了12%，达到了1.143亿hm2，成为过去五年来种植面积增加第二快的一年。[7] 2008年至2010年，我国新型转基因抗虫棉培育和产业化全面推进，新培育36个抗虫棉品种，累计推广1.67亿亩，实现效益160亿元，国产抗虫棉市场份额达到93%，有效控制了棉铃虫危害，彻底打破了国外抗虫棉的垄断地位。这是我国转基因生物新品种培育重大专项取得的成就之一。我国转基因技术研究与应用取得了显著成效：获得一批具有重要应用价值和自主知识产权的基因，培育一批抗病虫、抗逆、优质、高产、高效的重大转基因生物新品种，为我国农业可持续发展提供强有力的科技支撑。 然而，随着转基因抗虫棉在世界范围的发展，也不断涌现出一些问题，如棉花质量问题，抗虫性持久问题，对生态环境安全问题等，本文综述了转基因抗虫棉的研究进展，包括抗虫基因的研究、载体构建技术的研究、转化技术的研究及存在的问题等，并展望了转基因抗虫棉未来发展前景。 1.几种抗虫基因的介绍 1.1 Bt基因 Bt基因是苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）的简称，它是一种革兰氏阳性菌，在地球上分布十分广泛。Bt基因是抗虫棉中研究最多、进展最快、应用最广泛的一类基因，它对鳞翅目昆虫有专一杀伤作用。大部分Bt杀虫蛋白具有杀虫专
转基因抗虫棉的研究历程与展望
中国转基因抗虫棉的研究历程与展望——基因工程研究进展作业
生物技术B1104 刘岩 0514110410 摘要:本文从抗虫基因的分离与转基因棉株的获得、转基因抗虫棉品种的转化、转基因抗虫棉研究的现状与进展方面进行介绍,并在此基础上分析探讨了目前培育转基因抗虫棉存在的问题和将来的发展方向。 关键词：转基因抗虫棉研究背景转化方法问题展望 正文：转基因抗虫棉也称为转Bt基因抗虫棉。它是将苏云金芽孢杆菌的Bt基因导入到受体细胞（转基因抗虫棉的叶肉细胞）中。苏云金芽孢杆菌的代谢过程中能产生一种Bt杀虫蛋白，它对多种害虫具有毒杀作用，作为生物农药广泛使用在蔬菜、瓜果等作物上。通过根癌农杆菌介导等方法将Bt基因转入棉花植株的细胞中后，棉株体内也能合成Bt杀虫蛋白。转Bt基因抗虫棉的杀虫谱因Bt基因不同而存在差异。我国现有的转基因抗虫棉对棉铃虫、红铃虫、卷叶虫等鳞翅目的害虫具有非常显著的抗性。 一、转基因抗虫棉的研究背景 （一)抗虫基因分离与转基因棉花植株获得
用于植物抗虫基因工程研究的基因很多，但并不是所有的基因均可用于转基因抗虫基因抗虫棉的培育，而应根据棉花自身受害虫的危害情况，有针对性地选择那些对棉花害虫具有较强杀伤作用的基因。综观国内外的研究现状，目前已用于或正在用于转基因抗虫棉培育的基因主要有以下几类： 1．苏云金芽孢杆菌素蛋白基因（Bt基因）Bt制剂作为一种生物杀虫剂在农业上应用已有30余年的历史，虽然它具有专一性强、效果好、对人畜安全等优点，但在自然界被阳光钝化、雨水冲淋，从而限制了其在生产上的广泛应用。 2．蛋白酶抑制剂基因植物蛋白酶抑制剂是自然界含量最为丰富的蛋白种类之一，它广泛存在于植物的各种组织及器官中，其中以种子与块茎中的含量最高，可达总蛋白含量的1%-30%。蛋白酶抑制剂的种类很多而且自身特点较多。首先，从杀虫机理上看，其基因产物作用于昆虫消化酶的活性中心，这是酶的最保守部位，突变的可能性很小，基本上可以排除害虫通过突变产生抗性的可能；其次，蛋白酶抑制剂的抗虫谱广泛;另外，蛋白酶抑制剂来源于植物自身，对人畜无害。但是蛋白酶抑制剂基因要想达到理想的抗虫效果，就必须要求转基因植物蛋白酶抑制剂的表达量远远高于转Bt基因植株的表达量，这也给抗虫基因工程带来了一定的困难。 3、外源凝集素基因外源凝集素是一组广泛存在于植物组织中的蛋白质成分，在储藏器官和繁殖器官中的含量尤其丰富。 4、其它抗虫基因的研究及利用除上面所讲述的几种抗虫基因外，人们还在不断探索新的抗虫基因，以便创造出更多更好的抗虫转基因作物。 二、抗虫基因的转化方法
转基因抗虫棉鲁棉研37号品种简介
