产城会-第二代测序技术产业链研究报告

第二代测序技术产业链研究报告

珞珈投资发展（深圳）有限公司

一、节点简介

目前，市场上主要采用的二代测序技术，三代、四代技术尚未成熟，使用较少。Illumina高通量测序平台占据着霸主地位，为常见的测序平台，主要由HiSeq 测序仪和MiSeq测序仪组成；Roche的454GS-FLX测序平台为最早的二代测序系统，是基于焦磷酸测序(Pyrosequencing)原理建立的高通量基因组测序系统，Roche关闭454测序业务，454测序仪在2016年淘汰；另外，市面上常见的测序平台还有LifeTech公司的IonTorrent测序平台以及AppliedBiosystems公司的3730DNA测序平台。此外，紫鑫药业旗下子公司中科紫鑫于今年8月推出了BIGIS二代测序平台系统，该平台是基于罗氏454平台焦磷酸测序技术。相比于其他平台，BIGIS平台具有较长的读长且成本较低。

1、根据鲸准研究院报告，中国市场上目前约有1000台二代测序仪，大多来自Illumina、Thermo Fisher这两家跨国公司，两家公司在2013年占有测序仪市场份额超过90%，处于完全垄断地位，2014年Illumina试剂提价，导致华大基因利润急速下滑，年底其净利润增长率为-79.3%，可见上游设备厂商对中游服务提供商的能力。从2013-2017年，Illumina毛利率基本维持在65%以上，营业利润率则在23.2%左右，测序配套试剂耗材占其收入近一半。

二、产业链图谱

三、智能行业透视

（1）节点定义

节点定义

数据来源：华金证券

标题：医药行业周度报告：我国克隆猴技术取得重大突破?新药研发或将迎来重大变革

发布时间：2018-01-31

摘要：液态活检是目前临床上最领先的肿瘤早期无创诊断技术，主要通过检测患者血液中循环肿瘤细胞( CTC)、循环肿瘤DNA( ctDNA)、循环肿瘤RNA( ctRNA)和外泌体来实现。与传统的肿瘤组织活检相比，液态活检具有早期筛查、无创、取材简便、检测结果准确等多方面的优势，是肿瘤检测的发展方向。在4种检测材料中，ctDNA样本代表性好，研究最多，也是进展最快的领域。目前临床上ctDNA的检测方法主要是数字PCR、二代测序和荧光PCR。2016年，国家卫计委临床检验中心曾发布《2016年全国ctDNA基因突变检测室间质量评价报告》，报告显示，数字PCR准确率最高，但由于该技术是三种技术中最新的一种技术，临床上还未推广开：二代测序能同时检测多个基因的多种不同变异形式，但各个实验室的结果差异较大，对实验操作流程及数据处理的要求最高：荧光PCR具有操作简单、成本低廉的优势，在病理组织分子检测中已被广泛应用，是目前三类方法中临床接受度最高的技术。

数据来源：兴业证券

标题：医药生物：基因测序行业深度报告.解码生命，精准基石

发布时间：2016-04-03

摘要：第二代测序技术早期代表平台包括Illumina的Solexa、LifeTechnologies 的Solid、罗氏的454平台等目前市场的主流机型包括Illumina的

HiSeq/MiSeq/NextSeq、LifeTechnologies的Solid/IonPGM/IonProton等。它们的测序原理不完全相同但共同的特点是都以舍弃读长为代价实现了高通量。（2）行业规模

行业规模

数据来源：国金证券

标题：艾德生物:受益精准医学和政策变革双重浪潮

发布时间：2018-01-20

摘要：目前行业缺乏准确数据，根据我们草根调研和访问，我们估计2016年国内精准用药院内市场（以PCR 为主要平台）规模仅5 亿元左右，如计算外送收样检测（以NGS 为主）市场，整体规模10亿元左右。

数据来源：元码基因

标题：[临时报告]元码基因:公开转让说明书

发布时间：2017-12-07

摘要：根据Frost&Sullivan估计,全球二代基因测序（NGS）生物信息学市场（数据分析软件、工作平台、数据处理及数据解读）规模将从2012年的1.7亿美元以22.7%的年复合增长率成长到2018年的近6亿美元,成长空间可达到3-4倍。数据来源：华金证券

标题：华金证券医药行业深度分析：基因测序，开启生物大数据时代（下）

发布时间：2017-09-15

摘要：另一方面，随着测序技术在癌症领域临床转化癿丌断深入，基因测序在癌症领域癿渗透率也将快速提高。根据麦肯锡癿预测，到2018年常见癌症癿基因检测渗透率将达到较高癿水平。综合两方面癿利好因素，未来肿瘤基因测序癿市场觃模有望快速增长，Illumina预测诠细分市场癿全球市场空间为120亿美元。数据来源：之江生物

标题：[临时报告]之江生物:公开转让说明书

发布时间：2017-06-12

摘要：此外,虽然高通量测序技术还处在前期阶段,市场规模相对较小,一般不计入分子诊断总体规模中,但未来随着技术的进步和成本的降低,将迎来迅猛的发展。据Morgan Stanley预测,至2018年,整个高通量测序的终端市场规模将达到255亿美元,其中最主要的应用集中在肿瘤领域上,包括对肿瘤的诊断、监测上海之江生物科技股份有限公司公开转让说明书及遗传学分析等,占比超过50%,达135亿美元；另外生命科学研究、生殖遗传；

数据来源：贝壳社

标题：解码生命，精准基石—基因测序行业深度报告（上篇）

发布时间：2016-04-14

摘要：近年随着NGS技术的成熟和普及，其普及率持续提升。根据Markets&Markets的研究报告显示，2014年NGS的全球市场规模为25亿美金，预计2020年将达到87亿美金，复合增长率为23%。NGS成为分子诊断领域中增长最快的子行业，超过传统的PCR、FISH和基因芯片技术，未来有望成为行业主流，引领行业发展。

（5）竞争格局

竞争格局

数据来源：海通周期团队

标题：【海通医药首篇创新器械深度报告】黄金时代：中国医疗器械创新大潮开启

发布时间：2019-04-07

摘要：第二代测序技术发展初期出现多强争霸的局面，如Illumina、Thermo和Roche，但是随着优秀产品的不断壮大以及重大并购事件的发生，行业集中度

不断增加，形成了强者恒强的局面。在2017年之后，借助于HiSeq系列测序仪升级和推广，Illumina不断蚕食其他厂商的市场份额，逐渐形成了一家独大的局面。2018年Illumina以约12亿美元收购PacificBiosciences，将PacBio 的长读长测序技术与其自身的高通量、短读长测序平台相结合，以继续保持优势。PacBio的产品读长平均可达30kbp。

