细菌鉴定和耐药性检测方法的发展

细菌鉴定和耐药性检测对于指导临床精确用药和及时治疗患者具有重要意义。目前临床上进行细菌鉴定和耐药检测仍以表型检测方法为主，主要包括：传统手工鉴定与药敏实验方法、自动化药敏鉴定系统。传统方法虽然能够满足临床的部分需要，但这些方法仍然存在一些缺点，例如检测时间较长和检测结果不够准确等。因此，随着分子生物学技术在临床检验领域的应用，近年来发展了一系列快速细菌鉴定和（或）耐药检测技术，例如基于ＰＣＲ技术和ＤＮＡ探针杂交以及生物芯片技术等，这类方法的特点是快速而准确，一般在几个小时之内就可以得到检测结果。

１传统方法在细菌鉴定和耐药性检测中的应用临床手工细菌鉴定和细菌药敏实验，是临床上尤其在中小医院应用最广泛的方法。细菌鉴定主要是根据细菌对生化物质的代谢特点进行，药敏方法包括纸片扩散法（常规实验室使用较普遍）和抗生素稀释法（ＭＩＣ法）等。这些方法的特点是方便、易操作，成本低，而且灵活性强，测定的细菌和药物可灵活选择。其缺点是操作烦琐、经验依赖性强、报告结果慢，不能完全适应临床治疗的需要。

使用自动化药敏和鉴定系统，是临床微生物学实验包括体外药物敏感实验的发展方向。最有代表性的是ＶＩＴＥＫ－ＡＭＳ微生物自动分析系统，可同时完成细菌鉴定和药敏实验。该套系统的检测卡片分为１４种，每一种鉴定卡片含有２５种以上的生化反应指标，基本与常规检测鉴定相同。此方法的优点是简便、快速、鉴定范围广，受人为的影响小，可靠性高。但它仍需要细菌培养的步骤，准确性也受到一定限制，同时其耗材价格较为昂贵。使用这类仪器的主要是三级甲等以上的大型医院。在细菌快速鉴定方面最有代表性的是ｍｉｎｉ－Ｖｉｄａｓ全自动免疫分析仪，其原理是应用细菌的特异性抗体对细菌进行鉴定，以荧光为标记，进行自动化检测。其最大优点是速度快，可以在４０ｍｉｎ内快速鉴定沙门氏菌、大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７、单核李斯特菌，空肠弯曲杆菌和葡萄球菌肠毒素等。但检测指标过少，主要限于这几种菌，而且也不能进行药敏实验。

目前，微生物鉴定技术中除了少数医院使用半自动、全自动的细菌鉴定仪外，大多数医院主要还是使用常规鉴定技术进行细菌菌种的鉴定。

２分子生物学技术在细菌种属鉴定中的应用采用与系统发育学相关的基因实现对细菌血清型的分型，越来越成为一种趋势。目前，利用基因检测方法对细菌进行种属鉴定所涉及的基因包括细菌１６ｓｒＲＮＡ基因或５ＳｒＲＮＡ序列、ＨＳＰ基因家族、ｇｙｒＢ基因以及细菌特异基因等。

２．１利用１６ＳｒＲＮＡ基因序列作为分类依据的原因利用１６ＳｒＲＮＡ基因序列对细菌进行菌种鉴定在目前应用较多，也越来越被临床所接受。在细菌分类学著作中，如《伯杰氏系统细菌学手册》，越来越倾向于选择１６ＳｒＲＮＡ基因序列作为分类的依据。主要原因有下面几点：

２．１．１ｒＲＮＡ存在于所有生物中，在生物进化过程中其功能保持不变。１６ＳｒＲＮＡ基因普遍存在于原核生物中，在真核生物中其同源分子是１８ＳｒＲＮＡ。２．１．２１６ＳｒＲＮＡ最能反映细菌间的亲缘关系。在１６ＳｒＲＮＡ分子中，既含有高度保守的序列，又含

细菌鉴定和耐药性检测方法的发展文章编号：１６７２－３３８４（２００６）－０４－００３９－０６

【作者】杨华为蒋迪王璨赵传赞高华方

生物芯片北京国家工程研究中心（北京１０２２０６）

【中图分类号】Ｒ９１５【文献标识码】Ｂ

有中度保守和高度变化的序列，能够衡量进化距离不同的各类原核生物。

２．１．３１６ＳｒＲＮＡ分子量大小适中，便于序列分析。５ＳｒＲＮＡ约１２０ｂｐ，信息量太小；２３ＳｒＲＮＡ约２９００ｂｐ，信息量大，但分析工作量太大，不利于实际操作；１６ＳｒＲＮＡ，约１５４０ｂｐ，信息量足够，分析工作量适中。

２．２１６ＳｒＲＮＡ用于临床细菌鉴定的意义２．２．１菌种鉴定结果更加准确。利用基因序列进行菌种的分析是一种直接的分析方法，该方法比利用理化性状分析菌种更准确。在实际应用中，常规的细菌鉴定由于菌株的极易变异性，或某个具有鉴别意义的生化性状丢失，常会出现争议性的结果。２．２．２利用基因鉴定比常规方法更灵敏，特别是当标本中细菌数目少或难以培养时，只能通过用１６ＳｒＲＮＡ基因扩增后进行序列分析。

随着测序技术的发展，细菌基因组序列逐渐清楚，对细菌体内所含基因也逐渐了解，因此利用细菌的特异基因进行菌种鉴定就成为可能。目前在临床微生物研究中常常会用到特异基因对菌种鉴定，特别是当细菌菌种间通过１６ＳｒＲＮＡ基因不易区分时。

２．３１６ＳｒＲＮＡ基因在菌种鉴定中的应用。

ＤＮＡ芯片具有灵敏度高和检测通量高的特点，已经广泛用于微生物的检测。Ｗａｎｇ等［１］建立了一个寡核苷酸芯片来检测人类粪便中的肠道细菌，该芯片采用了２０个主要的人类肠道细菌菌种的１６ＳｒＲＮＡ序列设计的寡核苷酸探针，检测的２０个肠道菌包括：多形拟杆菌、普通拟杆菌、脆弱拟杆菌、梭状梭菌、普氏梭杆菌、白色瘤胃球菌、长双岐杆菌、青春期双岐杆菌、婴儿双岐杆菌、产气真杆菌、嗜酸乳杆菌、大肠埃希氏菌和屎肠球菌等。

除了使用１６ＳｒＲＮＡ基因作为检测靶基因外，也有报道使用另外具有细菌种属特征的基因，如２３ＳｒＲＮＡ基因。Ａｎｔｈｏｎｙ等［２］利用通用引物扩增细菌２３ＳｒＲＮＡ的可变区，产物与寡核苷酸芯片杂交，进行细菌菌种鉴定。可以检测血培养中常见的３０多种细菌。

另外，由于一些不常见肠球菌菌种的生化反应特征很少，通过常规生化实验难以鉴定，因此可以利用ＰＣＲ等分子方法实现对肠球菌进行准确地鉴定到菌种。Ｇｒｅｇｏｒｙ等［３］利用１６ＳｒＲＮＡ和２３ＳｒＲＮＡ基因之间的间区序列（ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃｓｐａｃｅｒ，ＩＴＳ）作为ＰＣＲ的靶基因，建立了一套ＰＣＲ辅用酶切图谱的方法，对肠球菌属的多个种做了准确的鉴定。

除了使用１６ＳｒＲＮＡ和２３ＳｒＲＮＡ基因作为菌种鉴定的依据外，ｇｙｒＢ基因也是选择较多的基因之一。Ｓｔｉｎａ等［４］构建了寡核苷酸玻璃芯片，用于急性上呼吸道感染细菌的诊断。探针序列来自呼吸道病原菌的编码拓扑酶ＧｙｒＢ和ＰａｒＥ基因的变异区域。检测的细菌种类有：白喉棒状杆菌、坏疽梭杆菌、嗜血流感杆菌、嗜肺军团菌、卡他摩拉菌、肺炎支原体、金葡菌、肺炎链球菌和化脓链球菌等。检测的临床标本包括中耳流出物和咽拭子标本。具有比较高的敏感性和特异性。对中耳流出物标本，检测嗜血流感杆菌、卡他摩拉菌和肺炎链球菌的敏感性分别为９６％（培养法９３％），７３％（培养法为９３％）和１００％（培养法为７８％）；咽拭子标本与口腔其他常见菌没有交叉反应；化脓链球的敏感性为９３％（培养法８０％）。