高产、抗病转基因抗虫棉新品种鲁棉研37号 鲁棉研37号（区试代号：鲁253）是山东棉花研究中心以高产、高抗黄萎病的自育品系鲁9136（豫2067×定陶621）为母本、转基因抗虫棉鲁99系为父本杂交后选育的常规抗虫棉新品种。2005-2006年参加山东省抗虫棉区试，2008年参加山东省生产试验，2009年通过山东省农作物品种委员会审定。该品种于2007年取得转基因生物山东省生产应用安全证书，2008年申报了黄河流域及西北内陆棉区的生产应用安全证书。 1、主要生物学特征 鲁253全生育期内长势强，生长旺盛。植株筒型；叶大，呈深绿色，叶功能强；铃卵圆形。全生育期129天，第一果枝节位7.2，株高108.2，果枝数14.4个，单株结铃性强，平均单株结铃22.9个，单铃重5.6g，衣分41.3%，籽指9.5g，霜前花率90.3% 2、丰产性 2005年山东省区试，皮棉和霜前皮棉亩产为111.0公斤、98.1公斤，分别比对照增产18.8%、15.8%；2006年皮棉和霜前皮棉亩产为108.8公斤、99.0公斤，分别比对照增产10.9%、12.5%，两年平均居小组第一。 3、纤维品质 经农业部纤维品质检测中心测试（HVICC标准），2005-2006两年平均2.5%跨长29.1，比强28.3cN/tex,麦克隆值4.8，纺纱均匀指数140.5。 4、高抗枯萎、耐黄萎、高抗棉铃虫 2005年山东省区试鉴定，各试点平均枯萎病指4.79，黄萎病指9.71，抗枯萎病、抗黄萎病；2006年个试点平均枯萎病指2.8，黄萎病指17.8，抗枯萎耐黄萎。保蕾效果87.7%，高抗棉铃虫。 5、鲁棉研37号的突出特点 （1）结铃性强该品种蕾期脱落较轻，结铃性强。山东省区试，单株结铃数两年平均22.9个，居第一位。2008年，在山东棉花研究中心临清试验站组织的新品种展示试验中，鲁棉研37号的结铃性居所有参展杂交种和常规种之首。 （2）抗病、抗旱、耐瘠薄能力强该品种全生育期内长势强，叶较大、叶
转基因抗虫棉的抗性研究与利用
棉铃虫是棉花生产的主要害虫之一，在抗虫棉没有推广应用前，当棉铃虫大发生时，均会给农民以及棉花产业带来严重的损失。由于棉铃虫防治只能依靠农药，而棉铃虫也逐渐对农药产生抗性，致使1992年棉铃虫在我国棉区大爆发，我国当年杀虫剂纯农药的生产量只有20万t，其中为防止棉铃虫就消耗15万t左右。出现了农药打不死棉铃虫，反而还威胁到人畜及生态的安全，也导致整个国家出现“棉荒”现象，造成严重的经济损失。1991年国家“863”计划开始启动转基因抗虫棉的研究，充分利用生物分子技术来解决常规育种技术难以解决的问题。经过二十多年的努力，我国已初步形成了基础研究、应用研究到产品开发的较为完整的技术体系，目前我国转基因抗虫棉整体发展处于国际先进水平。 1转基因抗虫棉创新与发展 1.1 转基因抗虫棉研究与创新 转基因抗虫棉是利用分子生物学技术将外援基因或经修饰的基因转移到棉株中，从中分离得到所需要的基因。常规杂交育种也属于一种转基因技术，但是它只能在有限的范围内对作物的遗传基因进行改良，并不能做到针对某一优良性状进行定向改造。因此，转基因技术是传统遗传育种技术的发展与创新，也将是我国未来农业发展的必然趋势。 1983年，世界首例转基因烟草培育成功；1986年，抗虫和抗除草剂的转基因棉花进入田间试验阶段；1990 《种子法》规定：销售的种子必须进行包装，而且要附有标签。购种时一看种子袋表面是否印有“作物种类、品种名称、生产商、质量指标、净含量、生产年月、警示标志(一般是对包衣种子而言)和‘转基因’标准”等内容(这些项目必须外标)，如果没有可认为是假种子；二看种子袋内是否装有内标牌，标牌上是否印有种子经营许可证、生产许可证、检疫证编号、生产商地址、联系方式和使用说明，如果没有、不全或与实物不符，说明种子来历不明或者是假种子。 3.3 注意检查种子包装是否规范 查看包装物的质地、印刷质量、字迹是否清楚、有无粘贴等。代销点不能随意拆袋，以防混入假劣种子。有的包装袋上注明严禁拆口销售。 3.4 仔细查看种子 正常的当年种子大小一致、籽粒饱满、色泽鲜亮，近闻有正常的谷香味。谷物类种子还要摸一摸、看一看含水量是否超标。双手插到种子袋中间感到凉、不粘手、掰开后茬口齐的种子含水量较低，反之含水量高，贮存时容易霉变。注意种子的生产年月，避免购买超过一个生长周期的种子，种子保存的时间长短，将影响其发芽率。 3.5 选择适宜品种 要根据当地气候、茬口选择适宜品种。