自噬和雷帕霉素靶蛋白复合物I(mTORC1)调控体细胞重编程的随机阶段pdf

中科院研究发现细胞“返老还童”关键机制

2015年05月21日08:16来源：《中国科学报》

原标题：研究发现细胞“返老还童”关键机制

（记者朱汉斌、丁佳通讯员黄博纯）记者从中科院广州生物医药与健康研究院获悉，该院裴端卿和秦宝明实验组发现了细胞在结构上“返老还童”的关键机制，有望为寻找新的治疗手段提供有力依据。5月18日，相关成果在线发表于《自然·细胞生物学》杂志。

据裴端卿介绍，细胞在饥饿等胁迫条件下会主动降解自身细胞质组分，这一过程被称为“自噬”。此前有研究认为，自噬在重编程早期发挥关键作用。但最新研究发现，自噬对重编程非但不是必须，反而起阻碍作用。重编程在自噬缺失的细胞中不仅效率更高，而且获得的诱导多能干细胞（iPS细胞）具有正常的多能性。

据了解，2006年，日本科学家建立的iPS细胞技术，实现了成体细胞逆转为具有多种分化潜能的类似胚胎干细胞状态的iPS细胞，从而叩开了再生医学的大门。不过，该技术在获得大规模应用前仍存在很多问题。

什么是细胞重塑？科研人员介绍说，成体细胞犹如一个具有特定功用的房间，房间里的器具构造决定了它是居家、办公还是商铺；而胚胎干细胞更像是一个空房间，根据需要可把它改造做任何用途。成体细胞重编程为胚胎干细胞的过程，如同把原有房间里的器具构造清空，只留下一些水电等最基本的设施。这就是细胞在结构上“返老还童”的关键过程。

最新发现将拓展对糖尿病、癌症以及神经退行性疾病等代谢疾病中细胞重塑如何影响细胞命运的认识，从而为寻找新的治疗手段提供有力依据。研究人员进一步发现，细胞重塑的发生实际上来自雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）的关闭，其持续开启则阻断细胞重塑、线粒体代谢转变以及重编程的发生。

自噬和雷帕霉素靶蛋白复合物I(mTORC1)调控体

细胞重编程的随机阶段

我们发现在小鼠的成纤维细胞在4个重组因子(Sox2,Oct4,Klf4and c-Myc)（此后就用4F表示）的作用下重编程诱导成为多能干细胞的过程中，自噬被强烈激活。该过程的发生独立于p53的激活，并且由雷帕霉素复合体1(mTORC1)机械目标的协同下调所介导，同时还有自噬相关基因的诱导表达。4F协同抑制mTORC1，它们对于自噬相关基因的调控有一个分歧作用，，Klf4和c-Myc起到诱导作用，Sox2和Oct4起到抑制作用。一方面，mTORC1的抑制可以通过细胞重塑来促进重新编程（线粒体改造和细胞体积减小）。另一方面，mTORC1会自相矛盾地因为引发细胞自噬而破坏重编程。自噬不参与细胞重编程但是会降解p62，p62在自噬缺陷细胞中的积聚中则会起到促进重编程的作用。我们的研究结果揭示了，在重编程的早期阶段，mTORC1抑制和自噬诱导之间存在一个复杂的信号网络，两者之间微妙的平衡关系最终决定重编程的效率。

体细胞重编程的限定因子展示了细胞的可塑性以及转录因子能够指定其命运的能力（1）。尽管在再生医学方面，生成特定的诱导性多能干细胞有前景（2，3），但是限定因子在体细胞重编程实践中的效率和质量是冗长而具有高变异性的（4）。这些缺点也强调说明需要更好地理解基本机制从而进一步提高技术水平（5）。就这一点而言，近段时间的研究使用了基于人群研究和单细胞分析两种方式表明了重编程可以被分为三个阶段：起始，成熟和稳定（6，7）。起始阶段是随机的，起始阶段的大多数细胞并不能激活后两个阶段的基因。这表明了一些起始阶段的变化是消极的，并且会破坏整个进程。一种更为优秀的描述方法或许需求的是能够使起始阶段的重组过程处于一种稳定的方式。这将确保不止在没有额外基因操作的情况下达到近100%的重编程效率（8，9），还具有可以达到更高精准度的转化的潜力。

自噬是一种负责维护细胞内稳态的异化的机制（10）。通过封存进入自噬体的细胞组件（例如，细胞膜，细胞器，细胞骨架组件或者蛋白质络合物），并且通过溶酶体进行降解，自噬允许细胞储存能量传代，细胞生存在代谢性应激条件下，如饥饿状态；或者改善基因毒性压力，如DNA损伤。作为一个集成应激反应,自噬参与各种生理和病理过程,如胚胎发育、衰老和癌症（11）。值得注意的是,一系列自噬相关基因已确定可以控制膜动力学在自噬小体形成期间和与溶酶体融合顺序方式(启动、成核、伸长和扩张)。在自噬的起始阶段是被mTORC1抑制的，其可以整合不同的上行营养与压力信号，也可以促进生物合成（12，13）。值得注意

的是,通过它在生物合成中的作用,mTORC1独立调节自噬中的细胞结构(包括细胞大小和细胞器组成)。

在这里，我们证明了mTORC1介导的线粒体调控和自噬之间良好的相互作用是小鼠成纤维细胞通过4F进行重编程的基础。

结果

自噬在重编程的早期被诱导

多能干细胞,例如鼠的多能干细胞或胚胎干细胞的细胞与体细胞相比具有较少的,相对不成熟的细胞内的细胞器如线粒体、ER（内质网）和高尔基体。我们一直想知道体细胞是如何重编程为多能干细胞，来解决这个细胞生物学问题，并且假设在体细胞重编程期间自噬的激活有助于重建改变细胞内细胞器。为了验证这个想法，我们用逆转录病毒酶产生4F在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）重编程期间测试自噬活动，其表达则用定量PCR技术进行确认(qPCR,补充图.1a)。我们使用微管相关蛋白轻链3（LC3），酵母的哺乳动物同系物Atg8，来辨识自噬小体的形成（14）。蛋白免疫印迹技术展示出来的结果显示与对照型的相比，4F转导的LC3B 的活性形式(LC3B-II)在4F中表达更为明显(图1a,上面的板块)。使用巴菲霉素A1进行干预，这是一种溶酶体酸化和自噬体与溶酶体融合的抑制剂，显示了在4F中LC3B-II进一步增加。这证明了在4F重编程中自噬通量是上涨的（15）。进一步对比MEFs和ESCs发现，尽管iPSCs/ESCs比ESCs拥有更高的自噬基础水平，在第6天和第9天时4F重编程在ESCs中减少更多的自噬通量。为了进一步描绘ESCs中的基底自噬活动，我们用免疫蛋白印迹技术测量不同培养条件下的LC3B-II水平(2iCLIF on gelatin16;serumCLIF on feeder;low or high cell density;补充图.1b左侧和中间的版面)。这个结果证明了ESCs中的自噬通量水平比MEFs中要高，尽管我们观察到2i+LIF（16）条件下的数值比serum+LIF条件下高，同样的情况发生在高细胞密度与低细胞密度中。同样地，我们发现在ESC分化期间自噬通量会下降(withdrawal of2i and LIF for3days,补充图1b右侧板块,1e-g).。除此之外，使用荧光显微法转换逆转病毒酶的4F感染细胞产生EGFP-LC3B显示除了典型的虚线胞质结构（自噬小体），与对照组的相比早了3天，并且他们会在接下来几天持续增加。这已经用电子显微镜证实，它也可以让我们检查自体吞泡的内容物。这些液泡以双层膜结构出现，在第5天的时候尤其显著，其体积为直径0.5-1微米并且和其他人报道的一样包含电子密度（17）（图1g）。与控制组的相比，在第三天和第五天的时候自噬区域的量化有显著提高(图1h)。值得注意的是,我们没有在液泡内观察到明显的细胞器，暗示他们主要包含膜和细胞骨架结构或蛋白质复合物(图1g)。此外，自噬细胞没有凋亡，

是以正常的核形态学显示出来(图1g)。

排除这种可能性，自噬是由逆转录病毒酶专一诱导的，而不是由于其它外源性因素，我们使用了多顺反子慢病毒系统。4F的表达也许就是用了这种方法，（18）自噬的强烈诱导可能在有或者没有Baf的情况下(/CBaf;Supplementary Fig. 1g,h)。排除自噬是只被腺病毒转导诱导的原因，我们转向使用小鼠的二次可重复编程的MEFs携带多西环素插入到Col1a locus（Col1a基因）中（19）。多西环素的增加可以激活4F的表达(补充图.1i)，也伴随着自噬的增强，表现为LC3B-II的积累(图.1g和补充图.1j)。基于这些结果，我们总结出在小鼠成纤维细胞重编程期间4F诱导自噬发生，并且是在进程的早期发生的。

图1：自噬在重编程的早期被诱导(a)WB结果：对照组及4F转导的成纤维细胞中LC3B蛋白及内参蛋白的表达情况。首次转导标记为0天。内参蛋白作为加载控制。Baf,巴菲霉素A1.Baf干预：10nM，2h(以后试验中亦如此)(b)图a中LC3B-II蛋白与actin蛋白相比较的量化情况(c)WB结果：小鼠胚胎干细胞与4F重编程的成纤维细胞在3，6，9，15天时，LC3B蛋白及内参蛋白的表达情况(d)图c中LC3B-II蛋白与actin蛋白相比较的量化情况(e)第3，5天时4F转导及对照转导的成纤维细胞中增强型绿色荧光染色的LC3B的共聚焦图像；比例尺：10微米(f)e的量化图(g)第3，5天时4F转导及对照转导的成纤维细胞中自噬空泡的透射电子显微镜图像（突出部分用红色箭头表示）比例尺：1微米(h)g图中自噬空泡的形态学量化(i)WB结果：Baf干预下二次可重复编程的成纤维细胞中LC3B与actin的表达。DOX,多西环素.干预用量2微克/ml.首次DOX干预标记为D0(相似实验亦是如此).补充图4提供的信息的来源.原始数据在补充图6中。

