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硫酸软骨素注射液细菌内毒素检查方法研究

硫酸软骨素注射液细菌内毒素检查方法研究

嵇 扬,高 锦,王文俊,胡 丹,沈 娟,聂渝琼

(总后勤部卫生部药品仪器检验所药理室,北京 100071)

摘 要:目的 建立检查硫酸软骨素注射液细菌内毒素的方法。方法 用中国药典2005年版附录细菌内毒素检查法。结果 硫酸软骨素注射液浓度0.025 mg/mL ,用灵敏度0.125 EU/mL 的鲎试剂检测细菌内毒素无干扰因素的影响。结论 硫酸软骨素注射液可用鲎试剂检查细菌内毒素。

关键词:硫酸软骨素注射液;细菌内毒素;干扰试验

中图分类号:Q538 文献标识码:A 文章编号:1672-979X(2009)09-0034-04

收稿日期:2008-11-24

作者简介:嵇扬(1957-),女,江苏阜宁人,主任药师,硕士生导师,研究方向为药检药理 E-mail: jiyang0809@http://www.wendangku.net/doc/0f15583391.html,

Study on Bacterial Endotoxin Test for Chondroitin Sulfate Injection

JI Y ang, Gao Jin, W ang W en-jun, HU Dan, Shen Juan, Nie Y u-qiong

(Institute for Drug and Instrument Control of Health Department, GLD of PLA, Beijing 100071, China )

Abstract: Objective To establish a detection method for bacterial endotoxin in Chondroitin Sulfate Injection. Methods The bacterial endotoxin test in the appendix of Chinese Pharmacopoeia (2005 edition) was adopted. Results The maximum noninterference concentration was 0.025mg ?mL -1 and the sensitivity of TAL was 0.125 Eu.mL -1. Conclusion The bacterial endotoxin test is suitable for Chondroitin Sulfate Injection by TAL.Key Words: chondroitin sulfate injection; bacterial endotoxin; interference test

硫酸软骨素广泛存在于人和动物的软骨组织中。硫酸软骨素注射液主要含有硫酸软骨素A 和C 两种异构体,用于辅助治疗神经性头痛、神经痛、关节痛、动脉硬化等疾病。临床用肌内注射方法给药。由于其原质量标准未设立热原或细菌内毒素检查项[1],为保证用药安全有效,本实验依据中国药典2005年版附录细菌内毒素检查法[2],研究建立硫酸软骨素注射液细菌内毒素的检查法。1 药物和试剂

见表1,表2。

表1 硫酸软骨素注射液(2 mL:40 mg )

表2 鲎试剂(0.1 mL )

细菌内毒素工作标准品(中国药品生物制品检定所,2003-3,150 EU/支);细菌内毒素检查用水(中国药品生物制品检定所,10 mL , 2005120)。 2 方法和结果

2.1 细菌内毒素限值(L )的确定

本品说明书规定硫酸软骨素注射液用法用量为:肌内注射,1~2次/d ,2 mL/次。

根据公式:L=K/M ,M 为40 mg ?(60 kg)-1 ?h -1,K 为5 EU ?kg -1?h -1。限值L =7.5 EU/mg ,考虑可能联合用

厂家批号常州千红生化制药060107 A

镇江恒新药业060104 B1 060512 B2 060703 B3湖南康普制药061203 C1 070101 C2 070102 C3

郑州羚锐制药0507152 D 开封康诺药业050601 E 衡阳恒生制药20061102 F 吉林恒和维康药业

20050901 G

厂家批号灵敏度/EU?mL -1

湛江安度斯生物06122910.25湛江安度斯生物05120720.25湛江博康海洋生物06022400.25厦门鲎试剂0510330.25福州新北生化061201130.25福州新北生化070204120.125湛江安度斯生物

0410270

0.125

药,最终确定限值为L=5 EU/mg。

2.2 鲎试剂灵敏度复核实验

按照中国药典细菌内毒素检查法,7批鲎试剂λc/ λ均在0.5~2.0之间,灵敏度复核结果均符合规定。

2.3 干扰试验预实验

2.3.1硫酸软骨素注射液有效稀释浓度(MVC)的计算公式MVC=λ/L,L为硫酸软骨素注射液的细菌内毒素限值5 EU/mg,λ为鲎试剂标示灵敏度,目前市售鲎试剂灵敏度λ通常为0.5~0.03 EU/mL ,硫酸软骨素注射液的对应有效稀释浓度则为:0.1,0.05,0.025,0.012,0.006 mg/mL。