特异基因也常用于细菌的鉴定。粪肠球菌和屎肠球菌是临床最常见的肠球菌，传统的生化方法能够鉴定出粪肠球菌，但却不能区分屎肠球菌和某些新发现的肠球菌菌种，这时通过ＰＣＲ方法扩增屎肠球菌特异靶基因片段，就可以快速而准确地鉴别屎肠球菌［５］。

３分子生物学技术在细菌耐药性检测中的应用越来越多的研究利用分子生物学技术进行耐药性检测，其中一些方法利用编码耐药性的基因进行细菌耐药性检测，已经被美国临床实验室标准化委员会（ＮＣＣＬＳ）认可。与传统的药敏实验方法比较，基因方法有可能提供更加快速和更加可靠的检测结果［６］，原因如下：①首先基因方法能够直接用于检测临床标本而无需对细菌进行分离培养。②由

于前者检测基因型，而传统方法检测的是人为的体外条件下基因型的表达型，显而易见，基因型方法用于检测药敏更加合理。这样风险更低，尤其当遇到临床危重感染如脑膜炎、菌血症或者需要长期抗生素治疗的心内膜炎和骨髓炎等感染时更是这样。

③对某些生长缓慢的细菌，基因型方法远快于传统法得到结果。④某些细菌体外无法培养，只能用基因法检测。⑤由于基因法不需要对细菌进行繁殖，因而也降低了致病菌的生物危害风险。但是目前基因方法仍未能大量应用于临床细菌耐药性的检测，原因主要有２点：①某些抗生素的耐药机制仍未完全阐明。②仅仅少部分基因方法经过了全面的临床实验验证。未来随着更多耐药机制的阐明和更多临床资料的积累，基因方法有望得到越来越多的应用。

随着分子生物学的发展和临床对细菌耐药机制研究的深入，目前已经发现许多细菌耐药性状与细菌体内的基因有直接的联系。如革兰氏阴性菌中产ＥＳＢＬｓ（超广谱β－内酰胺酶）菌株多与细菌体内的一些耐药基因的出现或基因突变有关。在中国由于头孢噻肟的频繁使用，使得肠杆菌科细菌临床株中检出最多的ＥＳＢＬ酶便是头孢噻肟水解酶ＣＴＸ－Ｍ，它由ｃｔｘ－ｍ基因编码，直接导致细菌对三代头孢菌素中头孢噻肟的耐药性。目前在国际上研究较多的还有ｓｈｖ、ｔｅｍ等基因突变形成的其他超广谱酶，导致细菌对其他三代头孢如头孢他啶等抗生素的耐药性。

在革兰氏阳性菌中，对于耐甲氧西林的ＭＲＳＡ或者ＭＲＣＮＳ菌株，研究已经表明耐药性状与细菌体内的ｍｅｃＡ基因有直接的关系。主要耐药机制是由染色体上的ｍｅｃＡ基因介导，该基因编码一种与β－内酰胺类抗生素亲和力降低的膜蛋白ＰＢＰ２ａ，从而产生耐药性。ｍｅｃＡ位于染色体上，可在转座子作用下插入其他染色体或质粒中，使耐药性得以传播。在临床药敏实验中通过检测ｍｅｃＡ基因的有无来确定葡萄球菌是否为ＭＲＳＡ或者ＭＲＣＮＳ菌株已经成为临床检验中的“金标准”方法。

研究发现用于治疗葡萄球菌感染的大环内酯类、林可霉素类抗生素耐药主要与细菌体内的ｅｒｍＡ、ｅｒｍＢ、ｅｒｍＣ、ｍｓｒＡ基因有关（ＮＣＣＬＳ，２００４）。

下面主要以临床革兰阳性球菌为例，具体介绍各类常用分子技术在细菌耐药基因检测中的应用。３．１单重ＰＣＲ方法在耐药基因检测中的应用ＰＣＲ技术是一项比较成熟的分子技术，具有高敏感性和特异性，目前这一技术已经被广泛用于临床致病菌、动物感染和食品微生物的检测上。目前在细菌耐药检测方面的应用很多，例如用于葡萄球菌甲氧西林耐药基因（ｍｅｃＡ）的检测。

由于ｍｅｃＡ基因在菌株中总是异质性表达，不是所有耐甲氧西林的葡萄球菌菌株都能够通过标准的表型方法检测出来。尤其在ＣＮＳ中，这种异质性表达更加显著。因此临床检测中直接检测葡萄球菌中介导甲氧西林耐药的ｍｅｃＡ基因对监测耐药结果更准确。

与药敏实验的表型方法如肉汤微量稀释ＭＩＣ、琼脂稀释法、纸片扩散法和琼脂筛选法比较，ＰＣＲ（扩增ｍｅｃＡ）阳性率更高（ＪｅｏｎｇＪ等［７］）。检测金黄色葡萄球菌对甲氧西林耐药时，以ＰＣＲ为对照，表型方法中与ＰＣＲ的符合率可以达到１００％；检测ＣＮＳ的甲氧西林耐药时，表皮葡萄球菌等其他ＣＮＳ菌株表型方法与基因型的符合率只有９２．１％。因此现有方法中，ＰＣＲ检测甲氧西林耐药性的灵敏性和特异性明显高于传统药敏实验。

单重ＰＣＲ方法的最大不足之处在于检测的指标过于单一。

３．２直接用ＤＮＡ探针检测耐药基因

检测临床菌株标本除了使用单重ＰＣＲ方法外，还可以使用ＤＮＡ探针技术，如化学发光标记探针、ｂＤＮＡ探针技术等。目前运用较多的方法是利用化学发光标记探针的液相杂交技术，液相磁珠捕捉杂交联用化学发光分析技术就是其中的一种。

液相磁珠捕捉杂交联用化学发光分析技术［８］方法无需扩增就可以快速检测临床葡萄球菌中的ｍｅｃＡ基因。通过对多株培养后的葡萄球菌（包括

金葡菌和ＣＮＳ）进行检测，验证了基因探针方法的高度特异性：与ＰＣＲ方法（扩增ｍｅｃＡ基因）符合很好；金葡菌符合率为１００％；ＣＮＳ阳性和阴性符合率分别为９９．２％和１００％。显著高于表型方法检测的符合率。

但该技术也有其应用上的缺点。ＤＮＡ探针技术并不适合临床实验室对甲氧西林耐药葡萄球菌的诊断。虽然基因鉴定的特异性不错，但是灵敏度并不高，而且操作比较繁琐。

３．３多重ＰＣＲ在耐药基因检测中的应用

单重ＰＣＲ方法虽然在细菌的诊断和耐药基因的检测方面灵敏度高、特异性好，尤其是在检测临床耐甲氧西林金葡菌（ＭＲＳＡ）时结果较好，但是临床上往往面对的是多种致病菌种及菌株对多个抗生素的耐药性，因此只有最大限度地鉴定出这些致病菌种和检测出菌株的多种耐药性才能更好地指导临床医生用药。从理论上来说，多重ＰＣＲ可以实现多目标的检测，因此在临床致病菌的诊断研究中，多重ＰＣＲ的应用研究是一个重要的方向。３．３．１葡萄球菌中多种耐药基因的检测韩国的研究者发展的４重ＰＣＲ能够同时检测葡萄球菌中介导２种耐药性的４个耐药基因：甲氧西林耐药基因ｍｅｃＡ、氨基糖苷类耐药基因ａａｃ（６′）－ａｐｈ（２″）、ａｐｈ（３′）－ＩＩＩａ、ａｎｔ（４′）－Ｉａ。结果表明在金黄色葡萄球菌和ＣＮＳ中基因扩增与表型耐药结果的符合率分别是：ｍｅｃＡ的基因为９８％和８１％，ａａｃ（６′）－ａｐｈ（２″）基因为１００％和８５％。