4F因子以非p53依赖的方式反向调节自噬

为了更全面的了解4F因子诱导自噬的分子机制，我们运用qPCR检测了以逆转录病毒为基础的重编程过程中不同时间点自噬相关基因的表达情况。结果表明，与对照组相比，在4F因子诱导过程中，基因诱导全面而早期，并且参与自噬的各个阶段（起始，成核，伸长，膨胀和溶酶体途径）（如图2a和补充图2a）。我们在重新编程实验及小鼠胚胎干细胞与小鼠胚胎成纤维细胞的对比中运用蛋白印迹法验证选择的目标（图2b）(补充图2b)。为了证实重新编程过程中自噬相关基因对于自噬的诱导作用，我们设计了Atg5,Becn1，Vps34的短发夹RNA 逆转录病毒载体。我们选择了每个基因及其组合中的各自两个shRNAs，其结果表明了明显的击倒效果在4F因子干预的重组中（补充图2c）。WB法检测LC3B-II 显示：与shRNA control(?/+Baf)相比，这些组合的shRNA也有效的抑制了自噬。（图3c）

接下来，我们研究了在重新编程4f因子如何配合诱导自噬基因。先前的研究已经表明，原癌基因c-myc引发大鼠细胞自噬（20），同时更多报道表明胚胎干细胞关键蛋白Sox2诱导结肠癌细胞自噬（21）。因此，我们使用转录病毒以单独或组合的形式过度表达4F因子。qPCR分析表明c-myc和Klf4诱导多个自噬基因（ULK1，Atg5，BECN1和Vps34由c-myc诱导；Atg5，ATG7，LC3B和BECN1由KLF4诱导），而单独或组合的SOX2和OCT4则不能（图2D）。对于LC3B-II和其他选定的自噬通路成分的免疫印迹分析证实了自噬（?/+Baf）和自噬基因Klf4+c-Myc的诱导（图2e和补充图2d），除了ULK1，这可能是由于翻译后修饰。相反，Oct4和Sox2抑制自噬及自噬基因的表达（图2e和补充图2d）（22）。

我们也发现，Klf4+c-Myc对于自噬基因的作用与p53的表达增加相关。（图2e）在这方面，p53通过直接激活Ulk1而诱导自噬是大家所共知的。为了研究p53是否调解重新编程过程中自噬的诱导，我们用4F逆转录病毒(?/+Baf)转染了p53敲除尾尖成纤维细胞(TTFs)。WB结果显示，与p53野生型小鼠胚胎成纤维细胞峰值出现在第7天相比(图2a)，尽管本结果峰值出现在第三天，p53敲除细胞LC3B-II也表现出了明显的诱导作用（图2f）。这也许可以通过p53敲除尾尖成纤维细胞的快速增殖和重新编程动力学来解释。同样，qPCR和WB结果都表明在p53敲除尾尖成纤维细胞中Ulk1,Atg5,Becn1and Vps34都被诱导（补充图2e和2g）。此外在这一背景下，Klf4+c-Myc诱导LC3B-II和其他自噬基因，而Sox2+Oct4则起到抑制作用(图2h和补充图2f)。为了证实两对重新编程因子的效果差别，我们在一个特殊的培养基(iCD1+BMP4)中重新编程小鼠胚胎成纤维细胞，这种培养基可以在只使用Sox2+Oct4的情况下形成iPSC（由一个基

因Oct4–GFP reporter26激活评估）（图2i）。重要的是，Sox2+Oct4作用的重新编程表现为一个逐渐的自噬下降过程而不是上升（见图2j）。这似乎不是一个在iCD1+BMP4培养基中的直接抑制作用，因为4F因子在相同的培养基中可以很强烈的诱导自噬（见补充图2g）。我们还观察到，在标准培养基中使用一个多顺反子慢病毒（3F DT）3因子重编程（Oct4，Sox2和Klf4；3F）不诱导自噬（补充图2h）。综上，我们的数据表明，4f因子在重新编程过程中通过ATG基因的调节和p53非依赖的方式拮抗调节自噬。

图2：(a)qPCR检测:在小鼠胚胎干细胞早期重新编程中，主要自噬相关基因在自噬各个阶段的表达情况。(b)在重新编程过程中，ULK1,ATG5–ATG12(ATG5-12),beclin1and VPS34几个蛋白的WB结果。(c)4F因子干预的转染小鼠胚胎成纤维细胞中LC3B及第五天显示的

组shRNAs（?/+Baf）的WB结果(d)qPCR：外部因素单独或者联合干扰转导小鼠胚胎成纤维细胞后第五天指示基因的表达情况。(e)外部因素组合介导小鼠胚胎成纤维细胞转导过程中LC3B及相关指示基因的WB分析结果，Sox2+Oct4;KM,Klf4+c-Myc。(f)p53敲除小鼠4F介导转染尾尖成纤维细胞中LC3B的WB结果。(g)4F介导转染p53敲除小鼠尾尖成纤维细胞中相关基因的WB结果。(h)组合重新编程因素干扰下p53敲除小鼠尾尖成纤维细胞中相关基因的WB结果。(i)典型绿色荧光蛋白克隆在重新编程细胞（iCD1+BMP4培养基）中，第十二天。比例尺:00μm.(j)iCD1+BMP4培养基培养的SO-转染小鼠胚胎成纤维细胞中LC3B的WB结果。数据显示的是三次技术复制的主要结果，数据来自两次代表性数据中的一次（a,d），在补充表4中提供了源数据，未被加工的原始扫描印记被提供在补充图6中。

图3自噬损伤重新编程(a)Atg基因敲除对4F逆转录病转导的OG2MEFs重编程效率的影

响(b)WB结果：在用DOX对成纤维细胞二次转导的第五天时indicated shRNAs LC3B的表达.(c)shRNA对重编程系统中重编程效率的影响(d)WB结果4F逆转录病毒转导的第三天，LC3B和beclin蛋白1在Flag和BECN1的表达.(e)BECN1对重编程的影响.(f)WB结果：二次编程的成纤维细胞的第三天，LC3B和beclin蛋白1在Flag和BECN1的表达.(g) BECN1对二次编程系统中重编程的影响.(h)WB结果：4F-dT lentivirus转导的Atg5敲除小鼠成纤维细胞中，ATG5–12和LC3B在Flag和Atg5的表达情.成纤维细胞来源于3只Atg5野生型和同窝敲除型的胚胎.(i)与野生型相比，重编程在Atg5敲除型中被提高Atg5复苏的自噬使重编程效率降低(j)WB结果：retroviral4F和inducible-Atg5转导的OG2-Atg5敲除型成纤维细胞中，ATG5–12和LC3B在DOX干扰和非干扰组的表达情况(k)Atg5对不同时间点4F retroviral重新编程的OG2-Atg5敲除型成纤维细胞的影响。数据是3次重复实验的结果来源于2(c,g,i,k)的1和3(a,e)代表性实验。补充图4提供的信息的来源.原始数据在补充图6中

图4.自噬不负责重新编程过程中线粒体的改造.(a)MEFs,Ctrl(4XFlag)D5,4F D5,2Atg5 WT iPSCs,2Atg5敲除iPSCs and mouse ESCs细胞体积的流式分析.(b)a中同样细胞的线粒体流式分析(c)qPCR结果：中同样细胞的mtDNA拷贝数.(d)a中同样细胞的活性氧流式分析.(e)对照组和4F转导组第三天，自噬小体、线粒体、细胞核的荧光图像（-/+Baf）。比例尺,10微米.(f)WB结果：在重编程早期线粒体蛋白VDAC1和TIM23的表达（-/+Baf.(g)用4F和Luc shRNA或者上述shRNAs转导MEFs第5天线粒体流式分析。(h)用4F和Luc shRNA或者上述shRNAs转导MEFs第5天ROS流式分析。(i)qPCR结果：4F转导的Atg5野生型和敲除型mtDNA拷贝数.(j)在Flag或ATG5复苏情况下4F转导的ATG5敲除型

MEFs细胞体积流式分析(g)和4(i,j)三次重复实验.补充图4提供的信息的来源.原始数据在补充图6中

图5：抑制mTORC1介导了线粒体重塑.(a)WB结果：在MEFs重新编程早期mTORC1信

号通路的变化。对照组是4XFlag.(b)结合重编程因子在第5天对mTORC1信号通路的影响。

对照,2XFlag(c)敲出Tsc2shRNAs第5天qPCR分析(d,e)WB结果：mTORC1信号通路成

分(d)和LC3B(e)在细胞中用4F和2shRNAs对Tsc2转导(-/+Baf).(f)Tsc2shRNAs对重编

程的作用(g)qPCR结果：4F和Tsc2-shRNA-转导细胞中mtDNA拷贝数.(h)Tsc2shRNAs对

线粒体的影响的流式分析(i)Tsc2shRNAs对ROS的影响的流式分析.(j)qPCR结果：4F和

对照或上述基因第5天mtDNA拷贝数(k)4F和对照或t上述基因第5天线粒体流式分析(l)4F

和对照或上述基因第5天ROS流式分析(m)上述基因过表达对4F重新编程效率的影响(n)

qPCR结果：上述基因转导MEFs的第五天mtDNA拷贝数。Tsc2shRNA是Tsc2shRNA1

和shRNA2的结合(o)上述基因转导MEFs的第五天线粒体流式分析(p)上述基因转导MEFs 的第五天ROS流式分析(i)来源于n=3的(c,g,h,j,o,p)和的两次独立重复实验(n)三次独立重复实验。补充图4提供的信息的来源.原始数据在补充图6中。

图6：p62是重新编程中自噬靶点.(a)WB结果：for in在4F-dT-转导的Atg5野生型和敲除型中MEFs中，p62和NBR1在Flag和ATG5中的表达.MEFs来源于1号和2号野生型小鼠胚胎，1XLenti-FlagCpMXs-Flag作为对照。星号是非特异性标识.(b)WB结果：4F-转导的Atg5野生型MEFs(-/+Baf)中p62和NBR1的表达(c)第5天时，P62在4F转导和图中作用于Atg基因的shRNA的蓄积(d)第5天时，P62在4F转导和图中基因突变体的shRN A的蓄积(e)第5天时，p62在4F重编程MEF中的减少使BECN1蛋白过表达(f)qPCR结果：p62shRNAs在4F-dT-t转导的Atg5敲除MEFs中的低效率.(g)p62shRNAs对Atg5敲除的MEFs重新编程的影响(h)图中所示的是外源性重编程因子调节自噬和mTORC1，以及对重新编程后两个过程的作用。示意图表示的外源性重组因子调节自噬和mTORC1和最后2对重组的影响。随机早期阶段,4F抑制mTORC1影响线粒体改造和诱导自噬影响重组效率。在随机相位的早期，4F抑制mTORC1来影响线粒体重塑以及诱导自噬，这能够影响重新编程的速率。数据是三次重复的平均值。