2.3.2 实验操作将硫酸软骨素注射液用细菌内毒

药物批号鲎试剂批号

药物浓度/mg?mL-1

阴性阳性20105 2.5 1.250.6250.312 5

060104(B1)0512072NPC- -- -- -- -- -- -- -

- -++ PPC++++++++++++++

060107(A)0512072NPC- -- -- -- -- -- -- -

- -++ PPC++++++++++++++

素检查用水稀释为20,10,5,2.5,1.25,0.625,

0.312 5,0.156,0.078 mg/mL,将10,5,2.5,1.25,

0.625,0.312 5,0.156,0.078系列浓度溶液记为

NPC。同时在20,10,5,2.5,1.25,0.625,0.312 5,

0.156 mg/mL溶液中加入细菌内毒素标准溶液,使每

一浓度的试验液均含有2 λ浓度的细菌内毒素,此系

列溶液记为PPC。

取灵敏度0.25 EU/mL鲎试剂,分别与PPC和NPC

反应,每一浓度重复2管,并设阳性对照(PC)和阴

性对照(NC)。结果见表3,表4。

表3表明,湛江安度斯生物公司生产的鲎试剂

(0512072)对硫酸软骨素细菌内毒素的实验结果在

20 mg/mL及以下浓度时均无抑制干扰。

药物批号鲎试剂批号

药物浓度/mg?mL-1

阴性阳性0.50.050.0250.005

060107(A)06120113NPC- -- -- -- -

- -++ PPC- -+-++++

060104(B1)NPC- -- -- -- -

- -++ PPC- -- -++++

070102 (C3)NPC- -- -- -- -

- -++ PPC- -++++++

0507152(D) NPC- -- -- -- -

- -++ PPC- -+-++++

050601(E)NPC- -- -- -- -

- -++ PPC- -+-++++

20061102(F)NPC- -- -- -- -

- -++ PPC- -- -++++

20050901(G)

NPC- -- -- -- -

- -++ PPC- -+-++++

表3 硫酸软骨素注射液干扰预试验

表4 硫酸软骨素注射液干扰预试验

表4表明,福州新北生化公司所生产鲎试剂(06120113)对硫酸软骨素细菌内毒素的实验结果有差异,在0.025 mg/mL 及以下浓度时无抑制干扰。2.4 正式干扰试验

为了最终确认有无抑制因素的影响,进行正式干

鲎试剂

样品内毒素浓度/EU?mL -1

阴性Es/EU?mL -1

Et/EU?mL -1

0.50.250.1250.060.03

0602240水溶液++++++++++++------0.125

060104++++++++++++------0.125051033

水溶液++++++++++++------0.125

060104

++++

++++

++++

------0.125

扰试验。分别用细菌内毒素检查用水稀释硫酸软骨素注射液,使最终干扰试验浓度为0.15 或0.025 mg/mL ,选择0.125 或0.25 EU/mL 灵敏度的鲎试剂,按中国药典2005年版二部附录中的细菌内毒素检查供试品干扰试验项进行实验,结果见表5,表6。

表5 硫酸软骨素注射液的干扰试验(0.15 mg ?mL -1)

表6 硫酸软骨素注射液的干扰试验(0.025 mg ?mL -1)

Es :细菌内毒素检查用水制成的细菌内毒素标准溶液反应终点浓度的几何平均值;Et :供试品溶液或其稀释液制成的细菌内毒素溶液反应终点浓度的几何平均值

鲎试剂样品内毒素浓度/EU?mL -1

阴性Es/EU?mL -1

Et/EU?mL -1

0.50.250.1250.060.0307020412

水溶液++++++++++++----------0.125

060104++++++++++++--------0.12520061102++++++++++++--------0.12520050901++++++++++++++++----0.060507152

++++

++++

++++

++++

----0.06表5结果表明,硫酸软骨素注射液浓度0.15 mg/mL 时,使用博康海洋鲎试剂(0602240)与厦门鲎试剂(051033),Es/Et 均在0.5~2.0范围内,确认无干扰影响;表6结果表明,硫酸软骨素注射液浓度0.025mg/mL 时,福州新北鲎试剂(07020412)的Es/Et 均在0.5~2.0范围内,确认无干扰影响。2.5 样品细菌内毒素检查