数据来源：元码基因

标题：[临时报告]元码基因:公开转让说明书

发布时间：2017-12-07

摘要：基因测序仪器市场方面,根据Next Generation Genomics数据显示,2016年,全球基因测序仪器市场从销售额来看,Illumina占83.9%,Thermo Fisher占9.90%,该市场的前两大寡头占据整体市场份额的93.8%,呈现高度垄断的态势。数据来源：华金证券

标题：医药：基因测序，开启生物大数据时代（上）

发布时间：2017-09-14

摘要：此前，全球癿测序仪市场被Illumina、Life Technologies（2012年被Thermo Fisher收购）和Roche 三家公司瓜分，长期处二寡头垄断癿局面，其中又以Illumina癿市场仹额最大。2013年时，Illumina癿市场仹额为71% 数据来源：华创证券

标题：医药生物行业周报：从消费升级角度看医药市场

发布时间：2017-08-22

摘要：在此篇PPT 中我们详细测算了未来NGS 在临床市场的应用前景和商业化规模，将NGS 两大龙头公司华大基因和贝瑞和康的基本面情况加以深入分

析，并将二者加以比较研究。我们比较研究的目的并不在于孰优孰劣，而是在NGS行业商业化开始蓬勃发展的初期，观察两家龙头公司的发展特色，帮助您构架行业研究的框架与方法。无论您之前对这个行业是否关注，相信您读完此文，都会对国内临床高通量测序行业形成基本的认识框架，并对华大和贝瑞这两家公司有了更为深入的理解。

数据来源：天风证券

标题：医疗器械：诊疗or预防，基因测序引导医学思维反转

发布时间：2017-07-07

摘要：经过了十年左右的发展成熟逐渐形成以Illumina公司为领头羊以ThermoFisher和Roche为主要玩家的市场格局由于测序仪技术壁垒极高市场极度集中这三家公司合计市场份额超过了95%其中Illumina公司产品独占鳌头行业一致认为Illumina占据了全球70-80%的市场份额。

数据来源：天风证券

标题：医疗器械：诊疗or预防，基因测序引导医学思维反转

发布时间：2017-07-07

摘要：预计几年内，北美仍将占据全球NGS测序市场的最大份额，约为40%，所占份额变化相差不大，亚太占约20%的市场份额。随着经济的不断发展和测序市场规范化，中国测序市场增速明显，中国将进入快速发展期，有望成为全球NGS市场的大本营之一，2012-2017年预计年复合增长率约为20-25%，位居全球前列。

数据来源：生物探索

标题：专访华大基因蒋慧：测序仪“规模化量产”是顺应市场需求

发布时间：2017-04-21

摘要：据去年发布的《中国高通量测序市场研究报告》，90%的全球测序仪市场由Illumina和Thermo Fisher占据，我国约有1700台NGS测序仪在市场上使用，绝大多数从Illumina、Thermo Fisher以及Pacific Biosciences三家美国测序仪设备供应商处采购。在被外资企业所垄断的市场中，国产测序仪的市场空白虽然已经得到了填补，但想要改变市场的整体格局，似乎还需要一定的时间。

数据来源：新浪医药

标题：“精准医学”的几点冷思考

发布时间：2016-08-11

摘要：根据华大科技近期发布的《中国高通量测序（NGS）市场研究报告（2016）》，目前全球各类高通量测序仪总量近10000台，我国约有1700台，占比高达17%。似乎精准医学与二代测序技术无形间被划上了等号。

数据来源：乐普基因

标题：[临时报告]乐普基因:公开转让说明书

发布时间：2016-02-22

摘要：高通量测序目前的主流平台有两个,分别是美国IlluminaNextSeq或HiSeq系列以及美国Thermo公司的IonProton测序平台。早期的454测序平台被Roche收购后已退出市场竞争,PacificBiosciences等三代测序平台眼下远未成熟,离应用还有不小的距离。据GenomeWeb2013年的市场调查,Illumina 占据了全球测序仪器市场71%的份额,IonProton测序平台（包括上一代机器

PGM）排名第二,仅分得16%的市场份额,而且它们之间的差距还在逐年扩大,基因测序设备的市场实际已经被Illumina独家垄断。

数据来源：动脉网

标题：『VB周报0914』上周国内互联网医疗融资超1亿美元

发布时间：2015-09-14

摘要：全基因组测序技术发展最快，逐渐霸占NGS市场。肿瘤研究和产前检测位居NGS应用市场的前二甲。

（3）发展历史与趋势

发展历史与趋势

数据来源：华大基因

标题：华大基因2018年年报

发布时间：2019-04-25

摘要：微生物检测作为基因检测的重要应用领域，发展空间值得期待。以病原高通量测序技术为代表的微生物检测技术是未来的发展方向和趋势。相较于早期的分离培养、免疫学、PCR和基因芯片等检测技术，宏基因组高通量测序具有检测范围广、无需预先培养样本、检测通量高、可检测未知微生物的综合优势，预计未来应用前景较为广阔。

数据来源：广证恒生咨询

标题：新三板医药行业专题:新技术突破传统微生物检测瓶颈,NGS引领变革

发布时间：2019-02-27

摘要：报告报告新三板医药专题由于耗时较长，精度较低等因素其发展受到相应制约。质谱和PCR 检测平台均处于发展期，未来会有较为明显的放量，由于

这两种技术平台依旧需要分离培养，并且对未知病原体检测的能力较低，因此相对于NGS技术而言，仍具有相应劣势。目前来说，虽然NGS技术起步晚、价格贵、普及度低，但是凭借着高通量、高精度快速等显著优势，其未来发展前景最为广阔

数据来源：兴证医药健康

标题：伴随诊断行业深度：迎百亿蓝海市场，伴随诊断大有可为【兴证医药】发布时间：2019-02-12

摘要：中期来看，PCR和NGS技术会并存，NGS适用于高通量的检测需求。相对于PCR的普及度高、操作简单、准确度高以及最为重要的出报告时间短，适用于临床需求等特点，NGS的优势在于其高通量，覆盖面积广、基因信息广，省略PCR扩增环节、测序读长长，检测突变形式多样。以肿瘤精准医疗应用最为成熟的肺癌为例，适应各种不同的标准类型，少于十个基因的检测需求通过PCR；多于十个基因的检测需求，通过NGS产品来满足。近年来，FDA和CFDA 已经批准了多款基于高通量测序技术的肿瘤药物伴随诊断试剂盒。目前在NGS 技术在无创产前基因检测应用相对成熟，在肿瘤诊断和个性化治疗前景广阔。数据来源：华大基因

标题：华大基因2018年半年度报告

发布时间：2018-08-28

摘要：新一代基因测序技术在早期主要被应用于科研服务，中国的代表企业是华大基因和诺禾致源；国外代表企业主要是Macrogen。而新一代基因测序技术目前最广泛的应用是在临床医学服务，代表性的应用有无创产前基因检测，中国的代表企业是华大基因和贝瑞基因；国外代表企业包括LabCorp（公司于2016