自噬抑制重新编程

我们通常认为自噬诱导对重新编程起到了保护和促进的作用，为了对此进行

探究，我们采用（图2c）.中的有效的shRNA来证实减少自噬对重新编程的影响。出乎意料地，与shRNA对照组（图3a）相比较，敲除4F重新编程的Atg5、Becnl、Vps34，诱导多功能肝细胞的效率并没有降低，反而增加了2-4倍。但这并不是由于凋亡的减少(补充图3a)而造成的，在重新编程中凋亡与自噬诱导相一致，不受P53的支配。这些shRNA在二代成纤维细胞中也抑制自噬，增加重编程的效率(图3b,c)。此外我们让ULK1、ATG5、VPS34、Atg16l这些基因的显性位点失活突变（补充图3b），使自噬诱导受到抑制，重新编程的速率增加了2倍。相反地，相应的野生型反转录的DNA对自噬和重编程效率并没有影响。在shRNA抑制Becn1和Vps34产生的诱导多功能干细胞以及Atg16l-M的过表达是包括种系传递嵌合小鼠在内的标准描述程序所展示的完全重新编程(补充图4a,b,e-i)。最近，苄氯素1被认为是自噬通路中的速度限制成分（27），我们发现在重新编码早期，它的蛋白在逐渐增加（图2b,g），因此我们使BECN1（一种自噬基因）过表达，它的过表达使自噬增强，同时使受损的GFP+的形成增多(图3d,e)。在二代成纤维细胞中，BECN1对自噬与重新编程的作用也同样被证实(图3f,g)。

上述提到的shRNA以及使显性位点失活突变并不能够完全的阻断自噬诱导(图2c，3b，补充图3c)，我们又采用了Atg5基因敲出的成纤维细胞。这样的成纤维细胞是有自噬诱导缺陷的（28）。与同窝野生型小鼠的成纤维细胞相比较，WB结果分析显示出基因敲出小鼠的成纤维细胞缺乏ATG5-ATG12结合以及LC3B-II(图3h,right panel)。使ATG5基因在敲除小鼠中重构，ATG5-ATG12结合以及LC3B-II得到了恢复。我们接着用4F-dT转导ATG5敲除的成纤维细胞，腺病毒转导以及转基因表达都没有受到自噬缺陷的影响(补充图3g,h)。4F-dT 转导的第12天，我们计算诱导多功能干细胞集落发现重组完成，SSEA-1染色阳性(补充图3i)。与野生组相比较，ATG5基因敲出的小鼠重编程效率连续提高了2-3倍(图3i,black columns)。显而易见地，将野生型的ATG5在基因敲除的成纤维细胞中过表达，会使重新编程速率降低到野生成纤维细胞的基本水平(图3i,white columns)，重要的是，在野生型和ATG5基因敲除小鼠之间，凋亡没有差异(补充图3j)。此外，ATG5基因敲除小鼠产生的诱导多功能干细胞是全能干细胞(补充图4c-e,g,i)。ATG5基因敲除小鼠能够提高重编程效率被产生OG2-Atg5敲除小鼠及其成纤维细胞的重新编程所证实(补充图3k)。为了研究自噬诱导对重新编程的时间效应，我们实用阿霉素诱导ATG5，并且使它在OG2-Atg5敲除小鼠中过表达，(图3j)。在ATG5诱导自噬的处事及中期阶段(不包括晚期)，4F对OG2-Atg5敲除小鼠重新编程受到抑制。为了进一步阐明自噬诱导与重新编程效率之间的负相关关系，我们也采用了3F对Atg5敲出成纤维细胞进行重新编程，我们发现将3F-dT转录到Atg5基因敲除的小鼠中无论伴有或者不伴有

Atg5基因，都对重新编程的效率没有影响，这与采用3F后低水平或近乎没有自噬的情况相一致(补充图2h)。总的来说，这些结果说明了在重新编程中自噬的负调节作用(补充图3l)。

mTORC1抑制是线粒体改造的基础以非自噬依赖的方式

在4F的重新编程中，一个最明显的细胞改变是细胞大小的减小(图4a)。在亚细胞水平，存在着线粒体质量的减少伴随着氧化磷酸化的减少(图4b,c)。尤其是这影响着活性氧（ROS）的生成，表现为ROS的减少(图4d)。最近，有人提出在线粒体的改造重新编程中自噬发挥着重要的作用。然而，我们的实验表明在重新编程中自噬是有害的。同样的，我们的透射电镜分析显示在重新编程细胞自噬泡的液泡的中没有任何明显的线粒体结构(see above图1e)。而且，在鼠胚胎成纤维细胞与4F重新编程的第三天中我们不能找到明显的线粒体(labelled by MT-DsRed)和自噬(labelled by EGFP-LC3)之间的共定位(图4e)。此外，蛋白免疫印迹技术（western blotting）测定的线粒体蛋白VDAC1和TIM23在Baf-处理和未处理细胞组之间没有区别(图4f)。为了进一步证实这一结果，我们用shRNAsforAtg5,Becn1orVps34抑制自噬，并观察到线粒体质量和ROS水平都没有改变。同时，当比较Atg5敲除型（KO）和野生型（WT）鼠胚胎成纤维细胞和4F重新编程中我们没有发现在线粒体数量上的任何明显的改变（通过qPCR测定线粒体DNA）(图4i)，我们也没有发现任何细胞大小的改变(图4j)。这些观察表明自噬对线粒体改造和重新编程中细胞大小的减小的影响较小。

为了确定在重新编程的早起阶段线粒体改造是如何发生的，除了抑制凋亡、通过YY1-PGC1α(ref.32)和TFAM(ref.33)积极调节线粒体生物起源和功能，我们还转向了mTORC1的研究。利用磷酸化的S6K，即最具特征的mTORC1的下游基片，作为一个读出数据，在之前的报导中，我们证实了在重新编程过程和胚胎干细胞中mTORC1是被抑制的(图5a和补充图5a,b)。通过蛋白免疫印迹技术（western blotting）测定其磷酸化形式发现这与激活其中一个主要的上游阻遏物TSC2密切相关。最近研究发现，在基因毒性应激中p53抑制mTORC1的活性。然而，正如我们在重新编程中观察自噬和mTORC1的抑制是独立于p53的，通过重新编程p53KO TTFs和4F反转录病毒也得到了证明(补充图5c)。然后，我们测定2-因子-转导细胞鼠胚胎成纤维细胞中的磷酸化的TSC2和S6K。我们观察到虽然Klf4+c-Myc和Sox2+Oct4抑制S6K活性，只有Klf4+c-Myc激活TSC2的活性(图5b)。这种影响不是由于mTOR表达的直接调节作用(补充图5d,e)，这表明2-因子组合通过不相关的机制使mTORC1失去活性。为了研究是否是mTORC1调节在重新编程过程中的线粒体改造和细胞大小的的减小，我们使用2 specific shRNAs for Tsc2(图5c)。这些2shRNAs显著地再活化mTORC1活性、抑制凋亡(图5e)。然而，这导致编程的效率降低而不是提高(图5f)，这和以

前的报导是一致的。显而易见的是利用Tsc2shRNAs再活化的mTORC1增加了线粒体的质量(图5g,h)和ROS的生成。这与增加线粒体生物起源的调节因子的信使RNA的表达、Pgc1α和其下游的靶点密切相关(补充图5f)，并伴随着大的细胞(补充图5g)。然后我们在4F重新编程中超表达了Pgc1α和另外两个线粒体生物起源调节蛋白(Pgc1β和Tfam)(补充图5h)。Pgc1α和1β,而不是Tfam，减少线粒体基因的表达、生物起源、ROS的生成(补充图5i和图5j–l)和阻止重新编程(图5m)。为了进一步证实在4F重新编程中线粒体生物起源的mTORC1激活的因果效应，我们也再鼠胚胎成纤维细胞中引入了Tsc2shRNA,Pgc1α,1β和Tfam。正如所预计的一样，Tsc2shRNA,Pgc1β和在较小程度上Pgc1α激活线粒体生物起源和增加细胞的大小(图5n–p和补充图5j)。这些改变连同减少细胞增殖(补充图5k)让人想起Tsc2?/?MEFs的早衰观察(39)。因此，在重新编程过程中mTORC1不依赖自噬，对调节线粒体改造和细胞大小发挥着重要作用。

p62，被自噬降解，促进重新编程

为了探究自噬如何影响重新编程，我们专注于选择自噬降解的信号介质。我们具体分析了调节不同信号通路的多功能调节介质NBR1和p62/SQSTM1（以下称为p62），有趣的是，通过蛋白免疫印迹技术（western blotting）测定发现与WT鼠胚胎成纤维细胞比较，是p62而不是NBR1在Atg5KO鼠胚胎成纤维细胞和4F逆转录病毒重新编程的积累。同样的，当自噬被Baf或者一个遗传学方法所阻止，p62就会在WT鼠胚胎成纤维细胞中积累(图6b–d)，当自噬由于BECN1的超表达而被进一步激活p62就会减少(图6e)。接下来，我们利用特定的shRNAs 敲除p62(图6f)，并观察到重新编程效率的降低(图6g)。这些结果证明自噬反应抑制重新编程至少有部分原因是通过降解p62。

讨论

我们提出的证据表明，自噬早期是被重编程因子诱导的。然而，与我们预期的相反，自噬抑制而不是促进诱导多功能干细胞的生成。这与人们认为的自噬是一种应激反应，不但可以增加细胞的适应性而且同时对细胞也能造成损伤的想法是符合的（42）。与此相关的，我们和其他人已经表明重组早期阶段的特点是通过呼吸爆发产生应激反应进而导致细胞衰老（26,43,44）。

4种干细胞转录因子（SOX2，KLF4，OCT4，c-Myc）诱导自噬至少通过两种途径的协同作用。首先，SOX2，KLF4，OCT4，c-Myc基因抑制mTORC1，引起ULK1介导的起始复合物激活。第二，Klf4和c-Myc在转录水平诱导多种自噬相关基因。KLF4和c-myc的影响是独立于p53基因（在其他环境里以参与触发自噬为

