提高显微镜分辨率的方法简述
目录
1 选题背景 (1)
2 方案论证及过程论述 (1)
2.1 像差 (1)
2.1.1 球面像差 (1)
2.1.2 慧形像差 (2)
2.1.3 色像差 (2)
2.2 照明对显微镜分辨率的影响 (2)
2.2.1 非相干光照明 (2)
2.2.2 相干光照明 (2)
2.2.3 部分相干光照明 (3)
2.2.4 临界照明 (3)
2.3 衍射 (3)
2.3.1 对两个发光点的分辨率 (3)
2.3.2 对不发光物体的分辨率 (4)
2.4 光噪声 (6)
3 结果分析 (6)
4 结论 (7)
4.1 提高光学显微镜与电子显微镜分辨率的方法 (7)
4.1.1 提高光学显微镜分辨率的方法 (7)
4.1.2 如何提高电子显微镜分辨率 (7)
参考文献 (9)
1 选题背景
显微镜是实验室最重要的设备之一，对观察微小物体细节的显微镜来说，评价光学显微镜及电子显微镜的重要指标之一是分辨本领。显微镜的分辨能力是指其分辨近距离物体细微结构的能力，它主要是显微镜的性能决定。通常是以显微镜的分辨率级即显微镜能分辨开两个物点的最小距离d来表示，d值越小，则显微镜的分辨能力越强。
人眼本身就是一台显微镜，在标准照明条件下，人眼在明视距离(国际公认为25cm)上的分辨率约等于1/10mm。对于观察两条直线来说，由于直线能刺激一系列神经细胞，眼睛的分辨率还能提高一些，这就是显微镜的分划板使用双线对准的原理所在。人眼的分辨率只有1/10mm，那么比1/10mm小的物体或比1/10mm近的两个微小物体的距离，人眼就无法分辨了。这时人们开始研制出放大镜和显微镜，显微镜的分辨率计算公式为：d=0.61入/NA；式中：d为分辨率(μm)；入为光源波长(μm)；NA为物镜的数值口径(也称镜口率)。
造成显微镜光学像欠缺的因素主要在物镜组，有像差、衍射和光噪声等，它们是影响显微镜分辨率的主要因素，其次照明对显微镜的分辨率也有一定的影响。
对于显微镜的使用者来讲，应该对造成显微镜分辨率下降的因素有比较清楚的认识，并知道克服和减少这些因素的方法。本文从几何像差、色像差、衍射、干涉和照明几个方面分析了对显微镜分辨率的影响,指出了孔径数的增加，从衍射角度看对显微镜分辨率的提高有好处，但从几何像差的角度看则会降低显微镜的分辨率;并指出了照明对显微镜分辨率的影响是不可忽略的等。
2 方案论证及过程论述
2.1 像差
像差可分为单色像差和色像差两大类。单色像差有五种：（1）球面像差；（2）彗形像差；（3）像散；（4）像场弯曲；（5）畴变。其中（1）和（2）是由大孔径引起的，（3）、（4）、（5）是由大视场引起的。显微镜需要大孔径，但不需要大视场，所以显微镜的单色像差主要是（1）和（2）。
2.1.1 球面像差
单球面公式只有在满足近轴光线的条件下才能成立。当孔径较大时，有许多远轴光线也进入了透镜，近轴光线和远轴光线经透镜折射后不能在同一点上会聚。换句话说，主轴上一物点经透镜成像后，像不是一个点，而是一个圆斑，这样就产生了球面像差。消除的方法有二：一是在透镜前加一光阑，用以限制远轴光线的进入。这样做，会使显微镜的孔径数降低，从而降低了显微镜的分辨率。二是用复合透镜法，显微镜物镜就是采用这种方法制作的。
2.1.2 慧形像差
傍轴物点.它正适用于显微镜发出的宽阔光束经透镜后在像平面上不再交于一点，而是形成如彗星样的亮斑，称为慧形像差。球差和慧差往往混在一起，只有当轴上物点的球差已消除时，才能明显地观察到傍轴物点的慧差。
2.1.3 色像差
由于折射率随颜色、波长而变，同一物点不同颜色的光所成的像，无论位置和大小都不同，这样就产生了色像差。消除的方法是采用消色差透镜组，即用冕牌玻璃的凸透镜和火石玻璃的凹透镜组成复合透镜。当把由几何光学计算得到的几何像差和色像差基本消除后，由于存在衍射效应，理想成像条件仍不能满足。
2.2 照明对显微镜分辨率的影响
2.2.1 非相干光照明
瑞利判据的前提就是两光点的光是非相干光。一般我们讨论的两光点都是自然光，这样，由两点发出的光在像面上叠加时，遵守强度叠加法则。当一个物点（点光源）在像平面上产生的爱里斑的中心正好落在近傍的第二个物点（点光源）所产生的爱里斑的边缘上时，则说它们是显微镜刚能分辨的两个物点（点光源），绘出两物点（等亮度）间隔为瑞利间格(即后面（8）式中的d)时两个爱里斑的重叠情况，就能得到合强度曲线，这曲线在两个峰值的中间有一个凹陷，其最低点的强度I c等于峰值I o的0.735倍，即：
I c：：I o = 0.735 ：1
这可以看作是瑞利判据的强度表述：若在两个点像的中央，合成强度分布有26.5%的下陷，则我们说对应的两个物点刚刚能被分辨。
2.2.2 相干光照明
用发自一点的单色光来照明标本，从标本上相邻两点发出的光是相干光。在两物点间隔为瑞利间格时，将像的强度曲线绘制出来。这时我们看到两个像点中央的光强度没有凹陷，反而高出原最大值的47%。
为什么会这样呢？是因为相干光照明引起的。当两物点（点光源）发出的光是相干光时，在像平面上是振幅相加（干涉）而不是强度相加。
为了对相干照明下的两物点也规定一个分辨标准，并且这个标准对不同的相干性照明都适用，比照瑞利判据，我们采用像平面上光强曲线在两个峰值间有一个凹陷，其最低点的光强等于峰值的0.735倍，这时我们认为对应物平面上的两点是刚好能被分辨的。于是，增大两物点间距，使像平面合强度曲线有26.5%的中央凹陷，经计算：
d＇= 0.77λ/NA （1）
此距离d＇即为最小分辨距离。
2.2.3 部分相干光照明
实际显微镜的照明都是部分相干的，完全的相干照明只是极限情况，而完全的非相干照明只存在于一些特殊的距离。对于部分相干照明来说，分辨本领介于相干情形和非相干情形之间，其最小分辨间隔可以表示为：
d〞= Cλ/NA （2）系数C介于0.61和0.77之间，它的值与相干度有关。调节照明的相干度，可以在一定的范围内改变显微镜的分辨本领，改变的范围为：
(0.77-0.61)/0.61 *100%= 26.4% （3）
可见改变的范围为26.4%这个数值是不可忽略的。
2.2.4 临界照明
无论点光源还是扩展光源，它们都是程度不同的相干照明。让一个亮度均匀的光源紧靠在场阑的后方，并由聚光镜成像在物平面上，对物平面上的标本照明。由光源上轴点发出的光受孔径光阑的限制，在聚光镜上的光锥截面是一个圆盘，它的半径以α表示，聚光镜到物平面的距离以L表示，其间的煤质折射率以n＇表示，则爱里斑(相干区域)的直径为：
D = 1.22λL/n＇·α（4）
式中α是受孔径光阑限制的，增大光阑则D变小，于是相干度变小，分辨率提高，反之分辨率降低。
上式中L/n＇·α近似和聚光镜的有效数值孔径N·A＇成反比，
即有：
D∝λ/N·A＇（5）因此可以说，聚光镜的数值孔径控制照明的相干度，从而影响显微镜的分辨率。2.3 衍射
在衍射理论的基础上，应区分对发光点和非发光物体两种不同情况的分辨。
2.3.1 对两个发光点的分辨率
按瑞利判据，在理想成像条件下，对于两个自发光点（即认为各点发出非相干光），在显微镜像平面上两个像点刚好能分辨开的最小距离d＇应等于爱利斑的半径，即为：
d＇≈1.22λl＇/Dˊ= 0.61λ/n＇sinu＇（6）式中：Dˊ——入瞳直径；
l＇——像点至物镜（入瞳）中心的距离；
u＇——物镜像方孔径角见图；
由于显微镜的成像满足正弦条件，即有
n·d·sinu = n＇d＇sinu＇ (7) 将上述正弦条件代入式（6）中，且有n＇= 1，则得到
d = 0.61λ/n·sinu = 0.61λ/NA (8)
上式中d即为显微镜物平面上能被分辨的两发光点的最小距离。
2.3.2 对不发光物体的分辨率