也有报道用９重ＰＣＲ进行耐药基因检测［１０］，检测的金葡菌中８个耐药基因介导的对５类抗生素的耐药性：ｍｅｃＡ（甲氧西林耐药），ａａｃＡ－ａｐｈＤ（氨基糖苷类耐药），ｔｅｔＫ和ｔｅｔＭ（四环素耐药），ｅｒｍ（Ａ）和ｅｒｍ（Ｃ）（大环内酯类耐药），ｖａｔ（Ａ）、ｖａｔ（Ｂ）和ｖａｔ（Ｃ）（链阳霉素Ａ耐药）。整个多重扩增和分析只需约６ｈ，结果也比较特异。３．３．２肠球菌中多种耐药基因的检测作为临床最为常见的革兰阳性球菌之一，肠球菌同样携带多种耐药基因。仅仅是介导耐药性的基因就有多个，详见表１。因此使用多重ＰＣＲ（Ｓｅｒｇｅｉ等［１１］）能够精确检测肠球菌中这些基因的存在。在用６重ＰＣＲ检测对庆大霉素耐药水平从低（ＭＩＣｓ，≥１６μｇ／ｍＬ）到中介到高水平（ＭＩＣｒａｎｇｅ，１２８ｔｏ≥５００μｇ／ｍＬ）的肠球菌株时，基因型与表型方法的结果一致。３．３．３多种细菌中的多种耐药基因的检测有些耐药基因存在于几个细菌种属中，如编码高水平庆大霉素耐药双功能氨基糖苷类修饰酶ＡＡＣ（６′）－ＡＰＨ（２″）的ａａｃ（６′）－Ｉｅ－ａｐｈ（２″）－Ｉａ基因，出现于葡萄球菌和肠球菌等其他菌属中。而介导红霉素耐药的基因ｅｒｍＡ、Ｂ、Ｃ等也已在葡萄球菌、肺炎链球菌以及肠球菌等菌属中检测到。

Ｊｕｎｇ－Ａ等［１２］用４多重ＰＣＲ检测了红霉素耐药菌株中相关的耐药基因ｅｒｍＡ、ｅｒｍ、ｅｒｍＣ和ｍｅｆ等，结果发现金葡菌中主要由ｅｒｍＡ介导耐药；肠球菌中主要由ｅｒｍＢ介导耐药；ＣＮＳ中主要由ｅｒｍＣ介导耐药；ｍｅｆ只出现于ＣＮＳ和肠球菌，而不出现于金黄色葡萄球菌中。

多重ＰＣＲ技术具有能够对多个基因同时检测的特点，特别适合于临床多指标的检验。但发展多重ＰＣＲ诊断技术也受到一些因素限制：由于ＰＣＲ产物的检测往往依靠电泳进行，因此实验设计时需要将扩增的各靶基因片断设计成不同的长度，以便

表１肠球菌重要的耐药基因

耐药基因介导的耐药性备注

ａａｃ（６′）－Ⅰｅ－ａｐｈ（２″）－Ⅰａａｐｈ（２″）－Ⅰｂ

ａｐｈ（２″－Ⅰｃ

ａｐｈ（２″）－Ⅰｄ

ａｐｈ（３′）－Ⅲａ

ａｎｔ（４′）－Ⅰａ对高水平庆大霉素耐药

对庆大霉素耐药

对庆大霉素耐药

对高水平庆大霉素耐药

多种氨基糖苷类耐药但不对庆大霉素耐药

多种氨基糖苷类耐药但不对庆大霉素耐药

高水平耐药（ＭＩＣ≥５００μｇ／ｍＬ））

低水平耐药

中水平耐药（ＭＩＣ＝２５６μｇ／ｍＬ）

高水平耐药（ＭＩＣ≥５００μｇ／ｍＬ）

低水平耐药

低水平耐药

区分各电泳条带，这对于扩增多个靶基因来说，难度较大。

３．４实时荧光ＰＣＲ在耐药基因检测中的应用实时荧光ＰＣＲ是根据荧光共振能量转移（ｆｌｕｏ－ｒｅｓｃｅｎｃｅｒｅｓｏｎａｎｃｅｅｎｅｒｇｙｔｒａｎｓｆｅｒ，ＦＲＥＴ）原理，设计相应的荧光标记核酸探针，通过ＰＣＲ反应对相应靶ＤＮＡ进行均相定性定量测定的技术。与传统的普通ＰＣＲ相比，荧光ＰＣＲ具有灵敏度高、对环境的污染小、可定量等优点。目前该技术也已应用于临床菌株的检测中。Ｈｕｌｅｔｓｋｙ等［１３］设计了非常巧妙的实时荧光多重ＰＣＲ方法，对含有各种混合葡萄球菌的临床标本进行了检测，检测结果能够确定其中的ＭＲＳＡ。Ｐａｔｒｉｃｅ等［１４］利用实时荧光多重ＰＣＲ直接快速检测无菌或有菌区标本的ＭＲＳＡ，来区分ｍｅｃＡ的信号是来源于金葡菌还是ＣＮＳ。

实时荧光多重ＰＣＲ技术具有检测快速、灵敏度高、特异性好以及自动化程度高等优点，因此比较适合临床使用。但该技术检测的临床指标过于单一，远不能满足临床的需要。

３．５基因芯片在耐药基因检测中的应用

ＤＮＡ芯片作为高通量检测技术，已经成为分析全转录子组（ｃＤＮＡ表达谱芯片）和ＤＮＡ序列变异（寡核苷酸芯片）的工具，尤其适合于检测细菌中多种耐药基因的存在。

３．５．１革兰阴性菌中多种耐药基因的检测ＤＮＡ芯片与多重ＰＣＲ结合，可用于多种耐药基因的检测。临床革兰氏阴性细菌，尤其肠杆菌科细菌中，由于超广谱β－内酰胺酶以及头孢菌素酶的流行，导致致病菌对主要的一线常用药β－内酰胺类抗生素高度耐药。因此对介导这些耐药的耐药基因进行检测，有很大的临床意义。Ｙｅｏｎｈｅｅ等［１５］针对常见的超广谱β－内酰胺酶编码耐药基因建立的ＤＮＡ芯片，检测的对象包括ｐｓｅ、ｏｘ、ｆｏｘ、ｍｅｎ、ｃｍｙ、ｔｅｍ、ｓｈｖ、ｏｘｙ、ａｍｐＣ等多个耐药基因。３．５．２革兰阳性菌多种耐药基因的检测可以用ＤＮＡ芯片检测临床金葡菌中存在的多种ＭＬＳＢ耐药相关基因［１６］：ｅｒｍＡ、ｅｒｍＢ、ｅｒｍＣ、ｅｒｅＡ、ｅｒｅＢ和

ｍｓｒＡ／Ｂ等６个靶基因，覆盖了９８％的临床ＭＬＳＢ耐药性金葡菌耐药基因。

为了建立一种快速和高通量的实用ＤＮＡ芯片技术，以用于临床细菌鉴定和耐药基因检测，还需进行大量的研究来克服目前分子生物学方法应用于临床的不足，如：建立一种简便有效提取临床细菌核酸的方法，建立有效的荧光标记模板方法比如不对称ＰＣＲ标记，以提高杂交效率等。另外，芯片操作自动化和数据处理等问题的解决更是芯片走向临床实用化的关键。

目前，传统的表型检测方法仍然是临床微生物诊断领域的基本手段，分子生物学方法仅仅起到一定程度的补充作用。可以预料，未来随着细菌耐药机制研究的深入和临床资料的积累，细菌基因型与耐药性之间的关系会更加明确，分子生物学方法将会为临床细菌鉴定和耐药性检测尤其是快速检测提供强大支持。

