高效聚磷菌的筛选

磷矿废水中高效聚磷菌的筛选

近年来我国水体富营养化越来越严重，水体受到污染不仅破坏了环境与动植物的生存也影响了人们的生活和人们的工农业发展。而水体富营养化都与水中的磷含量剧增有关，所以除去水中的磷对治理水体富营养化特别重要，这也是个社会非常关注的问题。我校的南湖水体污染特别严重是我校的美中不足。

关键词：生物去磷聚磷菌筛选环境污染污水处理

目前城市污水处理主要使用生物除磷，它是利用聚磷菌一类的微生物从水中摄取磷，并将磷存于体内，在水低形成高磷的污泥，达到了去磷防水体富营养化的效果。聚磷菌是生物除磷的决定生物，而聚磷菌的工作受到环境的影响，如氧浓度，PH值，温度等，且不同的聚磷菌的聚磷能力不同，所以要想达到高去磷的效果就必须筛选出聚磷效率高的菌种

.实验材料与方法

1.1主要的的仪器设备

摇床，超净工作台，全自动高压灭菌锅，培养箱，电子天平，酸度计，离心机,可见分光光度计，培养皿20个，细菌过滤器，移液枪（100ul和1000ul），量筒（10ml和50ml各一个)，锥形瓶（150ml,250ml和500ml），草酸铵结晶紫，革兰氏碘液，95%的酒精，石碳酸复染红，显微镜，载玻片及盖玻片。

1.2主要的试剂

微生物分离纯化用的试剂均是国产分析纯，主要有牛肉膏，蛋白胨，琼脂，乙酸钠，磷酸氢二钾，硫酸镁，硫酸亚铁，氢氧化钠硫酸铵，钼酸钾，抗坏血酸，酒石酸锑钾，磷酸二氢钾，氢氧化钾过硫酸钾，MOPSHighPurityGrade,Tricine,X--Pi.

1.3样本采集

磷矿废水

1.4培养基及溶液

（1)YG培养液：酵母侵膏1g,葡萄糖1g，K2HPO4 0.3g KH2PO4 0.25g 七水硫酸镁0.2g, 蒸馏水1000ml.

（2)MOPS培养基:100ml的10*MOPS 8.370g, tricine 0.717g, 30ml的去离子水，10mol/L KOH调PH到7.4. 总体积44ml. 0.01mol/L, 硫酸亚铁1ml，按下列加：氯化铵（1.9mol/L)5ml, 硫酸钾（0.276mol/L)1ml,二水氯化钙0.02mol/L)0.025ml, 六水氯化镁（2.5mol/L)0.21ml, NaCl(5mol/L)10ml, 微量元素混合液0.02ml, 葡萄糖0.1g, )取25ml置于两个500ml的三角瓶中，向一个三角瓶加0.0087gK2HPO4，成为限磷培养基。另一个加0.1732gK2HPO4成为过磷培养基。两瓶分别加离子水后用细菌过滤器过滤分别装于灭菌的150ml三角瓶中。

（3)LB培养基：酵母清膏5g蛋白胨10g，氯化钠5g，水1000ml，pH7.0~~~7.2

实验方法

1.聚磷菌的筛选：

（1)聚磷菌的分离，纯化与保存。将水样充分摇匀后，用移液枪取0.5ml水样于4.5ml的无

菌水中，震荡混匀，依次制成0.1 ，0.01 0.001 .0001 .00001 不同浓度的菌液，从各菌液中取0.1ml加入YG平板中，涂布均匀，每个浓度三个重复，于28摄氏度条件下培养2天，挑出形态不同的菌落，在YG 平板上多次划线纯化，挑取单菌落转接到YG斜面上，于28摄氏度培养两天，4摄氏度冰箱保存。

