小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定

小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定

【摘要】目的建立一种小鼠腹腔巨噬细胞分离培养的简便方法。方法以无血清的DMEM培养液灌洗小鼠腹腔，分离获取小鼠腹腔巨噬细胞，在含有10%成牛血清的DMEM培养液中培养。采用倒置显微镜观察细胞形态，台盼蓝染色计算存活率，瑞氏染色计算纯度。结果获得高纯度的巨噬细胞，具备巨噬细胞的形态特征。结论该方法是一种简单可行的分离巨噬细胞的方法。

【关键词】小鼠；巨噬细胞；分离；培养；鉴定

0.引言

巨噬细胞是动物机体内重要的免疫细胞，具有抗肿瘤和免疫调节等重要作用[1，2] ，被广泛应用于体外免疫增强药物的非特异性免疫功能评价[3] 。有很多文献报到已能从多种组织和器官中分离纯化巨噬细胞，但这些方法大多都是繁琐、复杂，所需时间长且耗资较大。本实验以小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象，探索建立一种巨噬细胞体外分离培养与鉴定简便的方法。

1.材料与方法

1.1实验对象

清洁级巴贝斯小鼠，体重在（30-32g），由兰州大学实验动物中心提供。

1.2实验方法

1.2.1小鼠腹腔单核巨噬细胞的分离培养

随机选取巴贝斯小鼠，腹腔注射不含小牛血清的RPMI-1640培养液5ml。轻柔小鼠腹部2-3min，静置5-7min后将小鼠颈椎脱臼处死，至于解剖板上，无菌条件下打开腹腔，用注射器抽取腹腔液，离心5min （1000r/min），弃上清，用PBS洗涤2遍。再用含10%成牛血清的RPMI-1640培养液（0.1%双抗溶液）调节至2×106ml-1，接种于培养瓶及6孔板，置37℃，5%CO2培养箱培养2h，弃上清。用不含小牛血清的RPMI-1640培养液洗涤2遍，然后加含有10%小牛血清的RPMI-1640培养液在37℃CO2培养箱中继续培养[4]。倒置显微镜观察细胞形态。

1.2.2巨噬细胞的观察与鉴定

（1）台盼蓝染色计算存活率。

4%台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4度保存。使用时。用PBS稀释至0.4%。（也可买Gibco的成品）；

小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定

小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定 【摘要】目的建立一种小鼠腹腔巨噬细胞分离培养的简便方法。方法以无血清的DMEM培养液灌洗小鼠腹腔，分离获取小鼠腹腔巨噬细胞，在含有10%成牛血清的DMEM培养液中培养。采用倒置显微镜观察细胞形态，台盼蓝染色计算存活率，瑞氏染色计算纯度。结果获得高纯度的巨噬细胞，具备巨噬细胞的形态特征。结论该方法是一种简单可行的分离巨噬细胞的方法。 【关键词】小鼠；巨噬细胞；分离；培养；鉴定 0.引言 巨噬细胞是动物机体内重要的免疫细胞，具有抗肿瘤和免疫调节等重要作用[1，2] ，被广泛应用于体外免疫增强药物的非特异性免疫功能评价[3] 。有很多文献报到已能从多种组织和器官中分离纯化巨噬细胞，但这些方法大多都是繁琐、复杂，所需时间长且耗资较大。本实验以小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象，探索建立一种巨噬细胞体外分离培养与鉴定简便的方法。 1.材料与方法 1.1实验对象 清洁级巴贝斯小鼠，体重在（30-32g），由兰州大学实验动物中心提供。 1.2实验方法 1.2.1小鼠腹腔单核巨噬细胞的分离培养 随机选取巴贝斯小鼠，腹腔注射不含小牛血清的RPMI-1640培养液5ml。轻柔小鼠腹部2-3min，静置5-7min后将小鼠颈椎脱臼处死，至于解剖板上，无菌条件下打开腹腔，用注射器抽取腹腔液，离心5min （1000r/min），弃上清，用PBS洗涤2遍。再用含10%成牛血清的RPMI-1640培养液（0.1%双抗溶液）调节至2×106ml-1，接种于培养瓶及6孔板，置37℃，5%CO2培养箱培养2h，弃上清。用不含小牛血清的RPMI-1640培养液洗涤2遍，然后加含有10%小牛血清的RPMI-1640培养液在37℃CO2培养箱中继续培养[4]。倒置显微镜观察细胞形态。 1.2.2巨噬细胞的观察与鉴定 （1）台盼蓝染色计算存活率。 4%台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4度保存。使用时。用PBS稀释至0.4%。（也可买Gibco的成品）；

实验6小鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象观察

实验6小鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象观察 姓名：李思露 学号：131140040 一、实验目的 1.通过对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞活动的观察,加深理解细胞吞噬作用的过程； 2.了解巨噬细胞吞噬能力检测的形态学方法 二、实验原理 吞噬作用也称为胞吞作用（cellular eating），指细胞通过质膜内陷形成内吞泡的方式吞入不能渗透过膜的较大固体物质（直径一般大于250mm）的过程。许多原生动物通过吞噬作用摄取营养；高等动物体内的巨噬细胞和嗜中性粒细胞的吞噬作用成为动物体非特异性免疫的重要组成部分。不同动物来源的巨噬细胞或同一动物来源的不同巨噬细胞吞噬功能强弱不同，个体吞噬细胞的平均吞噬能力是机体非特异性免疫功能强弱的重要反映。 吞噬细胞细胞膜上有识别某些病原体相关分子及凋亡细胞磷脂酰丝氨酸等配体的受体，可以使巨噬细胞识别结合病原体、凋亡细胞及其它异物，引起受体胞内区活化，进而导致与其相连的细胞骨架重排引发吞噬作用。 内吞 内吞体 吞噬溶酶体 胞吐 巨噬细胞吞噬自身衰老凋亡细胞而不吞噬正常细胞，原因是，凋亡细胞细胞膜内侧面的磷脂酰丝氨酸反转到胞膜外侧面而被巨噬细胞模式识别受体识别。 吞噬功能一般用吞噬百分率和吞噬指数两个指标反映。 吞噬百分率＝吞噬有鸡红细胞的巨噬细胞数/巨噬细胞总数×100％