大家所知[23]）和直接转录效应，如先前报道的芯片测序资料[45]（补充表1）。相反，Oct4和Sox2往往抵消由Klf4和c-Myc介导的自噬相关基因的增加，加强在重编程早期阶段过程中由外源性因素引发的相互矛盾信号的观点[46]。然而，出乎意料的是，在重编程过程中激活mTORC1（通过消耗它的负调节物TSC2）和抑制自噬相关基因的功能会有相反的功能改变。这种矛盾现象可以通过有促进作用的mTORC1对细胞结构的抑制效应来解释，包括线粒体重塑和细胞的大小，这可能是与mTORC1在PGC1活动[32]、全球蛋白质合成[33]和衰老[39]的作用有关。因此，在重编程过程中自噬的初活化是mTORC1活性的下调一个副产品，这将有利于细胞和代谢的重构。另一方面，在重编程中抑制自噬作用至少部分是通过对p62

的信号复合物的降解介导的（图6）。mTORC1是如何通过重组因子调节的,它是如何连接到其他相关应激信号通路的。如AMPK（47），p38和JNK（48）（49,50），以及如何将这些信号集成到核心转录网络编程的值得进一步研究参考文献（51,52）。我们还应探讨p62是如何调节4F（4种干细胞转录因子）重新编程的，也希望这能为阐明P62在肿瘤发生发展中行之有效的作用提供新的视角。此外，它将有益于确定自噬是否以及如何影响人类的重新编程。在这方面，中间体，即所需的用于胞质分裂且在干细胞中含量特别丰富的细胞器，已被证明是由在人类体细胞重编程中的NBR1（但不是P62）介导的细胞自噬所降解的（53）。

我们的工作还表明，胚胎干细胞比小鼠胚胎成纤维细胞和分化细胞有较高的自噬活性。这与最近一篇报道上提出的自噬通过维持最优水平的多能性转录因子从而在人类胚胎干细胞中起着关键的作用观点相一致（54）。未来的工作将需要进一步阐明自噬在与体细胞相比的多能干细胞中所起到的作用。

在这个手稿的准备期间，据报道，在重编程早期阶段的受限自噬的突然爆发（引起线粒体自噬）对诱导多功能干细胞生成是至关重要，这主要是由SOX2通过对mTOR的瞬态直接转录抑制实现的（30）。两个研究之间的差异性很难通过使用类似的实验模型来调和，包括ATG5（自噬相关基因）KO小鼠以及小鼠胚胎成纤维细胞。然而，重编程的动力学和效率对包括转录因子计量（55,56），试剂和协议等试验参数是非常敏感的，这也许能对两种研究之间的差异性作出解释。进一步对mTORC1和自噬对重编程机制的了解以及如何由外源性因素引起的变化可以帮助我们解决两个研究间的差异性，也会对其它研究领域有影响，比如在癌症的发展过程。

方法

动物和细胞培养p53?/?和Atg5+/?老鼠从南京大学的模式动物研究中心购得，后者获得RIKEN BRC and Y.Chen（清华大学生物膜与膜生物工程国家重点实验室，北京，中国）的许可。药物诱导的二级重新编程的小鼠从Jackson实验室购买。Atg5?/?小鼠胚胎成纤维细胞由E13.5胚胎和Atg5+/?小鼠杂交而成。OG2成纤维细胞和OG2二级成纤维细胞由携带Oct4-GFP转基因的等位基因的E13.5胚胎单独获得，或分别由可诱导的OSKM和rtTA转基因获得。Atg5+/?OG2+/?小鼠是由Atg5+/?、OG2+/+小鼠杂交而获得。.Atg5?/?OG2+/?成纤维细胞是由E13.5胚胎和Atg5+/?OG2+/?杂交获得。所有的成纤维细胞在高糖的DEME(Thermo Hyclone)补充10%胎牛血清（FBS、PAA）、GlutaMax(Invitrogen)、非必需氨基酸（NEAA,Invitrogen）、青霉素/链霉素(Thermo Hyclone)。P53敲除的小鼠尾成纤维细胞按上述的标准分离培养的。诱导型多能性干细胞克隆体由在KSR-based mouse ESC medium饲养层细胞培养，也就是去除DMEM，用15％敲除血清替代品（KSR，Invitrogen），Glutamax，非必需氨基酸，丙酮酸钠，青霉素/链霉素，β巯基乙醇（全来自Invitrogen）和1,000Uml-1，LIF（Millipore）。

诱导型多能性干细胞产生pMXs逆病毒载体质粒for4F(Addgene, https://www.wendangku.net/doc/1f15892584.html,)使用改良的磷酸钙转染方法转染到Plat-E细胞。将培养基转染8-12小时后改变。48小时后，该病毒通过过滤收集。通路2或3OG2成纤维细胞以4-5千细胞每平方厘米接种与逆转录病毒结合，第0天被指定为第一感染的时间点。慢病毒用包装载体包装在HEK293T细胞。经过2轮24小时的逆转录病毒感染或1轮8小时的慢病毒感染,培养基改为以标准15%的PBS为基础(GIBCO, Invitrogen)的小鼠ESC培养基。在第18天，四个重组因子的逆转录酶病毒，第12天4F-dT and secondary，或第20天3F-dT重新编程，明显的GFP+，在某些情况下，SSEA1/tdTomato-菌落使用荧光显微镜计数。with triplicate items至少进行3次的独立实验。诱导型多能性干细胞一步一步的生成的操作标准过程可以在ProtocolExchange上得到。

qPCR,western blotting和免疫荧光qPCR用SYBR green(Takara)，样品一式三份进行分析和以β肌动蛋白的值为基础行标准化，with triplicate items至少进行3次的独立实验，统计分析。引物可见于补充表格2。免疫印迹，细胞用DP BS洗涤两次，冰上放置，用RIPA裂解((50mM Tris–HCl,pH7.4,150mM NaCl, 0.25%sodium deoxycholate,0.1%NonidetP-40,0.1%TritonX-100辅以10mM Na3 VO4,50mM NaF，蛋白酶抑制剂cocktails(Roche)（罗氏）为1mm和甲基磺酰氟

液刮掉；擦去，细胞裂解物进行超声处理，根据标准步骤，细胞裂解物与loadin g bu?er混合，煮沸、装载蒲式耳FF呃煮，涡旋，离心混合并进行SDS-PAGE电泳并转移至PVDF膜（Millipore）上。用溶于TBST(50mMTris–HClatpH8.0,150m MNaCl,0.1%Tween20),的5%的脱脂奶粉封闭，将膜与乳脱脂奶粉或BSA-TBST稀释的一抗以及二抗一起孵育。荧光信号用Amersham ECL Prime Western Blottin g Detection Kit(GE)。所用抗体Rabbit anti-LC3B(no.2775,relative molecular mass14,000(Mr14K)and16K),rabbitanti-p53(clone:1C12,no.2524,53K),rabbitantip-TS C2(no.5584,200K),rabbitanti-mTOR(no.2972,289K),rabbitanti-p-mTOR(no.2971, 289K),rabbit anti-p70S6K(no.9202,70K),rabbit anti-p-p70S6K(no.9205,70 K),rabbit anti-p-S6(clone:d57.2.2E,no.4858,32K),rabbit anti-p-NF-κB(no. 3031,65K),rabbit anti-p-ERK(no.9101,42,44K),rabbit anti-NBR1(clone:D 2E6,no.9891,120K),rabbitanti-AKT(no.9272,60K),rabbitanti-p-AKT(Ser473)(no.927 1,60K)were from Cell Signaling Technology;rabbit anti-actin(no.A2066,43K),r abbit anti-ATG5–ATG12(no.A0731,56K),rabbit anti-ULK1(no.A7481,150K) were from Sigma-Aldrich;mouseanti-beclin1(clone:20,no.612112,61K),mouse an ti-E-cadherin(clone:36,no.610181,120K),mouse anti-TIM23(clone:32,no. 611222,23K)were from BD Biosciences;rabbit anti-VDAC1(no.15895,31 K),mouse anti-SOX2(clone:57CT23.3.4,no.75485,34K)were from Abcam; rabbitanti-VPS34(no.38–2,100,105K)was from Invitrogen;rabbitanti-TSC2(no.sc-893,200K)was from Santa Cruz;rabbit anti-p62(no.PM045,62K)was from MBL.除了VPS34(1/250)and TSC2(1/500)外其他的一抗稀释倍数为1/1,000，HRP-labelled goat anti-rabbit IgG(H+L)(no.A0208)or HRP-labelled goat anti-mouse IgG(H+L)(no.A0216)二抗来自Beyotime,稀释倍数为1/2,000。定量分析用Quantity One软件。至少进行3次的独立实验。免疫荧光抗体mouseanti-SSEA 1(abno.16825,Abcam,1/100),mouseanti-REX1(sc-377095clone:E-11,SantaCruz,1/100）一抗，Alexa Fluor568goat anti-mouse IgG(no.A-11031,Invitrogen,1/200),Ale xa Fluor488goat anti-mouse IgG(no.A-11029,Invitrogen,1/200)二抗。

分子克隆：为了得到超表达载体，所有cDNA都克隆成pMXs逆转录病毒质粒，p MXs-EGFP-LG3b融合载体是由Z陈（中国广州中山大学，癌症中心）帮忙提供的质粒亚克隆得来的，ATG5，（参考59）VPS34（参考60）ULK1（参考61）和BECN1是有正常人体的成纤维细胞cDNA放大的DN突变体由PCR生成的得来的。Atg16-M(参考62）Pgcl&,Pgc1B和Tfam是由老鼠的胚胎纤维细胞cDNA