（2）蓝白斑筛选;采用蓝白斑选法进行聚磷菌的初筛。方法为;将在YG平板上分离纯化的菌种到MOPS限磷，过磷平板中，28摄氏度培养2天，观察白斑生长情况。

菌体磷含量的测定：

将筛选好的菌种接在液体培养基的试管里30摄氏度过夜，取25ml加到250ml的锥形瓶中于30摄氏度在摇床中培养，不同时间段生长期测提菌体的含磷量及磷浓度。方法：

1.取不同生长期的50ml的菌液到离心管中，以12000 r /min 离心5min ,用无菌水溶解，再离心，重复3次的湿菌体，于105℃烘干测菌体干重。

2.将称重后的菌体无菌水溶解后再用过硫酸钾进行消解，按总磷测定方法测菌体磷含量。

3.上清液磷含量测量：在称干重时同时取第一次离心的上清液，取上清液按总磷的测定方法测磷浓度。记录培养液磷浓度随培养时间的变化。

2.革兰氏鉴定

1）涂片：在载玻片滴一滴水用接种环以无菌操作挑取上述筛选好的菌体于水滴中室温自然干燥

2）初染：草酸铵结晶紫染色液1到2分钟。倾取染液，自来水慢洗到玻片无色。

3）媒染：加一到两滴革兰氏碘液染1~~3分钟水洗。

4）脱水：酒精一到两滴30秒到1分钟，水洗。

5）复染：石碳酸复染红10到20秒，水洗。

6）镜检：待玻片干后先用低倍镜观察，再用油镜观察。

紫色为阳性，红色为阴性

实验结果与分析

高效聚磷菌的筛选

磷矿废水中高效聚磷菌的筛选 近年来我国水体富营养化越来越严重，水体受到污染不仅破坏了环境与动植物的生存也影响了人们的生活和人们的工农业发展。而水体富营养化都与水中的磷含量剧增有关，所以除去水中的磷对治理水体富营养化特别重要，这也是个社会非常关注的问题。我校的南湖水体污染特别严重是我校的美中不足。 关键词：生物去磷聚磷菌筛选环境污染污水处理 目前城市污水处理主要使用生物除磷，它是利用聚磷菌一类的微生物从水中摄取磷，并将磷存于体内，在水低形成高磷的污泥，达到了去磷防水体富营养化的效果。聚磷菌是生物除磷的决定生物，而聚磷菌的工作受到环境的影响，如氧浓度，PH值，温度等，且不同的聚磷菌的聚磷能力不同，所以要想达到高去磷的效果就必须筛选出聚磷效率高的菌种 .实验材料与方法 1.1主要的的仪器设备 摇床，超净工作台，全自动高压灭菌锅，培养箱，电子天平，酸度计，离心机,可见分光光度计，培养皿20个，细菌过滤器，移液枪（100ul和1000ul），量筒（10ml和50ml各一个)，锥形瓶（150ml,250ml和500ml），草酸铵结晶紫，革兰氏碘液，95%的酒精，石碳酸复染红，显微镜，载玻片及盖玻片。 1.2主要的试剂 微生物分离纯化用的试剂均是国产分析纯，主要有牛肉膏，蛋白胨，琼脂，乙酸钠，磷酸氢二钾，硫酸镁，硫酸亚铁，氢氧化钠硫酸铵，钼酸钾，抗坏血酸，酒石酸锑钾，磷酸二氢钾，氢氧化钾过硫酸钾，MOPSHighPurityGrade,Tricine,X--Pi. 1.3样本采集 磷矿废水 1.4培养基及溶液 （1)YG培养液：酵母侵膏1g,葡萄糖1g，K2HPO4 0.3g KH2PO4 0.25g 七水硫酸镁0.2g, 蒸馏水1000ml. （2)MOPS培养基:100ml的10*MOPS 8.370g, tricine 0.717g, 30ml的去离子水，10mol/L KOH调PH到7.4. 总体积44ml. 0.01mol/L, 硫酸亚铁1ml，按下列加：氯化铵（1.9mol/L)5ml, 硫酸钾（0.276mol/L)1ml,二水氯化钙0.02mol/L)0.025ml, 六水氯化镁（2.5mol/L)0.21ml, NaCl(5mol/L)10ml, 微量元素混合液0.02ml, 葡萄糖0.1g, )取25ml置于两个500ml的三角瓶中，向一个三角瓶加0.0087gK2HPO4，成为限磷培养基。另一个加0.1732gK2HPO4成为过磷培养基。两瓶分别加离子水后用细菌过滤器过滤分别装于灭菌的150ml三角瓶中。 （3)LB培养基：酵母清膏5g蛋白胨10g，氯化钠5g，水1000ml，pH7.0~~~7.2 实验方法 1.聚磷菌的筛选： （1)聚磷菌的分离，纯化与保存。将水样充分摇匀后，用移液枪取0.5ml水样于4.5ml的无

低碳源浓度条件下聚磷菌特性_林海

低碳源浓度条件下聚磷菌特性 林 海 李 萍 陈月芳 王 倩 侯瑞荣 张 艳 北京科技大学土木与环境工程学院,北京100083 摘 要 从北京城市排水集团高碑店污水处理厂二沉池回流污泥中分离获得两株高效聚磷菌株,确定出稀释倒平板分离技术更有利于聚磷微生物的筛选.经形态特征及生理生化实验初步鉴定为不动杆菌属(acinetobacter sp.).确定出A 、E 两菌的最优碳源选择分别为乙酸钠和谷氨酸钠;并在降低碳源质量浓度,即COD 小于100mg L -1的条件下进行最佳生长条件优化:A 、E 两菌的最适pH 值分别为8和7,最适温度分别为20 和25 ;金属镁、钾和锰离子对聚磷微生物具有积极促进作用.聚磷微生物呈现出较好的厌氧放磷、好氧摄磷的特性.关键词 聚磷菌(PAO );低碳源;筛选;生物除磷分类号 X 703 1 Characteristics of phosphorus accu mulating organisms at low carbon level L IN H ai,L I Ping,C H EN Y ue -f ang,W A N G Qian,H O U Rui -rong ,ZH A N G Yan S chool of Civil and Environmental Engineering,Universi ty of Science and Technology Beijing,Beijing 100083,China ABSTRAC T T wo efficient polyphosphate accumulating organisms,A and E,w ere screened from the returned sludge w hich comes from the final sedimentation tank in Beijing Gaobeidian Sewage T reatment Plant.At the same time,the reversing dilution plate sepa -ration t echnolog y w as identified to be beneficial to screening the polyphosphate accumulating organisms.Observations of their morpho -log ical,physiological and biochemical features indicate that they are acinetobacter sp.By exper iment,the optimal choices for car bon of the polyphosphate accumulating organisms A and E are CH 3COON a and C 5H 8NN aO 4,respectively.Exper imental data show the best g rowth condit ions of polyphosphate accumulating org anisms in reducing carbon concentrations,i.e.less than COD 100mg L -1:t he optimal pH v alues and temperatures of the polyphosphate accumulating org anisms A and E are 8and 7,20 and 25 ,respec -tiv ely.M etal ions M g 2+,K +and M n 2+can be helpful to accumulate polyphosphate.T he effect o f ox ygen on the phosphate accumu -lating microorganisms was discussed,and the character i stics o f P removal in anaerobic co ndition and P uptake in aerobic condition could be obser ved. KEY WORDS phosphor us accumulating organisms (PAO);low carbon sources;screening;biolog ical phosphorus r emoval 收稿日期:2008-07-04 基金项目:国家 十一五 科技支撑计划重大资助项目(No.2006BAC19B01)作者简介:林 海(1966 ),男,教授,博士生导师,E -mail:linhai@https://www.wendangku.net/doc/182526344.html, 目前磷是影响水体富营养化的重要因素,对污水中磷的质量浓度进行有效的控制处理是十分必要的[1-2].生物除磷法主要利用聚磷菌聚磷作用,相比化学除磷,具有运行费用低,减少二次污染,减少活性污泥膨胀现象,是目前大多数污水处理厂所采用的除磷方法[3]. 最早从活性污泥中分离出的是不动杆菌属[4],迄今为止分离出的聚磷菌为数不多.大部分污水处理厂在除磷工艺处理中由于碳源含量过低即COD 值较低,降低了聚磷微生物的除磷效率,并最终导致出水磷含量不达标.因此,本实验筛选高效聚磷微生物,并以磷为目标污染物,在降低碳源质量浓度的 条件下,对微生物的聚磷能力及生理生化特性进行 实验研究. 1 材料与方法 1 1 材料 (1)采样:北京城市排水集团高碑店污水处理厂二沉池回流污泥. (2)培养基:合成废水培养基[5],分离培养基采用牛肉膏蛋白胨基础培养基. 1 2 方法 (1)聚磷菌富集及分离纯化.通过连续培养的方式,不断增加培养液中磷的含量,淘汰聚磷效果差 第31卷第6期2009年6月北京科技大学学报 Journal of University of Science and Technology Beijing Vol.31No.6Jun.2009