实际显微镜中的成像情况要更为复杂。通常被观察的标本并非自发观体，而是由外加光源与照明系统照明的。标本各点的像是由光源（非点光源）发出的光线照射标本后，由标本上各点的散射或衍射形成的。
阿贝研究并创立了不发光物体的成像理论。按照这一理论，当用显微镜观察被照明物体的精细结构时，物体对所通过的光束的作用类似于衍射光栅，因此衍射作用对于像的形成具有决定意义。阿贝所建立的不发光物体分辨率公式，就是选择由许多平行的明暗交替条纹构成的最简单的衍射作为显微镜的理想标本成像而导出的。
根据衍射理论，在垂直的相干光照明条件下，显微镜对不发光物体的分辨率为:
d = λ/NA （9）
在倾斜照明条件下，显微镜对不发光物体的分辨率为
d = λ/2NA = 0.5/NA （10）
式中λ是所采用的照明光的波长。
表1-1是采用λ = 0.555μm的绿灯照明时，按式(10)计算得到的不同数值孔径物镜的分辨率值。
表1-1 不同数值孔径显微物镜的分辨率值
干系物镜油浸物镜
NA 0.10 0.30 0.65 0.95 1.25 1.40
d(μm) 2.75 0.92 0.42 0.29 0.22 0.20 式6～10表明，显微镜的分辨率具有波长的数量级，其具体数值取决于照明光的波长和显微镜的数值孔径。因此，为提高分辨本领，可采用短波长的光照明。例如，紫外线显微镜、x射线显微镜以及电子显微镜等都是提高显微镜本领的有效途径。
提高分辨本领的更主要途径是增大显微镜的数值孔径，即可通过提高物方折射率和增大物方孔径来达到。以透射式生物显微镜为例，对于物方（盖玻片与物镜前透镜之间）介质为空气的物镜（通常为干洗物镜），其最大数值孔径为1，对应的物方孔径角μ0(即玻璃-空气界面上的全反射临界角)约为41°实际上干系物镜的数值孔径最大不能超过0.95，由n0·sinu0 = n·sinu可知，其相应的u0和u角的值分别为39°和72°(见图1-1)；增大数值孔径的另一个重要手段是增大ｎ值，使之大于1。为此采用浸液物
镜，即在盖玻片和物镜的前透镜之间充以液体，如图1-2所示。当以水作浸液时，在盖玻片与浸液的界面上发生全反射的临界角约为61.5°，由工作距离和透镜直径所确定的角u值实际上可以达到64°，因而水浸物镜的最大数值孔径可达
NA = n·sinu = 1.33×sin64°= 1.20
实际上更多采用的是n = 1.5～1.6浸油，如甘油（n = 1.455）、杉木油（n = 1.515）等。其中，以杉木油用得最多，因其折射率与盖玻片及物镜前透镜基本相同，光线在界面上既不产生折射，也不产生全反射。此时，最大孔径角u可达67°，相应数值孔径可达1.40；进一步采用高折射率浸油（如二碘甲烷n = 1.741）可使数值孔径最高达到1.6。比较图1-1和图1-2可以看出，采用浸液物镜比采用干系物镜可以得到更大的数值孔径。
图1-1
图1-2
但是，当提高孔径数时，从前面的像差分析可知，球面像差、慧形像差都会变大，反而降低了显微镜的分辨率。
2.4 光噪声
各种不传递有关物体信息的光都属于光噪声，如由于在玻璃表面内反射所造成的杂散光和由于灰尘微粒或玻璃中的小气泡引起的散射光，也包括不均匀的照射光的起伏部分等等。由于光噪声是不传递标本信息的，所以它的存在就一定程度上影响到了标本上两靠近点的分辨，也就影响到了其分辨率。
3 结果分析
从上面的讨论中，我们知道，无论是几何像差、色像差，还是由于圆孔(透镜)产生的衍射，都会使得点物不能成点像，而是成为一光斑。它们在不同程度上使得相互靠近的两物点无法分辨。早期来说，因像差和杂散光引起的像的不完善完全掩盖了由衍射引起的像的模糊。现在，由衍射以外的其它原因引起的像的不完善性已减到很小。当仪器恰好在设计条件下运行时，衍射就成为实际的也是理想的极限了。因此在介绍显微镜的分辨率的时候，一般书上只涉及物镜的圆孔衍射，而不再考虑像差和杂散光等。从公式（8）可以明显看出，提高孔径数就能提高分辨率。或者说，物镜越靠近标本、物镜和标本间填充物(透明)的折射率越高，则显微镜的分辨本领越高，这是适合高放大率部分的。在低倍部分，我们从显微镜上能看到，物镜的倍数越小，它离标本的距离越大。为
什么？因为孔径数越大，几何像差就越大，显微镜的分辨本领就越低。这和（8）式的结论正好是相反的。由于放大倍数较低，通过牺牲孔径数来减少像差是比较合算的。这样既满足了设计要求，又使成本降到了最低。总之，影响显微镜分辨率的以上几种因素是始终存在的，通过合理的设计和组装，才能达到最佳要求。另外，照明对显微镜分辨率的影响也是不可忽略的，因为它对分辨率的改变范围达到了26.4%。
4 结论
4.1 提高光学显微镜与电子显微镜分辨率的方法
电子显微镜是显微光学一次革命，它使显微光学的最小分辨间距从0.2μm提高到0.2～0.3纳米，使人类能够看到一排排原子阵列的晶格结构，从而极大地提高了人类研究微观世界的能力，而光学显微镜和电子显微镜最大分辨率不同的原理使所使用的波长不同，前者使用可见光，分辨率最高达0.1微米级，最高放大倍率只能到1600倍左右。后者使用电子，根据物质波波长理论，在几十千伏至几百千伏的电压加速下，可使电子显微镜的分辨率达到纳米级，比光学显微镜的分辨率高千倍。
4.1.1 提高光学显微镜分辨率的方法
提高光学显微镜分辨率的方法根据分辨率的计算公式：d=0.61入/NA，可知提高光学显微镜分辨率的方法有三种：①减低波长。可见光最短波长0.39μm，若用0.13μm的紫外线作光源，则会比普通显微镜提高3倍以上。可是由于紫外线显微镜的透镜材料需特殊材质(透过紫外线的材料)制造，加之紫外线显微镜不能用肉眼直接观察，只能通过摄制显微镜照片进行分析，这样就限制了紫外线显微镜的应用。②增大折射率。一般显微镜的物镜分为低倍物镜(2×、4×、10×等)、高倍物镜(40×、45×等)、水浸物镜(63×)、油浸物镜(90×、100×)等。低倍物镜也叫干系物镜，其介质是空气，折射率是1；水浸物镜介质是蒸馏水，其折射率为1.33；油浸物镜介质是香柏油或其它透明油，其折射率一般在1．52左右，接近透镜和载玻片的折光率。水浸物镜和油浸物镜不仅放大倍数高而且由于使用高折射率的介质，分辨率也高。③加大物镜的镜口率来提高分辨力。数值孔径(镜口率)公式为：NA=n·sinα；式中：n——物镜与标本之间的介质析射率；α——物镜的镜口角。如低倍物镜指1×～6×，NA值为0.04～0.15；中倍物镜指6×～25×，NA值为0.15～0.40；高倍物镜指25×～63×，NA值为0.35～0.95；而油浸物镜指90×～100×，NA值可达1.25～1.40。由此可见，那NA值越大，说明显微镜物镜的镜口率越大，d值越小，分辨力越高，物象越清楚。
4.1.2 如何提高电子显微镜分辨率
电子显微镜就是利用短光波来提高分辨力以检视较小物体的。物镜分辨力的高低与成像是否清楚有密切的关系。而目镜没有这种性能，因为目镜只放大物镜所成的像。为
此，提高电子显微镜放大率的方法可从以下几个方面考虑：①保持良好的加速电压。加速电压不能很低，正常应保持在20～30KV。②尽量缩短工作距离。工作距离不能太大，一般保持在5～8mm，以缩短探头接收信号的距离。③保持好样品的倾斜度，样品倾斜10—150，使二次电子发射及接收的多。④聚光镜放在600—650左右，(数值越大，束斑尺寸越小，分辨率越高)。⑤对中良好，保证电子束对中，信号强，亮度好。⑥及时更换新的灯丝，使灯丝饱和，束流稳定，并使束流值保持在100—150。⑦物镜光阑合轴好(特征点在2000X倍以上时，基本同心聚焦散焦)。⑧延长抽真空的时间以提高真空度(一般在30分钟以上基本达到平衡)或检查真空系统的密封状态。
参考文献
【1】郭嘉泰.冯若冰.周晋阳.影响显微镜分辨率的几种因素.中国医学物理学杂志.2003.10.第20卷第4期.