不可只注重品质、产量等因素，盲目选择。 3.6 索取销售发票 购买时与商家索取销售发票，并在发票上注明品种名称、数量、价格、地点及时间，妥善保管。销售发票是购种的凭证，是有效的证据。播种开始时保存少量购买的种子作为样本，以备用。如果种子质量有问题，可以委托种子质量监督检验部门检验，凭检验报告要求种子经营单位予以赔偿，或到种子管理部门投诉。 3.7 仔细阅读种子使用说明和注意事项 仔细阅读种子使用说明和注意事项，不明事项要及时咨询，以免操作失误，影响产量和品质。对于瓜菜类及反季节栽培用的种子，一定要注意适宜的栽培时间(温度)和地点(气候类型)。 （收稿日期：2013—12—15） （本栏责任编辑：刘中漱） 徐福海1 许 泉1，2 王元慧1 康 勇1，2 张 莉1 金夏红1，2 （1 南京神州种业有限公司 210095 2 南京农业大学） 摘 要 转基因抗虫棉是我国唯一获准商品化生产的转基因作物，本文对抗虫基因的分离与转基因棉株的获得及抗虫棉的抗性原理进行了探讨。转Bt基因抗虫棉不同生育阶段，不同部位对棉铃虫的抗性，抗虫棉的研制成功与大规模产业化保障我国棉花稳步发展，增加农民收入保护环境作出了重要贡献。 关键词 转基因抗虫棉 抗性研究 利用技术 doi:10.3969/j.issn.1000-8071.2014.03.011
转基因抗虫棉的遗传转化与功能验证
转基因抗虫棉的遗传转化与功能验证 一、农杆菌介导的棉花胚胎再生遗传转化体系 （一）实验方法 以W0为受体，将pC2-dsGFP、pC2-dsJHAMT、pC2-dsPTTH3、pC2-dsPTTH5、pC2-dsJHBP载体的农杆菌菌株，运用农杆菌介导法分别将目的基因转入棉花下胚轴，通过组织培养技术获得转基因再生株系。 嫁接试验采用根系发达抗病性强的海岛棉（海7124）的实生苗做砧木，接 穗是转化基因再生植株。 （二）实验步骤 农杆菌介导的棉花遗传转化分3步，转化、胚胎发生和植株再生。
1）种子脱绒：轧花后的棉花种子，烘干（40℃左右），用适当硫酸（H2SO4）脱去短绒，自来水洗掉种子表面浓硫酸，充分晾干； 2）种子的消毒处理：选取饱满棉花种子于无菌三角瓶中，无菌水冲洗一次，70%乙醇表面消毒种子30 Sec，弃去乙醇，加入30%过氧化氢（H2O2）于摇床振荡2-3 h，弃掉H2O2，无菌水冲洗种子3-5 次，保留少量无菌水浸过种子，存放28℃，18-24 h，待到种子破壳露白； 3）外植体制备：在无菌条件下，滤掉消毒过种子的无菌水，剥去种子种壳，接种于苗培养基（1/2MS）上，28 ℃黑暗培养（N）3 d，然后在28℃、3000-5000 Lx光照下培养(D/N＝16 h/8 h) 3 d。 4）农杆菌活化与浸染液制备：将-70℃保存的农杆菌载体菌株，取出冻融。 在固体LB平板培养基上（含Kan 50μg/ml＋Rif/Str 50μg/ml）划线，28℃静止培养1-2天。平板挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体（Kan 50μg/ml＋Rif/Str 50μg/ml）培养基（10ml）中，28℃振荡过夜，再按1%接种量转接入50mL新鲜培养基中（含Kan 50μg/ml＋Rif/Str 50μg/ml）培养8小时左右，测定OD600为0.5左右。4℃，5000rpm离心5min ，收集菌体。然后用5mLMSB0（含100 uM/ml AS）液体培养基重新悬浮沉淀，再转入15-45mL的MSB0（含100uM AS）液体培养基，28℃摇床上培养至OD600为0.5左右，稀释培养液OD600 值0.3-0.7 时备用。 5）浸染与共培养：在超净台上使用手术刀切割茎段7cm左右，将下胚轴茎段浸泡于农杆菌侵染液中5-8 min，用灭菌滤纸吸干胚轴段菌液，放在铺有一层灭菌滤纸的共培养培养基上，用封口膜封口，22℃～25℃共培养2d。 6）下胚轴切段两端切口长出的愈伤组织直径大约0.5-1.0 cm时切下来单独继 代，愈伤组织块的直径大约2 cm时转移到胚性愈伤组织诱导培养基上。
转基因抗虫棉实验