【参考文献】

［１］ＷａｎｇＲＦ，ＢｅｇｇｓＭＬ，ＲｏｂｅｒｔｓｏｎＬＨ，ｅｔａｌ．Ｄｅｓｉｇｎａｎｄｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｍｉｃｒｏａｒｒａｙｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｂａｃｔｅｒｉａｉｎｆｅｃａｌｓａｍｐｌｅｓ．ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌＬｅｔｔ，２００２，２１３（２）：１７５－１８２

［２］ＡｎｔｈｏｎｙＲＭ，ＢｒｏｗｎＴＪ，ＦｒｅｎｃｈＧＬ．Ｒａｐｉｄｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆｂａｃ－ｔｅｒｅｍｉａｂｙｕｎｉｖｅｒｓａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ２３ＳｒｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡｆｏｌ－ｌｏｗｅｄｂｙｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｔｏａｎｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｒｒａｙ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉ－ｃｒｏｂｉｏｌ，２０００，７８１－７８８

［３］ＧｒｅｇｏｒｙＪ．Ｔｙｒｒｅｌｌ，ＲｏｂｅｒｔＮ．Ｂｅｔｈｕｎｅ，１ＢａｒｂａｒａＷｉｌｌｅｙ，ｅｔａｌ．ＳｐｅｃｉｅｓＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉｖｉａＩｎｔｅｒｇｅｎｉｃＲｉｂｏｓｏｍａｌＰＣＲ．ｊｏｕｒｎａｌｏｆｃｌｉｎｉｃａｌｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９７，１０５４－１０６０［４］ＳｔｉｎａＢ．Ｒｏｔｈ，ＪａｒｉＪａｌａｖａ，ＯｌｌｉＲｕｕｓｋａｎｅｎ，ｅｔａｌ．ＵｓｅｏｆａｎＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＡｒｒａｙｆｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＤｉａｇｎｏｓｉｓｏｆＢａｃｔｅｒｉａＲｅ－ｓｐｏｎｓｉｂｌｅｆｏｒＡｃｕｔｅＵｐｐｅｒＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＩｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００４，４２６８－４２７４

［５］ＳｈｕｑｉｕＣｈｅｎｇ，ＦｅｒｎｅＫ．Ｍｃｃｌｅｓｋｅｙ，ＭｉｃｈａｅｌＪ．Ｇｒｅｓｓ，ｅｔａｌ．ＡＰＣＲＡｓｓａｙｆｏｒＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃｉｕｍ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９７，１２４８－１２５０

［６］ＦｒａｎｋｌｉｎＲ．Ｃｏｃｋｅｒｉｌｌ，ＩＩＩ．ＧｅｎｅｔｉｃＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＡｓｓｅｓｓｉｎｇＡｎ－ｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌＲｅｓｉｓｔａｎｃｅ．ＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒ，１９９９，４３

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［７］ＪｅｏｎｇＪ，ＣｈａｎｇＣＬ，ＰａｒｋＴＳ．ｅｔａｌ．ＥａｒｌｙＳｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆＯｘａｃｉｌｌｉｎ－

ＲｅｓｉｓｔａｎｔＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓａｎｄＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓｆｒｏｍＢｌｏｏｄＣｕｌｔｕｒｅ．ＪＫｏｒｅａｎＭｅｄＳｃｉ，２００２，１７：１６８－１７２［８］

ＫｏｌｂｅｒｔＣＰ，ＣｏｎｎｏｌｌｙＪＥ，ＬｅｅＭＪ，ｅｔａｌ．ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌｍｅｃＡＧｅｎｅｂｙＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＤＮＡＨｙ－ｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，２１７９－２１８２

［９］ＣｈｏｉＳＭ，ＫｉｍＳＨ，ＫｉｍＨＪ，ｅｔａｌ．ＭｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎ

ｏｆｇｅｎｅｓｅｎｃｏｄｉｎｇａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅｍｏｄｉｆｙｉｎｇｅｎｚｙｍｅｓａｎｄｍｅｔｈｉ－ｃｉｌｌｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｍｏｎｇＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓｐｅｃｉｅｓ．ＪＫｏｒｅａｎＭｅｄＳｃｉ，２００３，１８（５）：６３１－６３６

［１０］ＢｉｒｇｉｔＳｔｒｏｍｍｅｎｇｅｒ，ＣｈｒｉｓｔｉａｎｅＫｅｔｔｌｉｔｚ，ＧｕｉｄｏＷｅｒｎｅｒ，ｅｔａｌ．

ＭｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲＡｓｓａｙｆｏｒＳｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＮｉｎｅＣｌｉｎ－ｉｃａｌｌｙＲｅｌｅｖａｎｔＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃＲｅｓｉｓｔａｎｃｅＧｅｎｅｓｉｎＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００３，４０８９－４０９４［１１］

ＳｅｒｇｅｉＢ．Ｖａｋｕｌｅｎｋｏ，ＳｕｓａｎＭ．Ｄｏｎａｂｅｄｉａｎ，ＡｎａｔｏｌｉｙＭ．Ｖｏｓｋｒｅｓｅｎｓｋｉｙ．ＭｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲｆｏｒＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＡｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅＲｅｓｉｓｔａｎｃｅＧｅｎｅｓｉｎＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ．ＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌＬＡｇｅｎｔｓａｎｄＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，２００３，１４２３－１４２６

［１２］Ｊｕｎｇ－Ａ．Ｌｉｍ，Ａｅ－ＲａｎＫｗｏｎ，Ｓｏｏｋ－ＫｙｕｎｇＫｉｍ，ｅｔａｌ．Ｐｒｅｖａ－

ｌｅｎｃｅｏｆｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｍａｃｒｏｌｉｄｅ，ｌｉｎｃｏｓａｍｉｄｅａｎｄｓｔｒｅｐｔｏｇｒａｍｉｎａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓｉｎＧｒａｍ－ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｃｃｉｉｓｏｌａｔｅｄｉｎａＫｏｒｅａｎｈｏｓｐｉ－ｔａｌ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，２００２，４９：４８９－４９５

［１３］ＨｕｌｅｔｓｋｙＡＲ，Ｇｉｒｏｕｘ，Ｖ．Ｒｏｓｓｂａｃｈ，ｅｔａｌ．Ｖａｉｌｌａｎｃｏｕｒｔ，１Ｍ．

Ｂｅｒｎｉｅｒ，Ｎｅｗｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲａｓｓａｙｆｏｒｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｍｅｔｈｉ－ｃｉｌｌｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓｄｉｒｅｃｔｌｙｆｒｏｍｓｐｅｃｉｍｅｎｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇａｍｉｘｔｕｒｅｏｆｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＭｉ－ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００４，４２（５）：１８７５－１８８４

［１４］ＰａｔｒｉｃｅＦｒａｎｃｏｉｓ，ＤｉｄｉｅｒＰｉｔｔｅｔ，ＭａｎｕｅｌａＢｅｎｔｏ，ｅｔａｌ．．ＲａｐｉｄＤｅ－

ｔｅｃｔｉｏｎｏｆＭｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ－ＲｅｓｉｓｔａｎｔＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓＤｉｒｅｃｔｌｙｆｒｏｍＳｔｅｒｉｌｅｏｒＮｏｎｓｔｅｒｉｌｅＣｌｉｎｉｃａｌＳａｍｐｌｅｓｂｙａＮｅｗＭｏｌｅｃｕｌａｒＡｓｓａｙ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００３，２５４－２６０［１５］ＹｅｏｎｈｅｅＬｅｅ１，Ｃｈｏｏｎｇ－ＳｉｋＬｅｅ，Ｙｅｏ－ＪｕｎｇＫｉｍ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ

ｏｆＤＮＡＣｈｉｐｆｏｒｔｈｅＳｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＶａｒｉｏｕｓｂ－ＬａｃｔａｍＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔＧｅｎｅｓ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ，２００２，１４

（２）：１９２－１９７

［１６］ＶｏｌｏｋｈｏｖＶ．ＣｈｉｚｈｉｋｏｖＫ．ＣｈｕｍａｋｏｖＡ．Ｒａｓｏｏｌｙ．Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ

ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ．ＪＡｐｐｌＭｉ－ｃｒｏｂｉｏｌ，２００３，９５（４）：７８７－７９８

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细菌耐药性检测方法

细菌耐药性检测方法 1、细菌耐药表型检测：判断细菌对抗菌药物的耐药性可根据 NCCLS 标准，通过测量纸片 扩散法、肉汤稀释法和 E 试验的抑菌圈直径、 MIC 值和 IC 值获得。也可通过以下方法进行 检测： （1）耐药筛选试验：以单一药物的单一浓度检测细菌的耐药性被称为耐药筛选试验，临床 上常用于筛选耐甲氧西林葡萄球菌、 万古霉素中介的葡萄球菌、 耐万古霉素肠球菌及氨基糖 苷类高水平耐药的肠球菌等。 （ 2）折点敏感试验：仅用特定的抗菌药物浓度（敏感、中介或耐药折点 MIC ），而不使用 测定 MIC 时所用的系列对倍稀释抗生素浓度测试细菌对抗菌药物的敏感性，称为折点敏感 试验。 （3）双纸片协同试验：双纸片协同试验是主要用于筛选产超广谱B 兰 阴性杆菌的纸片琼脂扩散试验。若指示药敏纸片在朝向阿莫西林 扩大现 象（协同），说明测试菌产生超广谱B -内酰胺酶 （ 4）药敏试验的仪器化和自动化：全自动细菌鉴定及药敏分析仪如： Microscan 等运用折点敏感试验的原理可半定量测定抗菌药物的 MIC 值。 2．B -内酰胺酶检测： 主要有碘淀粉测定法 （ iodometric test ）和头孢硝噻吩纸片法 （ nitrocefin test ）。临床常用头孢硝噻吩纸片法，B -内酰胺酶试验可快速检测流感嗜血杆菌、淋病奈瑟 菌、卡他莫拉菌和肠球菌对青霉素的耐药性。如B -内酰胺酶阳性，表示上述细菌对青霉素、 氨苄西林、 阿莫西林耐药； 表示葡萄球菌和肠球菌对青霉素 （包括氨基、 羧基和脲基青霉素） 耐 药。 3．耐药基因检测：临床可检测的耐药基因主要有：葡萄球菌与甲氧西林耐药有关的 MecA 基因，大肠埃希菌与B -内酰胺类耐药有关的 blaTEM 、blaSHV 、blaOXA 基因，肠球菌与万古 霉素耐药有关的 vanA 、 vanB 、 vanC 、 vanD 基因。检测抗菌药物耐药基因的方法主要有： PCR 扩增、PCR-RFLP 分析、PCR-SSCP 分析、PCR-线性探针分析、生物芯片技术 、自动 DNA 测序 4．特殊耐药菌检测 （1 ）耐甲氧西林葡萄球菌检测：对 1u g 苯唑西林纸片的抑菌圈直径W 10伽，或其MIC > 4u g/ml 的金黄色葡萄球菌和对 1u g 苯唑西林纸片的抑菌圈直径W 17 mm,或MIC > 0.5u g/ml 的凝固酶阴性葡萄球菌被称为耐甲氧西林葡萄球菌（ MRS ）。对MRS 不论其体外药敏试验 结果，所有的B -内酰胺类药物和B -内酰胺/B -内酰胺酶抑制剂均显示临床无效；绝大多数 的 MRS 常为多重耐药,耐药范围包括氨基糖甙类、大环内酯类、四环素类等。 （2） 耐青霉素肺炎链球菌检测：当对 1u g 苯唑西林纸片抑菌圈直径〈20 mm 或MIC > 0.06 u g/ml 均应视为耐青霉素肺炎链球菌 （PRSP ）。临床治疗显示 PRSP 对氨卞西林、氨卞西林 /舒巴坦、头胞克肟、头胞唑肟,临床治疗疗效很差,但应检测对头胞曲松、头胞噻肟和美 洛培南等的 MIC 以判断是否对这些抗生素敏感。 （3） 耐万古霉素肠球菌检测： 肠球菌对30 g 万古霉素纸片抑菌圈直径W 14 mm 或MIC > 32 u g/ml 被称为耐万古霉素肠球菌（VRE ）。针对多重万古霉素药物目前尚无有效治疗方法， 但对青霉素敏感的 VRE 可用青霉素和庆大霉素联合治疗,若对青霉素耐药而不是高水平耐 氨基糖甙类可用壁霉素 +庆大霉素。 （4） 产超广谱B -内酰胺酶的肠杆菌科细菌检测： 超广谱B -内酰胺酶是一种能水解青霉素、 -内酰胺酶（ESBLs ）革 /克拉维酸方向有抑菌圈 Vitek-2 、BD-Pheonix 、

16S_rDNA鉴定细菌的方法

16S rDNA鉴定细菌的方法 细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分： 1.提取细菌基因组DNA, 2.设计/选择引物进行PCR扩增，电泳检测纯度与大小。 3.琼脂糖凝胶电泳分离 4.胶回收目的片段 5.目的片段测序。 6.BLAST比对获取相似片段。 7.构建系统进化树 试剂： 1.1培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基（培养基组分过于复杂会影响DNA 的提取效果，也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。）。 1.2 1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)（1L）：121.1g Tris，加浓盐酸约（70ml, 60ml, 42ml），高温高压灭菌后，室温保存。冷却到室温后调pH，每升高1℃，pH大约下降0.03个单位。 1.3 0.5M EDTA（pH8.0）（1L）：186.1g Na2EDTA?2H2O，用NaOH调pH至8.0（约20g）,高温高压灭菌，室温保存。 1.410×TE Buffer(pH7.4，7.6，8.0)（1L）：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。1M Tris-HCl （pH7.4，7.6，8.0）取100ml，0.5M EDTA（pH8.0）取20ml。高温高压灭菌，室温保存。1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。 1.5 10%SDS（W/V）：称10g，68℃加热溶解，用浓盐酸调pH至7.2。室温保存。用之前在65℃溶解。配置时要戴口罩。 6、5M NaCl：称292.2gNaCl，高温高压灭菌，4℃保存。 7、CTAB/NaCl（10%CTAB，0.7M NaCl）：溶解4.1g NaCl，加10g CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），加热搅拌。用之前在65℃溶解。 8、氯仿/异戊醇：按氯仿：异戊醇=24：1（V/V）的比例加入异戊醇。 9、酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：按苯酚与氯仿/异戊醇=1：1的比例混合Tris-HCl平衡苯酚与氯仿/异戊醇。 10、TAE缓冲液：使用液1×：0.04 mol/L Tris-乙酸，0.001 mol/L EDTA。浓储存液50×：242g Tris，57.1 ml 冰醋酸，100 ml 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)。 11、6×上样缓冲液（100 ml）：0.25%溴酚蓝（BPB），40%蔗糖，10 mmol/L EDTA (pH8.0)（0.2 ml），4℃保存。 12、0.6%琼脂糖凝胶：称取0.3g琼脂糖用TAE溶液配置50 ml。 13、EB：10 mg/ml。称取1g溴化乙锭定容至100ml。棕色瓶室温避光保存。EB的工作浓度为0.5ug/ml。当配置50ml 琼脂糖凝胶时加入EB为2.5ul。（因EB是剧毒物质，目前很多实验室用生物荧光染料替代，常用的有Gelred等） 14、蛋白酶K：20 mg/ml 溶于水，-20℃保存，反应浓度50 ug/ml，反应缓冲液：0.01 mol/L Tris (pH 7.8), 0.005 mol/L EDTA, 5% SDS，反应温度37-56℃。无需预处理。 15、RNase A：10 mg/ml。25 mg RNase A 加1M Tris（pH 7.5）25ul，2.5M NaCl 15ul，无菌水2460 ul，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。（为避