【2】胡玉华.胡玉芝.陈守清.如何提高显微镜的分辨率.品牌与标准化.2010(2)
【3】李明.唐玄之.光学显微镜分辨率讨论时的一些问题.江苏教育学院学报（自然科学版）.1985(2)
【4】吴德邦.邹利元.对显微镜分辨率的几点.认识泸州医学院学报.1994(3)
【5】汤栋.透射电子显微镜分辨率的改进.电子显微学报.2004(4)
【6】姚启钧.光学教程.高等教育出版社.2011.5
【7】迟泽英.陈文建.东南大学出版社.2008.11
电子显微镜的景深和显微镜的分辨率
电子显微镜的景深和显微镜的分辨率 显微镜由于电子的波动性，当它通过小孔光阑时会发生衍射现象。衍射结果表现为每个物点形成的像是一个圆斑(周围的副光环可忽略不计)。定义这个衍射圆斑的半径为衍射像差。在像方或物方可分别表示为: (Ar&ff),=0.611/a(1一22a) (1rdff)o=0.61A/ao(1一22b) 式中各符号的意义同前。可以看出加大光阑孔径角as，可以减小衍射差。但实际工作中还应注意这样会带来的不利影响。 景深和焦探(11) 景深就是在保持像清晰的前提下，可允许物面在轴上的移动距离，或者说可允许物上不同部位处的凹凸差。根据图1-10，理想情况下物点P成像在Q点.如果物面在P点前后P’P"之间移动，则在Q看到的物有一定横向宽度。如果透镜有各种像差。该系统实际存在一个对物的可分辨极限(分辨率8)。显微镜价格只要P’P,,间平面上的物点宽度小于或等于s，则在Q处的成像效果与P点处几何物点造成的像斑是相同的，即其清晰度相同。因此可允许的物在轴上最大距离PP"称景深Do，它由下式定出: D0二 (1一23) 式中d一电子光学系统对物的分辨率; ao一电子束的物方有效孔径角. 对于100kV的电镜，偏光显微镜如果分辨率为lnm，物镜孔径角为5X10-1rad，则景深Do=200nm.这表示样品厚度或表面凹凸起伏不超过200nm时，能得到均匀清晰的图像.由此可见景深也常常成为对样品厚度的限制因素之一。
把景深这一特性转换到像方便可得到焦深Df。它就是为了得到清晰度相同的像，可允许的图像显示或记录平面的轴向位移量。参照(1一23)可得: Df=B;/a(1一24) 式中S;一像方的分辨率;a;一电子束的像方有效孔径角。 显微镜像方分辨率S;受观察荧光屏的分辨率所限制。通常荧光屏的分辨率为505m。如电镜最高放大倍数M=10`X，电子束孔径角ao=5X10-’rad，则最长焦深(D1),o,==100M。即使在最低放大倍数M=10’X，相应的ao=1X10-’rad时，最低焦深(Df).二50cm。可见电镜的焦深值很大.这就说明了在透射电镜中为什么我们只对荧光屏调焦，而把像记录在其下方的电子感光板或其上方的35mm胶片上时，总能得到清晰的像。 本文由广州深华实验室仪器设备整合发布
光学显微镜的结构与使用方法
光学显微镜的结构与使用方法 【目的要求】 1、熟悉光学显微镜的主要构造及其性能。 2、掌握低倍镜及高倍镜的使用方法。 3、初步掌握油镜的使用方法。 4、了解光学显微镜的维护方法。 【实验原理】 光学显微镜(light microscope)是生物科学和医学研究领域常用的仪器，它在细胞生物学、组织学、病理学、微生物学及其他有关学科的教学研究工作中有着极为广泛的用途，是研究人体及其他生物机体组织和细胞结构强有力的工具。 光学显微镜简称光镜，是利用光线照明使微小物体形成放大影像的仪器。目前使用的光镜种类繁多，外形和结构差别较大，有些类型的光镜有其特殊的用途，如暗视野显微镜、荧光显微镜、相差显微镜，倒置显微镜等，但其基本的构造和工作原理是相似的。一台普通光镜主要由机械系统和光学系统两部分构成，而光学系统则主要包括光源、反光镜、聚光器、物镜和目镜等部件。 光镜是如何使微小物体放大的呢？物镜和目镜的结构虽然比较复杂，但它们的作用都是相当于一个凸透镜，由于被检标本是放在物镜下方的1～2倍焦距之间的，上方形成一倒立的放大实相，该实相正好位于目镜的下焦点（焦平面）之内，目镜进一步将它放大成一个虚像，通过调焦可使虚像落在眼睛的明视距离处，在视网膜上形成一个直立的实像。显微镜中被放大的倒立虚像与视网膜上直立的实像是相吻合的，该虚像看起来好像在离眼睛25cm处。 分辨力是光镜的主要性能指示。所谓分辨力(resolving power)也称为辨率或分辨本领，是指显微镜或人眼在25cm的明视距离处，能清楚地分辨被检物体细微结构最小间隔的能力，即分辨出标本上相互接近的两点间的最小距离的能力。据测定，人眼的分辨力约为100 μm。显微镜的分辨力由物镜的分辨力决定，物镜的分辨力就是显微镜的分辨力，而目镜与显微镜的分辨力无关。光镜的分辨力（R）（R值越小，分辨率越高）可以下式计算： 这里n为聚光镜与物镜之间介质的折射率（空气为1、油为1.5）； 为标本对物镜镜口张角的半角，sin的最大值为1； 为照明光源的波长（白光约为0.5m）。放大率或放大倍数是光镜性能的另一重要参数，一台显微镜的总放大倍数等于目镜放大倍数与物镜放大倍数的乘积。 一、光学显微镜的基本构造及功能 （一）机械部分 1、镜筒：为安装在光镜最上方或镜臂前方的圆筒状结构，其上端装有目镜，下端与物镜转换器相连。根据镜筒的数目，光镜可分为单筒式或双筒式两类。单筒光镜又分为直立式和倾斜式两种。而双筒式光镜的镜筒均为倾斜的。镜筒直立式光镜的目镜与物镜的中心线互成45度角，在其镜筒中装有能使光线折转45度的棱镜。
提高显微镜分辨率的方法简述
目录 1 选题背景 (1) 2 方案论证及过程论述 (1) 2.1 像差 (1) 2.1.1 球面像差 (1) 2.1.2 慧形像差 (2) 2.1.3 色像差 (2) 2.2 照明对显微镜分辨率的影响 (2) 2.2.1 非相干光照明 (2) 2.2.2 相干光照明 (2) 2.2.3 部分相干光照明 (3) 2.2.4 临界照明 (3) 2.3 衍射 (3) 2.3.1 对两个发光点的分辨率 (3) 2.3.2 对不发光物体的分辨率 (4) 2.4 光噪声 (6) 3 结果分析 (6) 4 结论 (7) 4.1 提高光学显微镜与电子显微镜分辨率的方法 (7) 4.1.1 提高光学显微镜分辨率的方法 (7) 4.1.2 如何提高电子显微镜分辨率 (7) 参考文献 (9)
1 选题背景 显微镜是实验室最重要的设备之一，对观察微小物体细节的显微镜来说，评价光学显微镜及电子显微镜的重要指标之一是分辨本领。显微镜的分辨能力是指其分辨近距离物体细微结构的能力，它主要是显微镜的性能决定。通常是以显微镜的分辨率级即显微镜能分辨开两个物点的最小距离d来表示，d值越小，则显微镜的分辨能力越强。 人眼本身就是一台显微镜，在标准照明条件下，人眼在明视距离(国际公认为25cm)上的分辨率约等于1/10mm。对于观察两条直线来说，由于直线能刺激一系列神经细胞，眼睛的分辨率还能提高一些，这就是显微镜的分划板使用双线对准的原理所在。人眼的分辨率只有1/10mm，那么比1/10mm小的物体或比1/10mm近的两个微小物体的距离，人眼就无法分辨了。这时人们开始研制出放大镜和显微镜，显微镜的分辨率计算公式为：d=0.61入/NA；式中：d为分辨率(μm)；入为光源波长(μm)；NA为物镜的数值口径(也称镜口率)。 造成显微镜光学像欠缺的因素主要在物镜组，有像差、衍射和光噪声等，它们是影响显微镜分辨率的主要因素，其次照明对显微镜的分辨率也有一定的影响。 对于显微镜的使用者来讲，应该对造成显微镜分辨率下降的因素有比较清楚的认识，并知道克服和减少这些因素的方法。本文从几何像差、色像差、衍射、干涉和照明几个方面分析了对显微镜分辨率的影响,指出了孔径数的增加，从衍射角度看对显微镜分辨率的提高有好处，但从几何像差的角度看则会降低显微镜的分辨率;并指出了照明对显微镜分辨率的影响是不可忽略的等。 2 方案论证及过程论述 2.1 像差 像差可分为单色像差和色像差两大类。单色像差有五种：（1）球面像差；（2）彗形像差；（3）像散；（4）像场弯曲；（5）畴变。其中（1）和（2）是由大孔径引起的，（3）、（4）、（5）是由大视场引起的。显微镜需要大孔径，但不需要大视场，所以显微镜的单色像差主要是（1）和（2）。 2.1.1 球面像差 单球面公式只有在满足近轴光线的条件下才能成立。当孔径较大时，有许多远轴光线也进入了透镜，近轴光线和远轴光线经透镜折射后不能在同一点上会聚。换句话说，主轴上一物点经透镜成像后，像不是一个点，而是一个圆斑，这样就产生了球面像差。消除的方法有二：一是在透镜前加一光阑，用以限制远轴光线的进入。这样做，会使显微镜的孔径数降低，从而降低了显微镜的分辨率。二是用复合透镜法，显微镜物镜就是采用这种方法制作的。