转基因抗虫棉实验 一转基因植株的获得 1.选取克隆良好的抗虫棉基因，并构建转基因载体 抗虫棉的基因来自细菌，属于原核生物的基因，直接分离就行 用来构建载体的是一般是一些病毒的环形基因，用限制性核酸内切酶分别对该环形基因和目的基因进行切割，将切好的目的基因（抗虫棉基因）和环形基因通过DNA连接酶进行连接构成一个完整的基因，这个基因就是带有抗虫棉基因的重组基因 2.将目的基因转入植物细胞 主要方法有：1.鸟枪法 2.根癌农杆菌转化 3.慢病毒转染 农杆菌介导转化过程 农杆菌介导转化过程主要分为两步： 首先：农杆菌将T-DNA以单链的形式从Ti质粒上切下，然后与一系列Vir蛋白接个，这些过程都发生在农杆菌细胞内； 然后：与T-DNA相连的vir E2蛋白上有核定位序列，在它的作用下，T-DNA被转入宿主细胞，然后整合宿主基因组，整合的方式主要有双链打开修复和单链缺口修复两种方式。 3.再生植株培养（详细请查阅相关课本） 4.再生植株移苗至盆栽 二转基因植株分子检测 1.取再生植株叶片，进行基因组DNA提取 1 设备：移液器，冷冻高速离心机，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，50ml离心管（有盖）及5ml和1.5ml离心管，弯成钩状的小玻棒。 2试剂 1、提取缓冲液Ⅰ：100mmol/L Tris·Cl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS。
2、提取缓冲液Ⅱ：18.6g葡萄糖，6.9g二乙基二硫代碳酸钠，6.0gPVP，240ul巯基乙醇，加水至300ml。 3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇 4、RnaseA母液：配方见第一章。 5、其它试剂：液氮、异丙醇、TE缓冲液，无水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。 3操作步骤： （一）水稻幼苗或其它禾木科植物基因组DNA提取 1. 在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液Ⅰ, 60℃水浴预热。 2. 再生植株叶片5-10g, 剪碎, 在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中, 剧烈摇动混匀, 60℃水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高), 不时摇动。 3. 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 颠倒混匀(需带手套, 防止损伤皮肤)，室温下静置 5-10分钟, 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。 4. 室温下5000rpm离心5分钟。 5. 仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。 6. 在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转入含TE的离心管中,DNA很快溶解于TE。 7. 如DNA不形成絮状沉淀,则可用5000rpm离心5分钟, 再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀,往往难溶解于TE,可在60℃水浴放置15分钟以上，以帮助溶解。 8. 将DNA溶液3000rpm离心5分钟, 上清液倒入干净的5ml离心管。 9. 加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃10分钟, 除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。 10. 加入1/10体积的3mol/L NaAc及2×体积的冰乙醇,混匀,-20℃放置20分钟左右,DNA 形成絮状沉淀。 11. 用玻棒捞出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干净吸水纸上吸干。 12. 将DNA重溶解于1ml TE, -20贮存。