聚磷菌的培养(借鉴材料)

聚磷菌的培养 背景：污水中的磷和氮含量过高是造成水体富营养化的主要因素。而其中的磷不像氮那样可以结合氧转化为气体，含磷的气态物质（PH3）又不易转化，所以污水除磷一直都用生物除磷法。即用细菌等微生物来摄取水中的磷，达到除磷的效果。而为了提高微生物除磷的效率、便于和其他材料协同使用，筛选、培养除磷细菌也是必不可少的工作。 培养菌种\菌落：聚磷菌（PAOs） 菌落来源：废水除磷工艺中的活性污泥 菌落组成：主要由β—2亚群紫色细菌、不动杆菌、红环菌属和绿单胞菌属组成；其中不动杆菌为主导细菌，除磷作用突出 聚磷菌除磷机理： ①好氧条件下，聚磷菌不断摄取并氧化分解有机物，产生的能量一部分用 于磷的吸收和聚磷的合成，一部分则使ADP与H3PO4结合，转化为ATP 而储存起来。细菌以聚磷的形式在细胞中储存磷，其量可以超过生长所 需，这一过程称为聚磷菌磷的摄取。处理过程中，通过从系统中排除高 磷污泥以达到除磷的目的。 ②在厌氧条件下，聚磷菌体内的ATP进行水解，放出H3PO4和能量，形成 ADP。这一过程称为聚磷菌磷的释放。 聚磷菌除磷则就是通过以上两种过程完成的。 培养过程： 1、材料准备 1.1取样： 从实验室运行稳定的厌氧\缺氧SBR反应器中，取富含反硝化聚磷菌的 活性污泥做为实验样品。 1.2培养基配方： ( 1 ) 牛肉膏蛋白胨培养基（L1-）：蛋白胨10 g；牛肉膏3 g；NaCl 5 g；琼 脂20 g ；p H 7.2 ，用于反硝化聚磷菌的分离、纯化 ( 2) 缺磷培养基（L1-）：CH3COONa 2g ；Na2HPO4·2H2O 23 mg； CaCL2·2H2O 11 mg；NH4C1 152.8mg；MgSO4·7H2O 81.12 mg； K2SO4 17.83 mg；HEPES缓冲液7 g；微量元素)1( 2 mL；p H 7.2

_大豆根瘤菌剂载体的选择及最佳施用浓度筛选

第33卷第2期2014年 4月 大豆科学SOYBEAN SCIENCE Vol．33No．2Apr． 2014 大豆根瘤菌剂载体的选择及最佳施用浓度筛选 刘庆莉1，王金生1，刘丽君1，林蔚刚1，王红蕾2，张俐俐3，吴俊江 1 （1．黑龙江省农业科学院大豆研究所，黑龙江哈尔滨150086；2．黑龙江省农业科学院信息中心，黑龙江哈尔滨150086；3．黑龙江省农业科学院，黑龙江哈尔滨150086） 摘要：为筛选出适宜根瘤菌吸附且能促进大豆生长、提高产量的优质载体，并且在优质载体的条件下，筛选出大豆 根瘤菌液的最佳使用浓度，通过3种载体吸附不同浓度根瘤菌液拌种大豆盆栽播种后，对大豆的生物量、结瘤及产量的对比发现：不同载体介入、大豆接入根瘤菌后均对大豆的生物量及结瘤产生一定的促进作用。根瘤菌以草炭和蛭石为载体，更有利于促使大豆植株生长，积累更多的干物质；草炭的促进结瘤作用持续效果时间较长，液体的持续效果时间最短，而蛭石的持续效果时间相对比较居中；以草炭和蛭石作为根瘤菌载体，低浓度的根瘤菌液接入更能发挥其提高产量的作用，以液体作为根瘤菌载体，根瘤菌接入浓度较高才能发挥其提高产量的作用。结合生产成本来看， 草炭土更适宜作为自主研发根瘤菌剂的载体，同时推荐根瘤菌使用浓度为1．4?108 菌细胞 ·mL －1。关键词：大豆根瘤菌；结瘤；载体 中图分类号：S565．1文献标识码：A 文章编号：1000- 9841（2014）02-0207-04收稿日期：2013-10-11基金项目：国家“十二五”科技支撑计划（2012BAD14B06）；现代农业产业技术体系（CAＲS-004）；黑龙江省自然科学基金（C201104）；哈尔滨市科技创新人才研究专项资金（2013ＲFXYJ043）。 第一作者简介：刘庆莉（1971-），女，技师，主要从事大豆耕作与栽培研究。E-mail ：liuqingli1971@126．com 。通讯作者：吴俊江（1970-），男，博士， 研究员，主要从事大豆耕作与栽培研究。E-mail ：nkywujj@163．com 。Chosen of Soybean Ｒhizobia Carrier and Screening of the Best Concentration LIU Qing-li 1，WANG Jin-sheng 1，LIU Li-jun 1，LIN Wei-gang 1，WANG Hong-lei 2，ZHANG Li-li 3，WU Jun-jiang 1 （1．Soybean Ｒesearch Institute ，Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences ，Harbin 150086，China ；2．Information Center of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences ，Harbin 150086，China ；3．Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences ，Harbin 150086，China ） Abstract ：In order to screen the carrier that was more appropriate for the absorption of rhizobia ，improving yield and quality of inoculated soybean ，and screen the best soybean rhizobia bacterial concentration at levels of quality carrier ，three carriers ab-sorbed different soybean rhizobia bacterial concentration with seed dressing were performed according to the biomass ，nodular rate and yields of soybean plant by soil pot experiments．The results showed that different carriers and inoculating soybean rhi-zobia could improve the biomass and nodular rate of soybean plant．Peat and vermiculite were used as carriers of rhizobia could remarkably promote the growth of soybean plant and enhance dry matter accumulation ；thus the lasting effect of nodular was the longest ，followed by vermiculite and liquid．Low level bacterial concentration could remarkably increased soybean yield and quality with peat and vermiculite as carriers ，however the opposite when used liquid as carriers．In conclusion ，in view of the cost ，peat was more appropriate for soybean rhizobia ，and the best bacterial concentration was 1．4?108 cells ·mL －1．Key words ：Soybean rhizobia ；Nodulation ；Carrier 施用根瘤菌菌剂能促进大豆结瘤， 有效提高豆科植物的产量，减少生产中的化肥使用量，降低生产成本，而且可以提高土壤肥力，同时，由于根瘤菌剂耐污染能力强［1］ ，还可以减少因长期使用化肥对 环境的破坏 ［2-3］ ，对无公害大豆生产以及降低农民 投人， 保护环境等具有十分重要的作用［4-5］ 。因此 引起了人们的极大兴趣和广泛关注，已成为豆科植 物增产的主要研究方向。 近年来随着新技术特别是分子生物学技术的发展，各种高效菌种不断被选育或改造，制备菌剂的工艺、保藏菌剂的方法也不断完善和发展，配制成的菌剂的效果越来越好，在农业生产中得到了广泛利用。与此同时，诸如发酵水平低、保质期短和 技术不成熟、质量不过关等问题限制了根瘤菌剂的产业化和大面积推广应用。其中，菌种质量的高低一直是影响其应用效果的一个突出问题；载体也是大豆根瘤菌肥料质量控制的一个关键因素 ［6］ 。作 为根瘤菌的载体很多， 如草炭、蛭石、珍珠岩、煤炭、草炭、膨润土和高岭土等。草炭、蛭石由于其营养与pH 适中，表面积比较大和吸附性好，有利于根瘤菌的存活及菌剂保存，是理想的载体 ［7-9］ 。另外，草 炭和蛭石等资源丰富，价格低廉，适合于在根瘤菌剂生产中应用推广，已成为当代根瘤菌类肥料的主要类型。 本文的研究目的是筛选出适宜根瘤菌吸附且接种大豆能促进大豆生长、提高产量的优质载体，