细胞生物学光学显微镜
2.光学显微镜技术有哪些新发展？它们各有哪些突出优点？为什么电子显微镜不能完全代替光学显微镜？ .答：（1）光学显微镜技术的新发展 光学显微镜技术在细胞学研究中发挥了重要作用，随着多种现代生物学技术与光镜技术的结合，使光学显微镜展现出了新的活力，也有了新的发展。光学显微镜技术主要有普通复式光学显微镜技术、荧光显微镜技术、激光扫描共焦显微镜技术、相差和微分干涉显微镜技术、录像增差显微镜技术等。 （2）光学显微镜技术的优点 普通复式光学显微镜使用简单，操作方便，可以配备多套仪器使用，如暗视野显微镜。 荧光显微镜是目前在光镜水平上对特异性蛋白质等生物大分子定性、定位的最有利工具。 激光扫描共焦显微镜成像清晰，分辨率高，可以通过光学切片观察较厚样品的内部结构。 相差和微分干涉显微镜不需要染色就可以观察活细胞甚至研究细胞核、线粒体等细胞器的动态，并且具有很强的立体感。 录像增差显微镜分辨率比普通光镜提高了一个数量级，而且可在高分辨率下研究活细胞。 光学显微镜的优点如下表所示： 光学显微镜技术荧光显微镜 主要特点 样品进行荧光标记 突出特点 只有激发荧光可以成像 激光扫描共焦显微镜光通过一个小孔或裂缝成 像，只有焦平面的光成像图像比较清晰，分辨率提高1.4~1.7倍 相差显微镜增加一个“相差板”，夸大 样品密度相位差 不需要染色，可观察活体 微分干涉显微镜棱镜折射，增加样品密度的 明暗区别 增加反差，更具立体感 暗视野显微镜倒置显微镜黑暗背景下利用散射光观 察 照射系统和物镜颠倒位置 细胞及细胞器边缘轮廓清晰 增加了集光器和载物台的距离， 可放置培养皿观察 录像增差显微镜计算机辅助微分干涉显微 镜提高了分辨率，可观察颗粒的运动 （3）电子显微镜不能完全代替光学显微镜的原因 尽管电子显微镜具有分辨率高这一光学显微镜无法比拟的优越性，但光学显微镜在科研中的地位是不可取代的。这可以从以下几个方面进行说明。 ①细胞生物学是在显微、亚显微和分子三个结构层次上研究细胞的，在显微水平上研究细胞需用光学显微镜，在亚显微水平上研究细胞需用电子显微镜，因此二者是在细胞的不同显微水平上观察细胞结构的。 ②普通光学显微镜样品易制备，而电子显微镜对样品要求很高。 ③电子显微镜不能观察活细胞及其动态变化。 ④普通光学显微镜操作简单，对环境和设备的要求没有电子显微镜高。
练习使用光学显微镜
练习使用光学显微镜 蔡清柑 1、教学目标 ①知识目标：正确说明显微镜的结构与功能 ②能力目标：能独立、规范地使用显微镜，能观察到清晰的物像；在认识、使用显微镜的过程中发现问题，并尝试解决问题； ③情感目标：认同显微镜的规范操作方法，养成爱护显微镜的习惯，初步形成实事求是的科学态度。 2、教学重点、难点的分析： ①教学重点显微镜的使用方法。 ②教学难点规范使用显微镜，并观察到物象。 3、课前准备 教师：准备显微镜，并逐个检查（准备两个不同倍数的目镜）；两种标本（写有“上”字的玻片；永久装片），纱布，显微镜的使用课件；课前每班培训几名学生，以便课上帮助教师辅导其他学生。 4、教学程序 4.1导入新课复习显微镜的结构名称及其用途。（让学生指着显微镜说出结构名称及其用途）（展示图片：细胞图）让学生了解细胞非常小（提示图中物象之所以看的很清楚是被放大了百倍以上）而且形状各异。应该要会使用显微镜。 4.2新课过程 1、认识材料和用具引导学生观察实验桌上显微镜、玻片标本、擦镜纸、纱布等。
2、取镜和安放右手握，左手托；略偏左，安目镜。指导学生看书35页及课件展示：取镜和安放。强调安放目镜时，手指不要触摸镜头，对学生进行爱护显微镜的教育。 3、显微镜的构造学生四人一组，看书对照实物回顾显微镜各部分名称。 4、显微镜的使用教师对学生的回答进行鼓励，引出显微镜的使用。介绍两种观察标本： （1）写有“上”字的玻片；（2）永久装片 5、对光要求学生先看书，然后指导学生动手观察。按照先看到一个白亮的视野→放入标本→-看到清晰像的顺序。 （1）低倍物镜对准通光孔。（2）左眼看，右眼睁。（注：两眼都睁开）（3）转动反光镜，看到明亮视野。（注：双手转动反光镜） 6、观察学生边看书或课件展示自学边操作显微镜进行观察。 （1）标本放在载物台上，压住，正对通光孔。 （2）镜筒先下降，直到接近标本。 （3）左眼注视目镜，使镜筒缓缓上升，直到看清物像。 7、强调 ⑴用低倍物镜（4×，即最短的物镜）对准通光孔。 ⑵转动转换器的手法要正确，对学生进行爱护显微镜的教育。 ⑶镜筒先下降后上升，镜筒下降时，眼睛一定要看着物镜，以免压碎标本。 ⑷左眼看目镜，右眼睁开是为了画图。引导学生继续观察。 8、讨论并回答问题： ⑴视野中“上”字是否倒置，其物像比实际大小放大了多少倍？ ⑵若视野中“上”字位于左上方，怎样操作才能将其移至视野中央？ ⑶物像放大倍数越大，视野会越暗还是越亮？ ⑷物像放大倍数越大，视野中看到的细胞数目越多还是越少？
光学显微镜的使用步骤和维护保养
光学显微镜的使用步骤和维护保养 一、操作步骤和注意事项 （一）正置显微镜 1、安放右手握住镜臂，左手托住镜座，使镜体保持直立。桌面要清洁、平稳，要选择临窗或光线充足的地方。单筒的一般放在左侧，距离桌边3～4厘米处。 2、清洁检查显微镜是否有毛病，是否清洁，镜身机械部分可用干净软布擦拭。透镜要用擦镜纸擦拭，如有胶或粘污，可用少量二甲苯清洁之。 3、对光镜筒升至距载物台1～2厘米处，低倍镜对准通光孔。调节光圈和反光镜，光线强时用平面镜，光线弱时用凹面镜，反光镜要用双手转动。若使用的为带有光源的显微镜，可省去次步骤，但需要调节光亮度的旋钮。 4、安装标本将玻片放在载物台上，注意有盖玻片的一面一定朝上。用弹簧夹将玻片固定，转动平台移动器的旋钮，使要观察的材料对准通光孔中央。 5、调焦调焦时，先旋转粗调焦旋钮慢慢降低镜筒，并从侧面仔细观察，直到物镜贴近玻片标本，然后左眼自目镜观察，左手旋转粗调焦旋钮抬升镜筒，直到看清标本物像时停止，再用细调焦旋钮回调清晰。操作注意：不应在高倍镜下直接调焦；镜筒下降时，应从侧面观察镜筒和标本间的间距；要了解物距的临界值。若使用双筒显微镜，如观察者双眼视度有差异，可靠视度调节圈调节。另外双筒可相对平移以适应操作者两眼间距。 6、观察若使用单筒显微镜，两眼自然张开，左眼观察标本，右眼观察记录及绘图，同时左手调节焦距，使物象清晰并移动标本视野。右手记录、绘图。镜检时应将标本按一定方向移动视野，直至整个标本观察完毕，以便不漏检，不重复。光强的调节：一般情况下，染色标本光线宜强，无色或未染色标本光线宜弱；低倍镜观察光线宜弱，高倍镜观察光线宜强。