吞噬指数＝吞噬的鸡红细胞总数/吞噬有鸡红细胞的巨噬细胞数 三、实验材料、试剂及器材 （一）材料： 1.健康小白鼠：6-8周龄健康小白鼠，实验前1~2天，每只腹腔注射4％淀粉肉汤1mL。 2.抗凝鸡血 （二）试剂: 1.4%淀粉肉汤 2.D-Hanks液 3.0.85％生理盐水 4.180IU/mL肝素钠生理盐水溶液 （三）用品 普通光学显微镜、10mL低速离心机、托盘天平、水浴箱（37℃）、5mL一次性注射器、10mL玻璃离心管、试管架、胶头滴管等 四、实验操作 1.巨噬细胞收集：脱颈处死小鼠；腹腔注入2mL生理盐水，揉匀；剪开腹部皮肤， 暴露腹膜；用带针头的注射器插进腹腔吸取腹腔液。 2.体外吞噬。0.3mL腹腔液+0.3mL鸡红细胞悬液，37℃吞噬。 3.制片及观察。分别在0min、15min、30min、45min 制备细胞混合液临时装片，观 察现象并作图。 五、实验结果 图1 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡血红细胞装片（不染色） 0min15min30min45min 时 间 现 象 巨噬细胞吞噬物的变化亦具有与时间相关的特点，巨噬细胞吞噬物在形态上易于观察和检测，这些特征使得巨噬细胞在损伤时间推断过程中具有重要的法医学意义。 六、作业与思考题

小鼠腹腔巨噬细胞制备及提取

小鼠腹腔巨噬细胞制备及提取 实验动物： 6-8周的SPF级雄性BALB/C小鼠，小鼠取细胞前三天每天腹腔注射0.5-1mL淀粉肉汤，或者取细胞前一小时注射1mL淀粉肉汤。 试剂：75% 乙醇、RPMI 1640 （Gibcol/BRL，美国）、含10%小牛血清RPMI-1640液(10%牛胎血清、青霉素100U/ml、链霉素10μg/ml)步骤： 1、取6周左右的小鼠，剃去腹部的毛并消毒。 2、引颈杀死动物，手提鼠尾将全鼠浸入75%酒精中3～5秒。 3、倒立小鼠，置动物于解剖台上，固定四肢，75%酒精擦洗腹膜壁后，用9号针头5ml注射器沿腹中线将预冷的不含小牛血清的PBS5mL注入腹腔中，同时从两侧用手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动。轻轻按摩腹部2-3分钟，静置5-7分钟。 4、无菌条件下，剪开腹壁，双手持镊撕开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜，但勿伤及腹膜壁。再用75%酒精擦洗腹壁。 5、用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针头下吸入注射器内。小心拔出针头。把液体注入50ml离心管中。再用同样容量的PBS冲洗腹腔2～4次。合并渗出液于50 mL离心管中。直至冲洗液变澄清。 6、4℃ 250×g（1000 rpm/min）离心10min，去上清。 7、用PBS培养液洗涤细胞3次，每次4℃ 250×g（1000 rpm/min）离心10min，去上清。 8、用含10%小牛血清RPMI-1640液(10%牛胎血清、青霉素100U/ml、链霉素10μg/ml)悬浮细胞。将调整细胞浓度调整至 5×106cells/mL 加入培养皿中培养9、将培养皿置于5% CO2、37℃培养箱中培养3 h，然用37℃预温的RPMI-1640培养液清洗培养皿2-3次，去除未贴壁的细胞，即得到纯化的贴壁巨噬细胞。 种96孔板。2h细胞贴壁。换液。墨汁（时间短，可以不灭菌）染色。观察。

免疫细胞分离及检测技术

第十三章免疫细胞分离及检测技术 本章考点 1.免疫细胞的分离 2.淋巴细胞表面标志的检测 3.淋巴细胞功能检测技术 4.免疫细胞检测的临床意义 第一节免疫细胞的分离 一、外周血单个核细胞的分离 1.原理：外周血中单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的比重与红细胞、多核白细胞及血小板不同，介于1.075～1.090之间，红细胞及粒细胞在1.092左右，血小板在1.030～1.035之间。因而可利用一种比重介于1.075～1.092之间，而近于等渗的溶液作密度梯度离心，使一定比重的细胞按相应密度梯度分布而加以分离。 2.试剂：常用的分层液有Ficoll与Percoll两种 （1）Ficoll分层液法：主要用于分离外周血中单个核细胞，是一种单次密度梯度离心分离法，其分布由上到下依次为：稀释的血浆层，单个核细胞层，粒细胞层和红细胞层。Ficoll分层液即聚蔗糖-泛影葡胺，是一种较理想的细胞分层液，其主要成分是一种合成的蔗糖聚合物，具有高密度、低渗透压、无毒性的特点。操作时，将分层液置于试管下层，然后将肝素化的全血或白细胞悬液以Hanks或PBS液稀释后，轻轻铺于分层液面上，经2000rpm15-20min离心后，红细胞与粒细胞因比重大于分层液，故较快沉于管底。血小板则比重小于分层液而悬浮于血浆中。唯有与分层液比重相当的单核细胞和淋巴细胞密集于血浆层和分层液的界面中。其分布由上到下依次为：稀释的血浆层，单个核细胞层，粒细胞层和红细胞层。见下图。 图聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法外周血小分布示意图 引自陶义训主编：免疫学和免疫学检验，人民卫生出版社1995年9月第1版第4次印刷 （2）Percoll分层液法：是一种连续密度梯度离心分离法，其分布由上至下依次为：死细胞层，富含单核细胞组分层，富含淋巴细胞的组分层及红细胞与粒细胞组分层。 图连续密度梯度离心法分离单个核细胞中各细胞成分的分布示意图 引自陶义训主编：免疫学和免疫学检验，人民卫生出版社1995年9月第1版第4次印刷

小鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象观察

小鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象观察 一、实验目的 a)通过对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬大肠杆菌活动的观察,加深理解细胞吞噬 作用的过程； b)了解巨噬细胞吞噬能力检测的形态学方法。 二、实验原理 吞噬作用是细胞通过质膜内陷形成内吞泡的方式吞入不能渗透过膜的固体物质（直径一般大于250nm）的过程。 吞噬细胞细胞膜上有识别某些病原体相关分子及凋亡细胞磷脂酰丝氨酸等配体的受体，可以使巨噬细胞识别结合病原体、凋亡细胞及其它异物，引起受体胞内区活化，进而导致与其相连的细胞骨架重排引发吞噬作用。 许多原生动物通过吞噬作用摄取营养；高等动物体内的巨噬细胞和嗜中性粒细胞的吞噬作用成为动物体非特异性免疫的重要组成部分。 三、实验仪器及试剂 a)材料：健康小白鼠：6-8周龄健康小白鼠，实验前1~2天，一部分腹腔 注射4％淀粉肉汤1mL另一部分不注射，大肠杆菌悬液。 b)试剂:4%淀粉肉汤，D-Hanks液，0.85％生理盐水，180IU/mL肝素钠生理 盐水溶液 c)普通光学显微镜、 10mL低速离心机、托盘天平、水浴箱（37℃），5mL 一次性注射器、 10mL玻璃离心管、试管架、胶头滴管等 四、实验步骤 a)巨噬细胞收集：分别用脱颈法处死一只腹腔注射4％淀粉肉汤1mL的小 鼠和一只不注射的小鼠。然后都在腹腔注入2mL生理盐水，揉匀；剪开 腹部皮肤，暴露腹膜；用带针头的注射器插进腹腔吸取腹腔液。 b)体外吞噬。在两支10mL玻璃离心管分别加入0.3mL注射淀粉肉汤的腹腔 液+0.3mL大肠杆菌悬液和0.3mL不注射淀粉肉汤的腹腔液+0.3mL大肠杆 菌悬液，放在37℃水浴锅中吞噬。 c)制片及观察。分别在0min、15min、30min、45min 制备细胞混合液临 时装片，观察现象并作图。 d)在0min和45min时在两管中分别取两滴混合液滴于载玻片上，用次甲基 蓝染色5分钟后装片观察。 五、实验结果 a)0min时注射肉汤（左）与未注射肉汤（右）图片（次甲基蓝染色）

小鼠腹腔巨噬细胞和肾脏细胞的原代培养2013

细胞工程综合实验报告 小鼠腹腔巨噬细胞和肾脏细胞的原代培养 班级 xxxx 姓名 xxxx 学号 xxxxxxxxxx 指导教师 xxxx 实验时间 xxxx 成绩

小鼠腹腔巨噬细胞和肾脏细胞的原代培养 姓名学号班级 一、实验目的 1.了解细胞原代培养培养的基本方法和操作过程。 2.初步掌握培养过程中的无菌技术。 3.了解在相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况。 二、实验原理 原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分解成单个游离细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。 细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。 巨噬细胞属天然免疫细胞，具有趋化运动、吞噬、分泌和参与免疫调节等功能，是科学工作者研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周多用做原代培养，不易长期生存。巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。目前，单核巨噬细胞株也有，比如RAW264.7，但价格比较贵，且保存也不方便。 培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，目前以小鼠腹腔取材法最为实用，而目前获取小鼠巨噬细胞的方法有两种，一种是直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞，还有一种方法向动物腹腔中注射刺激物（如牛血清，淀粉，糖原，脂多糖，矿物油，PRMI1640培养液等），这样使机体产生大量巨噬细胞后再腹腔灌洗，但由于许多刺激物能激活巨噬细胞，而被激活的巨噬细胞大量吞噬刺激物，有此得到的巨噬细胞培养用于培养时，细胞中的刺激物不能很快被消化而残留在细胞中，影响细胞代谢，同时也不能很好的模拟体内环境，所以我们直接用培

免疫细胞的分离和保存技术

免疫细胞的分离和保存技术 用体外方法对机体各种具有免疫反应的细胞分别作鉴定、计数和功能测定，是观察机体免疫状态的一种重要手段。为此，须将各种参与免疫反应的细胞从血液或脏器中分离出来。参与免疫反应的细胞主要包括淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等。由于检测的目的和方法有同，分离细胞的需求和技术也异。有的仅需分离白细胞，有的则需分离单个核细胞（mononuclearcell），其中含淋巴细胞和单核细胞（monocyte），有的则需分离T细胞和B细胞以及其亚群。分离细胞选用的方法应力求简便可行，并能获得高纯度、高获得率、高活力的细胞。现用分离细胞群的原则，一是根据各类细胞的大小、沉降率、粘附和吞噬能力加以组分，另一则按照各类细胞的表面标志，包括细胞表面的抗原和受体加以选择性分离。 一、白细胞的分离 （一）血液中红细胞与白细胞比例约600～1000:1，两者的比重不同其沉降速度亦异，通常用两种方法加以分离。 本法是利用血细胞自然沉降率的分离法，采集血液后应及时抗凝，通常选用肝素抗凝法。肝素能阻止凝血酶原转化为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白而防止血液凝固。操作原则是将含抗凝血的试管直立静置室温30～60min 后，血液分成明显三层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，紧贴红细胞层上面的灰白层为白细胞，轻轻吸取即得富含白细胞的细胞群，离心洗涤后加入少量蒸馏水或含氯化铵的Gey溶液，经短时间的低渗处理，使红细胞裂解，经过反复洗涤可得纯度较高的白细胞悬液。 （二）聚合物加速沉淀法 本法是利用高分子量的聚合物如明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡喀烷酮（polyvinylpyrolidone，PVP）等使红细胞凝集成串，加速红细胞沉降，使之与白细胞分离。本法的细胞获得率比自然沉降法高。 二、外周血单个核细胞的分离 外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞密度较大，为1.090左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为 1.075～1.090，血小板为 1.030～1.035。为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液（分层液）做密度梯度离心，使一定密度的