(推荐)植物病原菌的接种

实验五植物病原物的接种 一、实验目的 人工使病原物与寄主植物感病部位接触，创造条件使病原物侵入并诱致寄主发病叫接种，接种是证病过程的重要步骤，在研究寄生现象发病规律，测定品种抗病性，药剂防病效果时都需要接种。因此，接种是植病工作者必须掌握的基本技术环节。 植物病害人工接种方法，是根据病害的传染方式和侵染途径设计的，植物病害的种类很多、其传染方式和侵染途径各异。因此接种方法也不相同。本次实验以玉米大斑病，小麦根腐病，小麦秆锈病，梨褐腐病等为内容学习常用的接种方法。 二、内容、材料和方法 (一)拌土法(小麦根腐病) 拌土法适于土壤传染的病害，方法是将消毒的土壤分别装入两个小花盆中，其中一盆表层覆以一厘米厚的菌土，菌土是用玉米砂培养菌1份加消毒土5份混合而成，另一盆不接种(不覆菌土)作为对照。将经0.1%升汞表面消毒3分钟并用无菌水洗3次的小麦种子，分别播种在两个花盆内，插上标牌，注明接种日期，方法病害名称及接种人姓名，花盆放在室温下，浇水保湿，遮阴管理，待幼苗出土展开叶子后(大约一周)，观察并记载根腐病发生情况。 (二)喷雾法(玉米大斑病) 气流及雨水传播的病害常用此法接种，将培养好的玉米大斑病的斜面

菌种一支，用移植钩刮于装有100毫升无菌水的三角瓶中，用力振荡，待孢子洗下后，以纱布过滤，并于滤液中加入

0.1克中性肥皂，即成孢子菌丝悬液，用卫生喷雾器均匀喷布在麦苗上。同时设一不喷菌液而喷无菌水的作对照，用塑料罩保湿48小时，揭布后正常管理，7天后作发病调查。 (三)涂抹法(小麦秆锈病) 这也是气流传播的病害常用的接种方法，用于禾本科锈病接种。方法是用姆指沾锈菌夏孢子悬液自下向上轻轻涂欲接种的小麦叶片，也可先用手指沾水摩擦叶片，使叶表有一层水膜，然后将夏孢子粉抹在上面，以不涂抹孢子悬液或孢子粉的作为对照。塑料罩保湿48小时后揭布，正常管理，7天后作发病调查。 (四)创伤接种法(白菜软腐病及梨褐腐病) 创伤接种法是伤口侵入的弱寄生菌常用的接种方法。 1.白菜软腐病：取切成适当大小的白菜帮两块、经水洗，待水稍干后，以10%漂白粉溶液作表面消毒，分放在两个灭过菌的上下铺有吸水纸的培养皿中，用酒精擦过的玻璃棒顺着白菜帮打三排不穿透的孔穴。将培养好的白菜软腐病菌斜面菌种的菌苔以无菌水洗下作成菌悬液。然后，先以灭过菌的兽用注射器吸取无菌水滴于菜帮的第一排内孔作为对照，再用该注射器吸菌液滴于第二、三排孔内。注意无论无菌水、还是菌液都不要滴的过多。以免流出孔穴，另一培养皿的菜帮以同法处理作为重复。盖好皿盖，置于26—28℃的温箱中，24小时后检查发病情况。 2.梨褐腐病：取白梨以酒精火焰表面消毒后，用炽热的解剖刀，在其上切成小手指粗的孔穴3

反硝化聚磷菌同步解决脱氮除磷两大问题

反硝化聚磷菌同步解决脱氮除磷两大问题 01 反硝化除磷机理 反硝化除磷就是在厌氧 /缺氧环境交替运行的条件下，易富集一类兼有反硝化作用和除磷作用的兼性厌氧微生物，该聚磷菌能利用 NO3-作为电子受体，通过它们的代谢作用同时完成过量吸磷和反硝化过程。最大限度地减少碳源需求量，实现了能源和资源的双重节约。反硝化除磷能节省 COD 约 50%，节省氧约 30%，剩余污泥量减少 50%左右。 大量实验室和生产性规模的生物除磷脱氮研究也表明，当微生物依次经过厌氧、缺氧和好氧 3个阶段后，约占 50%的聚磷菌既能利用氧气又能利用NO3-作为电子受体来聚磷，即反硝化聚磷菌（DPB的除磷效果相当于总聚磷菌的 50%左右）。这些发现一方面说明了硝酸盐亦可作为某些微生物氧化PHB 的电子受体，另一方面也证实了在污水的生物除磷系统中的确存在着 DPB 属微生物，而且通过驯化可得到富集 DPB 的活性污泥。 02 反硝化除磷工艺 该技术对城市污水特别是 C/N 比较低的污水有很好的处理效果。目前满足 DPB 所需环境和基质的工艺有单双两级。在单级工艺中，DPB 细菌、硝化细菌及非聚磷异养菌同时存在于悬浮增长的混合液中，顺序经历厌氧／缺氧／好氧 3种环境，最具代表性的是 BCFS 工艺。在双级工艺中，硝化细菌独立于DPB 而单独存在于某一反应器中，Dephanox 工艺和A2N 工艺是最具代表性的双级工艺。