除调节反光镜或光源灯以外，虹彩光圈的调节也十分重要。 （1）低倍镜观察观察任何标本时，都必须先使用低倍镜，因为其视野大，易发现目标和确定要观察的部位。 （2）高倍镜观察从低倍镜转至高倍时，只需略微调动细调焦旋钮，即可使物像清晰。使用高倍镜时切勿使用粗调焦旋钮，否则易压碎盖玻片并损伤镜头。转动物镜转换器时，不可用手指直接推转物镜，这样容易使物镜的光轴发生偏斜，转换器螺纹受力不均匀而破坏，最后导致转换器就会报废。（3）油镜的观察先用低倍镜及高倍镜将被检物体移至视野中央后，再换油镜观察。油镜观察前，应将显微镜亮度调整至最亮，光圈完全打开。使用油镜时，先在盖玻片上滴加一滴香柏油（镜油），然后降低镜筒并从侧面仔细观察，直到油镜浸入香柏油并贴近玻片标本，然后用目镜观察，并用细调焦旋钮抬升镜筒，直到看清标本的焦段时停止并调节清晰。香柏油滴加要适量。油镜使用完毕后一定要用擦镜纸沾取二甲苯擦去香柏油，并再用干的擦镜纸擦去多余二甲苯。 7、结束操作观察完毕，移去样品，扭转转换器，使镜头V字型偏于两旁，反光镜要竖立，降下镜筒，擦抹干净，并套上镜套。若使用的是带有光源的显微镜，需要调节亮度旋钮将光亮度调至最暗，再关闭电源按钮，以防止下次开机时瞬间过强电流烧坏光源灯。 （二）倒置显微镜倒置显微镜与正置显微镜的主要区别在于物镜位于载物台下方，这样有利于观察时在上方对样品进行一些实时操作。 倒置显微镜操作过程基本与双筒的正置显微镜相似，需注意以下几点：观察时可调节铰链式双目目镜至舒适的位置。组织培养液或水溅到载物台上、物镜上或显微镜镜架上可能会损伤设备。如果溅上后，应该立即从墙上插座拔下电源线，擦去溅出液或水。一定要轻柔转动光强调节钮，不要试图将旋钮转过终点位置。使用后一定要先将灯的强度调至最小再关电源。使用后要旋转三孔转换器，使物镜镜片置于载物台下侧，防止灰尘的沉降。 （三）实体显微镜又称体视显微镜或解剖显微镜。操作步骤基本和双筒正置显微镜类似：取用解剖镜时，移动需用双手，保持稳重。若需连镜箱搬动，应将镜箱锁好，同时镜箱的钥匙必须拔除。镜管上若有防尘罩，应取下并换上目镜及眼罩。将样品置于玻片上或蜡盘中再放到载物盘上待观察。拧开锁紧螺丝，把镜
人眼、光学显微镜以及电子显微镜成像原理、分辨率及其影响因素
人眼、光学显微镜以及电子显微镜成像原理、分辨率及其影响因素 文章主要从人眼成像原理入手，逐步介绍光学显微镜以及电子显微镜的成像原理、分辨率和分辨率的影响因素。分三部分作简要说明。 一人眼成像 1 、人眼结构 人眼成像原理图如下，所取的距离为250米，则人眼成像见下图1： 图1 人眼结构原理图 2 、成像原理 自然界各种物体在光线的照射下，不同颜色可以反射出明暗不同的光线，这些光线透过角膜、晶状体、玻璃体的折射，眼球中的角膜和晶状体的共同作用，相当于一个“凸透镜”，在视网膜上形成倒立、缩小的实像，构成光刺激。视网膜上的感光细胞（圆锥和杆状细胞）受光的刺激后，经过一系列的物理化学变化，转换成神经冲动，由视神经传入大脑层的视觉中枢，然后我们就能看见物体了,经过大脑皮层的综合分析，产生视觉，人就看清了正立的立体像。 人的眼睛是个复杂的成像系统，而人的大脑像CPU处理这些图像，让人能在视觉上感知到图像。人眼成像最主要的是晶状体和视网膜。晶状体调整眼睛的焦距是光束集中到富有视锥细胞和视柱细胞的视网膜上，在进行光电（生物电）变化，由视觉神经把信号传至大脑生成图像。人类的目标就是能制造出能过可以和眼睛相媲美的视觉系统，这是机器智能化的关键部分。
3 、分辨率 说及人眼分辨率首先需要知道如下几个概念： （1）视角：观看物体时，人眼对该物体所张的角度。 （2）分辨角：人眼的分辨角：指刚能看出两黑点时，两黑点对人眼的张角。（3）分辨力：人眼分辨图像细节的能力称为分辨力，可用分辨角来衡量，分辨角的倒数为分辨力。它也反映了人眼的视力。分辨力还与照度及景物相对对比度有关。 人眼分辨率指的是人眼能够分辨两个相邻的点或者线的能力，通常以刚能被分开的两点或两线与眼睛瞳孔中心所成的张角表示。其最小分辨的距离在0.2mm 左右。要观察和分析更小的距离时，就必须借助于专门仪器。观看物体时，能清晰看清视场区域对应的分辨率为2169 ×1213。再算上上下左右比较模糊的区域，最后的分辨率在6000×4000。 4 、分辨率影响因素 分辨率的大小由视网膜分辨影像能力的大小来判定,具体是由眼的屈光介质 决定如角膜、晶体、玻璃体等，如果屈光介质变得混浊或存在不正即近视、远视、散光等时,即使视网膜功能良好，也会看不清。 二光学显微镜 1 、成像原理图 图2 光学显微镜成像原理图 2 、成像原理
实验一 普通光学显微镜的构造和使用
实验一普通光学显微镜的构造和使用 一、目的要求 1.掌握普通光学显微镜的基本构造、使用方法、保护要点。 2.掌握普通光学显微镜油浸系的原理。 3.使用油镜观察几种细菌的基本形态。 二、显微镜的基本构造 显微镜由机械装置和光学系统两大部分组成（图1-1）。 光学显微镜的构造(图1-1) 1. 物镜转换器 2. 接物镜 3.游标卡尺 4.载物台 5.聚光器 6. 彩虹光阑 7.光源 8. 镜座 9. 电源开关 10. 光源滑动变阻器 11. 粗调螺旋 12. 微调螺旋 13. 镜臂 14.镜筒 15.目镜 16.标本移动螺旋 1．机械装置 镜座（base）和镜臂（arm）镜座位于显微镜底部，呈马蹄形，它支持全镜。镜臂有固定式和活动式两种，活动式的镜臂可改变角度。镜臂支持镜筒。 镜筒（body tube）是由金属制成的圆筒，上接目镜，下接转换器。镜筒有单筒和双筒两种，单筒又可分为直立式和后倾式两种。而双筒则都是倾斜式的，倾斜式镜筒倾斜45°。双筒中的一个目镜有屈光度调节装置，以备在两眼视力不同的情况下调节使用。
转换器（no sepiece）为两个金属碟所合成的一个转盘，其上装3—4个物镜，可使每个物镜通过镜筒与目镜构成一个放大系统。 载物台（stage）又称镜台，为方形或圆形的盘，用以载放被检物体，中心有一个通光孔。在载物台上有的装有两个金属压夹称标本夹，用以固定标本；有的装有标本推动器，将标本固定后，能向前后左右推动。有的推动器上还有刻度，能确定标本的位置，便于找到变换的视野。 调焦装置是调节物镜和标本间距离的机件，有粗动螺旋（coarse adjustment）即粗调节器和微动螺旋（fine adjustment）即细调节器，利用它们使镜筒或镜台上下移动，当物体在物镜和目镜焦点上时，则得到清晰的图像。2．光学系统 物镜（objective）物镜安装在镜筒下端的转换器上，因接近被观察的物体，故又称接物镜。其作用是将物体作第一次放大，是决定成像质量和分辨能力的重要部件。物镜上通常标有数值孔径、放大倍数、镜筒长度、焦距等主要参数。如：NA0．30；10×；160/0．17；16mm。其中“NA0．30”表示数值孔径（numerical aperture，简写为NA），“10×”表示放大倍数，“160/0．17”分别表示镜筒长度和所需盖玻片厚度（mm），16mm表示焦距。 目镜（ocular lens）装于镜筒上端，由两块透镜组成。镜把物镜造成的像再次放大，不增加分辨力，上面一般标有7×、10×、15×等放大倍数，可根据需要选用。一般可按与物镜放大倍数的乘积为物镜数值孔径的500—700倍，最大也不能超过1000倍的选择。目镜的放大倍数过大，反而影响观察效果。 聚光器（condenser）光源射出的光线通过聚光器汇聚成光锥照射标本，增强照明度和造成适宜的光锥角度，提高物镜的分辨力。