小鼠巨噬细胞功能的检测

小鼠巨噬细胞功能的检测 伍国强 （兰州大学草业学院兰州730020） 摘要：本实验用CFA免疫小鼠后，检测小鼠腹腔巨噬细胞的数目以及用中性红检测巨噬细胞的吞噬能力。结果表明，免疫小鼠的腹腔巨噬细胞的数目和吞噬能力均有所提高。 关键词：巨噬细胞；功能；检测 1 前言 巨噬细胞是一种多功能免疫细胞,在机体的特异性和非特异性免疫反应中发挥重要功能。主要作用有：（1）吞噬杀伤作用：直接吞噬、调理吞噬作用。（2）抗原提呈作用：即外来的抗原性异物通过巨噬细胞的捕获、加工和处理后，与胞内合成的MHC-1/II类分子形成抗原肽－MHC分子复合物，并被呈递到细胞膜表面，被TCR 识别的作用。具有此作用的细胞叫抗原呈递细胞（antigen presenting cell,APC)。此外，巨噬细胞表面还表达多种共刺激分子，如B7、ICAM-1、LFA-1,3等分别与T细胞上的CD28、LFA -1(CD11)、LFA-2(CD2)等相互作用，为T细胞的活化提供第二信号。（3）抗肿瘤作用：Mφ被某些细胞因子如IFN-γ激活后能有效杀伤肿瘤等靶细胞，其吞噬杀菌能力也显著提高。（4）分泌生物活性介质，产生免疫应答和其它免疫效应：如 IL-1,12、IFN、TNF、PGE等;以及某些补体成份和凝血因子、组织修复因子等。为了检测巨噬细胞的吞噬功能，我们用CFA免疫的小白鼠作为实验材料检测其腹腔巨噬细胞吞噬中性红的作用。 2 材料与方法 2．1 材料 2．1．1 药品：生理盐水、0.6%环磷酰胺、Hank’s溶液、1640培养基、细胞裂解液、中性红等。 2．1．2 仪器：血球计数板、细胞培养箱、分光光度计等。 2．1．3 动物：小白鼠2只，由兰大医学院动物实验中心提供。 2.2、方法 2．2．1 小鼠腹腔巨噬细胞制备取小白鼠2只，分为对照组和实验组，对照组注射0.1ml生理盐水，试验组注射0.1mlcFA。48小时后，小鼠眼眶放血，断颈处死。腹腔注射3ml预冷的生理盐水。吸取腹腔渗出液5ml离心管（冰浴）。1600rpm离心10 分钟，弃上清，4℃生理盐水定容至5ml。血球计数板镜下巨噬细胞计数。用生理盐水调mΦ浓度为1×106，取4ml 1600rpm 离心10分钟，弃上清加4ml 1640定悬。将mΦ加入24孔板，每组4孔，每孔1ml。37℃，5%CO2细胞培养箱贴壁培养纯化2小时。2．2．2 巨噬细胞吞噬中性红试验将贴壁纯化好的mΦ弃1640培养液，对照孔加0.5ml生理盐水，其余每孔加0.5ml0.075%中性红,继续培养1小时。倾去上清液,用温PBS 洗细胞3 次,每孔加入细胞溶解液(为体积分数50 %的乙酸和体积分数50 %的无水乙醇) 2ml ,室温下放置30分钟,待细胞溶解后,即用分光光度计测定OD值。以OD 值表示巨噬细胞功能的强弱。 3 结果与讨论表：mΦ的浓度及吸光值 mΦ细胞个数mΦ浓度 （个/ml) 0D值 对照组256 6.4×105 0.252 试验组2176 5.44×106 0.283 3．1 免疫小鼠腹腔巨噬细胞浓度从上表可以看出，用cFA免疫的小鼠腹腔巨噬

小鼠腹腔巨噬细胞原代培养实验具体步骤及方法

小鼠腹腔巨噬细胞原代培养实验具体步骤及方法巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周，多用做原代培养，难以长期生存。 步骤 一、实验材料准备 1. 动物：各个品系的小鼠2-4只。 2. 试剂：RPMI1640培养基(含酚红)，小牛血清，双抗，培养液(10%小牛血清、RPMI1640、双抗)，台盼兰等。碘酒绵球和酒精绵球。 3. 器械：一次性注射器、手术器械。 二、实验方法 如果采用刺激物，则可在实验前三天腹腔注射3%巯基乙醇酸钠每只2 mL，获得的巨噬细胞数要多一些。不采用刺激物，直接开始下面的步骤。 1. 拉颈处死小鼠，在75%酒精浸泡1-2分钟，移入超净台中，仰卧位固定于解剖板上，碘酒消毒腹部皮肤，酒精绵球脱碘。用手术直剪充分剪开腹部皮肤，暴露腹部肌层，再用

酒精绵球消毒腹部肌层。 2. 用注射器抽取5 mL含双抗的RPMI1640培养基注入腹腔，用绵球轻揉腹部1-2 min，然后，用眼科镊稍提起腹腔，并用眼科剪剪开一个小口，用吸管吸取细胞悬液，移入离心管中(个人认为，此法比用注射器抽吸好一些)。 3. 1 000 rpm离心5 min后，用含双抗的RPMI1640培养基洗涤一次，再次离心，重悬细胞于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中，如果是作为饲养细胞使用，则选择相应的培养液。台盼蓝拒染法计数，将细胞稀释到目的浓度后，接种即可。 4. 如果是作为饲养细胞使用，调整浓度至2x105个/mL，接种到96孔板中，每孔100-200 uL；如果作为其它实验使用，可以调整成2x106/mL，加到24孔平底培养板中，1 mL/孔；5% CO2温箱孵育2 h后，换液，并用RPMI1640培养基洗1-2次，弃去未粘附细胞，贴壁细胞为单层的巨噬细胞。 三、结果 巨噬细胞刚贴壁时偏圆形，或者类似鹅卵石形状，然后慢慢伸出伪足，铺开呈三角形或多角形。巨噬细胞有吞噬的特性，当与细菌混合在一起的时候，在40倍物镜下可以看到巨噬细胞吞噬细菌，因此，巨噬细胞作为饲养细胞可以清除部分污染的细菌、支原体和部分细胞碎片。 注意