1、BCFS 工艺 BCFS 工艺是在 UCT 工艺及原理的基础上开发的。 其工艺流程如图 1。改进在于增加了 2个反应池，接触池与混合池；增加了 2个混合液循环 Q1和Q3 。 接触池的功能为：回流污泥和来自厌氧池的混合液在池中充分混合，吸附剩余 COD；有效防止污泥膨胀。 混和池的功能为：最大程度地保证污泥再生而不影响反硝化或除磷；容易控制 SVI；最大程度地利用 DPB 以获得最少的污泥产量。 混合液循环Q1 的功能是为了增加硝化或同时反硝化的机会，从而获得良好的出水氮浓度。Q3则是起辅助回流污泥向缺氧池补充硝酸盐氮的作用。 BCFS 将生物、化学除磷工艺合并，是在线磷分离与离线磷沉淀的生物与化学除磷结合方式，充分利用反硝化聚磷菌的反硝化除磷和脱氮双重作用，来实现磷的完全去除和氮的最佳去除过程。由于充分利用BCFS 工艺中的污泥龄易满足硝化细菌增长所需的生长条件，污泥产

利用不同的方法筛选和鉴定转化子

生物工程上游技术实验综合实验设计 利用不同的方法筛选和鉴定转化子 生命科学学院 生工121 指导老师: 田长恩、周玉萍 摘要 本次实验我们小组通过含Amp的培养基初步筛选出转化子、菌落直接PCR、摇菌培养观察细菌表达形态等一系列实验方法，从6个转化子中筛选出了2个目的重组子.，从而达到实

验的基本目的，基本掌握了转基因生物筛选鉴定的基本方法。 关键词 筛选、菌落直接PCR、摇菌培养、电泳 引言 在质粒载体上进行克隆时，由于重组质粒转化的大肠杆菌的量少，连接产物没有也不可能在经过分离纯化而获得纯的重组质粒，连接产物中混有载体自连而成的空载体、载体与目的片段连接而成的目的重组质粒和载体与非目的片段连接而成的非目的重组质粒。同时，宿主的转化效率极低，因此，绝大部分宿主是没有被转化的，所以很有必要对转化产物进行筛选与鉴定。首先，通过抗生素抗性从转化后代中筛选出转化子。然后，通过菌落直接PCR从转化子中筛选出候选转基因生物。最后，摇菌培养观察菌株表达形态。 通过抗生素抗性筛选，从转化后代中筛选出转化子。因为非转化菌没有质粒而缺乏相应的抗生素抗性，所以可将转化产物涂布在含有相应抗生素的培养基上筛选，只有含有相应抗性的抗生素抗性基因才能生长繁殖形成菌落。 通过菌落直接PCR从转化子中筛选出转基因生物，扩增出特殊目的基因片段，判断所得转化子是否为重组子。但因为PCR技术的高灵敏性，往往会产生假阳性结果，所以有必要进一步进行鉴定.。从候选重组子中进行摇菌培养关注菌株表达形态，若出现荧光蛋白则说明菌株成功转化并表达了GFP荧光蛋白。 三、使用仪器、材料 1、材料：实验九准备好的菌株。 2、实验仪器及设备:PCR仪、恒温摇床、台式高速离心机、恒温水浴锅、琼脂糖凝胶电泳装置、电热恒温培养箱、电泳仪、超净工作台、微量移液抢、1.5mL离心管等。 3、主要试剂：10×PCR buffer 、dNTP mixture 、前向引物(P1) 、反向引物r(P2) 、 rTaq 酶、灭菌蒸馏水、LB液体培养基： 四、实验步骤 1、转化子筛选：在实验九含有Amp的筛选培养基中长出的菌落中挑选出6个白色单菌 落，并做好标记，这6个单菌落即为转化子。 2、菌落直接PCR：用无菌牙签把6个白色单菌落，先在编好号的6支PCR反应管中的 底部分别涂擦，然后在PCR管中配制60μL反应体系.并按每管9μL分装好反应体系。反应体系如下: DNA template buffer （用牙签挑取菌落在PCR管中涂抹） 10×PCR buffer 6μL

聚磷菌

生物强化除磷中的聚磷菌利用比较普遍，目前也是生物除磷的主要研究方向，本文详细介绍聚磷菌的除磷原理及影响因素！ 一、除磷原理 聚磷菌也叫做摄磷菌、除磷菌，是传统活性污泥工艺中一类特殊的细菌，在好氧状态下能超量地将污水中的磷吸入体内，使体内的含磷量超过一般细菌体内的含磷量的数倍，这类细菌被广泛地用于生物除磷。 在厌氧条件下，除磷菌能分解体内的聚磷酸盐而产生ATP，并利用ATP将废水中的有机物摄入细胞内，以聚b-羟基丁酸等有机颗粒的形式贮存于细胞内，同时还将分解聚磷酸盐所产生的磷酸排出体外。而好氧条件下，除磷菌利用废水中的BOD5或体内贮存的聚b-羟基丁酸的氧化分解所释放的能量来摄取废水中的磷，一部分磷被用来合成ATP，另外绝大部分的磷则被合成为聚磷酸盐而贮存在细胞体内。 二、影响因素 生物除磷的影响因素包括：温度、pH值、厌氧池DO、厌氧池硝态氮、泥龄、RBCOD含量、糖原。 （1）温度 温度对除磷效果的影响不如对生物脱氮过程的影响那么明显，在一定温度范围内，温度变化不是十分大时，生物除磷都能成功运行。试验表明，生物除磷的温度宜大于10℃，因为聚磷菌在低温时生长速度会减慢。 （2）PH值 在pH在6.5一8.0时，聚磷微生物的含磷量和吸磷率保持稳定，当pH值低于6.5时，吸磷率急剧下降。当pH值突然降低，无论在好氧区还是厌氧区磷的浓度都急剧上升，pH降低的幅度越大释放量越大，这说明pH降低引起的磷释放不是聚磷菌本身对pH变化的生理生化反应，而是一种纯化学的“酸溶”效应，而且pH下降引起的厌氧释放量越大，则好氧吸磷能力越低，这说明pH下降引起的释放是破坏性的，无效的。pH升高时则出现磷的轻微吸收。