年收购Sequenom）、美国Illumina, Inc.（公司于2013年收购Verinata Health）、美国Natera、瑞士罗氏公司（公司于2014年收购Ariosa）、德国LifeCodexx。美国的个人基因组服务机构发展领先，代表企业有23andMe、Helix和Ancestry，以上企业依据基因芯片数据为主，采用标准或定制化基因芯片，为受检者提供特定位点的检测和分析服务。拥有高深度人全基因组测序技术的代表企业有美国Illumina和中国华大智造，华大基因基于华大智造测序平台提供的人全基因组测序服务全球领先。

数据来源：天风证券

标题：医疗器械：诊疗or预防，基因测序引导医学思维反转

发布时间：2017-07-07

摘要：根据Research & Market的预测，2015年NGS全球市场规模为33亿美元，2016年升至40亿美元，2020年预计将达到86亿美元，年复合增长率达到21.3%，占整个基因测序行业市场份额的70-80%，未来仍是主要的市场。数据来源：国联证券

标题：基因测序行业:泡沫里的金矿,精准医疗大时代

发布时间：2015-11-25

摘要：2.1.2第二代测序技术21世纪初，随着人类基因组计划的完成，人们进入功能基因组时代，传统的测序方法已经不能满足深度测序和重复测序等大规模基因组测序的需求，这促使了第二代测序技术的诞生。

数据来源：中银国际证券

标题：医药生物行业基因测序专题研究:二代测序技术,精准医疗的先行者

发布时间：2015-11-10

摘要：二代测序技术,又叫做高通量测序技术,可以一次完成数十万到数百万条DNA分子的序列测定,是对传统测序技术的革命性变革。经过十几年的发展,二代测序技术已经从科研一个小众领域逐渐走向临床,应用在产前筛查、肿瘤检测、遗传病筛查和胚胎植入前筛查等领域。根据BBC Research数据,2007年全球基因测序市场规模为794.1万美元,而2013年大幅增长至45亿美元,预计2018年市场规模将达到117亿美元,2013年-2018年的年均复合增长率为21.2%,未来几年全球市场仍将继续保持快速增长。

数据来源：生物探索

标题：NGS：预计七年后市场规模300亿美元，产前检测市场份额排老二

发布时间：2015-09-10

摘要：根据GrandViewResearch的报道，2014年全球下一代测序（NGS）市场规模为20亿美元，预计在2015年至2022年，市场值以40.1%的年复合增长率增长，至2022年市场值达300亿美元。

数据来源：生物探索

标题：展望2015生命科学仪器市场：将迎来爆发性增长

发布时间：2015-02-02

摘要：Roche关闭454业务后，新一代测序仪的市场则主要被Illumina和Life Technologies所占据。据C&EN杂志发表的数据，Illumina在新一代测序仪市场中占有绝对的市场份额，市场占有率达到71%，而近期受到普遍关注的第三代测序技术，大多处于开发阶段或商品化初期，目前不大可能威胁Illumina 的领导地位。

数据来源：健康界

标题：基因测序是颠覆医疗的技术

发布时间：

摘要：4.基因测序技术的发展趋势目前市面上主要的基因测序平台，进口的测序仪占领了90%以上的市场，其中以Illumina为主。

（4）政策法规

政策法规

数据来源：新浪医药

标题：重磅！中检院发布首份PGS质控指南，促进产业有序发展

发布时间：2017-05-05

摘要：2017年3月15日，中国食品药品检定研究院官网发布了《胚胎植入前染色体非整倍体检测试剂的质量控制技术评价指南（高通量测序法）》（以下简称《指南》），旨在规范申请人在胚胎植入前染色体非整倍体检测试剂盒（高通量测序法）的产品设计开发、性能评价的诊断试剂技术指标和要求，并为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。

数据来源：迈迪生物

标题：[临时报告]迈迪生物:公开转让说明书

发布时间：2016-11-30

摘要：2011年7月,科学技术部发布《国家“十二五”科学和技术发展规划》,提出重点研发基因组学及新一代测序技术、蛋白质组学技术、干细胞技术、生物合成技术、生物治疗技术、分子诊断和分子影像技术、生物信息技术、药靶发现与药物分子设计技术。

数据来源：新浪医药

标题：深圳成立国内首家医生集团

发布时间：2016-08-09

摘要：7.中国食品药品检定研究院：发布《第二代测序技术检测试剂质量评价通用技术指导原则》。

四、路演项目

五、典型公司

DNA测序原理和方法.

DNA测序原理和方法 DNA序列测定分手工测序和自动测序，手工测序包括Sanger双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert化学降解法。自动化测序实际上已成为当今DNA序列分析的主流。美国PE ABI公司已生产出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA测序仪，其中310型是临床检测实验室中使用最多的一种型号。本实验介绍的是ABI PRISM 310型DNA测序仪的测序原理和操作规程。 【原理】ABI PRISM 310型基因分析仪(即DNA测序仪)，采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法)，因此通过单引物PCR测序反应，生成的PCR产物则是相差1个碱基的3''''末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物，使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的CCD(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。 它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。PE公司还提供凝胶高分子聚合物，包括DNA测序胶(POP 6)和GeneScan胶(POP 4)。这些凝胶颗粒孔径均一，避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、Macintosh电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。电脑中则包括资料收集，分析和仪器运行等软件。它使用最新的CCD摄影机检测器，使DNA 测序缩短至2.5h，PCR片段大小分析和定量分析为10～40min。 由于该仪器具有DNA测序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可进行DNA测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(SSCP)、微卫星序列分析、长片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，临床上可除进行常规DNA测序外，还可进行单核苷酸多态性(SNP)分析、基因突变检测、HLA配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。【试剂与器材】 1．BigDye测序反应试剂盒主要试剂是BigDye Mix，内含PE专利四色荧光标记的ddNTP 和普通dNTP，AmpliTaq DNA polymerase FS，反应缓冲液等。 2．pGEM-3Zf (+) 双链DNA对照模板0.2g/L，试剂盒配套试剂。 3．M13(-21)引物TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2μmol/L，即3.2pmol/μl，试剂盒配套试剂。 4．DNA测序模板可以是PCR产物、单链DNA和质粒DNA等。模板浓度应调整在PCR 反应时取量1μl为宜。本实验测定的质粒DNA，浓度为0.2g/L，即200ng/μl。 5．引物需根据所要测定的DNA片段设计正向或反向引物，配制成3.2μmol/L，即3.2pmol/μl。如重组质粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13(-21)引物，T7引物等。 6．灭菌去离子水或三蒸水。 7．0.2ml或和0.5ml的PCR管盖体分离，PE公司产品。 8．3mol/L 醋酸钠(pH5.2) 称取40.8g NaAc·3H2O溶于70ml蒸馏水中，冰醋酸调pH至5.2，定容至100ml，高压灭菌后分装。 9．70%乙醇和无水乙醇。 10．NaAc/乙醇混合液取37.5ml无水乙醇和2.5ml 3mol/L NaAc混匀，室温可保存1年。11．POP 6测序胶ABI产品。