小鼠巨噬细胞试验

一、小鼠巨噬细胞分离培养 小鼠脱颈处死，浸入75%酒精中5min后，于腹中线处剪开皮肤，暴露腹壁肌肉，用酒精消毒腹膜壁，用无菌注射器将PBS或无血清DMEM培养液5ml 注入腹腔，仰卧平放并轻柔小鼠腹部2~3min，静置5min后，使动物体倾向一侧，用注射器抽取腹腔液约4~4.5ml，1500rpm离心8min，去上清，用含10%小牛血清的DMEM培养液进行细胞计数，调整细胞浓度为lx10∧6个/ml(取出一滴细胞悬液经台盼蓝染色，细胞存活率大于99%)，5ml/瓶接种于25cm2的培养瓶中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养，2-3小时后更换培养液除去未贴壁细胞，贴壁细胞则为腹腔巨噬细胞。 注：巨噬细胞不增殖，不传代，能培养存活2-3周，细胞形态基本不变，细胞贴壁成不规则形状。 二、细胞计数 1.制备细胞悬浮液，用DMEM培养基进行计数 2.准备记数板：用蒸馏水冲洗，擦镜纸擦拭，再用酒精擦净，2-3次 3.加样 4.计数：用台盼蓝染色计数。 细胞悬液细胞数/ml=4个大方格总数/4×10∧4，如计算前已稀释再乘稀释倍数 三、药物配制 将挥发油配成64mg/ml母液，用DMSO助溶，用无血清DMEM培养液稀释，使其终浓度为3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625mg/ml。 四、挥发油对细胞毒性检测 将浓度为1×10∧6个/ml的细胞悬液1ml/孔接种于16孔板中，置培养箱中培养，24h后加入不同浓度的挥发油，同时设DMSO对照、空白对照及空白调零孔。培养24h后弃培养液，每孔加入ml无血清培养液和20ulMTT(5mg/ml)液，继续培养4h，然后弃培养液每孔加入 150ulDMSO，微量振荡器振荡10min后，采用酶标仪测定其在570nm波长的吸光度(A值)，并用下列公式计算细胞的存活率: 药物组A值均数 细胞存活率(%)= x100 空白组A值均数 五、细胞炎症模型建立 为建立体外细胞炎症模型，确定后续实验中LPS刺激巨噬细胞的时间和浓度，对LPs刺激巨噬细胞的时效与量效关系进行了研究。采用ELISA或RT-PCR测定小鼠腹腔巨噬细胞上清液中TNF-a含量来研究时效与量效关系。 时效关系：培养24h后的细胞分组加药：空白组（完全培养液）、LPS 1h组（终浓度为1ug/ml）、LPS 3h组（1ug/ml）、LPS 6h组（1ug/ml）、LPS 12h组（1ug/ml），分别在规定时间终止培养，弃去培养液。用ELISA法，450nm测TNF-a含量。量效关系：方法同上，分6组LPS浓度分别为0、0.001、0.01、0.1、1、10ug/ml

免疫细胞知识

免疫细胞 简介 免疫细胞（白细胞）是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等。免疫细胞可以分为多种，在人体中各种免疫细胞担任着重要角色。组成 免疫器官 类型:扁桃体、淋巴结、胸腺、脾、骨髓等。 功能:免疫细胞生成、成熟、或集中分布的场所。 免疫细胞 吞噬细胞:①与体液中的杀菌物质构成人体的第二道防线，参与非特异性免疫。 ②摄取和处理抗原，参与细胞免疫和体液免疫。 淋巴细胞:①T细胞 ②B细胞 免疫活性物质 抗体、淋巴因子及溶解酶等。

种类 T淋巴细胞———胸腺依赖淋巴细胞，简称T细胞，来源于骨髓的多能干细胞，是淋巴细胞的主要组分，它具有多种生物学功能，如直接杀伤靶细胞，辅助或抑制B细胞产生抗体，对特异性抗原和促有丝分裂原的应答反应以及产生细胞因子等，是身体中抵御疾病感染、肿瘤形成的英勇斗士。T细胞产生的免疫应答是细胞免疫，细胞免疫的效应形式主要有两种:与靶细胞特异性结合，破坏靶细胞膜，直接杀伤靶细胞;另一种是释放淋巴因子，最终使免疫效应扩大和增强。

B淋巴细胞——简称B细胞。来源于骨髓的多能干细胞。是由骨髓中的淋巴干细胞分化而来。与T淋巴细胞相比，它的体积略大。这种淋巴细胞受抗原刺激后，会增殖分化出大量浆细胞。浆细胞可合成和分泌抗体并在血液中循环。B细胞在体内存活的时间较短，仅数天至数周，但其记忆细胞在体内可长期存在。 K淋巴细胞——抗体依赖淋巴细胞，直接从骨髓的多能干细胞衍化而来，表面无抗原标志，但有抗体IgG的受体。发挥杀伤靶细胞的功能时必须有靶细胞的相应抗体存在。靶细胞表面抗原与相应抗体结合后，再结合到K细胞的相应受体上，从而触发K细胞的杀伤作用。凡结合有IgG抗体的靶细胞，均有被K细胞杀伤的可能性。因此，也可以说K细胞本身的杀伤作用是非特异性的，其对靶细胞的识别完全依赖于特异性抗体的识别作用。K细胞约占人外周血中淋巴细胞总数的 5~10%，但杀伤效应却很高。当体内仅有微量特异性抗体，虽可与抗原结合，但不足以激活补体系统破坏靶细胞时，K细胞即可发挥其杀伤作用。K细胞在腹腔渗出液、脾脏中较多，淋巴结中较少，胸导管淋巴液中没有，表明K细胞不参加淋巴细胞的再循环。但K细胞的杀伤作用在肿瘤免疫、抗病毒免疫、抗寄生虫免疫、移植排斥反应及一些自身免疫性疾病中均有重要作用，产生的免疫应答有免疫防护及免疫病理两种类型。如靶细胞过大(寄生虫或实体瘤)，吞噬细胞不能发挥作用或靶细胞表面被抗体覆盖，T细胞不能接近时，K细胞仍能发挥作用。肾移植中的排斥反应，机体自身免疫性疾病的受累器官或组织的破坏，都可能与K 细胞有关。 NK淋巴细胞（自然杀伤细胞）——是与T、B细胞并列的第三类群淋巴细胞。NK 细胞数量较少，在外周血中约占淋巴细胞总数的15%，在脾内约有3%~4%，也可出现在肺脏、肝脏和肠粘膜，但在胸腺、淋巴结和胸导管中罕见。 NK细胞可非特异直接杀伤靶细胞，这种天然杀伤活性既不需要预先由抗原致敏，也不需要抗体参与，且无MHC限制。 NK细胞杀伤的靶细胞主要是肿瘤细胞、病毒感染细胞、较大的病原体(如真菌和寄生虫)、同种异体移植的器官、组织等。

复旦大学免疫实验小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数

小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数 实验时间：实验地点：实验人： 1实验原理 小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体积较大，长条形，属于外周免疫器官。 外周血中淋巴细胞可经再循环驻如脾脏等外周免疫器官的特定区域，所以富含各类免疫细胞。 免疫细胞的分离：采用红细胞裂解法，是根据细胞对渗透压变化的敏感度。红细胞由于细胞结构较为简单，仅有细胞膜结构，对于膨胀的耐受能力较差，因此绝大部分就会涨破，受到破坏。是一种比较温和的去除红细胞最简便易行的方法。 2实验材料： 1)健康小鼠 2)手术器械（剪刀、镊子）、解剖板 3)70%乙醇 4)PBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK） 5)0.2%台盼蓝 6)细胞计数板、计数器 7)离心机 8)显微镜 3实验方法： 3.1取小鼠脾脏 ●将小鼠颈椎脱位处死，用酒精消毒。 ●用剪刀剪开背部皮肤，再找到脾脏，用镊子夹出脾脏并剪除周围组织。 3.2制备单个核细胞悬液 ●将取出的脾脏置于盛有3mlPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中，