聚光器由聚光镜和虹彩光圈（iris diaphragm）组成，聚光镜由透镜组成，其数值孔径可大于1，当使用大于1的聚光镜时，需在聚光镜和载玻片之间加香柏油，否则只能达到1．0。虹彩光圈由簿金属片组成，中心形成圆孔，推动把手可随意调整透进光的强弱。调节聚光镜的高度和虹彩光圈的大小，可得到适当的光照和清晰的图像。 光源（light source）较新式的显微镜其光源通常是安装在显微镜的镜座内，通过按钮开关来控制；老式的显微镜大多是采用附着在镜臂上的反光镜，反光镜是一个两面镜子，一面是平面，另一面是凹面。在使用低倍和高倍镜观察时，用平面反光镜；使用油镜或光线弱时可用凹面反光镜。 滤光片（filter）可见光是各种颜色的光组成的，不同颜色的光线波长不同。如只需某一波长的光线时，就要用滤光片。选用适当的滤光片，可以提高分辨力，增加影像的反差和清晰度。滤光片有紫、青、蓝、绿、黄、橙、红等各种颜色的，分别透过不同波长的可见光，可根据标本本身的颜色，在聚光器下加相应的滤光片。 三、油镜物镜的基本原理 微生物学研究用的显微镜的物镜通常有低倍物镜（16mm，10×）、高倍物镜（4mm，40—45×）和油镜（1．8 mm，95—100×）三种。油镜通常标有黑圈或红圈，也有的以“OI（oil immer-sion）字样表示，它是三者中放大倍数最大的。根据使用不同放大倍数的目镜，可使被检物体放大1000—2 000多倍。从图Ⅲ-3中可看出油镜的焦距和工作距离（标本在焦点上看得最清晰时，物镜与样品之间的距离）最短，光圈则开得最大，因此，在使用油镜观察时，镜头离标本十分近，需特别小心。
光学显微镜成像原理
物体介于物镜的焦距和二倍焦距之间，成倒立放大的实相，据凸透镜成像规律，知实相在异侧二倍焦距之外。实相位于目镜焦点或者焦点之内，被再次放大，形成放大的虚像。而人的眼睛是可以看到虚像的（这个原理自然清楚）。要搞清显微镜的使用原理，就得对物理中的凸透镜成像有所理解。 { 只有当物体对人眼的张角不小于某一值时，肉眼才能区别其各个细部，该量称为目视分辨率ε。在最佳条件下，即物体的照度为50~70lx及其对比度较大时，可达到1'。为易于观测，一般将该量加大到2'，并取此为平均目镜分辨率。物体视角的大小与该物体的长度尺寸和物体至眼睛的距离有关。有公式y=Lε 距离L不能取得很小，因为眼睛的调节能力有一定限度，尤其是眼睛在接近调节能力的极限范围工作时，会使视力极度疲劳。对于标准(正视)而言，最佳的视距规定为250mm(明视距离)。这意味着，在没有仪器的条件下，目视分辨率ε=2'的眼睛，能清楚地区分大小为0.15mm的物体细节。 在观测视角小于1'的物体时，必须使用放大仪器。放大镜和显微镜是用于观测放置在观测人员近处应予放大的物体的。 （一）放大镜的成像原理 表面为曲面的玻璃或其他透明材料制成的光学透镜可以使物体放大成像，光路图如图1所示。位于物方焦点F以内的物AB，其大小为y，它被放大镜成一大小为y'的虚像A'B'。 放大镜的放大率 Γ=250/f' 式中250--明视距离，单位为mm f'--放大镜焦距，单位为mm 该放大率是指在250mm的距离内用放大镜观察到的物体像的视角同没有放大镜观察到的物体视角的比值。 （二）显微镜的成像原理 显微镜和放大镜起着同样的作用，就是把近处的微小物体成一放大的像，以供人眼观察。只是显微镜比放大镜可以具有更高的放大率而已。 图2是物体被显微镜成像的原理图。图中为方便计，把物镜L1和目镜L2均以单块透镜表示。物体AB位于物镜前方，离开物镜的距离大于物镜的焦距，但小于两倍物镜焦距。所以，它经物镜以后，必然形成一个倒立的放大的实像A'B'。A'B'位于目镜的物方焦点F2上，或者在很靠近F2的位置上。再经目镜放大为虚像A''B''后供眼睛观察。虚像A''B''的位置取决于F2和A'B'之间的距离，可以在无限远处（当A'B'位于F2上时），也可以在观察者的明视距离处（当A'B'在图中焦点F2之右边时）。目镜的作用与放大镜一样。所不同的只是眼睛通过目镜所看到的不是物体本身，而是物体被物镜所成的已经放大了一次的像。 （三）显微镜的重要光学技术参数 在镜检时，人们总是希望能清晰而明亮的理想图象，这就需要显微镜的各项光学技术参数达到一定的标准，并且要求在使用时，必须根据镜检的目的和实际情况来协调各参数的关系。只有这样，才能充分发挥显微镜应有的性能，得到满意的镜检效果。
光学显微镜的结构及使用
光学显微镜的结构及使用 使用日期：2017年9月26日 一、教材分析 人类在很长时间，都是依靠肉眼来观察世界上形形色色的事物的，不过我们周围还有很多肉眼看不到的微小物体，要看到它们就要借助显微镜，这节课就来介绍如何使用显微镜。 二、实验目的 1、练习使用显微镜，学会规的操作方法。 2、能够独立操作显微镜。 3、能够将标本移动到视野中央，并看到清晰的图像。 三、重点与难点 重点：显微镜的结构和使用方法 难点：正确使用显微镜；理解实物与物像之间的关系到；理解玻片移动方向和物像移动方向之间的关系。 三、学情分析 学生们平时没有接触显微镜的机会，但是都通过很多途径见过显微镜，对它有一定的认识和了解。 四、教学环境及资源准备 显微镜，有“e”字的玻片，动、植物标本，擦镜纸，纱布。 在上课前分好组，并把显微镜发放到各组的操作台上，放置到指定的位置；发放实验时所用的器材及材料。 【新课导学】： 知识回顾：生命活动的基本层次包括哪些？ 上节课我们学习到了细胞是生命活动结构和功能的最基本单位，那么同学们是否知道我们如果想观察细胞的话，应该用什么工具呢？ 答：初中的时候我们用低倍光学显微镜观察细胞的，现在，让我们尝试用高倍镜来观察多种类的细胞。 基本容： 一．展示显微镜，学生回顾基本的结构（学生课堂讨论，教师总结）
对照图片，认清基本结构，并总结。 目镜----长放大倍数小 镜头 物镜----长放大倍数大（学生观察镜头，并总结）光学结构 平面镜----调暗视野 反光镜 凹面镜----调亮视野（学生亲自操作，总结）准焦螺旋----使镜筒上升或下降 （有粗细之分） 机械结构转换器----更换物镜 光圈----调节视野亮度 （有大小之分） 导：同学们已经学会了显微镜的基本结构，那你们想不想用显微镜来看看微观的世界是什么样子的？ 答：想。那下面我们就来看看细胞吧。 二．用显微镜观察物象 给出永久性装片，让学生利用显微镜观察，并分成小组讨论，总结基本的操作方法。 基本操作步骤： 1.用低倍物镜观察 放置装片(标本正对通光孔的中心)→侧面观察降镜筒(转动粗准焦螺旋)→左眼观察找物像(转动粗准焦螺旋升高镜筒)→转动细准焦螺旋将物像调清晰。 2.用高倍物镜观察
超高分辨率共聚焦显微镜
北京大学生命科学院 “超高分辨率共聚焦显微镜”招标采购项目 招标文件 编号：2013[017] 北京大学实验室与设备管理部 二〇一三年七月四日
目录 第一部分投标邀请 (2) 第二部分招标说明 (4) 第三部分货物需求一览表及技术规格 (7) 第四部分设备明细表 (12) 第五部分技术规格偏离表 (13) 第六部分原厂授权书 (14) 开标一览表 (15)