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白：神经系统治疗的新靶点

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白：神经系统治疗的新靶点 美国神经科学细胞及分子信号研究实验室Kenneth Maiese博士，在《中国神经再生研究》（英文版）杂志2015年10卷第4期探讨了如何通过生长因子、Wnt信号及WISP1和干细胞组织防止糖尿病神经系统并发症的问题。营养因子，如胰岛素样生长因子-1、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和促红细胞生成素，可以通过控制氧化应激和糖尿病中葡萄糖稳态防止神经元死亡。有趣的是最近的研究也表明，细胞因子和生长因子促红细胞生成素通过Wnt信号保护间充质干细胞防止血管损伤死亡有关的途径，促进神经系统免疫细胞起到保护作用。通过独立的途径，Wnt信号和WISP1通过促进干细胞的生长和迁移，增加胰细胞增殖，从而导致新的血管生长，修复糖尿病伤口，并控制关键的程序性细胞死亡途径促进糖尿病期间保护神经系统中的细胞凋亡和自噬。在下游区，Wnt信号和WISP1通过雷帕霉素和AMP途径维持葡萄糖稳态和正常代谢活化的蛋白激酶。 Maiese博士还强调了通过注意“这些生物系统的活化程度是通过设计是营养因子、Wnt 信号、WISP1治疗糖尿病保护神经系统时所必须考虑的。例如，Wnt信号、WISP1和生长因子可导致如血管渗漏的视网膜和视力损害甚至癌症。总之，神经系统生长因子、Wnt信号和WISP1具有治疗糖尿病的并发症的广阔前景，然而，如何精确应用这些途径的靶点成功的保护 修复神经系统及神经元的功能仍值得探讨。 Article: "Novel applications of trophic factors, Wnt and WISP for neuronal repair and regeneration in metabolic disease" by Kenneth Maiese (Cellular and Molecular Signaling, Newark, New Jersey 07101, USA) Maiese K (2015) Novel applications of trophic factors, Wnt and WISP for neuronal repair and regeneration in metabolic disease. Neural Regen Res 10(4):518-528. 欲获更多资讯：文章全文请见：Neural Regen Res New Prospects for Targeting Diabetes Mellitus with Trophic Factors, Wnt, and WISP SUMMARY Diabetes mellitus (DM) affects almost 350 million individuals throughout the world and leads to significant disability in the nervous system involving dementia, stroke, neuropathy, and retinal disease. To combat these detrimental effects of DM, new avenues of discovery are being pursued that target novel growth factors and specific cellular pathways of Wnt signaling, Wnt1 inducible signaling pathway protein 1 (WISP1), and stem cells to block neuronal death and potentially lead to reparative processes in the nervous system. NEWS RELEASE Dr. Kenneth Maiese, an expert in cellular signaling and a physician scientist, explores in the journal Neural Regeneration Research(Vol. 10, No. 4, 2015) how novel targeting with growth factors, Wnt, WISP1, and stem cell tissue regeneration may offer new strategies to prevent the complications of DM in the nervous system. Trophic factors that include insulin-like growth factor-1 (IGF-1), fibroblast growth factor (FGF), epidermal growth factor (EGF), and

自噬和雷帕霉素靶蛋白复合物I(mTORC1)调控体细胞重编程的随机阶段pdf

中科院研究发现细胞“返老还童”关键机制 2015年05月21日08:16来源：《中国科学报》 原标题：研究发现细胞“返老还童”关键机制 （记者朱汉斌、丁佳通讯员黄博纯）记者从中科院广州生物医药与健康研究院获悉，该院裴端卿和秦宝明实验组发现了细胞在结构上“返老还童”的关键机制，有望为寻找新的治疗手段提供有力依据。5月18日，相关成果在线发表于《自然·细胞生物学》杂志。 据裴端卿介绍，细胞在饥饿等胁迫条件下会主动降解自身细胞质组分，这一过程被称为“自噬”。此前有研究认为，自噬在重编程早期发挥关键作用。但最新研究发现，自噬对重编程非但不是必须，反而起阻碍作用。重编程在自噬缺失的细胞中不仅效率更高，而且获得的诱导多能干细胞（iPS细胞）具有正常的多能性。 据了解，2006年，日本科学家建立的iPS细胞技术，实现了成体细胞逆转为具有多种分化潜能的类似胚胎干细胞状态的iPS细胞，从而叩开了再生医学的大门。不过，该技术在获得大规模应用前仍存在很多问题。 什么是细胞重塑？科研人员介绍说，成体细胞犹如一个具有特定功用的房间，房间里的器具构造决定了它是居家、办公还是商铺；而胚胎干细胞更像是一个空房间，根据需要可把它改造做任何用途。成体细胞重编程为胚胎干细胞的过程，如同把原有房间里的器具构造清空，只留下一些水电等最基本的设施。这就是细胞在结构上“返老还童”的关键过程。 最新发现将拓展对糖尿病、癌症以及神经退行性疾病等代谢疾病中细胞重塑如何影响细胞命运的认识，从而为寻找新的治疗手段提供有力依据。研究人员进一步发现，细胞重塑的发生实际上来自雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）的关闭，其持续开启则阻断细胞重塑、线粒体代谢转变以及重编程的发生。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTOR在小鼠卵母细胞成熟过程中的表达及作用

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在小鼠卵母细胞成熟过程中的表达及作用 杨彩荣 魏延昌张 岩郑可佳 李 宁严云勤* (东北农业大学动物细胞与发育生物学教研室，哈尔滨150030) 摘要哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin ，mTOR)是一种Ser/Thr 激酶，属于PIKK 超家族，对调节细 胞周期、蛋白质合成等具有重要作用，是细胞生长、增殖、分化、凋亡的中心调控器，但在哺乳动物卵母细胞中的研究还未见报道．以小鼠卵母细胞为研究对象，采用免疫荧光为主要研究方法，对mTOR 在小鼠卵母细胞中的表达进行研究，并通过mTOR 的特异性抑制剂雷帕霉素(rapamycin ，RAPA )对卵母细胞进行处理，对mTOR 在卵母细胞成熟过程中的作用进行研究．结果显示：小鼠卵母细胞成熟过程中，生发泡(germinal vesicle ，GV )期mTOR 主要集中在核膜处表达，生发泡破裂(germinal vesicle breakdown ，GVBD )后mTOR 伴随染色体分布，第二次减数分裂中期(second metaphase ，M Ⅱ期)mTOR 伴随纺锤体分布；雷帕霉素处理后，小鼠卵母细胞的成熟受到抑制，且这种抑制作用具有浓度依赖性，同时其mTOR 的表达部位和形态也发生变化．研究表明，在小鼠卵母细胞成熟过程中，mTOR 在各个时期的表达及分布具有阶段特异性，并对小鼠卵母细胞GVBD 的发生和第一极体的排放都具有重要作用． 关键词雷帕霉素靶蛋白(mTOR)，小鼠卵母细胞，雷帕霉素，免疫荧光学科分类号 Q2 DOI:10.3724/SP.J.1206.2009.00446 生物化学与生物物理进展 Progress in Biochemistry and Biophysics 2009,36(10):1334~1339 https://www.wendangku.net/doc/1f15892584.html, 研究报告 Research Papers *通讯联系人. Tel:0451-********,E-mail:yanyunqin@https://www.wendangku.net/doc/1f15892584.html, 收稿日期：2009-07-23，接受日期：2009-09-04 雷帕霉素靶蛋白(mTOR)结构与功能上高度保守，是一种存在于哺乳动物细胞中的Ser/Thr 激酶，属于磷脂酰肌醇激酶相关激酶(phosphatidylinositol kinase-related kinase ，PIKK)家族成员．mTOR 信号通路可以汇聚和整合来自于营养、生长因子、能量和环境胁迫对细胞的刺激信号[1～3]，通过其下游的靶蛋白核糖体蛋白S6激酶1(ribosomal protein S6kinase 1，S6K1)和蛋白质翻译起始因子eIF4E 结合蛋白1(eIF4E binding protein 1,4EBP1)调控蛋白质的翻译，加快细胞G1期/S 期的转换，促进细胞生长和增殖，抑制细胞凋亡[4～6]．mTOR 信号通路紊乱与肿瘤的形成及细胞的恶性转化密切相关[7]． 雷帕霉素(rapamycin ，RAPA ，RPM)是一种大环内酯类抗生素和免疫抑制剂，它进入体内后与胞浆受体FKBP12结合形成复合物，此复合物能够结合在mTOR 蛋白羧基端的FRB 结构域内，形成三元复合物，使得mTOR 的激酶催化域失去接近并磷酸化下游靶蛋白的能力，从而抑制mTOR 的生物学功能[8～10]． mTOR 在卵母细胞成熟和早期胚胎发育中的研究较少，且大多集中在海星、海胆等动物中[11,12]， 而在哺乳动物卵母细胞中的研究还未见报道．以往的研究表明，mTOR 与一些蛋白质的合成有关[12]，而特定蛋白质的合成对卵母细胞成熟具有重要的作用，因此我们推测，mTOR 可能在哺乳动物卵母细胞成熟过程中有重要作用．所以本研究以小鼠卵母细胞为研究对象，观察了mTOR 在卵母细胞成熟各个阶段的表达及分布情况，同时通过雷帕霉素的处理观察mTOR 对卵母细胞成熟的重要作用，为进一步探索mTOR 在小鼠卵母细胞成熟过程中的分子机制提供实验依据． 1材料与方法 1．1 实验材料 本实验选用昆明白品系6～8周龄性成熟雌鼠，购自哈尔滨肿瘤医院实验动物中心． 1．2 主要试剂 α-MEM 购自Gibco 公司；雷帕霉素购自江苏碧云天生物技术研究所；孕马血清(pregnant mare

药物洗脱支架DES综述

Drug-eluting stent/药物洗脱支架 一、支架用途： 用于血管狭窄，如下腔静脉、冠状动脉、脑血管狭窄等的介入治疗（支架放入血管，使血管扩张）。 其他治疗方法有药物治疗、手术（冠脉搭桥、球囊扩张术等）。 二、支架种类 1. 裸支架 无包裹金属支架技术成功之处在于它能立即回复受损血管的血 液循环。然而支架放置对血管的刺激会引起血管壁平滑肌细胞增生，可导致血管闭塞，或支架塌陷，增加心血管病的发病几率。因此采用耐久性聚合物材料释放药物的方法来解决此问题。 2．药物洗脱支架 药物洗脱支架(drug eluting stent，DES)也可称之为药物释放支架，通过包被于金属支架表面的聚合物携带药物，当支架置入血管内病变部位后，药物自聚合物涂层中通过洗脱方式有控制地释放至心血管壁组织而发挥生物学效应。目前上市的药物洗脱支架主要有雷帕霉