克隆的筛选和快速鉴定

实验六克隆的筛选和快速鉴定 一、目的 掌握快速细胞破碎法测定大小不等的众多的质粒DNA；和菌落PCR快速鉴定克隆。 二、原理 在这个实验方法中，只需配制一种细胞缓冲液（它可以在室温下保存，长期使用）。利用破碎细胞缓冲液中的阴离子去污剂SDS在37℃溶解膜蛋白，使细胞破裂，并解聚核蛋白，SDS还能与蛋白质结合形成复合物，使得蛋白质沉淀。利用EDTA螯合金属离子，防止破碎细胞的脱氧核糖核酸酶对DNA的降解。然后高速离心，去除细胞碎片核大部分的染色体DNA和RNA蛋白，将含有质粒DNA的上清夜直接进行点样电泳和分离。在琼脂糖凝胶上分离开的个组分中，有染色体DNA，不同大小的质粒DNA和RNA，它们都可以经肉眼观察或拍照显示。 或者用设计好的引物，做菌落PCR快速鉴定克隆。 三、试剂与仪器 （一）试剂 1．破碎细胞缓冲液50mmol/L Tris-HCl (pH6.8)、1% SDS、2mmol/L EDTA、400mmol/L 蔗糖和0.01%溴酚蓝。 配制方法：1mol/L Tris-HCl (pH6.8) 10ml 20% SDS 10ml 250mmol/L EDTA 1.6ml 蔗糖27.2g 1.2%溴酚蓝 1.67ml 加ddH2O至200ml 2．10mg/ml 溴乙啶 3．TBE电泳缓冲液（5×） 4．Taq DNA聚合酶(5U/μl) 5．10×反应缓冲液（含25mmol MgCl2） 6．dNTP 7．点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油。 （二）仪器 1．电泳仪2．1.5ml 离心管3．Tip 4．培养皿5．PCR扩增仪6．台式离心机 7．紫外分析仪8．恒温水浴 四、操作步骤 （一）快速细胞破碎法测定 1．取1.5ml离心管编号码，每管加入50μl破碎细胞缓冲液。 2 3．待转化的细菌菌落长到2mm时

根瘤菌及其应用

根瘤菌与豆科植物及其应用 摘要：自贝叶林克1888年首次从豆科植物根瘤中分离获得根瘤菌以来，国内外的许多学者都为揭开这一大自然的奥秘进行着孜孜不倦的研究，成为生命科学最为活跃的领域之一。人们从生物学，生态学，生理生化，分类和遗传等方面对根瘤菌进行了广泛研究，在根瘤菌和根瘤的形态结构，固氮酶的结构和功能，固氮机理和作用调件，根瘤菌在细菌分类学中的地位直到固氮基因，结瘤基因，固氮生态等应用方面都有着较快发展，20世纪90年代共生固氮体系已进入分子水平，研究转入根瘤菌与宿主豆目植物植物的相互识别和信息传递以及根瘤菌群体感应等方面。 关键词：根瘤菌生物固氮根瘤菌应用 一．根瘤菌的生物学特征 根瘤菌：根瘤菌主要指与豆类作物根部共生形成根瘤并能固氮的细菌，一般指根瘤菌属和慢生根瘤菌属；两属都属于根瘤菌目。根瘤菌侵入寄主根内，刺激根部皮层和中柱鞘的某些细胞，引起这些细胞的强烈和生长，使根的局部膨大形成根瘤；根瘤菌在根内定居，植物供给根瘤菌以矿物养料和能源，根瘤菌固定大气中游离氮气，为植物提供氮素养料，两者在拮抗寄生关系中处于均衡状态而表现共生现象。 根瘤菌的形态特征：根瘤菌是短杆状细菌，因生活环境和发育阶段的不同，在形态上有显著变化.根瘤菌在固体培养基上和土壤中呈杆状，端生或周生鞭毛能运动，革兰氏染色阴性，无芽孢，培养较久

菌体粗大，染色不均。 生存习性：根瘤菌与植物的共生体系具有很强的固氮能力。已知全世界豆科植物近两万种。根瘤菌是通过豆科植物根毛、侧根杈口(如花生)或其他部位侵入，形成侵入线，进到根的皮层，刺激宿主皮层细胞分裂，形成根瘤，根瘤菌从侵入线进到根瘤细胞，继续繁殖，根瘤中含有根瘤菌的细胞群构成含菌组织。 根瘤菌进入这些宿主细胞后被一层膜套包围，有些菌在膜套内能继续繁殖，大量增加根瘤内的根瘤菌数，以后停止增殖，成为成熟的类菌体；宿主细胞与根瘤菌共同合成豆血红蛋白，分布在膜套内外，作为氧的载体，调节膜套内外的氧量。 类菌体执行固氮功能，将分子氮还原成NH3，分泌至根瘤细胞内，并合成酰胺类或酰尿类化合物，输出根瘤，由根的传导组织运输至宿主地上部分供利用。与宿主的共生关系是宿主为根瘤菌提供良好的居住环境、碳源和能源以及其他必需营养，而根瘤菌则为宿主提供氮素营养。 二．根瘤菌与豆科植物 根瘤菌(root nodule bacteria)是与豆科植物共生，形成根瘤并固定空气中的氮气供植物营养的一类杆状细菌。这种共生体系具有很强的固氮能力。已知全世界豆科植物近两万种。根瘤菌是通过豆科植物根毛、侧根杈口(如花生)或其他部位侵入，形成侵入线，进到根的皮层，刺激宿主皮层细胞分裂，形成根瘤，根瘤菌从侵入线进到根