用针芯轻轻碾压使得单个核细胞悬浮于平皿中。 ●吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管（15ml）中，以1500rpm离心10min， 弃去上清液，加入ASK至2-3ml，轻轻吹打混匀并放置2min，以破坏红细胞。 然后加入PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心10min。 ●弃去上清液，用PBS缓冲液定容至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞 悬液。 3.3计算细胞浓度 稀释十倍，随机选取一个大方格计数 细胞计数为324个，计算细胞浓度为324×104×10=3.24×107/ml 3.4计算细胞活力 在总计为324个细胞中计数，死亡细胞有16个，计算细胞活力为： 324-16/324×100%=95.1% 在理论范围之内 4实验结果 4.1研磨脾脏得到细胞悬液 本实验中将小鼠的脾脏放入尼龙指套内，置于少量PBS液中缓慢研磨，获得细胞悬液。实验中，我们发现尼龙指套不能滤去所有结缔组织，操作中会有结为絮状团块的结缔组织。这些结缔组织在离心后会和细胞绞缠在一起，去除十分麻烦，而且会损失细胞。应该在离心之前尽早用吸管吹打后小心弃去（这样损失的细胞比较少，造成较小的误差）。 研磨脾脏时的力度、时间、温度都会影响细胞的活性。所以应置于冰上快速、轻柔地研磨，置于液体中避免干磨。我们在实验室室温下碾磨，造成细胞破碎较多，影响最终实验结果。 4.2白细胞计数 在使用血球计数板时，遇到了镜下看不到计数板格子线的问题:起初，我们小组能够在镜下观察到细胞，但是细胞清晰时无法找到计数板格子线。后来我们

临床免疫学和免疫检验第十四章 免疫细胞的分离及其表面标志检测技术讲义

第十四章免疫细胞的分离及其表面标志检测技术 第一节免疫细胞的分离 一、外周血单个核细胞的分离 外周血中单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的比重与红细胞、多核白细胞及血小板不同，介于1.075～1.090之间，红细胞及粒细胞在1.092左右，血小板在1.030～1.035之间，因而可利用一种比重介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液作密度梯度离心，使一定比重的细胞按相应密度梯度分布而加以分离。 分离介质是分离各类细胞的关键，对分离介质的基本要求是：①对细胞无毒；②基本等渗；③不溶于血浆及分离物质；④有特定的比重。 Ficoll分离液为常规的淋巴细胞分离液，其比重为1.077±0.002，主要用于分离外周血中单个核细胞。 其分布由上到下依次为：稀释的血浆层、单个核细胞层、粒细胞层和红细胞层。 二、淋巴细胞的分离 纯淋巴细胞群的采集是利用单核细胞在37℃和Ca2+存在时，能主动黏附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶的特性，从单个核细胞悬液中除去单核细胞，从而获得纯淋巴细胞群。主要的方法有： 1.黏附贴壁法； 2.吸附柱过滤法； 3.磁铁吸引法； 4.Percoll分离液法。 三、T、B细胞和T细胞亚群的分离 （一）磁性微球分离法 （二）荧光激活细胞分离仪分离法 四、分离细胞的保存及活力测定 1.短期保存技术：将分离的细胞用适量含10%～20%灭活小牛血清的Hanks、Tc-199、RPMI1640或其他培养液稀释重悬。短期保存可置于4℃保存。 2.长期保存技术：液氮深低温（-196℃）环境保存细胞，加入二甲亚砜作为保护剂。 活力测定最简便常用的为台盼蓝染色法。这是一种阴离子型染料，不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，但死亡细胞的细胞膜通透性增加，可使染料通过细胞膜进入细胞内，使死细胞着色呈蓝色，通过死亡细胞与活细胞的百分比可反映细胞活力。 第二节淋巴细胞表面标志及亚群分类 常用于鉴定和检测淋巴细胞表面标志的是簇分化抗原（CD）。CD抗原的鉴定和检测依赖于其相应的单克隆抗体。 一、T细胞表面标志及其亚群 T细胞是参与机体细胞免疫反应并起主导调节作用的一组免疫细胞。所有的T细胞均有共同的标志性抗原，一般认为是CD3分子，不同功能的T细胞亚群又有各自的标志性抗原。根据T细胞的免疫效应功能和表面CD分子表达至少可以将T细胞分为：CD3+CD4+CD8-辅助性T细胞（help T cell Th）、CD3+CD4－CD8+细胞毒性T细胞（cytotoxic T cell ,Tc或CTL）和CD4+CD25+调节性T细胞（regulatory T cell ,Tr或Treg）等几组亚群。 （一）T细胞表面主要的CD抗原 1.CD2：表达于全部人T细胞和NK细胞表面，因其能与绵羊红细胞（SRBC）结合，又称为绵羊红细胞受体。

实验6小鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象观察教案资料

实验 6 小鼠腹腔 巨噬 细胞吞噬现象观察

实验6小鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象观察 姓名：李思露 学号：131140040 实验目的 1. 通过对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞活动的观察，加深理解细胞吞噬作用的过 程； 2. 了解巨噬细胞吞噬能力检测的形态学方法实验原理 吞噬作用也称为胞吞作用( cellular eating),指细胞通过质膜内陷形成内吞泡的方式吞入不能渗透过膜的较大固体物质(直径一般大于250mm)的过程。许多原生动 物通过吞噬作用摄取营养；高等动物体内的巨噬细胞和嗜中性粒细胞的吞噬作用成为动物体非特异性免疫的重要组成部分。不同动物来源的巨噬细胞或同一动物来源的不同巨噬细胞吞噬功能强弱不同，个体吞噬细胞的平均吞噬能力是机体非特异性免疫功能强弱的重要反映。 吞噬细胞细胞膜上有识别某些病原体相关分子及凋亡细胞磷脂酰丝氨酸等配体的受体，可以使巨噬细胞识别结合病原体、凋亡细胞及其它异物，引起受体胞内区活化，进而导致与其相连的细胞骨架重排引发吞噬作用。 ck griuk'd maR-rtal 巨噬细胞吞噬自身衰老凋亡细胞而不吞噬正常细胞，原因是，凋亡细胞细胞膜内侧面的磷脂酰丝氨酸反转到胞膜外侧面而被巨噬细胞模式识别受体识别。 吞噬功能一般用吞噬百分率和吞噬指数两个指标反映。 吞噬百分率=吞噬有鸡红细胞的巨噬细胞数/巨噬细胞总数x 100 %