第一部分投标邀请 公告日期：2013年7月4日 项目名称：北京大学生命科学院“超高分辨率共聚焦显微镜”招标采购项目 招标编号: 2013[017] 招标机构名称: 北京大学实验室与设备管理部 地址：北京市海淀区颐和园路5号北京大学红5楼邮编：100871 电话： 62758587 62751412；传真：62751411 联系人：张宇波石铄 北京大学实验室与设备管理部（以下简称“招标机构”）具体承办北京大学生命科学院“超高分辨率共聚焦显微镜”招标采购项目的招标采购事宜，邀请合格投标人就下列货物和有关服务提交密封投标。合格投标人均可在招标机构得到进一步的信息和查阅招标文件。 1.招标内容 1.1招标货物名称：超高分辨率共聚焦显微镜 1.2数量及技术规格要求：数量壹套，技术规格要求详见标书 1.3交货地点：北京首都机场 2.合格投标人必须符合《中华人民共和国政府采购法》第二十二条之规定。 3.招标文件购买时间和办法：2013年7月4日—2013年7月24日(工作日)9:00至16:30时在招标机构（北京大学西门内红1楼、红2楼之间横楼二层5216室）购买招标文件。标书售价200元人民币，售后不退。 4.投标人可从北京大学招标公告栏或实验室与设备管理部网站下载本次招标的电子版标书（https://www.wendangku.net/doc/197203709.html,/more2.asp），以供参考。 5.接受投标时间、投标截止时间及开标时间 5.1接受投标及投标截止时间：所有投标书应于2013年7月25日8:30前递交到上述购买标书地址， 逾期恕不接受。 5.2开标时间：兹定于2013年7月25日8:30整在北京大学实验室与设备管理部后院会议室进行开标、 评标工作。 6.投标细则 6.1 投标内容 6.1.1最终用户：北京大学生命科学院
奥林巴斯显微镜：物镜的数值孔径和分辨率
奥林巴斯显微镜：物镜的数值孔径和分辨率 显微镜物镜的数值孔径是其收集光并解决细标本细节 在一个固定的物体距离的能力的量度。图象形成光波穿过试样和在倒置锥体进入物镜，如图1这个锥形光的纵向切片显示了孔径角，是由物镜的焦距确定的值。角μ是二分之一的数值孔径角（A），它与通过以下等式的数值孔径：数值孔径(NA) = n(sin μ)其中n是物镜的前透镜和试样玻璃盖，一个值，该范围为1.00空气1.51专门浸没油之间的成像介质的折射率。许多作者替换变量α为μ在数值孔径方程。从这个等式很明显，当成像介质为空气（具有折射率，n= 1.0），则数值孔径仅取决于所述角μ的最大值为90°。角度的sin μ，因此，具有1.0（SIN（90°）= 1），这是一个透镜与空气作为所述成像介质操作的理论最大数值孔径（使用“干”显微镜物镜）的最大值。在实践中，但是，它是很难实现的数值孔径值在0.95以上的干的物镜。图2示出了一系列从变焦距和数值孔径的物镜衍生光锥。作为光锥改变，角度μ从7°的增加在图2（a）至图2的（c）60°，从而增加了数值孔径从0.12至0.87，接近极限时空气是成像媒介。通过检查数值孔径方程，很明显的是，折射率是在实现数值孔径大于1.0的限制因素。因此，为了获得较高的工作数值孔径，物镜的前透镜和试样之间的介质的折射率必须增加。显微镜物镜，
现已允许成像在其他媒体，如水（折射率= 1.33），甘油（折射率= 1.47），和浸油（折射率= 1.51）。护理应与这些物镜可用于防止当一个物镜是，使用具有比它的物镜是为不同的浸没介质，这将产生不希望的伪影。我们建议显微镜从来不使用专为油浸无论是与甘油或水的物镜，虽然有几个新的物镜，最近已经出台，将与多个介质。您应与制造商检查是否有任何疑虑。多数物镜在60倍和100倍（或更高版本）的放大倍率范围是设计用于浸油的使用。通过检查上面的数值孔径方程，我们发现，最高理论数值孔径与浸油获得的是1.51（当sin（μ）= 1）。在实践中，然而，大多数的油浸物镜的1.4的最大数值孔径，以最常用的数值孔径范围为1.0至1.35。物镜的数值孔径也依赖，在一定程度上，在校正光学像差的量。高度校正的物镜趋于如示于下表1中有大得多的数值孔径为各个放大倍数。如果我们采取了一系列典型的10倍物镜作为一个例子，我们看到，平场校正的规划物镜，数值孔径增加对应校正色差和球面像差：平场消色差，NA = 0.25; 平场萤石，NA = 0.30; 并平场复消色差透镜，NA = 0.45。物镜的数值孔径放大平场 消色差 （NA）平场 萤石 （NA）平场
光学显微重建技术与超分辨率显微镜
光学显微重建技术与超分辨率显微镜 一．光学显微重建技术 光学显微镜技术受限于光的波长，而电子显微镜虽然可以达到纳米级的分辨率，但通电的结果容易造成样品的破坏，因此能观测的样本也相当有限。这几年超高分辨率荧光显微镜跨越了一大步，使得研究者可以从纳米级观测细胞突起的伸展，从而宣告200―750纳米大小范围的模糊团块的时代结束了。 这些超高分辨率荧光显微镜技术有些基于图像照明，比如受激发射减损(stimulated emission depletion ,STED)以及相关的RESOLFT显微技术，还有饱和结构光照明显微(Saturated Structured Illumination Microscopy)，有些基于单分子开关和定位，比如随机光学重建显微镜(stochastic optical reconstruction microscopy, STORM)，以及(荧光)光敏定位显微技术(PALM, photoactivated localization microscopy)，利用这些方法可以达到生物样品成像10-100nm的分辨率，从而令研究人员观察到亚细胞结构的具体细节。 但是由于大部分蛋白分子只有几纳米，如果要直接解析细胞中这些分子的相互作用，还需要更高的分辨率。在这篇文章中，研究人员就介绍了一种实验方法，可以将荧光基团化学转换成对荧光状态光敏感的稳定暗态(dark state)，从而再次提高超高分辨率荧光显微镜技 术的分辨率。 STORM和(F)PALM方法都能通过顺序开关和单个荧光基团定位构建探针高分辨率图谱， 这需要这些探针在暗态中准备好，并带有一部分能随时开启的开关。此前曾利用过多种光控开关和光敏荧光探针，比如一些有机染料，荧光蛋白和量子点，但是部分由于这些荧光基团无法在暗态中准备，因此限制了高分辨率成像的发展。 研究人员提供的这种实验程序方法详细介绍了荧光染料和还原剂(NaBH4)的准备方法，解决了将荧光基团化学转换成对荧光状态光敏感的稳定暗态的问题。这种方法能在原位进行，由于还原染料的吸收光谱具有强烈的蓝色转移，因此染料能有效的转换进暗态。这种方法能用于多种可见光谱荧光基团，因此将能在超高分辨率显微技术中发挥重要的作用。 二．超分辨率显微镜NIKON N-STORM简介 随机光学重建显微（STORM)技术通过探测显微标本内的各荧光团的精确定位信息重建超分辨率荧光影像。N-STORM利用NIKON的强大Ti-E倒置式显微镜应用3维高精度多通道分子定位和重建，从而实现了比传统显微镜高10倍（横向约20nm）的超高分辨率。此强大技术能够观察到纳米级分子相互作用，开启研究的全新境界。 ?比传统光学显微镜高10倍的超高分辨率（横向约20nm） N-STORM利用显微镜样本内部数以千计的离散荧光体分子，实现2D或3D高精度定位信息，展现无比壮观 的超高分辨率图像，与传统光学显微镜相比，空间分辨率可提高10倍。
光学显微镜的结构及其使用
第一章：细胞概述 重点解析：光学显微镜的结构及其使用 普通光学显微镜的构造主要分为三部分：机械部分、照明部分和光学部分。 ◆机械部分 （1）镜座：是显微镜的底座，用以支持整个镜体。 （2）镜柱：是镜座上面直立的部分，用以连接镜座和镜臂。 （3）镜臂：一端连于镜柱，一端连于镜筒，是取放显微镜时手握部位。 （4）镜筒：连在镜臂的前上方，镜筒上端装有目镜，下端装有物镜转换器。 （5）物镜转换器(旋转器)：接于棱镜壳的下方，可自由转动，盘上有3－4个圆孔，是安装物镜部位，转动转换器，可以调换不同倍数的物镜，当听到碰叩声时，方可进行观察，此时物镜光轴恰好对准通光孔中心，光路接通。 （6）镜台(载物台)：在镜筒下方，形状有方、圆两种，用以放置玻片标本，中央有一通光孔，我们所用的显微镜其镜台上装有玻片标本推进器(推片器)，推进器左侧有弹簧夹，用以夹持玻片标本，镜台下有推进器调节轮，可使玻片标本作左右、前后方向的移动。 （7）调节器：是装在镜柱上的大小两种螺旋，调节时使镜台作上下方向的移动。 ①粗调节器(粗螺旋)：大螺旋称粗调节器，移动时可使镜台作快速和较大幅度的升降，所以能迅速调节物镜和标本之间的距离使物象呈现于视野中，通常在使用低倍镜时，先用粗调节器迅速找到物象。 ②细调节器(细螺旋)：小螺旋称细调节器，移动时可使镜台缓慢地升降，多在运用高倍镜时使用，从而得到更清晰的物象，并借以观察标本的不同层次和不同深度的结构。