我国转基因抗虫棉存在的问题及对策
我国转基因抗虫棉存在的问题及对策 摘要：从20世纪90年代起,中国开始了转基因抗虫棉的研究、开发和利用。2006年, 国产抗虫棉的种植面积已经占到全国抗虫棉面积的82% ,以绝对优势占据了国内抗虫棉市场。目前在我国推广种植的抗虫棉,存在的主要问题是昆虫抗性、基因漂流、抗虫性的时空问题、抗虫范围狭窄、抗虫强度差及抗虫棉的安全管理。针对这些问题提出一系列解决方法，如培育转多基因抗虫棉、蛋白结构域互换、寻找广谱抗虫基因,采用特异启动子和诱导表达启动子、避难所政策等等。 关键词：转基因抗虫棉；发展；抗虫性；安全性；对策 1 转基因抗虫棉技术发展背景 棉花产业在我国国民经济发展中占有举足轻重的地位，我国棉花种植面积7500万亩左右，约占世界面积的15%，皮棉产量约占世界总产量的25%。它涉及１亿棉农的重要经济来源，1900万纺织及相关行业工人的就业问题。全球工业化以来，世界人口迅速增长，而耕地面积则因为城市化及沙漠化等等原因愈减愈少。同时，化学农药的过度滥用、化学肥料的使用不当、不可降解塑料的污染使得生态环境被严重破坏，水土流失、土地沙漠化、土地盐碱化等问题紧接而来。20世纪末期，这种情况愈演愈烈。 1992年，我国爆发了大规模持续的棉铃虫灾害，农药喷洒与棉铃抗药性形成了恶性循环，迫使中国农民放弃棉花种植。而此时美国转基因抗虫棉花恰研制成功，美国趁此机会迅速占领中国市场，至1998年，在中国的市场份额达95%，企图通过长期垄断来获取暴利，一斤种子卖到100多块钱，每年国家蒙受着几十亿甚至上百亿元的经济损失。在当时的情况下，投入巨资、人力和物力发展转基因棉技术, 已成为中国现代农业生产的不二选择。 1991年国家“863”计划启动抗虫棉研制工作后，我国科学家于1992年底研制成功具有自主知识产权的GFM CRY1A融合BT杀虫基因，转入棉花创造出单价转基因抗虫棉。1996年又研制成功双价抗虫棉(BT+CPT1)。在多方力量的共同努力下，我国育成了拥有自主知识产权的系列国产转基因抗虫棉品种70个，均已在河北、山东、河南等主产棉省大面积推广应用。 中国抗虫棉的迅速崛起打破了国外公司垄断中国 市场、攫取高额利润的企图, 有效地保护了国家和棉农的利益, 具有非凡的意义。在国家的大力扶持下, 经过数年的时间, 国产抗虫棉产业化迅速崛起。2006年, 国产抗虫棉的种植面积已经占到全国抗虫棉面积的82% , 以绝对优势占据了国内抗虫棉市场。07年12月科技部统计中国抗虫棉累计推广1亿多亩，带来直接经济效益150亿元[16]。目前我国转基因抗虫棉在技术上已走通全过程, 完全拥有自己的专利和知识产权, 是继美国之后独立 自主地研制成功抗虫棉的第二个国家。 2 转基因抗虫棉存在问题及其安全性 研究表明，转基因抗虫棉对棉花纤维品质并无显著影响[1]，这说明抗虫棉单纯就经济上而言具有更高的效益。但还有研究表明，抗虫棉除了在抗虫毒蛋白的表达与天然棉花不一样之外，另外也改变了棉花的某种代谢途径，使其各蛋白含量放生了变化[2]。虽然棉花并非是人的食品，但是棉子粉、棉子油却经常被作为畜牧饲料，进而间接影响人类。可以预计，随着转入基因的多样化与复杂化，其可能引发的非预期效应将更加复杂且不确定。可以说，大部分转基因产物——不仅仅是转基因棉——存在的问题，来源于这部分“未知”。
转基因抗虫棉研究进展
转基因抗虫棉研究进展、问题及对策 谢德意 （河南省农科院经济作物研究所， 郑州 ４５０００２） 为解决棉铃虫给棉花生产造成巨大为害这一世界性难题，从２０世纪８０年代开始，国内外相继开展了转基因抗虫棉的研究，到目前为止，美国、澳大利亚、中国等转基因抗虫棉已在生产中应用，转基因抗虫棉的研究取得了重大进展。 １ 转基因抗虫棉研究进展 转基因抗虫棉研究中常用的外源抗虫基因有苏云金芽孢杆菌〖ＷＴ５ＢＸ〗（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）毒素蛋白基因简称Ｂｔ基因、 蛋白酶抑制基因、 淀粉酶抑制基因、 外源凝集素基因、 几丁质酶基因、 蝎毒素基因等，目前人们已成功地将Ｂｔ基因和豇豆胰蛋白酶抑制基因（Ｃｏｗｐｅａ Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｇｅｎｅ简称ＣＰＴＩ基因）分别或同时导入到棉花植株内，获得了抗虫性强且能稳定遗传的转基因植株。