抗生素耐药性的来源与控制对策

抗生素耐药性的来源与控制对策 抗生素的抗性1抗生素耐药性是指一些微生物亚群体能够在暴露于一种或多种抗生素的条件下得以生存的现象，其主要机制包括：（1）抗生素失活。通过直接对抗生素的降解或取代活性基团，破坏抗生素的结构，从而使抗生素丧失原本的功能；（2）细胞外排泵。通过特异或通用的抗生素外排泵将抗生素排出细胞外，降低胞内抗生素浓度而表现出抗性；（3）药物靶位点修饰。通过对抗生素靶位点的修饰，使抗 生素无法与之结合而表现出抗性。 微生物对抗生素的耐性是自然界固有的，因为抗生素实际上是微生物的次生代谢产物，因此能够合成抗生素的微生物首先应该具有抗性，否则这些微生物就不能持续生长。这种固有的抗生素耐药性，也称作内在抗性（intrinsic resistance），是指存在于环境微生物基因组上的抗性基因的原型、准抗性基因或未表达的抗性基因。这些耐药基因起源于环境微生物，并且在近百万年的时间里进化出不同的功能，如控制产生低浓度的抗生素来抑制竞争者的生长，以及控制微生物的解毒机制，微生物之间的信号传递，新陈代谢等，从而帮助微生物更好地适应环境。因此，抗生素耐药性的问题其实是自然和古老的。科学家在北极的冻土中提取到3万年前的古DNA，从中发现了较高多样性的抗生素抗性基因，而且部分抗性蛋

白的结构与现代的变体相似，也证实了抗生素耐药性问题是古老的。虽然一些抗生素抗性微生物和抗性基因很早就存在于自然界，但是抗生素大规模的生产和使用加速了固有抗性微生物和抗性基因的扩散，极大地增加了抗生素耐药性的发生频率。抗生素耐药基因的存在往往与抗生素的使用之间存在良好的相关性。由外源进入并残留在环境中的抗生素对环境微生物的耐药性产生选择压力，携带耐药基因的具有抗性的微生物能存活下来并逐渐成为优势微生物，并不断地将其耐药基因传播给其他微生物。众多研究证实抗生素耐药基因具有较高的移动性，主要是通过基因水平转移（Horizontal gene transfer，HGT）机制，又称基因横向转移（Lateralgene transfer）。即借助基因组中一些可移动遗传因子，如质粒（plasmids）、整合子（integrons）、转座子（transposons）和插入序列（insertion sequences）等，将耐药基因在不同的微生物之间，甚至致病菌和非致病菌之间相互传播。环境中拥有基因横向转移等内在机制的微生物组成一个巨大的 抗性基因储存库，并可能将抗生素耐药性转移到人类共生微生物和病原体中。医学专家很早就指出，抗生素的广泛使用导致了内源性感染和细菌耐药性的增加。而通过宏基因组学的研究方法，科学家在人类肠道微生物群中也发现了高丰度、高多样性的抗生素耐药基因，也印证了这一观点。 人类活动与耐药性2 已有文献和相关统计资料显示，我国

细菌鉴定和耐药性检测方法的发展

细菌鉴定和耐药性检测对于指导临床精确用药和及时治疗患者具有重要意义。目前临床上进行细菌鉴定和耐药检测仍以表型检测方法为主，主要包括：传统手工鉴定与药敏实验方法、自动化药敏鉴定系统。传统方法虽然能够满足临床的部分需要，但这些方法仍然存在一些缺点，例如检测时间较长和检测结果不够准确等。因此，随着分子生物学技术在临床检验领域的应用，近年来发展了一系列快速细菌鉴定和（或）耐药检测技术，例如基于ＰＣＲ技术和ＤＮＡ探针杂交以及生物芯片技术等，这类方法的特点是快速而准确，一般在几个小时之内就可以得到检测结果。 １传统方法在细菌鉴定和耐药性检测中的应用临床手工细菌鉴定和细菌药敏实验，是临床上尤其在中小医院应用最广泛的方法。细菌鉴定主要是根据细菌对生化物质的代谢特点进行，药敏方法包括纸片扩散法（常规实验室使用较普遍）和抗生素稀释法（ＭＩＣ法）等。这些方法的特点是方便、易操作，成本低，而且灵活性强，测定的细菌和药物可灵活选择。其缺点是操作烦琐、经验依赖性强、报告结果慢，不能完全适应临床治疗的需要。 使用自动化药敏和鉴定系统，是临床微生物学实验包括体外药物敏感实验的发展方向。最有代表性的是ＶＩＴＥＫ－ＡＭＳ微生物自动分析系统，可同时完成细菌鉴定和药敏实验。该套系统的检测卡片分为１４种，每一种鉴定卡片含有２５种以上的生化反应指标，基本与常规检测鉴定相同。此方法的优点是简便、快速、鉴定范围广，受人为的影响小，可靠性高。但它仍需要细菌培养的步骤，准确性也受到一定限制，同时其耗材价格较为昂贵。使用这类仪器的主要是三级甲等以上的大型医院。在细菌快速鉴定方面最有代表性的是ｍｉｎｉ－Ｖｉｄａｓ全自动免疫分析仪，其原理是应用细菌的特异性抗体对细菌进行鉴定，以荧光为标记，进行自动化检测。其最大优点是速度快，可以在４０ｍｉｎ内快速鉴定沙门氏菌、大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７、单核李斯特菌，空肠弯曲杆菌和葡萄球菌肠毒素等。但检测指标过少，主要限于这几种菌，而且也不能进行药敏实验。 目前，微生物鉴定技术中除了少数医院使用半自动、全自动的细菌鉴定仪外，大多数医院主要还是使用常规鉴定技术进行细菌菌种的鉴定。 ２分子生物学技术在细菌种属鉴定中的应用采用与系统发育学相关的基因实现对细菌血清型的分型，越来越成为一种趋势。目前，利用基因检测方法对细菌进行种属鉴定所涉及的基因包括细菌１６ｓｒＲＮＡ基因或５ＳｒＲＮＡ序列、ＨＳＰ基因家族、ｇｙｒＢ基因以及细菌特异基因等。 ２．１利用１６ＳｒＲＮＡ基因序列作为分类依据的原因利用１６ＳｒＲＮＡ基因序列对细菌进行菌种鉴定在目前应用较多，也越来越被临床所接受。在细菌分类学著作中，如《伯杰氏系统细菌学手册》，越来越倾向于选择１６ＳｒＲＮＡ基因序列作为分类的依据。主要原因有下面几点： ２．１．１ｒＲＮＡ存在于所有生物中，在生物进化过程中其功能保持不变。１６ＳｒＲＮＡ基因普遍存在于原核生物中，在真核生物中其同源分子是１８ＳｒＲＮＡ。２．１．２１６ＳｒＲＮＡ最能反映细菌间的亲缘关系。在１６ＳｒＲＮＡ分子中，既含有高度保守的序列，又含 细菌鉴定和耐药性检测方法的发展文章编号：１６７２－３３８４（２００６）－０４－００３９－０６ 【作者】杨华为蒋迪王璨赵传赞高华方 生物芯片北京国家工程研究中心（北京１０２２０６） 【中图分类号】Ｒ９１５【文献标识码】Ｂ