DNA第一代-第二代-第三代测序的介绍

双脱氧链终止法又称为Sanger法 原理是：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4 种单脱氧核苷三磷酸 ( d NTP，其中的一种用放射性P32标记 )存在条件下复制时，在四管反应系统中分别按比例引入4种双脱氧核苷三磷酸 ( dd NTP )，因为双脱氧核苷没有3’-O H，所以只要双脱氧核苷掺入链的末端，该链就停止延长，若链端掺入单脱氧核苷，链就可以继续延长。如此每管反应体系中便合成以各自 的双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分4个泳道进行凝胶电泳，分离长短不一的核酸片段，长度相邻的片段相差一个碱基。经过放射自显影后，根据片段3’端的双脱氧核苷，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。Sanger法因操作简便，得到广泛的应用。后来在此基础上发展出多种DNA 测序技术，其中最重要的是荧光自动测序技术。 荧光自动测序技术荧光自动测序技术基于Sanger 原理，用荧光标记代替同位素标记，并用成像系统自动检测，从而大大提高了D NA测序的速度和准确性。20世纪80 年代初Jorgenson 和 Lukacs提出了毛细管电泳技术( c a p il l ar y el ect r ophor es i s )。1992 年美国的Mathies实验室首先提出阵列毛细管电泳 ( c a p il l ar y ar r a y el ectr ophor es i s ) 新方法，并采用激光聚焦荧光扫描检测装置，25只毛细管并列电泳，每只毛细管在1.5h内可读出350 bp，DNA 序列,分析效率可达6 000 bp/h。1995年Woolley研究组用该技术进行测序研究，使用四色荧光标记法，每个毛细管长3.5cM，在9min内可读取150个碱基，准确率约 97 % 。目前, 应用最广泛的应用生物系统公司 ( ABI ) 37 30 系列自动测序仪即是基于毛细管电泳和荧光标记技术的D NA测序仪。如ABI3730XL 测序仪拥有 96 道毛细管, 4 种双脱氧核苷酸的碱基分别用不同的荧光标记, 在通过毛细管时 不同长度的 DNA 片段上的 4 种荧光基团被激光激发, 发出不同颜色的荧光, 被 CCD 检测系统识别, 并直接翻译成 DNA 序列。 杂交测序技术杂交法测序是20世纪80年代末出现的一种测序方法, 该方法不同于化学降解法和Sanger 法, 而是利用 DNA杂交原理, 将一系列已知序列的单链寡核苷酸片段固定在基片上, 把待测的 DN A 样品片段变性后与其杂交, 根据杂交情况排列出样品的序列

一代、二代、三代测序技术

一代、二代、三代测序技术 (2014-01-22 10:42:13) 转载 第一代测序技术-Sanger链终止法 一代测序技术是20世纪70年代中期由Fred Sanger及其同事首先发明。其基本原理是，聚丙烯酰胺凝胶电泳能够把长度只差一个核苷酸的单链DNA分子区分开来。一代测序实验的起始材料是均一的单链DNA分子。第一步是短寡聚核苷酸在每个分子的相同位置上退火，然后该寡聚核苷酸就充当引物来合成与模板互补的新的DNA链。用双脱氧核苷酸作为链终止试剂（双脱氧核苷酸在脱氧核糖上没有聚合酶延伸链所需要的3－OH基团，所以可被用作链终止试剂）通过聚合酶的引物延伸产生一系列大小不同的分子后再进行分离的方法。测序引物与单链DNA模板分子结合后，DNA聚合酶用dNTP延伸引物。延伸反应分四组进行，每一组分别用四种ddNTP（双脱氧核苷酸）中的一种来进行终止，再用PAGE分析四组样品。从得到的PAGE胶上可以读出我们需要的序列。 第二代测序技术-大规模平行测序 大规模平行测序平台（massively parallel DNA sequencing platform）的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一，还让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的“特权”能够被众多研究人员分享。新一代DNA测序技术有助于人们以更低廉的价格，更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质之间交互作用组的各项数据。市面上出现了很多新一代测序仪产品，例如美国Roche Applied Science公司的454基因组测序仪、美国Illumina公司和英国Solexa technology公司合作开发的Illumina测序仪、美国Applied Biosystems公司的SOLiD测序仪。Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成边测序。在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。以Illumina测序仪说明二代测序的一般流程，（1）文库制备，将DNA用雾化或超声波随机片段化成几百碱基或更短的小片段。用聚合酶和外切核酸酶把DNA片段切成平末端，紧接着磷酸化并增加一个核苷酸黏性末端。然后将Illumina测序接头与片段连接。（2）簇的创建，将模板分子加入芯片用于产生克隆簇和测序循环。芯片有8个纵向泳道的硅基片。每个泳道内芯片表面有无数的被固定的单链接头。上述步骤得到的带接头的DNA 片段变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构，以供后续的预扩增使用。通过不断循环获得上百万条成簇分布的双链待测片段。（3）测序，分三步：DNA聚合酶结合荧光可逆终止子，荧光标记簇成像，在下一个循环开

高通量测序：第二代测序技术详细介绍

在过去几年里，新一代DNA测序技术平台在那些大型测序实验室中迅猛发展，各种新技术犹如雨后春笋般涌现。之所以将它们称之为新一代测序技术(next-generation sequencing)，是相对于传统Sanger测 序而言的。Sanger测序法一直以来因可靠、准确，可以产生长的读长而被广泛应用，但是它的致命缺陷 是相当慢。十三年，一个人类基因组，这显然不是理想的速度，我们需要更高通量的测序平台。此时，新 一代测序技术应运而生，它们利用大量并行处理的能力读取多个短DNA片段，然后拼接成一幅完整的图 画。 Sanger测序大家都比较了解，是先将基因组DNA片断化，然后克隆到质粒载体上，再转化大肠杆菌。对 于每个测序反应，挑出单克隆，并纯化质粒DNA每个循环测序反应产生以ddNTP终止的，荧光标记的产 物梯度，在测序仪的96或384毛细管中进行高分辨率的电泳分离。当不同分子量的荧光标记片断通过检测器时，四通道发射光谱就构成了测序轨迹。 在新一代测序技术中，片断化的基因组DNA两侧连上接头，随后运用不同的步骤来产生几百万个空间固定的PCR克隆阵列(polony )。每个克隆由单个文库片段的多个拷贝组成。之后进行引物杂交和酶延伸反应。由于所有的克隆都是系在同一平面上，这些反应就能够大规模平行进行。同样地，每个延伸所掺入的 荧光标记的成像检测也能同时进行，来获取测序数据。酶拷问和成像的持续反复构成了相邻的测序阅读片 段。 DNA hnginetilntion DNA fraqmentnlion fn vivo cloning and amplification Cycle sequencing 3'-... GACTAGATACGAGCGTGA.. .-5* (template) 彳-…CTGAT O 曲爭i .CTGATC^A ...CTGATCT"*^ …CTG町CTA先 _________ > .,,CTGATCTAT ..CTGATCTATC ,.CTGATCTATGC ..CTGATCTATGCT ...CTGATCTATGCTC ..CTGATCTATGCTCG — Electro pho rsesis (1 read/cnpU(ary) Cyclic array sequencing Cycle 1 (>10? reads/array) Cycle 2 Cyde 3 B- A A A Is O 0 O? What IS Ibas# 1 ? Whar is bast 卍 in vitro ndaptor ligation Generf^tiorii ol ipolony array Polymerase dNTPs Lat>0led ddNTPs