吞噬指数=吞噬的鸡红细胞总数/吞噬有鸡红细胞的巨噬细胞数 三、实验材料、试剂及器材 （一）材料: 6-8周龄健康小白鼠，实验前1~2天，每只腹腔注射4%淀粉肉汤 1. 健康小白鼠: 1mL。 2. 抗凝鸡血 （二）试剂： 1. 4漩粉肉汤 2. D-Hanks 液 3. 0.85 %生理盐水 4. 180IU/mL肝素钠生理盐水溶液 （三）用品 普通光学显微镜、10mL低速离心机、托盘天平、水浴箱（37C）、5mL一次性注射器、10mL玻璃离心管、试管架、胶头滴管等 四、实验操作 1. 巨噬细胞收集：脱颈处死小鼠；腹腔注入2mL生理盐水，揉匀；剪开腹部皮肤，暴 露腹膜；用带针头的注射器插进腹腔吸取腹腔液。 2. 体外吞噬。0.3mL腹腔液+0.3mL鸡红细胞悬液，37C吞噬。 3. 制片及观察。分别在0min、15min、30min、45min制备细胞混合液临时装片，观 察现象并作图。 五、实验结果 巨噬细胞吞噬物的变化亦具有与时间相关的特点，巨噬细胞吞噬物在形态上易于观察和检测，这些特征使得巨噬细胞在损伤时间推断过程中具有重要的法医学意义。 六、作业与思考题

巨噬细胞吞噬实验&沉淀实验实验报告

实验二 一巨噬细胞吞噬功能实验 【原理】巨噬细胞是单核吞噬细胞系统的主要细胞，局域活跃的吞噬功能。吞噬细胞受抗原刺激后活化，可使吞噬功能明显增强。 在小鼠体内诱导腹腔巨噬细胞产生后，再给小鼠腹腔注射鸡血红细胞，30min后处死小鼠，取出腹腔液，以冷亚甲蓝染色，显微镜下计数吞噬红细胞的百分数，及观察吞噬细胞内鸡红细胞的数目，以判断吞噬细胞的杀伤能力，由此间接地测定机体的非特异性免疫水平。【方法】体内法： （1）实验前3小时，小鼠腹腔注射6%无菌淀粉液1ml，诱导巨噬细胞渗出至腹腔中。（2）实验时，每只小鼠注射鸡红细胞1ml，轻柔腹部，使其在腹腔中分布均匀，利于吞噬。（3）30min后，将小鼠拉颈处死，固定，打开腹腔暴露肠管，用载玻片轻擦腹腔，使腹腔液均匀涂于载玻片过，再滴一滴0.03%冷亚甲蓝溶液，盖上盖玻片。 （4）高倍镜下进行观察，计数。 【结果】 【分析】 在小鼠体内诱导腹腔巨噬细胞产生后，再给小鼠注射鸡红细胞后镜检腹腔液，可观察到巨噬细胞吞噬鸡红细胞的现象，并且可看到部分鸡红细胞聚集到吞噬细胞附近。 二沉淀反应双向琼脂扩散实验

【原理】将可溶性抗原与相应抗体分别加入琼脂板上的孔内，二者均可发生扩散，并且随扩散距离的增大浓度降低，在抗原抗体比例适宜处形成可见的沉淀线。本实验是定性实验，常用于分析抗原抗体的纯度关系以及相互关系。 【方法】 （1）制板：将熔化的1%琼脂加在载玻片上约5ml （2）打孔：待琼脂凝固后，将载玻片置于打孔样板上，用打孔器打孔 （3）加样：在中央孔内加抗体，上下两孔加抗原1，左右加抗原二，每孔加10μl （4）结果观察：将琼脂板置于湿盒，37℃一天后观察结果。 【结果】 在中央孔与添加抗原1的孔之间出现沉淀线，有抗原抗体反应，为阳性反应，说明抗原1与抗体相对应。中央孔与添加抗原2的孔之间没有沉淀线，说明抗原2与抗体之间不相对应。【分析】抗体与抗原发生扩散时，随扩散距离的增大浓度降低，在抗原抗体比例适宜处形成可见的沉淀线。当有沉淀线出现时，说明有抗原抗体反应。 琼脂铺板时要一次铺成，并且铺设均匀。 打孔时要注意垂直打孔，注意不要有裂隙产生。

小鼠腹腔巨噬细胞准备

peritoneal macrophage cell preparation 1.小鼠颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡3分钟，取出小鼠，置于无菌纸上，腹面朝上； 2.用镊子提起小鼠下腹部皮肤，剪开一小口，撕开皮肤，完全暴露腹膜； 3. 10ml注射器装上大号针头，注入6 ml Hanks液或PBS，用镊子提起腹膜，向腹腔中注入Hanks液，针尖朝上，避开肠和脂肪，回抽腹腔液，不同方向冲洗数次，吸出腹腔液； 4.细胞悬液离心200×g10分钟，用Hanks液洗一次，用RPMI1640－5%小牛血清悬起细胞，2×106细胞/ ml. 5.细胞悬液置入培养瓶，37度培养2小时后，吸弃上清，用预热培养基洗二次，留下贴壁细胞； 6.含10 mM EDTA的PBS加入培养瓶，覆盖细胞，37度孵育20分钟，用吸管用力吹打下细胞，或用橡皮擦帚轻轻刮下细胞，即为腹腔巨噬细胞，纯度一般大于90%，每只小鼠平均可得2×106腹腔巨噬细胞。 注: 1.雌性小鼠6-8周最适用。雄性小鼠肠壁脂肪多。不利于腹腔液收集； 2.在冲洗过程中应小心，以免刺破血管或肠壁，血液流入腹腔液； 3.吸出的腹腔液应洗后再贴壁，否则有血浆膜形成，影响贴壁； 4.贴壁巨噬细胞分离有较多方法，如利多卡因孵育，但大多不理想，故细胞分离后应用台盼兰染色检测活力； 5.橡皮擦帚可自制，用自行车气门芯上的橡皮管套在预先折弯的滴管尖头上，灭菌后使用，较为实用；