浅谈细菌的耐药性及控制对策

浅谈细菌的耐药性及其控制对策 1 概述 由于各种抗菌药物的广泛使用，各种微生物势必加强其防御能力，抵御抗菌药物的侵入，从而使微生物对抗菌药物的敏感性降低甚至消失，这是微生物的一种天然抗生现象，此称为耐药性或抗药性（Resistance to Drug ）。加之耐药基因的传代、转移、传播、扩散，耐药微生物越来越多，耐药程度越来越严重，形成多重耐药性(multidrug resistance,MDR)耐药性一旦产生，药物的化疗作用就明显下降。耐药性根据其发生原因可分为获得耐药性和天然耐药性。自然界中的病原体，如细菌的某一株也可存在天然耐药性。当长期应用抗生素时，占多数的敏感菌株不断被杀灭，耐药菌株就大量繁殖，代替敏感菌株，而使细菌对该种药物的耐药率不断升高。目前认为后一种方式是产生耐药菌的主要原因。 细菌耐药问题已成为全球危机，为遏制细菌耐药，我国不少专家和学者都开展了对细菌耐药的研究，这些研究大多是从微观的角度、从细菌耐药本身开展的探索，从宏观角度研究的很少。本研究旨在从宏观管理和微观的角度，用流行病学的思路和方法，研究我国细菌耐药性在时间、空间、抗菌药间的“三间”分布情况，为细菌耐药研究者提供新的研究思路，促进细菌耐药研究的全面性，并预测细菌耐药性的发展趋势，探索潜在的用药风险；通过利益集团分析方法，分析我国控制细菌耐药性策略的可行性，最终提出优先控制策略，以达到提高我国控制细菌耐药性、提高抗菌药的效果、节约有限卫生资源的目的。 2 细菌的耐药性现状 随着抗菌药物、抗肿瘤药物、免疫抑制剂、各种侵袭性操作,特别是静脉导管及各种介入性治疗手段的应用,细菌性血流感染在医院中的发生率及细菌的耐药性均有上升的趋势,主要G+球菌对常用抗生素的耐药率为22%～100%[1]。喹诺酮抗菌药物进入我国仅仅20多年,但耐药率达60%～70%。

临床微生物检验和细菌耐药性监测分析

临床微生物检验和细菌耐药性监测分析 摘要目的深入分析临床微生物检验和细菌耐药性监测。方法收集尿液、分泌物、血液等检测标本，对药敏使用常规方法以及KirbyBauer方法进行试验并鉴定分析。结果本次研究分离出的致病菌株共500株，其中包括革兰阳性球菌270株（54.0%），革兰阴性杆菌230株（46.0%）；各个菌种对于抗菌药物的耐药率均不同。结论加强临床微生物的检验工作，以及对细菌耐药性进行监测，能够为临床抗菌药物的选择提供借鉴作用，对控制医院感染率具有十分重要的临床作用和意义，值得在临床实践中大力推广。 关键词临床微生物检验；细菌耐药性；监测 细菌耐药性（抗药性）指的是细菌对抗菌药物存在不同程度的耐受性，如果细菌产生耐药性后，会使临床抗菌药物的化疗效果受到很大的影响，使药物的治疗作用大大降低，从而直接影响到患者的治疗效果，因此加强临床微生物的检验工作，并对细菌耐药性进行监测具有十分重要的意义[1]。本次研究选取于2013年11月～2015年7月收集的尿分泌物、血液等检测标本进行微生物检验，以及对细菌耐药性进行监测，现报告如下。 1 资料与方法 1. 1 一般资料选取2013年11月～2015年7月本院收集的尿液、分泌物、血液等检测标本，按照常规方法对所有细菌进行培养、鉴定以及分离，共获得致病菌株500株。 1. 2 方法对收集的尿分泌物、血液等检测标本先采用常规方法分离病原菌，然后采用KirbyBauer 方法进行试验并鉴定分析，对相关抗菌药物最小的抑菌浓度使用肉汤稀释的方法进行检测，参考美国临床试验委员会制定的标准对以上检验结果进行鉴定并分析[2]。本次研究使用的抗菌药物药敏纸片为革兰阳性球菌药敏板条P535和革兰阴性杆菌药敏板条GN09、GN13，均为法国生物梅里埃公司生产。 2 结果 2. 1 菌种分布情况本次研究分离出的致病菌株共500株，其中包括革兰阳性球菌270株（54.0%），革兰阴性杆菌230株（46.0%）。其中67株（1 3.4%）凝固酶阴性葡萄球菌，66株（13.2%）铜绿假单胞菌，60株（12.0%）大肠埃希菌，57株（11.4%）金黄色葡萄球菌，57株（11.4%）枸橼酸菌属，50株（10.0%）不动杆菌属，44株（8.8%）变形杆菌属，36株（7.2%）克雷伯菌属，33株（6.6%）肠杆菌属，30株（6.0%）肠球菌。研究表明，凝固酶阴性葡萄球菌在耐甲氧西林中所占的比例要比金黄色葡萄球菌高很多，并且不动杆菌在革兰阴性菌中的比例也呈现出大幅度上升的趋势，同时发现的嗜麦芽寡养单胞菌以及洋葱克伯霍尔德菌均较为罕见。

多重耐药菌监测方案

多重耐药菌监测方案集团标准化小组：[VVOPPT-JOPP28-JPPTL98-LOPPNN]

长沙市第四医院 多重耐药菌监测方案 一、监测目的 为了加强多重耐药菌的医院感染管理，开展多重耐药菌监测，达到有效预防和控制多重耐药在医院内的传播，保障患者安全。 二、监测项目 主要监测常见的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、耐万古霉素场球菌（VER）、产超广谱β-内酰胺酶（ESBLS）细菌、耐碳青霉烯类抗菌药物肠杆菌细菌（CRE）、耐碳青霉烯类抗菌药物鲍曼不动杆菌（CR-AB）、多重耐药/泛耐药铜绿假单细胞菌（MDR/PDR-PA）等。 三、监测调查对象临床标本分离的病原菌 四、监测内容 细菌，抗菌药物，药物耐药结果 五、监测方法及程序、步骤 （1）临床科室在接诊感染性疾病患者后应及时送检相应的病原学标本，及时发现、早期诊断多重耐药菌感染患者和定植患； （2）微生物室检测到监测的目标多重耐药菌患者时，应在检验报告单上备注“多重耐药菌、请隔离”的醒目提醒标识，并对阳性结果及患者分布科室等情况予以登记，立即上报医院感染管理科，通知所在的临床科室；

(3)临床科室接到“多重耐药菌”的报告单或感染监控专职人员监测反馈通知后，结合病人病情分析，如果确为多重耐药菌的感染或定植，开“接触隔离”医嘱；立即报告科主任、护士长，采取相应的预防控制措施；并在24小时内填报多重耐药菌报告卡至医院感染科，如诊断为医院感染的，必须同时报告院感病例； (4)医院感染管理科进行有关流行病学调查，当发现有多重耐药菌医院感染暴发或流行可能时，立即向分管院长报告，并进行有关相应处置；(5)微生物室必须加强对多重耐药菌的监测，每半年向全院公布细菌耐药性监测分析； (6)医院感染管理科每季度对医院感染多重耐药菌分布情况进行分析；（7）抗菌药物合理使用检查各小组成员在每月进行全院各科室抗菌药物合理使用评价会议时，发现多重耐药抗菌感染患者抗菌药物应用不合理情况给予重点标注、分析，反馈。 六、多重耐药菌医院感染的预防与控制 （一）严格实施消毒隔离措施 1.应对多重耐药菌感染患者和定植患者实施隔离措施，首选单间隔离．也可以将同类多重耐药菌感染者或定植者安置在同一房间。隔离病房不足时才考虑进行床边隔离，不能与气管插管、深静脉留置导管、有开放伤口或者免疫功能抑制患者安置在同一房间。当感染者较多时．应保护性隔离未感染者。 2.设置隔离病房时．应在门上粘贴接触隔离标识，控制无关人员进入。