新一代DNA测序技术总览

作者：尹银亮、陈会平、毛良伟译来源：生物谷 原文刊登于《分析化学》综述Analytical Chemistry 原文标题：Landscape of Next-Generation Sequencing Technologies 索引信息：https://www.wendangku.net/doc/0515071137.html,/10.1021/ac2010857 | Anal. Chem. 2011, 83, 4327–4341 原文作者：Thomas P. Niedringhaus, Denitsa Milanova, Matthew B. Kerby, Michael P. Snyder,and Annelise E. Barro 译者资料： 尹银亮，香港华大基因研发中心有限公司email：stevenyinbio@https://www.wendangku.net/doc/0515071137.html, 陈会平，毛良伟，武汉华大基因科技有限公司 【内容】 第二代测序 第二代测序成本 第三代测序技术 单分子测序法 边连接边测序法 边合成边测序法 纳米孔测序技术 蛋白质纳米孔测序法 固态纳米孔测序法 长距离阅读DNA的扩展方法 总结性评论 DNA测序正处在技术上天翻地覆剧变的阵痛之中，其突出特点是，测序通量（测序数据量）的大幅增长，原始数据中每个碱基的测序成本急剧下跌，并伴随着以巨资购买仪器以引进新技术的需求。以前看似高不可攀的奢侈性研究活动（如个人基因组测序，宏基因组学研究，以及对大量重要物种的测序），在短短几年之间，正以急速的步伐而变得越来越切实可行了。本篇综述将集中讨论在第三，第四代测序方法背后的故事：它们所面临的挑战；各种方法的局限性；以及它们带给我们的充满诱惑的前景。 第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）. 在1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌 体X174的，全长5375个碱基。其测序方法和历史过程以前已做过详细回顾。 后来的四色荧光桑格测序法（每一种荧光代表四种碱基中的一种）被用在自动毛细管电泳测序系统中，此系统由应用生物系统有限公司（Applied Biosystems Inc.）推上市场，后来该公司被整合入生命技术公司(Life Technologies)和贝克曼.考尔特公司(Beckman Coulter inc.)（见表1）。发表于2001年的第一个人类基因组

DNA第一代,第二代,第三代测序的介绍

原理是：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4 种单脱氧核苷三磷酸 ( d NTP，其中的一种用放射性P32标记 )存在条件下复制时，在四管反应系统中分别按比例引入4种双脱氧核苷三磷酸 ( dd NTP )，因为双脱氧核苷没有3’-O H，所以只要双脱氧核苷掺入链的末端，该链就停止延长，若链端掺入单脱氧核苷，链就可以继续延长。如此每管反应体系中便合成以各自 的双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分4个泳道进行凝胶电泳，分离长短不一的核酸片段，长度相邻的片段相差一个碱基。经过放射自显影后，根据片段3’端的双脱氧核苷，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。Sanger法因操作简便，得到广泛的应用。后来在此基础上发展出多种DNA 测序技术，其中最重要的是荧光自动测序技术。 荧光自动测序技术荧光自动测序技术基于Sanger 原理，用荧光标记代替同位素标记，并用成像系统自动检测，从而大大提高了D NA测序的速度和准确性。20世纪80 年代初Jorgenson 和 Lukacs提出了毛细管电泳技术( c a p il l ar y el ect r ophor es i s )。1992 年美国的Mathies实验室首先提出阵列毛细管电泳 ( c a p il l ar y ar r a y el ectr ophor es i s ) 新方法，并采用激光聚焦荧光扫描检测装置，25只毛细管并列电泳，每只毛细管在内可读出350 bp，DNA 序列,分析效率可达6 000 bp/h。1995年Woolley研究组用该技术进行测序研究，使用四色荧光标记法，每个毛细管长，在9min内可读取150个碱基，准确率约 97 % 。目前, 应用最广泛的应用生物系统公司 ( ABI ) 37 30 系列自动测序仪即是基于毛细管电泳和荧光标记技术的D NA测序仪。如ABI3730XL 测序仪拥有 96 道毛细管, 4 种双脱氧核苷酸的碱基分别用不同的荧光标记, 在通过毛细管时 不同长度的 DNA 片段上的 4 种荧光基团被激光激发, 发出不同颜色的荧光, 被 CCD 检测系统识别, 并直接翻译成 DNA 序列。 杂交测序技术杂交法测序是20世纪80年代末出现的一种测序方法, 该方法不同于化学降解法和Sanger 法, 而是利用 DNA杂交原理, 将一系列已知序列的单链寡核苷酸片段固定在基片上, 把待测的 DN A 样品片段变性后与其杂交, 根据杂交情况排列出样品的序列

高通量测序：第二代测序技术详细介绍

高通量测序：第二代测序技 术详细介绍 -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII

在过去几年里，新一代DNA 测序技术平台在那些大型测序实验室中迅猛发展，各种新技术犹如雨后春笋般涌现。之所以将它们称之为新一代测序技术（next-generation sequencing），是相对于传统Sanger 测序而言的。Sanger 测序法一直以来因可靠、准确，可以产生长的读长而被广泛应用，但是它的致命缺陷是相当慢。十三年，一个人类基因组，这显然不是理想的速度，我们需要更高通量的测序平台。此时，新一代测序技术应运而生，它们利用大量并行处理的能力读取多个短DNA 片段，然后拼接成一幅完整的图画。 Sanger 测序大家都比较了解，是先将基因组DNA 片断化，然后克隆到质粒载体上，再转化大肠杆菌。对于每个测序反应，挑出单克隆，并纯化质粒DNA。每个循环测序反应产生以ddNTP 终止的，荧光标记的产物梯度，在测序仪的96 或384 毛细管中进行高分辨率的电泳分离。当不同分子量的荧光标记片断通过检测器时，四通道发射光谱就构成了测序轨迹。 在新一代测序技术中，片断化的基因组DNA 两侧连上接头，随后运用不同的步骤来产生几百万个空间固定的PCR 克隆阵列（polony）。每个克隆由单个文库片段的多个拷贝组成。之后进行引物杂交和酶延伸反应。由于所有的克隆都是系在同一平面上，这些反应就能够大规模平行进行。同样地，每个延伸所掺入的荧光标记的成像检测也能同时进行，来获取测序数据。酶拷问和成像的持续反复构成了相邻的测序阅读片段。