6.炎性巨噬细胞的制备可用3%的脱水硫羟乙酸培养基2ml，注入小鼠腹腔，4天后同法集腹腔细胞，每只小鼠腹腔细胞产量可以增加到3×107细胞左右。需指出的是炎性巨噬细胞的功能活性与正常腹腔巨噬细胞有很大差异。 小鼠腹腔巨噬细胞提取的经验方法总结如下： 第一： 用刺激物质的方法，一般都是在实验前三天腹腔注射3%巯基乙醇酸钠（应该现配现用，否则效果较差）每只2ML。实验当天将小鼠断头处死，置于1%的新洁尔灭或者75%的乙醇溶液中浸泡2—3MIN，消毒皮肤。于无菌环境下向腹腔注入HANKS液8ML，用手轻轻挤压腹壁20次以上，吸出灌洗液。将灌洗液离心2000R/MIN，5MIN，弃去上清，用HANKS洗涤3次，合并小鼠细胞，用含15%小牛血清的RPMI1640培养液重悬细胞，记数，调整腹腔细胞浓度为 2*10*6/ML，将腹腔细胞加入24孔培养板中，1ML/孔，于37摄氏度，5%CO2培养箱中培养3–4小时，使巨噬细胞贴壁，取出培养板，弃去上清夜，用HANKS也反复吹洗培养孔3遍，除去非粘附细胞，即为巨噬细胞单层.（炎性巨噬细胞，即激活的巨噬细胞） 第二种： 不加刺激物质的提取方法： 1实验结束后，拉颈处死小鼠，用75%酒精消毒。 2用带9号针头的5ML注射器腹腔注入含75%小牛血清的HANKS液 （5%NBS—HBSS）轻柔腹部吸出腹腔液体（内含腹腔细胞0，反复抽吸几次。 3 1500 R/MIN离心8MIN，用5%NBS—HBSS洗2次。 4将腹腔细胞用含10%小牛血清1640液（10%NBS—1640）配成2*10#6/ML 加到24孔平底培养板中，1ML/孔，5% CO2温箱孵育2H 5每孔用5%NBS—HBSS洗3次，弃去未粘附细胞，贴壁细胞为巨噬细胞单层

T细胞分离

T淋巴细胞分离技术免疫细胞的分离、纯化和鉴定第一节免疫细胞的分离、纯化技术各种免疫细胞的分工与协作，共同完成免疫应答及其调控，因此，各种免疫细胞的分离及其功能测定对于了解其在免疫应答中的作用及相互关系有着重要意义。 免疫细胞分离的方法有很多，主要是根据细胞的理化性状、功能，以及细胞表面标志等的差异而设计的。 粘附分离法、尼龙毛柱分离法、羰基铁分离法等主要根据细胞的属性（如粘附）和功能不同，旨在将粘附和非粘附或粘附力较小的细胞分离开。 有人证实免疫细胞在玻璃或塑料平面上的粘附能力分别为： 巨噬细胞或单核细胞〉树突状细胞二抗体产生细胞〉B淋巴细胞〉T淋巴细胞二红细胞。 粘附的细胞可通过trypsin洗脱而收集。 葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法和Percoll不连续密度梯度离心法等是根据细胞的大小及比重的差异进行细胞分离。 E花环沉淀分离技术主要是利用细胞表面标志进行细胞分离。 尚可利用特异性单克隆抗体结合其它技术分选细胞，如补体细胞毒分离法，洗淘分离法（panning）、流式细胞术分离法，以及免疫磁珠法分离细胞技术等。 一般应根据实验的目的及所需细胞的种类、纯度及数量等要求来确定采用何种方法。 实验一Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞（PBMC 外周血单个核细胞（Peripheralbloodmonuclearcell,PBMC的分离是免疫学研究中的一项基本技术。 目前国内外分离PBMC的常用方法是葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法 (ficoll-hypaquedensitygradientcentrifugation )，用此方法分离PBMC纯度可达95%，淋巴细胞约占90%，其中T淋巴细胞占80%, B淋巴细胞占4?10%。 ficoll-hypaque混合溶液，又称淋巴细胞分层液，在分离人PBMC时，要求

巨噬细胞提取方法

我是按照经典的方法，注射淀粉肉汤3天后腹腔灌洗得来的，培养3小时除去上清液后纯化了巨噬细胞然后加药的，培养24小时后可以看到细胞已经贴壁了，但是我发现加了LPS的组细胞悬浮的比阴性组多，这个就很奇怪了，我的LPS浓度从10ng一直到20ug/mL都有设置，但是吞噬率无一超过阴性组的。(1) 小鼠2 ml/只腹腔注射3%巯基乙醇酸钠，三天后颈椎脱臼处死小鼠，用75%乙醇浸湿3 min消毒，置超净台中； (2)用镊子将小鼠下腹部皮肤提起，剪开一个小口，将皮肤撕开，完全暴露腹膜； (3)用镊子提起腹膜，用10ml注射器向小鼠腹腔中注入6ml PBS缓冲液,针尖向上，避开肠和脂肪,反复回抽腹腔液，不同的方向冲洗数次，最后吸出腹腔液； (4)将细胞悬液1000r/min条件下离心10min，用PBS液洗涤l次，用含10%的胎牛血清RPMIl-1640将细胞悬起，台盼蓝染色，当活细胞数达到95%以上时调整细胞浓度至2×106个/ml。 (5)将细胞接种到96孔细胞培养板中，每孔100μL，把细胞培养板放置于37℃5%CO2的培养箱中培养3h； (6)3h后取出细胞培养板，清洗1次，去除未贴壁的细胞，弃去上清液，然后每孔加入100mL RPMI-1640完全培养液,此时细胞培养板孔内的贴壁细胞即为纯化以后的小鼠腹腔巨噬细胞。 按照以上述制备和纯化腹腔巨噬细胞方法处理细胞后，200μL/孔加入不同浓度的阳性药LPS，阴性对照孔加200μL培养基，放置于培养箱中，培养24 h后取出细胞板，弃上清，用PBS液200μL/孔洗3遍，加0.1%中性红溶液200μL/孔，继续于培养箱中孵育3h。取出细胞板，弃上清，用PBS液200μL/孔洗两遍后加细胞裂解液(醋酸与无水乙醇等体积混合) 200μL/孔，将96孔板放在微型振荡器上振荡10 min后，放在4℃冰箱12h过夜。将细胞板520 nm 波长处测定吸光度。按下式计算吞噬中性红增加率%=(给药孔A值一对照孔A值)/对照孔A值×100%。