素(rapamycin)洗脱支架和紫杉醇( paclitaxel)洗脱支架，二者均通过 抑制平滑肌细胞过度增生而预防支架内再狭窄形成。 雷帕霉素为天然大环内酯类抗生素，具有较强的抗细胞增殖与免疫抑制作用，主要作用于血管平滑肌有丝分裂的G1期，使细胞有丝分裂停止于静止期G0期。TAXUS支架则是携带药物紫杉醇，紫杉 醇作用于血管平滑肌细胞有丝分裂G2-M期，抑制血管平滑肌细胞增殖。 三、DES介入治疗的主要副作用及形成原因 1. 支架内再狭窄 1.1 手术影响由于介入治疗中心脏一直处于跳动中，给支架定位造成困难。由于心脏狭窄血管较长，需要2～3个支架叠加，还需要 植入后再扩张，这都对血管内皮和平滑肌造成过度损伤，导致支架局部组织过度增生。 1.2 组织学发生机制目前公认的支架内再狭窄主要原因是植入 支架局部的组织过度增生。现在研究认为糖尿病、支架植入数、支架植入后最小管腔直径及过长的靶病变是ISR独立危险因素。而高血压、复杂病变、小血管病变、长支架植入等也可使支架内再狭窄危险性增高。Palmaz等发现支架种类、所用材料也与支架再狭窄发生率有关, 如钽支架较不锈钢支架再狭窄率更低。 2. 血栓形成 涂层药是把双刃剑，如雷帕霉素主要作用是抑制平滑肌的增殖与迁移，但同时也抑制内皮细胞的增殖，破坏血管内皮化，延迟血管的自然愈合相关。 血栓形成的过程就是一个血液凝固的过程。当心及血管内皮细胞发生损伤之后，在数秒钟内血小板就在损伤的局部沉积下来，并与暴

Excel雷帕霉素药物洗脱支架的临床应用

Excel雷帕霉素药物洗脱支架的临床应用作者：刘扬，马小峰，苗丽，周翠林 【摘要】目的观察应用Excel雷帕霉素药物洗脱支架的近期疗效及安全性。方法选择2005年1月～2006年12月89例接受药物涂层支架的患者。39例患者植入Cypher支架60个。50例患者植入Excel 支架83个，观察Excel支架的近期疗效及安全性。结果两组基本临床特征相似,狭窄程度及病变范围相似，93%的病人完成6个月随访，两组病人均未发生死亡、ST段抬高性心肌梗死，6个月内因胸痛再入院者，Cypher支架组2例，Excel支架组3例，复查造影，均未需再次血管重建术。结论国产Excel雷帕霉素药物洗脱支架临床应用安全，近期主要心血管事件与Cypher药物洗脱支架相似。 【关键词】雷帕霉素药物洗脱支架；冠状动脉疾病；疗效 药物洗脱支架（drug eluting stents，DEs）可明显降低经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention，PCI）术后的再狭窄发生率，可以明显改善冠心病患者的远期预后，但进口药物支架费用昂贵，自2004年，国产药物支架进入临床观察阶段，我科对89例植入Cypher支架和Excel支架的患者进行6个月的临床随访，部分病例完成造影，现将临床观察结果总结如下。 1 资料与方法 1.1 一般资料选择2005年1月～2006年12月，共89例冠心病患者。男58例（65%），女31例（35%），平均年龄（55±9）岁。其中39例植入Cypher药物洗脱支架，50例植入Excel药物洗脱支架。

吸烟患者45例，糖尿病患者28例。 1.2 手术方法所有患者术前3天口服氯吡格雷（波立维）75 mg/d 和肠溶阿司匹林300 mg/d。以标准技术先做选择性冠状动脉造影术及支架术［1］。术中经动脉鞘管注入肝素6000～8000 u，并根据手术时间长短给予补充。手术方式由操作者决定。直接支架治疗排除标准为：左主干病变，冠脉内弥漫性或巨大血栓形成，血管严重扭曲，完全闭塞或次全闭塞，严重钙化。直接置入支架时如支架无法通过病变血管，退出支架，再以稍小球囊扩张后置入原支架。 1.3 术后随诊及用药所有患者于术后1个月、3个月和6个月进行电话或临床门诊随访，观察有无胸痛复发、心电图改变、心肌梗死、猝死、再次住院及再次血管重建术。术后长期服用阿司匹林100 mg/d，氯吡格雷75 mg/d至少6个月；低分子肝素（立迈青）皮下注射5000 u，2次/d，持续6天。 1.4 统计学方法计量资料以均数±标准差（x±s）表示，计数资料以百分比（％）表示，应用SPSS 12．0软件进行χ2检验，P＜0.05有统计学意义。 2 结果 2.1 一般情况两组病人年龄相仿，合并高血压、高血脂、糖尿病、吸烟情况相似，急性冠脉综合征及陈旧性心肌梗死病例数无统计学差异。 2.2 冠脉造影及支架植入情况单支血管病变40例，双支血管病变23例，三支血管病变14例，病变血管123支，其中前降支（LAD）72支，回旋支（LCX）15支，右冠状动脉（RCA）36支。完全闭塞5

中国肾移植受者哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂临床应用专家共识(最全版)

中国肾移植受者哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂临床应用专家共识 （最全版） 一、前言 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂(mammalian target of rapamycin inhibitors，mTORi)作为免疫抑制剂在临床应用已经有10多年的历史，目前用于移植后免疫抑制治疗的mTORi主要包括西罗莫司(sirolimus，SRL)和依维莫司(everolimus，EVL)，其他mTORi，如坦西莫司等仅用于抗肿瘤治疗。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，是参与细胞内多个信号通路的重要物质，影响细胞生长、增殖、代谢、自噬、血管生成等诸多重要过程。mTORi进入细胞后，在胞浆内与FK结合蛋白12(FK binding protein-12，FKBP-12)结合形成复合物，进而与mTOR结合，抑制mTOR活性，使p70S6激酶脱磷酸化而失活，从而抑制蛋白质的合成及细胞周期循环。因此，mTORi可抑制T淋巴细胞、B 淋巴细胞的增殖、分化及抗体的形成，同时也可抑制非免疫细胞(成纤维细胞、内皮细胞、肝细胞和平滑肌细胞)的增殖[1]。 mTORi可以作为肾移植受者的初始治疗药物，也可以作为其他治疗方案的转换药物。按照转换时间可将转换治疗分为早期转换(术后2～6个月)和晚期转换(术后6个月以后)；按照转换原因分为主动转换(pre-emptive/proactive)和被动转换(reactive)，主动转换用于避免可预期的钙调磷酸酶抑制剂(calcineur ininhibitors，CNI)的不良反应或用于肿

瘤、病毒感染等高危人群，被动转换是指在CNI的不良反应出现后进行转换。 二、mTORi作为初始治疗药物 初始给药时，可以采用CNI(慢撤除或低剂量长期合用)＋SRL＋糖皮质激素(glucocorticoid，GC)方案，其中慢撤除指CNI在4～6周内逐渐停药。研究证明，当SRL浓度达到8～12 μg/L，撤除或联合应用低剂量CNI 将减轻CNI肾毒性，并改善移植受者的肾功能，同时不增加排斥反应风险，有助于提高移植肾长期存活率。 建议1：免疫低、中危受者和高危受者采用mTORi作为初始治疗药物时，应联合CNI类药物。 建议2：慎用于切口不易愈合的受者，包括体重指数(body mass index，BMI)>30 kg/m2、2型糖尿病、既往有广泛盆腔手术史或放疗史、既往由于前次移植或自身免疫性疾病服用GC的肾移植受者。 建议3：避免用于因局灶节段性肾小球硬化(focal segmental glomurular sclerosis，FSGS)、膜增生性肾小球肾炎(mesangial proliferative glomerulonephritis，MPGN)等易于复发的肾脏疾病而行肾移植治疗的受者[2]。 建议4：初始治疗采用CNI(慢撤除或低剂量长期合用)＋SRL＋GC方案具有较好的临床疗效，且相对安全。 早期研究证明，相对于环孢素A(CsA)＋霉酚酸类(mycophenolic acid，MPA)＋GC方案，SRL＋MPA[或硫唑嘌呤(azathioprine，Aza)]＋GC(CNI-free)方案能显著提高肾移植受者的肾小球滤过率(glomerular

mTOR抑制剂的筛选方法

mTOR抑制剂的筛选方法 【摘要】雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是是丝氨酸/苏氨酸激酶分子靶位。mTOR是细胞生长增生的中心调控者，直接或间接参与细胞生长增生有关环节的调控。人体多种肿瘤细胞中可见mTOR通路的失调。近年来，有关mTOR抑制剂的专利申请不断增加，设计、合成、筛选结构新颖的mTOR抑制剂已经成为抗肿瘤药物研发的重大课题。本文就mTOR的结构功能、信号转导通路及mTOR抑制剂的筛选方法进行简单的介绍。 【关键词】雷帕霉素靶蛋白雷帕霉素靶蛋白抑制剂药物筛选 TOR(target of rapamycin，雷帕霉素靶蛋白)是一类进化上非常保守的蛋白激酶家族，广泛存在于各种生物细胞中。 1994年，Brown等证实并克隆了哺乳动物TOR基因，其产物只有一种蛋白，即mTOR(mammalian target of rapamycin，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)。mTOR属P13K蛋白激酶类家族，是P13K／PKB信号通路下游的一个效应蛋白，其底物主要控制与细胞生长和增殖密切相关的蛋白质的合成。mTOR控制细胞内mRNA的翻译，参与膜蛋白转运，蛋白质降解，蛋白激酶C信号转导和核糖体合成等一系列生理病理过程。 1.mTOR的分子结构 mTOR分子结构复杂，由2 549个氨基酸残基组成，分子中有数个各自独立而保守的结构域，类似于酵母中TOR的结构。mToR分子的氨基端存在20个串联重复序列，每一个重复序列包含2个分别由40个氨基酸残基组成的α螺旋，每个螺旋都有一个亲水基团和一个疏水基团。这种重复结构介导蛋白质之间的相互作用，并有利于mTOR定位于浆膜。 mTOR分子羧基端的中部是蛋白激酶域，结构和P13K激酶的催