苏云金芽孢杆菌是一种革兰氏阳性菌，在芽孢形成过程中产生的伴胞晶体被称为δ２内毒素或杀虫晶体蛋白（ＩＣＰ， Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ Ｃｒｙｓｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）。它可毒杀鳞翅目、双翅目和鞘翅目等的昆虫，是目前世界上应用最为广泛的生物杀虫剂。据统计已有６０多种Ｂｔ基因被报道，根据它们的杀虫范围和基因序列的同源性的不同又可大致分为六大类，即ＣｒｙＩ、ＣｒｙⅡ、ＣｒｙⅢ、ＣｒｙⅣ、ＣｒｙⅤ和Ｃｙｔ，每一类中又包含有不同的亚类，前五类称为晶体蛋白基因家族（Ｃｒｙｓｔａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｄｅｎ Ｇｅｎｅ），而第六类称为细胞外溶解性晶体蛋白基因（Ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｄｅｎ Ｇｅｎｅ）。典型的ＩＣＰ为１３０ｋｂ左右，由两部分构成即Ｎ端的活性片段和Ｃ端的结构片段。带有结构片段的ＩＣＰ 被称为原毒素，它经过蛋白酶的消化作用后，产生有活性的毒性肽。 １９８１年，Ｓｃｈｎｅｐｆ和Ｗｈｉｔｅｌｅｙ等首次从苏云金芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ ｋｕｒｓｔａｋｉ）中分离并克隆了Ｂｔ基因。美国Ａｇｒｏｃｅｔｕｓ公司克隆了与δ－内毒素有关的片段，利用农杆菌介导法首次将其导入棉花中，使棉株能形成自身的杀虫蛋白。１９８８年，美国Ｍｏｎｓａｎｔｏ公司获得经改造后Ｂｔ基因的转基因棉花，１９８９年温室鉴定杀虫效果良好，１９９０～１９９２年大田试验结果表明，Ｂｔ转基因棉花在治虫和不治虫两种情况下，皮棉产量均高于对照。１９９５年正式申请并通过美国环保局的批准登记，首批发放的２个品种为ＮｕＣＯＴＮ３３Ｂ和ＮｕＣＯＴＮ３５Ｂ，１９９６年正式开始大面积商品化种植。１９９８年将ＢＸＮ基因与Ｂｔ基因同时转入一个品种中，得到了既抗虫又抗除草剂的棉花品种，１９９９年得到了双价转基因抗虫棉，预计到２００２年前后，转基因抗棉铃虫、象鼻虫的棉花可望发放种植。到目前美国国内抗虫棉种植面积大约有１００万公顷，而且岱字棉公司已在世界上十多个主产棉国推广种植其转基因棉花，包括中国、澳大利亚、南非、津巴布韦、墨西哥和印度等。 我国抗虫基因工程棉花品种的培育起步较晚，但发展很快。１９９０年，范云六等从苏云 金芽孢杆菌亚种ａｉｚａｗａｉ７—２９和ｋｕｒｓｔａｋｉＨＤ—１中分离克隆出了Ｂｔ基因。１９９１年，谢道昕等首次报道将Ｂｔ毒素基因通过花粉管途径导入我国棉花品种，其后代在实验室内虽具有一定的抗虫性，但抗虫性差，不足以致死害虫。范云六、郭三堆等对Ｂｔ基因进行了改造，获得了具有自主知识产权的抗虫性强的Ｂｔ基因。随后，中国农科院生物工程中心、中国农科院棉花研究所、山西省棉花研究所、江苏农科院经作所等单位将这些改造后的Ｂｔ基因导入到我国自育品种中棉所１２号、中棉所１６、晋棉７号、泗棉２号、泗棉３号等中，获得了我国第一批转基因棉花。到目前为止，我国共选育抗虫棉品种（系）５２个， 其中２１个通过了安全性评价，１２个通过审定。在这５２个品种（系）中，又有７个抗虫杂交棉，３个双价转基因抗虫棉。此外，河北省、安徽省还分别与美国岱字棉公司成立了合资公司，引进其转基因抗虫棉７个。据统计，１９９９年我国抗虫棉种植总面积约６０万公顷。 ２ 转基因抗虫棉存在的问题
论我国转基因抗虫棉育种