◆照明部分 装在镜台下方，包括反光镜,集光器。 （1）反光镜：装在镜座上面，可向任意方向转动，它有平、凹两面，其作用是将光源光线反射到聚光器上，再经通光孔照明标本，凹面镜聚光作用强，适于光线较弱的时候使用，平面镜聚光作用弱，适于光线较强时使用。 （2）集光器(聚光器)位于镜台下方的集光器架上，由聚光镜和光圈组成，其作用是把光线集中到所要观察的标本上。 ①聚光镜：由一片或数片透镜组成，起汇聚光线的作用，加强对标本的照明，并使光线射入物镜内，镜柱旁有一调节螺旋，转动它可升降聚光器，以调节视野中光亮度的强弱。 ②光圈(虹彩光圈)：在聚光镜下方，由十几张金属薄片组成，其外侧伸出一柄，推动它可调节其开孔的大小，以调节光量。 ◆光学部分 （1）目镜：装在镜筒的上端，通常备有2－3个，上面刻有5×、10×或15×符号以表示其放大倍数，一般装的是10×的目镜。 （2）物镜：装在镜筒下端的旋转器上，一般有3－4个物镜，其中最短的刻有“10×”符号的为低倍镜，较长的刻有“40×”符号的为高倍镜，最长的刻有“100×”符号的为油镜，此外，在高倍镜和油镜上还常加有一圈不同颜色的线，以示区别。 显微镜的放大倍数是物镜的放大倍数与目镜的放大倍数的乘积，如物镜为10×，目镜为10×，其放大倍数就为10×10=100。 【成像特点】 观察到的是经两次放大后的倒立虚像 【使用方法】 ■低倍镜的使用方法 （1）取镜和放置：显微镜平时存放在柜或箱中，用时从柜中取出，右手紧握镜臂，左一手托住镜座,将显微镜放在自己左肩前方的实验台上，镜座后端距桌边1－2寸为宜，便于坐着操作。 （2）对光：用拇指和中指移动旋转器(切忌手持物镜移动)，使低倍镜对准镜台的通光孔(当转动听到碰叩声时，说明物镜光轴已对准镜筒中心)。打开光圈，上升集光器，并将反光镜转向光源，以左眼在目镜上观察(右眼睁开),同时调节反光镜方向，直到视野内的光线均匀明亮为止。 （3）放置玻片标本：取一玻片标本放在镜台上，一定使有盖玻片的一面朝上，切不可放反，用推片器弹簧夹夹住，然后旋转推片器螺旋，将所要观察的部位调到通光孔的正中。 （4）调节焦距：以左手按逆时针方向转动粗调节器，使镜台缓慢地上升至物镜距标本片约5毫米处，应注意在上升镜台时，切勿在目镜上观察。一定要从右侧看着镜台上升，以免上升过多，造成镜头或标本片的损坏。然后，两眼同时睁开，用左眼在目镜上观察，左手顺时针方向缓慢转动粗调节器，使镜台缓慢下降，直到视野中出现清晰的物象为止。 如果物象不在视野中心，可调节推片器将其调到中心(注意移动玻片的方向与视野物象移动的方向是相反的)。如果视野内的亮度不合适，可通过升降集光器的位置或开闭光圈的大小来调节，如果在调节焦距时，镜台下降已超过工作距离(>5.40mm)而未见到物象，说明此次操作失败，则应重新操作，切不可心急而盲目地上升镜台。
光学显微镜操作规程
光学显微镜操作规程标准化管理处编码[BBX968T-XBB8968-NNJ668-MM9N]
光学显微镜操作规程使用说明： 1. 将标本切片放在载物台上，用切片压片压紧。 2. 将各倍率的物镜顺序装入物镜转换器，将所选用的目镜插入目镜 筒中。使用双目时，应使双目间距调至适合瞳距。 3. 转动反光镜，使照明光线射入镜筒（或接通电照明光源），然后 调节聚光镜下光栏的孔径大小，使视场明暗适度。 4. 观察时，先用低倍物镜寻找观察物，然后将被观察物移至视场中 心，再换高倍物镜观察。当使用 100X （油弹）物镜时，应先用干 净的细木棒蘸少许香柏油滴于物镜端部，再转入视场。必须使物镜 端部和盖玻片之间充满香油柏油液体，方可观察操作。 5. 调焦时，一般先用粗调焦旋钮调节物镜至能看到标本轮廓，然后 再用微调旋钮进行调节，直至物像最清晰为止。使用高倍物镜时最 好由下到上进行调节，以避免镜头因碰到切片而损坏。 6. 调节聚光镜的高低和孔径光栏口径大小，至标本像对比度适宜， 像质清晰。 7. 观察时，可拉动目镜滑板至瞳距位置，调节目镜调节圈，使目镜 筒升降位置与目镜滑板在标尺上所处的位置相一致，直至调节像质 清晰为止。 注意事项：
1. 仪器使用完毕后，用吹风球吹去镜头上的灰尘，用细软布蘸二甲苯擦试镜头上的油污。用清洁的细软布擦试整机上的灰尘和污迹。运动部分应随即涂上薄薄一层无腐蚀性的润滑剂，然后放入泡沫包装，装回木箱，并放在干燥、清洁、通风良好和无酸碱蒸汽的地方。 2. 显微镜出厂前已经通过仔细的检验和调整，物镜和目镜不要自行拆卸。 3. 物镜使用后必须装入物镜盒中，以防碰损和沾污。
光学显微镜的使用
显微镜的使用 口诀：一取二放三安装，四转低倍五对光，六上玻片七下降，八升镜筒找物象（找到调清移中央），九换高倍控好光（再调细准边观赏），十步整理和归箱。 使用方法和步骤： 一、取镜和安放 1．右手握住镜臂，左手托住镜座。 2．把显微镜放在实验台上，略偏左（显微镜放在距实验台边缘7厘米左右处）。安装好目镜和物镜。 二、对光 3．转动转换器，使低倍物镜对准通光孔(物镜的前端与载物台要保持2厘米的距离)。 4．把一个较大的光圈对准通光孔。左眼注视目镜内(右眼睁开，便于以后同时画图)。转动反光镜，使光线通过通光孔反射到镜筒内。通过目镜，可以看到白亮的视野。 三、观察 5．把所要观察的玻片标本（也可以用印有“6”字的薄纸片制成）放上载物台，用压片夹压住，标本要正对通光孔的中心。 6．转动粗准焦螺旋，使镜筒缓缓下降，直到物镜接近玻片标本为止（眼睛看着物镜，以免物镜碰到玻片标本）。 7．左眼向目镜内看，同时反方向转动粗准焦螺旋，使镜筒缓缓上升，直到看清物像为止。再略微调节细准焦螺旋，使看到的物像更加清晰。 8．高倍物镜的使用：使用高倍物镜之前，必须先用低倍物镜找到观察的物象，并移到视野的正中央，然后转动转换器再换高倍镜。换用高倍镜后，视野内亮度变暗，因此一般选用较大的光圈并使用反光镜的凹面增加进光量，然后调节细准焦螺旋使物像清晰。观看的物体数目变少，但是体积变大。 四、整理 9．实验完毕，把显微镜的外表擦拭干净。转动转换器，把两个物镜偏到两旁，并将镜筒缓缓下降到最低处，反光镜竖直放置。最后把显微镜归箱，送回原处。 《注意事项》： 1、严忌单手提取显微镜。 2、若须移动显微镜，务必将显微镜提起再放至适当位置，严忌推动显微镜（推动时造成的震动可能会导致显微镜内部零件的松动，切记!!），使用显微镜请务必小心轻放。 3、使用显微镜时坐椅的高度应适当，观察时更应习惯两眼同时观察，且光圈及光源亮度皆应适当，否则长时间观察时极易感觉疲劳。 4、转动旋转盘时务必将载物台降至最低点，以免因操作不当而刮伤接目镜之镜头。 载物台上操作，以免染剂或其它液体流入显微镜内部或伤及镜头。 6、观察完一种材料，欲更换另一种材料时，务必将载物台下降至最低点，换好玻片后再依标准程序重新对焦，切勿直接抽换标本，以免刮伤镜头或玻片标本。 7、用毕显微镜应将载物台下降至最低点，并将低倍镜对准载物台中央圆孔处，将电源线卷好，盖上防尘罩，并收入存放柜中。