自噬研究方法

MDC:取12 mg粉末溶于720 nl DMSO使其浓度为50 mmol/L,分装后-20冰箱保存。 临用前用MEM稀释到终浓度50 umol/L; Rapamycin:用MEM培养基配成终浓度为1 umol/L,现用现配; 400ng/ml喹乙醇:称取4 mg喹乙醇,DMSO预溶(体积<0.1%)后加入10 ml MEM培养液至完全溶解,现用现配,避光保存; 3-MA:首先用PBS溶解粉末,临用前加热至完全溶解后再加入MEM培养基至终浓度10mmol/L; PI3K抑制剂（3-MA，Wortmannin）可干扰或阻断自噬体的形成 用RAPAMYCIN诱导自噬我也查过一部分文献，有用无血清的，也有用，一般培养基的，浓度从25nM到100nM都有，用的是50nM的雷帕霉素，加入一般的培养基中，目的是排除无血清所诱导出来的自噬。 文献说饥饿初期激活的是大分子自噬，在4-6小时活力达到最大，24h后以CMA途径为主Earle's balanced salts solution (EBSS) for 48 h sigma的EBSS，货号E2888，有碳酸氢钠，有酚红的，酚红到不是很必须，只是一个PH指示作用，好看些 无血清诱导自噬：EBSS 诱导6个小时就可以了。 EBSS一定可以诱导出来，只是需要说明的是时间点的设置，因为从饥饿诱导开始半个小时就可能开始自噬了，一直到24小时都持续，所以应该设置不同的时间点观察这个作用。另外一个很大的问题是，饥饿诱导的一个很大的弊端是细胞死亡，这也是我面临的问题，就是在细胞收养的时候蛋白浓度太小了。24小时就很少了，更不要说48小时和72小时了 Hank's诱导，也就是通常所说的饥饿诱导，细胞培养到对数生长期后以Hank's替代常规完全培养基，3h后就可诱导出自噬。我用Hank's诱导了3h后电镜观察有30%细胞都有自噬这种现象，但不如国外报道的高。 sigma的氯喹的货号C6628。用氯喹做自噬抑制剂，293T细胞50uM就可以。1. 可以用双蒸水配制2. 配制后4度保存 不同的自噬抑制剂机制不同。抑制的步骤也不同。有的不能抑制lc3的剪切，但能抑制后续的步骤，Chloroquine抑制自噬体与溶酶体的融合过程，autophgy不能完成，所以lc3才会累积。因此加了抑制剂lc3之后会比不加的要高。氯喹能提高溶酶体中的pH值，使溶酶体中的酸性水解酶丧失活性，从而导致“自噬溶酶体”不能降解，因此，位于自噬体和自噬溶酶体膜上的LC3不能按时降解，表现为LC3荧光长时间的保留或WB中LC3条带变粗。 Z-VAD-FMK（caspase-3 抑制剂）抑制EV71感染所引起的细胞凋亡，观察细胞的自噬情况。研究发现，抑制细胞凋亡能增加LC3-I转化为LC3-II以及p62的降解。 1. 雷帕霉素：作为以mTOR 为靶点最经典的诱导剂已经被广为应用，推荐工作浓度为1μmol-10μmol； 2. 氯喹：氯喹（Chloroquine）作为溶酶体的抑制剂，可以抑制自噬体与溶酶体的融合从而可以用来作为自噬以及自噬流的抑制剂用于实验研究，推荐使用浓度：10umol-50umol。 正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节，经报道的

雷帕霉素促进自噬并降低神经组织损伤和脊髓损伤后运动功能障碍

雷帕霉素促进自噬并降低神经组织损伤和脊髓损伤 后的运动功能障碍 摘要:哺乳动物雷帕霉素的受体(mTOR)是负向调节自噬的丝氨酸/苏氨酸激酶。雷帕霉是mTOR 信号抑制剂，可以促进自噬并在中枢神经系统 (CNS) 的几种疾病中起到神经保护作用。在本研究中，我们评估了小鼠脊髓损伤 (SCI) 后，应用雷帕霉素是否促进自噬，并降低神经组织损伤和减少运动功能障碍。我们的结果表明雷帕霉素的应用大大减少了损伤脊髓组织中p70S6K 蛋白质的磷酸化以及LC3和Beclin 1 的高表达。此外，损伤脊髓组织中，雷帕霉素组的神经元丢失和细胞死亡率明显低于溶剂对照组。并且，在大鼠后肢运动功能评分--（BMS评分）中，雷帕霉素处理组得分明显高于溶剂对照组。这些结果表明，脊髓损伤后，雷帕霉素通过抑制 mTOR 信号通路，提高自噬水平，并减少神经组织损伤和运动功能障碍。脊髓损伤后应用雷帕霉素治疗可能成为一种新的治疗策略。 关键词：自噬；Beclin1；LC3；雷帕霉素靶蛋白；雷帕霉素；脊髓损伤 前言：雷帕霉素是一种大环内酯类药物，最初被用作抗真菌剂。雷帕霉素是一种特殊的哺乳动物雷帕霉素受体阻滞剂(Ravikumar et al., 2004; Schmelzle and Hall, 2000)。它结合于胞质的FK结合蛋白(FKBP12)。雷帕霉素-FKBP12复合物抑制mTOR，阻止p70S6K 和4EBP1的磷酸化(Vignot et al., 2005)。因此，雷帕霉素抑制mTOR 从而促进自噬(Kamada et al., 2004;Klionsky and Emr, 2000;

Schmelzle and Hall, 2000; Wang and Klionsky, 2003)。 自噬是一种细胞内的分解代谢的机制，通过自噬溶酶体途径降解细胞质成分(Mizushima, 2004)。这种机制对维持稳态起着重要的作用，在某些疾病中起到保护作用(Hara et al., 2006; Liang et al., 1999; Ru-binsztein et al., 2005; Shintani and Klionsky, 2004)。自噬在细胞生长和应激状态下清除或者再利用长寿蛋白和受损的细胞器(Levine and Klionsky, 2004;Shintani and Klionsky, 2004)。已有研究表明，自噬对正常细胞的生长，分化和存活也很重要(Reggiori and Klionsky, 2002; Schmelzle and Hall, 2000)。 新近研究表明，应用雷帕霉素能够增强自噬，在亨廷顿病和帕金森病等某些神经退行性疾病中能够保护神经细胞(Malagelada et al., 2010; Ravikumar et al.,2004)。在这些退行性疾病中，应用雷帕霉素诱导自噬能够增强对聚集蛋白的清除从而减少其毒性(Berger et al., 2006; Webb et al., 2003)。以往的研究表明，在创伤性脑损伤和脑缺血后的神经组织中自噬活动是增强的(Bigford et al., 2009; Diskin et al., 2005; Ramiet al., 2008)。应用雷帕霉素增强自噬的活性并降低脑外伤和新生儿缺氧缺血性脑损伤的神经组织损伤(Carloni et al., 2008; Erlich et al., 2007a)。一些研究也表明，自体吞噬增强可以减少受中枢神经系统（CNS）中受损神经细胞的凋亡(Carloni et al., 2008; Pan et al., 2008)。因此，使用雷帕霉素促进自噬被认为能够在中枢神经系统中起到神经保护功能。

国产可降解雷帕霉素药物洗脱支架置入的疗效评价：与金属裸支架比较

中国组织工程研究与临床康复第15卷第3期2011–01–15出版 Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research January 15, 2011 Vol.15, No.3 ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH 487 Department of Cardiology, Shenzhou Hospital Affiliated to Shenyang Medical College, Shenyang 110002, Liaoning Province, China Zhao Hong-li★, Master, Associate chief physician, Department of Cardiology, Shenzhou Hospital Affiliated to Shenyang Medical College, Shenyang 110002, Liaoning Province, China zhao_hongli@ sina.c om.c n Correspondence to: Li Lu, Doctor, Chief physician, Department of Cardiology, Shenzhou Hospital Affiliated to Shenyang Medical College, Shenyang 110002, Liaoning Province, China liluxin5@ https://www.wendangku.net/doc/1f15892584.html, Supported by: Science and Technology Program of Shenyang, No. 1081284-9-00* Received: 2010-07-21 Accepted: 2010-09-26 国产可降解雷帕霉素药物洗脱支架置入的疗效评价：与金属裸支架比较*★赵红丽，李潞，王帅，李纯 Efficacy of homemade biodegradable rapamycin drug-eluting stent implantation: Compared with bare-metal stents Zhao Hong-li, Li Lu, Wang Shuai, Li Chun Abstract BACKGROUND:The drug-eluting stent (DES) can obviously decrease restenosis rate, but permanent polymer coating impedes the process of vascular endothelial and promotes restenosis, cause many complications such as late thrombosis at the same time of the inhibition of vascular smooth muscle cells proliferation. OBJECTIVE: To investigate the long-term outcomes and safety after homemade biodegradable DES implantation for patients with coronary artery disease and diabetes mellitus, and compare with bare-metal stents. METHODS: A total of 136 consecutive patients of coronary artery disease and type-2 diabetes mellitus, receiving homemade biodegradable DES (EXCEL TM) implantation following percutaneous coronary angioplasty were studied as DES group; A total of 87 patients with coronary artery disease and type-2 diabetes mellitus treated with bare-metal stents were included as control group. All patients were identified and followed up at least 12 months. The differences of major adverse cardiovascular events were recorded and the patients were rechecked undergoing quantitative coronary angiography. RESULTS AND CONCLUSION: A total 129 patients in DES group and 83 patients in control group accomplished follow-up at a mean time of (13.5±3.5) months. There were 8 patients and 12 patients in DES group and control group appeared major adverse cardiovascular events with significant difference between the two groups (P=0.045), the rate of target vessel revascularization and repeated angina were higher control group than in BMS group (P < 0.05). The late loss index and restenosis rate with DES were lower when underwent quantitative coronary angiograph follow-up (P < 0.05). The restenosis and major adverse cardiovascular events were reduced by homemade biodegradable DES in coronary heart disease patients with diabetic mellitus, and DES is safe and effective with improved long-termed prognosis. Zhao HL, Li L, Wang S, Li C.Efficacy of homemade biodegradable rapamycin drug-eluting stent implantation: Compared with bare-metal stents. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2011;15(3): 487-490. [https://www.wendangku.net/doc/1f15892584.html, https://www.wendangku.net/doc/1f15892584.html,] 摘要 背景：药物洗脱支架明显降低了再狭窄率，但永久聚合物涂层在抑制血管平滑肌细胞增生的同时，阻碍血管完全内皮化进 程，促使再狭窄发生，且永久聚合物涂层可引发晚期血栓等并发症。 目的：观察冠心病合并糖尿患者置入国产可降解药物洗脱支架后的远期疗效和安全性，并与置入金属裸支架患者进行比较。 方法：实验组选择冠心病合并2型糖尿病患者136例，首次经皮冠状动脉成形治疗，置入国产可降解药物洗脱支架 (EXCEL TM)，并以同期行金属裸支架置入治疗的冠心病合并2型糖尿病患者87例为对照组，随访12个月以上，记录主要 不良心血管事件发生情况，并复查冠状动脉造影。 结果与结论：实验组129例，对照组83例完成(13.5±3.5)个月随访，实验组及对照组分别有8例及12例患者发生不良心 血管事件，两组间差异有显著性意义(P=0.045)，对照组靶血管血运重建及再发心绞痛多于实验组(P < 0.05)。两组患者随访 冠状动脉造影的定量分析提示实验组最终丢失指数小于对照组(P < 0.05)，再狭窄率低于对照组(P < 0.05)。说明对于冠心病 合并糖尿病患者，应用国产可降解药物洗脱支架可降低不良心血管事件发生率，减少再狭窄，改善患者远期预后，安全性 能良好。 关键词：血管成形；裸支架；可降解药物洗脱支架；经皮冠状动脉；糖尿病 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2011.03.026 赵红丽，李潞，王帅，李纯.国产可降解雷帕霉素药物洗脱支架置入的疗效评价：与金属裸支架比较[J].中国组织工程研究与 临床康复，2011，15(3):487-490. [h ttp://https://www.wendangku.net/doc/1f15892584.html, h ttp://https://www.wendangku.net/doc/1f15892584.html,] 0 引言 冠状动脉内支架置入是冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)介入治疗的重大发展，裸金属支架再狭窄率可达20%~40%，2003年药物洗脱支架的应用使再狭窄率明显降低，是又一个介入治疗的里程碑，但近年来药物洗脱支架置入后晚发支架内血栓形成，引起广泛关注[1-2]。研究证实药物洗脱支架明显降低再狭窄率的同时，其表面永久聚合物涂层在抑制血管平滑肌细胞增生的同时，阻碍血管完全内皮化进程，可引发支架内血栓形成[3-4]，故新一代药物洗脱支架着重于改善多聚物的生物相容性，通过应用可降解的多聚物来提高支架的安全性能。冠心病是糖尿病的重要并发症，同时糖尿病是支架内再狭窄的最主要危险因素[5]，在接受冠状动脉介入治疗的患者中，糖尿病患者占20%~