植物病原菌分离方法

病原菌分离方法 一、实验原理： 植物患病组织内的真丝菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除了个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。植物病原菌的分离就是指通过人工培养，重染病植物组织中将病原真菌与其他杂菌相分开并从寄主植物中分离出来，再将分离得到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病原的分离培养。 二、实验用具： 酒精灯、手术剪、镊子、75%酒精、3%~5%次氯酸钠、灭菌水、培养皿、封口膜、乳酸等 三、实验前的准备工作： 1、煮培养基（PDA）：马铃薯200g,葡萄糖20g，琼脂粉(AGAR)20g（10:1:1）水1000ml （1）将去皮称量好的马铃薯切片后加水煮沸15~20min（水可以适量多加200ml 左右，因为在煮的过程中会蒸发一些），待土豆煮软即可。 （2）三层纱布滤去马铃薯后将过滤的水倒入洗净的锅中，加琼脂粉搅拌充分后再加热煮沸，小火使其充分融化。 （3）加入葡萄糖并不断搅拌，待其完全融化后双层纱布过滤，定容到1000ml，分装到500ml的玻璃瓶内，每个玻璃瓶最多装300ml，121℃湿热灭菌 30min。 2、培养皿干热灭菌170℃1h;蒸馏水、枪头等湿热灭菌121℃30min。 四、实验步骤： 1、用75%酒精擦拭超净工作台，所有器具用紫外灯灭菌30min,分离室要保持清洁。 2、取样，病斑大小约20个（含病缘线） 3、分装培养基：（1）融PDA，松盖在微波炉中加热约3min（看量多少而定） （2）待冷却至50℃后在超净工作台指示灯显绿灯时分装 (3) 分装时滴入一管乳酸约20滴（每10ml培养基中加3滴乳酸） （4）左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基 约15m1(300ml一瓶的培养基倒20多个平板)，加盖后轻轻摇动培 养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝

聚磷菌的除磷机理及影响因素

聚磷菌的除磷机理及影响因素！ 污水生物除磷的原理就是人为创造生物超量除磷过程，实现可控的除磷效果。整个过程必须通过创造厌氧与好氧交替环节利用聚磷菌的作用来实现生物除磷过程。 一、聚磷菌除磷机理 聚磷菌也叫做摄磷菌、除磷菌，是传统活性污泥工艺中一类特殊的细菌，在好氧状态下能超量地将污水中的磷吸入体内，使体内的含磷量超过一般细菌体内的含磷量的数倍，这类细菌被广泛地用于生物除磷。 1）厌氧条件下释磷 在没有溶解氧或硝态氮存在的条件下，兼性细菌通过发酵作用将可溶性BOD5转化为低分子挥发性有机酸VFA。聚磷菌吸收这些发酵产物或来自原污水的VFA，并将其运送到细胞内，同化成胞内碳能源储存物质

PHB，所需的能力来源于聚磷的水解以及细胞内糖的酵解，并导致磷酸盐的释放。 2）好氧条件下摄磷 好氧条件下，聚磷菌的活力得到恢复，并以聚磷的形式存储超过生长所需的磷量，通过PHB的氧化代谢产生能量，用于磷的吸收和聚磷的合成，能量以聚磷酸高能键的形式捕集存储，磷酸盐从水中被去除。 3）富磷污泥的排放 产生的富磷污泥通过剩余污泥的形式排放，从而将磷去除。从能量角度来看，聚磷菌在无氧条件下释放磷获取能量以吸收废水中溶解性有机物，在好氧状态下降解吸收溶解性有机物获取能量以吸收磷。 除磷的关键是厌氧区的设置，聚磷菌能在短暂的厌氧条件下，由于非聚磷菌吸收低分子基质并快速同化和储存这些发酵产物，即厌氧区为聚磷菌提供了竞争优势。 这样一来，能吸收大量磷的聚磷菌就能在处理系统中得到选择性增殖，并可通过排除高含磷量的剩余污泥达到除磷的目的。这种选择性增殖的另一好处是抑制了丝状

菌的增殖，避免了产生沉淀性能较差的污泥的可能，因此厌氧/好氧生物除磷工艺一般不会出现污泥膨胀。 二、聚磷菌代谢的影响因素 生物除磷中通过聚磷菌在厌氧状态下释放磷，在好氧状态下过量地摄取磷。经过排放富磷剩余污泥而除磷，其影响聚磷菌代谢的影响因素包括：温度、pH值、厌氧池DO、厌氧池硝态氮、泥龄、CP比、RBCOD含量、糖原、HRT等。 1、温度 温度对除磷效果的影响不如对生物脱氮过程的影响那么明显，在一定温度范围内，温度变化不是十分大时，生物除磷都能成功运行。试验表明，生物除磷的温度宜大于10℃，因为聚磷菌在低温时生长速度会减慢。 2、pH值 在pH在6.5一8.0时，聚磷微生物的含磷量和吸磷率保持稳定，当pH值低于6.5时，吸磷率急剧下降。当pH值突然降低，无论在好氧区还是厌氧区磷的浓度都急剧上升，pH降低的幅度越大释放量越大，这说明pH降低引起的磷释放不是聚磷菌本身对pH变化的生

聚磷菌

科技名词定义 中文名称：聚磷菌 英文名称：poly-P bacteria 定义：一类可对磷超量吸收的细菌，磷以聚磷酸盐颗粒(异染粒)的形式存在 于细胞内。 应用学科：生态学（一级学科）；污染生态学（二级学科） 以上内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 聚磷菌也叫做摄磷菌，是传统活性污泥工艺中一类特殊的兼性细菌，在好氧或缺氧状态下能超量地将污水中的磷吸入体内，使体内的含磷量超过一般细菌体内的含磷量的数倍，这类细菌被广泛地用于生物除磷。 当活性污泥中的聚磷菌生活在营养丰富的环境中，在将进入对数生长期时，为大量分裂作准备，细胞能从废水中大量摄取溶解态的正磷酸盐，在细胞内合成多聚磷酸盐，如具有环状结构的三偏磷酸盐和四偏磷酸盐；具有线状结构的焦磷酸盐和不溶结晶聚磷酸盐；具有横联结构的过磷酸盐等，并加以积累，供下阶段对数生长时期合成核酸耗用磷素之需。另外，细菌经过对数生长期而进入静止期时，大部分细胞已停止繁殖，核酸的合成虽已停止，对磷的需要量也已很低，但若环境中的磷源仍有剩余，细胞又有一定的能量时，仍能从外界吸收磷元素，这种对磷的积累作用大大超过微生物正常生长所需的磷量，可达细胞重量的6%-8%，有报道甚至可达10%。以多聚磷酸盐的形式积累于细胞内作为贮存物质。

但当细菌细胞处于极为不利的生活条件时，例如使好氧细菌处于厌氧条件下，即所谓细菌“压抑”状态时，聚磷菌能吸收污水中的乙酸、甲酸、丙酸及乙醇等极易生物降解的有机物质，贮存在体内作为营养源，同时将体内存贮的聚磷酸盐分解，以P043—P的形式释放到环境中来，以便获得能量，供细菌在不利环境中维持其生存所需，此时菌体内多聚磷酸盐就逐渐消失，而以可溶性单磷酸盐的形式排到体外环境中，如果该类细菌再次进入营养丰富的好氧环境时，它将重复上述的体内积磷。