对结实不利,毕节地区北部的威宁、大方等地虽日照和辐射占优势,但气温低,不利于草坪草生长。所以对于冷季型草坪草种子生产较适宜的地区是毕节西南部,这些地区日照辐射、气温、降雨月分布等综合指标最合适,其次为贵阳→安顺→六盘水的中西部地区。这是根据草坪草生理特性和我省气候因素综合推断的,是否能完全进行种子规模化生产,最好作适应性试验。目前我们正在进行草坪草种子生产研究,至于我省草坪草种子生产前景如何,需研究结束方能肯定。 论我国转基因抗虫棉育种 张存信 (天津市种子管理站 300061) 摘要:本文论述了由于棉花害虫为害严重必须进行防治,而化学防治失控必须开辟新途径,利用棉花自身抗虫性是最佳选择,转基因抗虫棉已显示出无可比拟的优势。还分析总结了转基因抗虫棉的现状。并针对当前存在的主要问题,研究提出转基因抗虫棉育种发展趋势 关键词 转基因 抗虫棉 育种 棉花是我国主要经济作物。近年来,由于害虫为害严重,化学防治失控,不仅造成严重的经济损失,而且污染生态环境。转基因抗虫棉的培育和应用,为棉花害虫防治开辟了新途径。为此,总结分析转基因抗虫棉的重要意义、基本概念和分类状况,并针对当前主要问题,研究探讨其发展趋势是十分必要的。1 转基因抗虫棉育种是生产发展的必然选择1.1 棉花害虫为害严重,必须进行防治 棉花是重要的经济作物和纤维作物,也是害虫最多,为害时间最长,为害最严重的作物。据统计,棉花一生害虫不断,受到几百种害虫相继为害,其中以棉铃虫、棉蚜、棉红铃虫等分布最广泛,为害最严重。棉花害虫的为害,对我国棉花生产造成了巨大损失。据统计,每年棉花产量损失15%～20%。进入90年代以来,由于气候条件的变化,耕作制度的改革,害虫抗药性的增强及天敌控制作用的减弱等不可持续发展因素的综合影响,棉铃虫在我国北方棉田大面积暴发成灾,我国最大的棉产区——黄淮海棉区减产20%～30%,严重减产50%,甚至绝收,每年损失60亿～100亿元,损失之重不次于蝗灾。我市损失也十分严重。 1.2 化学防治失控,必须开辟新途径 人们在长期的生产实践中,总结出了一系列棉花害虫防治措施,其中常用的有化学防治、农业防治、物理防治、生物防治等,并以化学防治为主。化学农药的大量使用,不仅增加了棉农负担,提高了植棉成本。据统计,每年棉田用药20次左右,甚至更多,每公顷药费高达1200～1800元;而且污染了环境,伤害了天敌,破坏了生态平衡,害虫产生了抗药性,降低了用药效果。虽然增加用药剂量或施用杀伤力更大的农药,可解决燃眉之急,但害虫抗药性不断增加,形成恶性循环,其后患无穷;更为严重的是,威胁着人畜安全,挫伤了棉农的植棉积极性。1.3 利用棉花自身抗虫性,是最佳选择 综上所述,世界各国均十分重视探索棉花害虫治理新途径。其中棉花抗虫性的利用和抗虫棉的培育被认为是当前和今后棉花害虫综合防治的最经济、最有效的方法之一。人们利用棉花形态抗性和生化抗性培育出的抗虫棉,一般可减少治虫用药10%～20%左右。如我市推广应用的中棉所36形态抗虫棉。特别是近年来高新技术的兴起,在实验室内,可将其它生物体如微生物中具有抗虫基因导入棉株体内,使棉花自身获得高水平抗虫能力。这种转基因抗虫棉育种,就为棉铃虫等棉花主要害虫的有效安全防治,提供了新的技术措施。目前,我国培育和推广应用的转Bt基因抗虫棉,一般可减少治虫用药50%以上。我市引种抗虫棉可减少用药60%以上。 1.4 转基因抗虫棉已显示出无可比拟的优势 从理论上讲,将外源抗虫基因导入到棉花中,并能稳定地遗传和表达,从而培育成抗虫棉新品种,其具有以下优点:一是棉花自身能合成杀虫物质,有抵御害虫为害的能力;二是抗性具有专一性。即只杀死目标害虫,对非害生物无影响;三是抗性具有连续性。即在棉花生长发育的任何时期,都可控制害虫为害;四是抗性具有整体性。即整个棉株都能得到保护;五是安全、卫生、持久。由于抗虫物质只存在于棉株体内,不易被外界环境破坏,也不会污染环境;六是经济有效。与发展新型杀虫剂相比,投资少,见效快。我市推广应用引种抗虫棉中棉所30等的生产实践,也证明了上述论述。 2 转基因抗虫棉的基本概念和分类 就全世界范围而言,抗虫棉目前尚处在研究和生产应用的初级阶段。在研究上,科学家们使用的抗虫棉抗性分级标准较为复杂和严格;在生产应用上,一般认定为抗虫棉的标准是:能够减少治虫用药20%～50%的棉花品种(系)就属于抗虫棉的范畴。可见,抗虫棉的抗虫性是有限的,并非万能的“无虫棉”。目前,抗虫棉分为形态抗虫棉、生化抗虫棉和转基因抗虫棉等三大类。 所谓转基因抗虫棉是指将外源抗虫基因导入棉株体内,而使棉花本身具有抗虫性状的抗虫棉。