MTOR抑制剂的研究进展

1 mtor概述 mtor（哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)是蛋白激酶家族中新的一员，这类蛋白激酶又属于磷酯酰肌醇激酶相关激酶(pikk)［1-3］。mtor是在研究免疫抑制剂雷帕霉素的过程中发现的，科学家在研究中发现结构相似的免疫抑制剂fk506和雷帕霉素能够与相同的靶蛋白fkbp12 (fk506结合蛋白)结合发挥其免疫抑制作用，但是它却与fk506的免疫抑制机制不同，雷帕霉素与fkbp12结合形成的复合物不能与钙调素结合，并且雷帕霉素也不能抑制t细胞的早期激活或直接减少细胞因子的合成，它是通过不同的细胞因子受体阻断信号传导，阻断t淋巴细胞及其它细胞由g1期至s期的进程，而fk506则是抑制t淋巴细胞由g0期至g1期的增殖［4］。 由于mtor在细胞增殖、分化、转移和存活中的重要地位，mtor已经成为癌症治疗中的一个新靶点。mtor抑制剂的抗癌机制都是通过首先与fkbp-12蛋白生成复合物，此复合物再与mtor的frb区域结合由此抑制mtor的功能，从而抑制了下游的相关因子的功能，将肿瘤细胞阻滞于g1期(前dna合成期)从而使肿瘤细胞的生长受抑制并最终阻滞细胞的增殖甚至使细胞凋亡。 2 mtor抑制剂 2.1 雷帕霉素及其衍生物雷帕霉素(rapamycin,sirolimus,rapa,1)属大环内酯类抗生素，与fk506结构相似。早在1975年，从们已从吸水链霉菌(steoptomyces hyproscopicus)的代谢产物中分离出雷帕霉素，但由于其过低的抗菌活性而遭冷遇，直至1977年由于其结构与免疫抑制剂fk506相似而被发现同样具有免疫抑制活性，但令人惊奇的是雷帕霉素与fk506却有着非常不同的免疫抑制机制，这也加深了人们对t细胞活化的理解。1989年雷帕霉素作为抗移植的排斥反应的新药进入临床，现已上市。在上世纪90年代中期，由于雷帕霉素对t 淋巴细胞增殖的抑制又引导人们将其用于抗肿瘤细胞治疗，并发现其同样具有较好的抗肿瘤活性，此药作为抗癌药已由美国惠氏公司开发即将进入临床［5］。 雷帕霉素的抗肿瘤活性虽强，但它有两个严重的缺点：稳定性差及溶解性差。雷帕霉素对酸或碱都不稳定，即使在生理ph条件下雷帕霉素也会发生β-消除形成α,β-不饱和酮和发生内酯环的水解形成β-羟基酮而活性下降。所以曾有研究者尝试将内酯环附近引入较大位阻的基团以及将32位的羰基还原以阻止雷帕霉素的降解。其修饰的结果表明在1位引入烷基可以延长雷帕霉素衍生物的半衰期，并且烷基的体积增大使得雷帕霉素衍生物的稳定性增加但其fkbp结合活性也随之剧降从而使得mtor抑制活性降低；而将32位的羰基还原成羟基对稳定性和抑制活性的影响都较小［6-7］。 雷帕霉素溶解性差的问题则导致了很难得到其盖仑制剂或口服剂型，一直以来雷帕霉素的使用都是通过非肠道给药系统。为了解决口服给药生物利用度过低的问题，研究者试图在雷帕霉素的结构上引人亲水性的基团。将16位的甲氧基的甲基脱去或者将甲氧基替换成炔氧基可以增加雷帕霉素衍生物的稳定性和生物利用度。而在40位的羟基上的修饰显然对改善雷帕霉素的理化性质更为有利。 everolimus［certican,rad001,sdz rad,43-o-(2-hydroxethyl)-rapamycin］everolimus（其结构如图1所示）是novartis公司研发的水溶性比雷帕霉素好的半合成衍生物，可以口服给药。体外免疫抑制活性比雷帕霉素低3倍，但在体内与雷帕霉素相当。作为免疫抑制剂与环孢素有协同作用，目前处于肾移植的ⅲ期临床试验中；evero-limus有抑制血管内皮细胞增殖的作用，已批准作为药物支架的涂层药物；everolimus也是mtor抑制剂，

MTOR抑制剂的研究进展

1.mtor概述 mtor（哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)是蛋白激酶家族中新的一员，这类蛋白激酶又属于磷酯酰肌醇激酶相关激酶(pikk)［1-3］。mtor是在研究免疫抑制剂雷帕霉素的过程中发现的，科学家在研究中发现结构相似的免疫抑制剂fk506和雷帕霉素能够与相同的靶蛋白fkbp12 (fk506结合蛋白)结合发挥其免疫抑制作用，但是它却与fk506的免疫抑制机制不同，雷帕霉素与fkbp12结合形成的复合物不能与钙调素结合，并且雷帕霉素也不能抑制t细胞的早期激活或直接减少细胞因子的合成，它是通过不同的细胞因子受体阻断信号传导，阻断t淋巴细胞及其它细胞由g1期至s期的进程，而fk506则是抑制t淋巴细胞由g0期至g1期的增殖［4］。 由于mtor在细胞增殖、分化、转移和存活中的重要地位，mtor已经成为癌症治疗中的一个新靶点。mtor抑制剂的抗癌机制都是通过首先与fkbp-12蛋白生成复合物，此复合物再与mtor的frb区域结合由此抑制mtor的功能，从而抑制了下游的相关因子的功能，将肿瘤细胞阻滞于g1期(前dna合成期)从而使肿瘤细胞的生长受抑制并最终阻滞细胞的增殖甚至使细胞凋亡。 2 mtor抑制剂 2.1 雷帕霉素及其衍生物雷帕霉素(rapamycin,sirolimus,rapa,1)属大环内酯类抗生素，与fk506结构相似。早在1975年，从们已从吸水链霉菌(steoptomyces hyproscopicus)的代谢产物中分离出雷帕霉素，但由于其过低的抗菌活性而遭冷遇，直至1977年由于其结构与免疫抑制剂fk506相似而被发现同样具有免疫抑制活性，但令人惊奇的是雷帕霉素与fk506却有着非常不同的免疫抑制机制，这也加深了人们对t细胞活化的理解。1989年雷帕霉素作为抗移植的排斥反应的新药进入临床，现已上市。在上世纪90年代中期，由于雷帕霉素对t 淋巴细胞增殖的抑制又引导人们将其用于抗肿瘤细胞治疗，并发现其同样具有较好的抗肿瘤活性，此药作为抗癌药已由美国惠氏公司开发即将进入临床［5］。 雷帕霉素的抗肿瘤活性虽强，但它有两个严重的缺点：稳定性差及溶解性差。雷帕霉素对酸或碱都不稳定，即使在生理ph条件下雷帕霉素也会发生β-消除形成α,β-不饱和酮和发生内酯环的水解形成β-羟基酮而活性下降。所以曾有研究者尝试将内酯环附近引入较大位阻的基团以及将32位的羰基还原以阻止雷帕霉素的降解。其修饰的结果表明在1位引入烷基可以延长雷帕霉素衍生物的半衰期，并且烷基的体积增大使得雷帕霉素衍生物的稳定性增加但其fkbp结合活性也随之剧降从而使得mtor抑制活性降低；而将32位的羰基还原成羟基对稳定性和抑制活性的影响都较小［6-7］。 雷帕霉素溶解性差的问题则导致了很难得到其盖仑制剂或口服剂型，一直以来雷帕霉素的使用都是通过非肠道给药系统。为了解决口服给药生物利用度过低的问题，研究者试图在雷帕霉素的结构上引人亲水性的基团。将16位的甲氧基的甲基脱去或者将甲氧基替换成炔氧基可以增加雷帕霉素衍生物的稳定性和生物利用度。而在40位的羟基上的修饰显然对改善雷帕霉素的理化性质更为有利。 everolimus［certican,rad001,sdz rad,43-o-(2-hydroxethyl)-rapamycin］everolimus（其结构如图1所示）是novartis公司研发的水溶性比雷帕霉素好的半合成衍生物，可以口服给药。体外免疫抑制活性比雷帕霉素低3倍，但在体内与雷帕霉素相当。作为免疫抑制剂与环孢素有协同作用，目前处于肾移植的ⅲ期临床试验中；evero-limus有抑制血管内皮细胞增殖的作用，已批准作为药物支架的涂层药物；everolimus也是mtor抑制剂，是作用于mtor靶位的抗肿瘤药物，它能与细胞毒抗肿瘤药物联合使用，对非小细胞肺癌有实质性的效果，处在i期临床。对黑色素瘤、直肠癌、胰腺癌有作用，口服剂量2.5 mg/ （kg•d）［8］。