Solexa 高通量测序原理 --采用大规模并行合成测序法(SBS, Sequencing-By-Synthesis)和可逆性末端终结技术（Reversible Terminator Chemistry） --可减少因二级结构造成的一段区域的缺失。 --具有高精确度、高通量、高灵敏度和低成本等突出优势 --可以同时完成传统基因组学研究（测序和注释）以及功能基因组学（基因表达及调控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究 ----将接头连接到片段上，经 PCR 扩增后制成 Library 。 ----随后在含有接头（单链引物）的芯片（ flow cell ）上将已加入接头的 DNA 片段变成单链后通过与单链引物互补配对绑定在芯片上，另一端和附近的另外一个引物互补也被固定，形成“桥” ----经30伦扩增反应，形成单克隆DNA簇 ----边合成边测序（Sequencing By Synthesis）的原理，加入改造过的DNA 聚合酶和带有4 种荧光标记的dNTP。这些dNTP是“可逆终止子”，其3’羟基末端带有可化学切割的基团，使得每个循环只能掺入单个碱基。此时，用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类。之后，将这些基团化学切割，恢复3'端粘性，继续聚合第二个核苷酸。如此继续下去，直到每条模板序列都完全被聚合为双链。这样，统计每轮收集到的荧光信号结果，就可以得知每个模板DNA 片段的序列。目前的配对末端读长可达到2×50 bp，更长的读长也能实现，但错误率会增高。读长会受到多个引起信号衰减的因素所影响，如荧光标记的不完全切割。 Roche 454 测序技术 “一个片段 = 一个磁珠 = 一条读长（One fragment =One bead = One read）”

一、二、三代测序技术

一代、二代、三代测序技术 第一代测序技术-Sanger链终止法 一代测序技术是20世纪70年代中期由Fred Sanger及其同事首先发明。其基本原理是，聚丙烯酰胺凝胶电泳能够把长度只差一个核苷酸的单链DNA分子区分开来。一代测序实验的起始材料是均一的单链DNA分子。第一步是短寡聚核苷酸在每个分子的相同位置上退火，然后该寡聚核苷酸就充当引物来合成与模板互补的新的DNA链。用双脱氧核苷酸作为链终止试剂（双脱氧核苷酸在脱氧核糖上没有聚合酶延伸链所需要的3－OH基团，所以可被用作链终止试剂）通过聚合酶的引物延伸产生一系列大小不同的分子后再进行分离的方法。测序引物与单链DNA模板分子结合后，DNA聚合酶用dNTP延伸引物。延伸反应分四组进行，每一组分别用四种ddNTP（双脱氧核苷酸）中的一种来进行终止，再用PAGE分析四组样品。从得到的PAGE胶上可以读出我们需要的序列。 第二代测序技术-大规模平行测序 大规模平行测序平台（massively parallel DNA sequencing platform）的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一，还让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的“特权”能够被众多研究人员分享。新一代DNA测序技术有助于人们以更低廉的价格，更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质之间交互作用组的各项数据。市面上出现了很多新一代测序仪产品，例如美国Roche Applied Science公司的454基因组测序仪、美国Illumina公司和英国Solexa

technology公司合作开发的Illumina测序仪、美国Applied Biosystems公司的SOLiD测序仪。Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成边测序。在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。以Illumina测序仪说明二代测序的一般流程，（1）文库制备，将DNA用雾化或超声波随机片段化成几百碱基或更短的小片段。用聚合酶和外切核酸酶把DNA片段切成平末端，紧接着磷酸化并增加一个核苷酸黏性末端。然后将Illumina测序接头与片段连接。（2）簇的创建，将模板分子加入芯片用于产生克隆簇和测序循环。芯片有8个纵向泳道的硅基片。每个泳道内芯片表面有无数的被固定的单链接头。上述步骤得到的带接头的DNA 片段变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构，以供后续的预扩增使用。通过不断循环获得上百万条成簇分布的双链待测片段。（3）测序，分三步：DNA 聚合酶结合荧光可逆终止子，荧光标记簇成像，在下一个循环开始前将结合的核苷酸剪切并分解。（4）数据分析 第三代测序技术-高通量、单分子测序 被称为第三代的测序的He-licos单分子测序仪，PacificBioscience的SMRT技术和 Oxford Nanopore Technologies 公司正在研究的纳米孔单分子测序技术正向着高通量低成本长读取长度的方向发展。不同于第二代测序依赖于DNA模板

picbio 三代测序原理

三代测序之PacBio SMRT技术全解析2017-05-11 11:29 来源:基因谷技术 气温回升，天气渐暖， 花儿开了一簇又一簇~ 在这美好的季节里， 我们准备聊点新话题。 今天小编要来和你分享： PacBio SMRT测序那些事儿~

测序技术在近几年中又有里程碑的发展，Pacific Biosciences公司成功推出商业化的第三代测序仪平台，让三代测序正式走入我们的视线。与前两代相比，第三代测序有什么不同呢？今天小编带大家详细了解测序界新宠-PacBio SMRT测序平台。 PacBio SMRT测序原理 Pacific Biosciences公司研发的单分子实时测序系统（Single Molecule Real Time，SMRT）应用了边合成边测序的原理，并以SMRT芯片为测序载体。基本原理如下： 聚合酶捕获文库DNA序列，锚定在零模波导孔底部 4种不同荧光标记的dNTP随机进入零模波导孔底部 荧光dNTP被激光照射，发出荧光，检测荧光 荧光dNTP与DNA模板的碱基匹配，在酶的作用下合成一个碱基 统计荧光信号存在时间长短，区分匹配碱基与游离碱基，获得DNA序列 酶反应过程中，一方面使链延伸，另一方面使dNTP上的荧光基团脱落 聚合反应持续进行，测序同时持续进行 PacBio SMRT测序原理 PacBio SMRT的单分子测序和超长读长是如何实现的？我们重点看一下该技术的两点关键创新：分别是零模波导孔（zero-mode waveguides, ZMWs）和荧光标记在核苷酸焦磷酸链上（Phospholinked nucleotides）。