高效聚磷菌筛选综述

高效聚磷菌的分离、筛选和效率研究进展摘要：高效聚磷菌的获得是深入把握生物除磷的复杂机制以及优化生物除磷工艺设计的基础。该文对比分析了近年来对高效聚磷菌的分离筛选与效率等方面的研究进展。 关键词：富营养化；生物除磷；聚磷菌 Research Progress of Isolation.Screening and Efficiency of High-efficient Polyphosphate-accumulating Organisms Abstract:Acquisition of high－efficient polyphosphate－accumulating organisms (PAOs) could lay foundation for exploring the complex mechanisms of biological phosphorus removal and optimization of its processing design. This article reviews the methods used in the isolation，screening and genetic building of high－efficient PAOs in recent year. Keywords:eutrophication; biological phosphorus removal; polyphosphate－accumulating organism

我国磷矿资源丰富, 储量约14Gt,仅次于美国、摩洛哥,居世界第三位,是世 界上重要的磷化工产品生产国,年产量近9Mt(以P 2O 5 含量计)[1]。尽管我国磷矿资 源十分丰富,但大部分属沉积磷块岩矿床,以P 2O 5 计占90%以上,这类矿石品位低, 杂质多,P 2O 5 的含量平均值只有17%-22% ,且80%磷矿含镁量偏高,嵌布粒度细[2]。 在开采利用磷矿山的过程中,会产生大量的废水,但是选矿过程是排放废水的主要环节,这是因为在选磷矿的过程中要求磨矿细度高,药耗大,需要大量的工业清水和产生大量工业废水(尾矿水),而且选磷废水中溶有残留的多种浮选药剂(有机物及无机物)和大量选别后的尾矿固体颗粒悬浮物,是具有一定稳定性的多相分散体系[3],其CODcr 、BOD、SS、P等严重超出国家规定的工业废水排放标准,废水的硬度也较大。原成都科技大学磷复肥室开发的弱酸脱镁工艺可使矿中MgO 含量降到0.5 %以下, 但该工艺每处理1t磷矿约产生4t含 MgO、CaO、P 2O 5 、SO 3 、 Fe 2O 3 、Al 2 O 3 和F的废水[4]。 水体富营养化是一类世界性的环境污染问题，在我国，处于富营养化状态的 湖泊有80%以上[5]，而73%以上都达到严重污染程度[5].太湖巢湖和滇池等大型水体多年来都处于富营养化状态，造成巨大经济损失的同时也严重影响周边居民的生产与生活对富营养化防治的关键在于除磷，而强化生物除磷(Enhanced Biological Phosphorus Removal，EBPR) 生态效应与经济效益良好，具有效率高减少二次污染等优点，是目前得到广泛研究与发展的除磷方法，它利用具有超量吸磷能力的聚磷菌(Phosphorus Accumulating Organisms，PAOs)来实现对污水中磷的去除。 聚磷菌不是细菌分类学中的概念，只是对具有超量吸磷特征的一类微生物的总称，所谓超量吸磷，是因为指它们可以把多余的磷以多聚磷酸盐的形式储藏在体内，以备在不良环境中提供能量与营养所以有些聚磷菌菌体的磷含量可达干重的10%以上而且，因为在超量吸磷的过程中可以使外界环境中的磷含量明显减少，聚磷菌就成为了污水生物除磷的主要执行者，目前已报道较多的聚磷菌主要分离自活性污泥，包括:不动杆菌(Acinetobacter sp.)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)[7]、假单胞菌(Pseudomonas sp.)[8]克雷伯氏杆菌(Klebsiellasp.)和产碱杆菌(Alcaligenes sp.) 和节杆菌(Arthrobacter sp.)[9]等。另外，近年来随着分子生态学技术的发展，人们还发现了活性污泥中多种仍未获得纯培养的聚磷菌类群，

信息检索信息搜索、鉴别和筛选

信息检索信息搜索、鉴别和筛选 一提到网络搜索，大家马上会想到谷歌和百度。当然，一遇到问题人们可能最先想到的就是这两大搜索引擎。但是呢，好的信息搜索并不只有这两个，每一种搜索引擎都有各自的利弊，选不对搜索引擎，就像选了不合脚的鞋一样，能走路，但艰辛痛苦，也跑不快走不远。使用搜索引擎首先要了解各种搜索引擎特点，否则你可能浪费大量时间。这次搜索，你应该使用百度还是Yahoo？Google还是百度？分析你的需求，选根据需求找拥有相应功能优势的搜索引擎。这里介绍一些： 1.方向着手 （1）从行业入手查找，比较好用的是“百度产品大全”（点击首页“更多”选项即可）：行业报告——各行业官方报告、评定、专家解读，行业与单个品牌市场综述、分析，行业与单个品牌数据、过往新闻。当然这个不乏广告成分，所以需要鉴别，当心受骗。 （2）寻找特定领域的人了解情况，寻找合适采访对象，如专家学者、老一辈，想熟悉某个领域或了解某个城市、历史、词条……这些比较细致的东西，可以用“百度百科”，网友们集体贡献的智慧是无穷的，而且网友的料也是无穷的，你往往能有意外收获。

另外wikipedia（维基百科）也是巨型资料库，而且更新很快。 （3）Google有一个实用搜索功能是“大学搜索”，要知道现在多数有点名的所谓专家学者都没少在大学挂职，各种研究所、实验室、官方组织的这个那个不少也扎根大学，而大学又是产生思想文化的重要阵地。用这个搜索可以一网打尽和某所大学有关的所有东西。 （4）现在有一些新开发的搜索引擎，它们可以对网页库中的某类专门的信息进行一次整合。有人称之为：元搜索引擎。这种搜索引擎的特点是大大减少了你整合资料的时间。 比如比比猫（Bbmao）。这个搜索引擎的特点是：自动分类、自动去掉重复结果、汇集五大搜索引擎结果。智能分类，你可能在分类中发现一些你不曾想到的东西。 不过元搜索是不是好用，可能仁者见仁智者见智，但是只要适应了这种新方式，会给你带来很多方便。 2.技巧着手 （1）设计关键词：使用搜索引擎要避免大而空的关键词，它不知道你要找啥，就可能返回很多莫名其妙结果。