按中国药典细菌内毒素检查法,使用湛江博康海洋生物和安度斯生物的鲎试剂对样品(0.15 mg/mL )进行细菌内毒素检查,并同时设样品的自身阳性对照,结果均符合规定;使用福州新北生化的鲎试剂对样品(0.025 mg/mL )进行细菌内毒素检查,并同时设立样品的自身阳性对照,结果均符合规定。见表7,表8,表9。

厂家样品批号NPC PPC PC NC 镇江恒新60104--++++--镇江恒新60512--++++--常州千红60107--++++--衡阳恒生20061102--++++--湖南康普70101--++++--湖南康普61203--++++--郑州羚锐

507152

--++

++

--

表7 硫酸软骨素注射液细菌内毒素检查

(0.15 mg ?mL -1 )

(湛江博康海洋生物公司鲎试剂 批号0602240 ,

λ 0.25EU ?mL -1 )

表8 硫酸软骨素注射液细菌内毒素检查

(0.15 mg?mL-1)

(湛江安度斯生物公司鲎试剂批号0612291 ,

λ 0.25 EU?mL-1)

表9 硫酸软骨素注射液细菌内毒素检查

(0.025 mg?mL-1)

(福州新北生化工业公司鲎试剂批号07020412 ,

λ 0.125 EU?mL-1)

3 讨论

为确保临床用药安全有效,国家药典委员会计划进一步提高注射剂的质量标准。我们承担了提高硫酸软骨素注射液质量标准的研究任务。硫酸软骨素注射液质量标准中未设细菌内毒素检查项。我们选择灵敏度0.25 EU/mL的安度斯与新北鲎试剂对硫酸软骨素注射液进行干扰预试验,结果显示,20 mg/mL硫酸软骨素注射液不干扰细菌内毒素检查。以0.15 mg/mL硫酸软骨素注射液进行正式干扰试验,结果表明,Es/ Et均在0.5~2.0范围,表明确无干扰影响。我们选择灵敏度0.25 EU/mL福州新北的鲎试剂对硫酸软骨素注射液检查细菌内毒素时,对应有效稀释浓度(0.05 mg/mL)的硫酸软骨素注射液表现不同程度的抑制作用,干扰细菌内毒素检查。我们选择福州新北灵敏度为0.125 EU/mL的鲎试剂,将硫酸软骨素注射液稀释为对应有效稀释浓度0.025 mg?mL-1,进行正式干扰试验,结果显示,Es/Et均在0.5~2.0范围,表明确无干扰影响。本实验表明,硫酸软骨素注射液适用于细菌内毒素检查,但需将样品稀释至0.025 mg/mL,选择0.125 EU/mL灵敏度的鲎试剂。我们建议,硫酸软骨素注射液质量标准中细菌内毒素检查项内应写明:取本品制成0.025 mg/mL,依法检查,每1 mg含内毒素应小于5 EU。

参考文献

[1] 国家食品药品监督管理局. 国家药品标准[S]. 第9册 WS-10001-

(HD-0893)-2002 :296.

[2] 国家药典委员会. 中国药典2005年版(二部)[S]. 北京:化学

工业出版社,附录XIE。

厂家批号NPC PPC PC NC

镇江恒新60703--++++--

开封康诺50601--++++--

湖南康普70102--++++--

生产厂家样品批号NPC PPC PC NC

镇江恒新60703--++++--

开封康诺50601--++++--

湖南康普70102--++++--

本刊采用“中华人民共和国法定计量单位”,如:物质的量浓度c(M r或A r已准确测得时)及其单位mol/L,mmol/L,μmol/L等;或质量浓度ρ(混合物或M r、A r未准确测得时)及其单位g/L,mg/L,μg/L等。

组合单位符号中的斜线只限 1条,如 mg/kg/d应改为 mg/(kg ? d)。单位与数值之间均空1/4字。参考文献所用计量单位,在引用时可不修改。

文中表述尽量使用国际代号和缩写,如:3 d,4 h,5 min,6 s,100 IU(国际单位); r/min(转速),P(概率),n(样本数)等。国际代号不能用于无数字的文句中,如每天不应写作每d。非公知缩写在文中首次出现时应注明中(英)文名称。

只在必要时使用图和表。图应清晰。表采用“三线式”。图和表均应有序号和题名。图表中量和单位采用量/单位的形式,如:λ/nm;l/m;t/d。。

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