高通量测序：第二代测序技术详细介绍

在过去几年里，新一代DNA 测序技术平台在那些大型测序实验室中迅猛发展，各种新技术犹如雨后春笋般涌现。之所以将它们称之为新一代测序技术（next-generation sequencing），是相对于传统Sanger 测序而言的。Sanger 测序法一直以来因可靠、准确，可以产生长的读长而被广泛应用，但是它的致命缺陷是相当慢。十三年，一个人类基因组，这显然不是理想的速度，我们需要更高通量的测序平台。此时，新一代测序技术应运而生，它们利用大量并行处理的能力读取多个短DNA 片段，然后拼接成一幅完整的图画。 Sanger 测序大家都比较了解，是先将基因组DNA 片断化，然后克隆到质粒载体上，再转化大肠杆菌。对于每个测序反应，挑出单克隆，并纯化质粒DNA。每个循环测序反应产生以ddNTP 终止的，荧光标记的产物梯度，在测序仪的96或384 毛细管中进行高分辨率的电泳分离。当不同分子量的荧光标记片断通过检测器时，四通道发射光谱就构成了测序轨迹。 在新一代测序技术中，片断化的基因组DNA 两侧连上接头，随后运用不同的步骤来产生几百万个空间固定的PCR 克隆阵列（polony）。每个克隆由单个文库片段的多个拷贝组成。之后进行引物杂交和酶延伸反应。由于所有的克隆都是系在同一平面上，这些反应就能够大规模平行进行。同样地，每个延伸所掺入的荧光标记的成像检测也能同时进行，来获取测序数据。酶拷问和成像的持续反复构成了相邻的测序阅读片段。

Solexa高通量测序原理 --采用大规模并行合成测序法(SBS,Sequencing-By-Synthesis)和可逆性末端终结技术（ReversibleTerminatorChemistry） --可减少因二级结构造成的一段区域的缺失。 --具有高精确度、高通量、高灵敏度和低成本等突出优势 --可以同时完成传统基因组学研究（测序和注释）以及功能基因组学（基因表达及调控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究 ----将接头连接到片段上，经PCR扩增后制成Library。 ----随后在含有接头（单链引物）的芯片（flowcell）上将已加入接头的DNA片段变成单链后通过与单链引物互补配对绑定在芯片上，另一端和附近的另外一个引物互补也被固定，形成“桥” ----经30伦扩增反应，形成单克隆DNA簇 ----边合成边测序（Sequencing By Synthesis）的原理，加入改造过的DNA 聚合酶和带有4 种荧光标记的dNTP。这些dNTP是“可逆终止子”，其3’羟基末端带有可化学切割的基团，使得每个循环只能掺入单个碱基。此时，用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类。之后，将这些基团化学切割，恢复3'端粘性，继续聚合第二个核苷酸。如此继续下去，直到每条模板序列都完全被聚合为双链。这样，统计每轮收集到的荧光信号结果，就可以得知每个模板DNA 片段的序列。目前的配对末端读长可达到2×50 bp，更长的读长也能实现，但错误率会增高。读长会受到多个引起信号衰减的因素所影响，如荧光标记的不完全切割。 Roche 454 测序技术 “一个片段= 一个磁珠= 一条读长（One fragment =One bead = One read）”

基因测序的前世今生(一代测序,二代测序,三代测序最详原理)

测序技术的前世今生 测序技术的发展历程 第一代测序技术（Sanger测序） 第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）,在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础。 原理：ddNTP的3’无羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP （分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。

第二代测序技术(NGS) 第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。经过不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa、Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。其大大降低了测序成本的同时，还大幅提高了测序速度，并且保持了高准确性，以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1周，但在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多，大多只有100bp-150bp。 1.illumina Illumina公司的Solexa和Hiseq是目前全球使用量最大的第二代测序机器，占全球75%以上，以HiSeq系列为主，技术核心原理都是边合成边测序的方法，测序过程主要分为以下4步：

分子机制-核酸检测-二代DNA测序技术

主题：第二代DNA测序技术 概述： 第一代测序（缺点：通量低1000个核苷酸/反应，费用高） ?化学降解法 ?双脱氧链终止法（Sanger法） ?荧光自动测序技术 ?杂交测序技术 高通量测序： 第二代测序（next-generation sequencing，NGS） 第二代测序技术的核心思想是边合成边测序(Sequencing by Synthesis)，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列，现有的技术平台主要包括Roche/454FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID system。这三个技术平台各有优点，454FLX的测序片段比较长，高质量的读长(read)能达到400bp；Solexa测序性价比最高，不仅机器的售价比其他两种低，而且运行成本也低，在数据量相同的情况下，成本只有454测序的1/10；SOLID测序的准确度高，原始碱基数据的准确度大于99.94%，而在15X覆盖率时的准确度可以达到99.999%，是目前第二代测序技术中准确度最高的。虽然第二代测序技术的工作一般都由专业的商业公司来完成，但是了解测序原理、操作流程等会对后续的数据分析有很重要的作用，下文将以Illumina/Solexa Genome Analyzer测序为例，简述第二代测序技术的基本原理、操作流程等方面。 原理： Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成边测序。在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。 Illumina Solexa测序仪特点：

三代测序原理技术比较

导从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）1,发展至今三十多年时间，测导序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从读长到短，再从短到长。 摘要：从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）1，发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到 长。虽然就当前形势看来第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势 位置，但第三和第四代测序技术也已在这一两年的时间中快速发展着。测序技术的每一次变 革，也都对基因组研究，疾病医疗研究，药物研发，育种等领域产生巨大的推动作用。在 这里我主要对当前的测序技术以及它们的测序原理做一个简单的小结。 图1 :测序技术的发展历程 生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研究有着十分重要的意义。以上（图1）所描述的是自沃森和克里克在1953年建立DNA双螺旋结构以来，整个测序技术的发展历程。 第一代测序技术 第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson ）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam和吉尔伯特（Gilbert ）发明的化学法（链降解）?并在1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌体X174的，全长5375个碱 基1。自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。 研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。在2001年，完成的首个人类基 因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础，Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2' 和3'都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA 合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列（图2）。这个网址为san ger测序法制作了一个小短片，形象而生动。 值得注意的是，就在测序技术起步发展的这一时期中，除了San ger法之外还出现了一 些其他的测序技术，如焦磷酸测序法、链接酶法等。其中，焦磷酸测序法是后来Roche公司454技术所使用的测序方法2 - 4,而连接酶测序法是后来ABI公司SOLID技术使用的测序方 法2,4，但他们的共同核心手段都是利用了Sanger1中的可中断DNA合成反应的dNTP 图2: Sanger法测序原理