自然界中能抗虫的生物很多,人们可将该生物中控制合成抗虫物质的基因分离克隆出来,然后导入棉株体内,获得抗虫的各种类型棉花新品种。根据导入抗虫基因种类不同,转基因抗虫棉又可分为转苏云金芽孢秆菌毒素蛋白基因(简称Bt基因)抗虫棉、转豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(简称CPT I基因)抗虫棉、转慈菇胰蛋白酶抑制剂基因(简称AP I基因)抗虫棉等。根据导入外源基因数量的不同,转基因抗虫棉又可分为单价转基因抗虫棉、双价转基因抗虫棉、多价转基因抗虫棉等。 ? 62 ? 种子 Seed 2002年 第1期 (总第120期)
转基因抗虫棉研究现状
转基因抗虫棉研究现状与展望 摘要；棉花生长周期长、虫害多，造成的损失非常严重。据统计，在转基因抗虫棉商品化之前，全球每年用于防治棉花虫害的费用高达20亿美元，约占所有农作物防虫费用的四分之一。[1]传统的化学农药防治棉铃虫不仅费用高，且已引发了棉虫的抗药性，同时化学杀虫剂的过量使用也带来了环境污染的问题，而转基因植物所产生的杀虫蛋白主要是通过抑制害虫消化等生理功能而达到抗虫的目的。关键词：转基因抗虫棉花研究进展 棉花生长周期长、虫害多，造成的损失非常严重。据统计，在转基因抗虫棉商品化之前，全球每年用于防治棉花虫害的费用高达20亿美元，约占所有农作物防虫费用的四分之一。[1]传统的化学农药防治棉铃虫不仅费用高，且已引发了棉虫的抗药性，同时化学杀虫剂的过量使用也带来了环境污染的问题，而转基因植物所产生的杀虫蛋白主要是通过抑制害虫消化等生理功能而达到抗虫的目的。 然而，随着转基因抗虫棉在世界范围的发展，也不断涌现出一些问题，如棉花质量问题，抗虫性持久问题，对生态环境安全问题等。 1、抗虫基因分离与转基因棉花植株获得 用于植物抗虫基因工程研究的基因很多，但并不是所有的基因均可用于转基因抗虫基因抗虫棉的培育，而应根据棉花自身受害虫的危害情况，有针对性地选择那些对棉花害虫具有较强杀伤作用的基因。综观国内外的研究现状，目前已用于或正在用于转基因抗虫棉培育的基因主要有以下几类： 1．1 苏云金芽孢杆菌素蛋白基因（Bt基因） Bt制剂作为一种生物杀虫剂在农业上应用已有30余年的历史，虽然它具有专一性强、效果好、对人畜安全等优点，但在自然界被阳光钝化、雨水冲淋，从而限制了其在生产上的广泛应用。 1．2蛋白酶抑制剂基因植物蛋白酶抑制剂是自然界含量最为丰富的蛋白种类之一，它广泛存在于植物的各种组织及器官中，其中以种子与块茎中的含量最高，可达总蛋白含量的1%-30%。蛋白酶抑制剂的种类很多而且自身特点较多。首先，从杀虫机理上看，其基因产物作用于昆虫消化酶的活性中心，这是酶的最保守部位，突变的可能性很小，基本上可以排除害虫通过突变产生抗性的可能；其次，蛋白酶抑制剂的抗虫谱广泛;另外，蛋白酶抑制剂来源于植物自身，对人畜无害。但是蛋白酶抑制剂基因要想达到理想的抗虫效果，就必须要求转基因植物蛋白酶抑制剂的表达量远远高于转Bt基因植株的表达量，这也给抗虫基因工程带来了一定的困难。 1．3外源凝集素基因外源凝集素是一组广泛存在于植物组织中的蛋白质成分，在储藏器官和繁殖器官中的含量尤其丰富。 1．4其它抗虫基因的研究及利用除上面所讲述的几种抗虫基因外，人们还在不断探索新的抗虫基因，以便创造出更多更好的抗虫转基因作物。 1．5不同基因抗虫性的比较在目前转化植物成功获得转基因抗虫植物的多种基因中，Bt抗虫基因是使用最广泛也是最有效的基因，因而到目前为止在生产上使用的转基因抗虫植物大多是转Bt抗虫基因植物，这是因为Bt基因表达产生的δ-内毒素对棉铃虫等多种害虫具有很强的毒杀作用，再加上经过人们的不断修饰和改造现已能使该基因在植物体内达到高水平的表达。 2.抗虫基因的转化方法 2.1 农杆菌质粒介导法 土壤农杆菌是一种能侵染多种双子叶植物的细菌，它体内含有一些很大的质粒，统称Ti质粒。在Ti质粒上有一段DNA，称为T-DNA，土壤农杆菌有二个种：根癌农杆菌和发根农杆菌。它们均能向植物细胞转移其质粒上的一段DNA即T-DNA，T-DNA上含有一些致瘤基因。使被侵染的植物产生肿瘤。即冠瘿瘤。T-DNA可整合