二代测序流程

Illumina测序的化学原理 目前我们接触到的很多生物信息学的技术，都是基于NGS技术的，比如RNA-Seq，ChIP-Seq，FAIRE-Seq，ChIA-PET，Hi-C等等。所谓的NGS就是Next Generation Sequencing，翻译为“下一代测序技术”，或者是“第二代测序技术”。之所以这么叫，是因为相比较于第一代测序技术其测序通量有了很大的提升 一些常用的基本概念介绍： flowcell：是指Illumina测序时，测序反应发生的位置，1个flowcell含有8条lane lane：每一个flowcell上都有8条泳道，用于测序反应，可以添加试剂，洗脱等等tail：每一次测序荧光扫描的最小单位 reads：指测序的结果，1条序列一般称为1条reads bp：base pair 碱基对，用于衡量序列长度 双端测序：是指一条序列可能比较长，如500bp，我们可以两端各测150bp junction：在进行双端测序时，中间会留有200bp测不到的东西，我们称其为junction adapter：就是在测序时需要的一段特定的序列，有类似于引物的功能 primer：PCR中的引物 测序反应基本流程介绍： 1、建库 A、将基因组DNA用超声波打断（由于Illumina测序策略本身的问题，导致其测序长度不可能太长，目前最好的X Ten测序仪也就只能双端各测150bp，所以不可能直接拿整个基因组去测序，因此在测序的时候就需要先将其打断成一定长度的片段，这个根据需要使用不同的策略，一般测人的基因组，我们是先将其打断成300-500bp长度的片段，这个是根据跑胶控制的） B、打断以后会出现末端不平整的情况，用酶补平，所以现在的序列是平末端 C、完成补平以后，在3'端使用酶加上一个特异的碱基A D、加上A之后就可以利用互补配对的原则，添加adapter，这个adpater可以分成两个部分，一部分是测序的时候需要使用的引物序列，另一部分是建库扩增时候需要用到的引物序列 E、进行PCR扩增，使得DNA样品浓度能够满足上机要求 建库示意图如下：

第三代基因测序技术比较与总结

第三代基因测序技术比较与总结 [摘要]在第二代测序技术的协助下，个人基因组图谱正在如火如荼地绘制中。 在第二代测序技术的协助下，个人基因组图谱正在如火如荼地绘制中。但第二代测序技术很快就遇上了强劲的对手——第三代测序技术，也被称为“下、下一代的测序(next-next-generation sequencing)”。第三代测序技术是基于纳米孔(nanopore)的单分子读取技术，有着更快的数据读取速度，应用潜能也势必超越测序。 2012年2月5日，基因组科学家们齐聚美国佛罗里达州的基因组生物和技术进展会议，来了解哪家公司的第三代测序技术能实现人类基因组的3分钟测序或以5000美元的价格出售。尽管科学家们对公布的数据表示谨慎乐观，但他们对于此类测序仪的优越之处仍心存疑虑。 Complete Genomics 在2008年10月，美国加利福尼亚州的Complete Genomics公司曾宣称他们将在2009年以5000美元的价格售卖人类基因组，但当时没有公布支持数据。在这次会议上，该公司公布了一个人类基因组，据称是用9台仪器在8天内完成的。 该公司的CEO，Clifford Reid表示，他们将254GB的数据拼接成草图，覆盖某个匿名男性基因组的92%，每个碱基平均读取了91次。与目前应用中的高速测序，即第二代测序类似，Complete Genomics也产生短的DNA读长。通过对每个碱基的多次测序，它的目标是排除悄悄混入的可能错误。Reid认为这项技术非常准确，碱基错误的概率低于0.33%。这与目前的测序仪相当。 Complete Genomics并不出售测序仪，但用自己的测序仪来完成所有的内部工作。这让某些科学家质疑，但另一些却深受鼓舞。 速度和费用成为Complete Genomics的最大卖点。该公司并没有透露基因组测序的确切费用，但据称每个基因组的原材料费用低至1000美元。它的目标是在上个月推出市场，今年对1000个基因组进行测序，明年测序数量达到20000个。 Pacific Biosciences 在Complete Genomics做报告前的一小时，Pacific Biosciences的首席技术官Stephen Turner展示了大肠杆菌的完整基因组，并称每个碱基的平均读取了38次，准确率大于99.9999%。 Pacific Biosciences利用了单分子技术和DNA聚合酶，在反应的同时读取测序产物。尽管目前仪器的读取速度仅为3 碱基/秒，但它的目标是在2013年前实现三分钟读完人类基因组。它还有望实现更长的读长。Tuner表示大肠杆菌

第二代测序技术检测试剂质量评价通用技术指导原则

第二代测序技术检测试剂质量评价通用技术指导原则 一、前言 本指导原则主要针对第二代测序（next generation sequencing，NGS）技术检测试剂（以下简称“NGS检测试剂”）产品质量提出指导性要求，涉及基本原则、主要原材料、检测流程及性能评价等方面。 本指导原则是对企业和检验人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制订的，随着法规和标准的不断完善、科学技术的不断发展，其相关内容也将进行适时的调整。 二、适用范围 本指导原则适用于基于NGS技术的检测试剂的质量评价。NGS检测试剂的预期用途包括但不限于以下内容：肿瘤相关基因异常、遗传疾病相关基因异常、胚胎植入前染色体非整倍体、胎儿染色体非整倍体及病原微生物等临床检测应用。此类检测试剂涉及的NGS技术包括靶向性测序和非靶向性测序：靶向性测序法是指对样本中的基因组进行部分测序，如靶基因测序、外显子（组）测序等；非靶向性测序是指对样本中潜在生物体的基因组进行测序。原则上不建议企业应用全基因组测序进行检测，如果企业应用全基因组测序技术，应进行充分的技术适用性验证并提交报告。 待测样本可以是人源样本（如体液、组织、排泄物等）或病原微生物分离培养物（如血培养物、痰培养物等），检测对象可以是脱氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）或两者的混合物。

本指导原则尽可能覆盖所有的NGS技术原理和测序平台，所讨论和描述的内容不限于某个特定的NGS检测试剂。但鉴于NGS技术一直在不断升级和更新，可能会有本指导原则未能涉及的新技术。 三、基本要求 （一）基本原则 1.NGS检测试剂的生产企业应获得《医疗器械生产许可证》。研制、生产用的各种原料、辅料等应制定其相应的质量标准，并应符合有关法规的要求。 2.试剂生产企业生产质量管理体系应符合《医疗器械生产质量管理规范》及《医疗器械生产质量管理规范附录体外诊断试剂》的要求，并应通过《医疗器械生产质量管理规范体外诊断试剂现场检查指导原则》的核查。 3.试剂生产企业应具有与其技术要求相适应的人员、厂房、设施和仪器设备以及适宜的生产环境。建立专用实验室，实验室应当严格分区，人员和物品应当单向流动，以最大限度地防止实验过程中样本之间的污染和避免扩增产物的污染。生产用于病原微生物核酸检测的生产企业应建立符合生物安全要求的设施和措施。 （二）主要原材料 NGS检测试剂的主要原材料包括实验原材料和数据分析原材料。实验原材料包括引物、探针、酶、参考品或标准品等，企业应提供尽量完整的研究资料，如选择与来源、制备过程、质量分析和质量标准等；数据分析原材料包括数据库（参考序列）、生物信息学分析软件及数据储存中心等。数据分析原材料能影响检测结果，企业应提供尽量完整的研究资料，如数据库（参考序列）的溯源性、生物信息学分析软件的算法以及数据储存中心的安全性与稳定性等。 对于实验原材料，若企业自己生产，其生产工艺必须相对稳定；若来自市场（从其他单位购买），应提供的资料包括：对供应商审核的相关资料、购买合同、供货方提供的质量标准、出厂检定报告，以及该原材料到货后的质量检验资料。原材料或