细菌的耐药性与控制策略综述

细菌的耐药性与控制策略 一、选择题 A型题 1.细菌因基因突变发生的耐药性的特点是 A.不是随机发生的 B.突变频率很高 C.在接触抗菌药物之前出现 D.不稳定 E.不发生回复突变 2.R质粒决定的耐药性的特点是 A.单一耐药性 B.稳定 C.发生任何细菌 D.可经接合转移 E.不能从宿主菌检出 3.来源于质粒的β-内酰胺酶有 A.头孢菌素酶 B.非金属碳青霉烯酶 C.金属酶 D.头孢菌素类 E.羧苄青霉素酶 4.细菌对磺胺耐药是改变体内的哪种酶 A.二氢叶酸合成酶 B. DNA旋转酶 C.拓扑异构酶 D .转肽酶 E. 转糖基酶 5.青霉素结合蛋白(PBPs)介导的耐药性最常见的细菌是 A.肺炎链球菌 B.淋病奈瑟菌 C.葡萄球菌 D.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 E.脑膜炎奈瑟菌 6.耐药株30S亚基S12蛋白的构型改变，使细菌对哪种抗菌药物发生耐药性 A.链霉素 B.红霉素 C.利福平 D.青霉素 E.喹诺酮类药 7.耐药株50S亚基的L12蛋白的构型改变，使细菌对哪种抗菌药物发生耐药性 A.链霉素 B.红霉素 C.利福平 D.青霉素 E.磺胺药 8.当RNA聚合酶的β亚基的编码基因突变时，使细菌对哪种抗菌药物发生耐 药性 A.利福平 B.红霉素 C.链霉素 D.青霉素 E.磺胺药 X型题 1.R质粒导致耐药性传递其特点是 A.可从宿主菌检出R质粒 B.以多重耐药性常见 C.容易因质粒丢失成为敏感株 D.耐药性可经接合转移 2.丁胺卡那霉素具有的钝化酶是 A..乙酰化酶 B.磷酸转移酶 C.腺苷转移酶 D..青霉素酶 3.细菌获得耐药性可以通过 A.产生钝化酶 B.改变药物的作用靶位 C.改变细胞壁的屏障功能 D.主动外排机制 4.铜绿假单胞菌中存在主动外排机制的药物是 A.四环素 B.青霉素类 C.喹诺酮类 D.头孢菌素类 5.某些革兰阴性菌通过改变细胞壁通透性实现非特异性低水平耐药性的抗菌药物有

细菌耐药性监测分析中应注意的问题

细菌耐药性监测分析中应注意的问题 摘要：细菌耐药性监测对于了解本地区细菌耐药性现状和发展趋势、指导临床合理使用抗生素具有重要意义。为此，临床微 生物学工作者应认真掌握临床常见细菌的某些特性及抗生素的相关知识，如天然耐药性、罕见耐药谱型、易产生选择性耐药的抗生 素及代表性药物在药敏试验中的作用。因为这些知识对于如何解释药敏试验结果和监测数据分析时至关重要。 关键词：耐药性监测；天然耐药性；耐药谱型 体外细菌药敏试验最重要的是如何对其结果进行分析和判读，而不是仅将结果记录并报告给临床医生。为此，本文简要介绍美国临床实验室标准委员会［１］（ＣＩ。ＳＩ／ＮＣＣＬＳ）和英国抗感染化疗委员会［２］（ＢＳＡＣ）有关耐药谱型分析和解读的有关内容，其目的是帮助临床微生物实验室工作人员（１）了解临床常见菌种天然或固有耐药性；（２）发现异常和罕见的细菌耐药表型；（３）了解对特殊菌种易引起选择性耐药的抗菌药物，建议临床医生尽可能不用或避免长期使用；（４）认识代表性药物在药敏试验中的作用。 尽管国内临床常见菌种的耐药谱型与国外情况有不同之处，常出现与下述谱型存在差异和矛盾的地方，但这并不影响我们在监测数据分析时发现不足和缺点，提高监测数据的质量。１天然或固有耐药的菌属或菌种 有些菌属和菌种对某些抗菌药物天然耐药或固有耐药。因此，若药敏试验的结果为敏感应予以怀疑，有必要重复药敏试验和重新鉴定菌种，同时，细菌天然耐药也可作为菌种鉴定的辅助手段之一。表１列举了临床常见细菌的天然耐药表型。２罕见耐药谱型影响体外药敏试验结果的因素很多，因此，加强临床微生物实验室的质控工作至关重要［３３。当质控菌的结果在ＣＩ．ＳＩ／ＮＣＣＬＳ要求的允许范围内，所出现的异常或罕见耐药表型应引起实验室工作人员的注意。 表２中介绍的耐药谱型在世界范围内均属罕见，如在日常药敏试验中发现并经复试依然出现相同的结果，应该将菌株送到参考实验室进行核实。 ３易产生选择性耐药的抗生素和致病菌组合 某些抗生素容易诱导某些菌种产生耐药性，因此，应避免选择这些抗生素进行特定感染的治疗，或尽可能避免长期使用这类抗生素。表３列举了主要易诱导产生耐药性的抗生素和致病菌组合。 ４代表性药物在药敏试验中的作用 代表性药物在药敏试验中的作用不仅仅局限于该抗生素本身，还代表与其相关的抗菌药物。如葡萄球菌对头孢西丁耐药表明它对所有ｐ一内酰胺类抗生素耐药（表４）。 ５从耐药表型推论耐药机理 根据机制和表型的有关知识，可以从不同的细菌表型组合来推断其耐药机制，其目的可以（１）估计耐药特性菌株的分布；（２）确定菌种鉴定和药敏试验结果的正确性；（３）推荐抗菌药物的选择。 ５．1β-内酰胺类抗生素 β-内酰胺类抗生素的耐药机制和表型很多，由于临床微生物实验室的常规试验不可能包括很多的ｐ内酰胺类抗生素，因此，表５～８有一定的局限性。但根据表中的基本原则，依然可以提供有意义的参考价值。 诱导型ＡｍｐＣ酶（肠杆菌属、弗氏柠檬酸杆菌）头孢西丁耐药，但与甲氧亚氨基８一内酰胺类抗生素不交叉耐药；去阻遏ＡｍｐＣ酶头孢他啶、头孢噻肟和头孢西丁耐药。通过比较含酶抑制剂的复合口一内酰胺类和不耐酶青霉素类抗生素的药敏结果，可以得出较

细菌鉴定及检测方法

细菌鉴定及检测方法 一、启动条件 1、目的样出现坏包，若批次相同，取表现性状相同的任意一包进行细菌初步鉴 定。若批次不同则分别进行细菌初步鉴定。 2、随机样出现坏包，必须进行细菌初步鉴定。 二、胀包 1、记录批次。 2、及时用72%的酒精对样品的外表进行消毒，尽量不损坏封合待以后检查。在 超净台内以无菌操作剪开包装，再避开横竖封处剪开一个圆形或三角形。3、对样品进行微生物划线培养。 3.1采用普通营养琼脂培养基做细菌的划线培养36±1℃、48小时。 3.2分别吸取10毫升样品到两个无菌的小试管中，，分别在80和100℃的水 浴中加热10分钟，冷却用营养琼脂分别做芽孢（36±1℃、72小时） 和耐热芽孢（55±1℃、72小时）的划线培养。 3.3采用普通营养琼脂培养基或快速检测培养基做嗜冷菌/低温菌的划线培 养（4—6℃ 10天或21±0.5℃ 25小时）。 3.4 必须用高盐察氏或虎红琼脂培养基做霉菌和酵母菌的划线培养 （25—28℃ 5--7天） 4、对样品做感官检测。 5、用PH计检测样品的PH值。 6、将样品倒掉，进行包装密封性检查，并进行记录。 7、记录菌落特征。 8、选区不同形态的单一菌落进行坚定。 8.1 革兰氏阴性菌和阳性菌的鉴定： 8.1.1涂片、革兰氏染色、镜检。或结晶紫染色、镜检、氢氧化钾拉 丝试验。 8.1.2革兰氏染色、结晶紫染色方法见《微生物检测》 8.1.3氢氧化钾拉丝试验 在微生物载物片上滴一滴3%氢氧化钾，用接种针从培养皿上的

菌落中挑取微生物，放在氢氧化钾溶液中用力搅拌。7—10秒后，抬 起针头，观察针头和玻片之间是否有丝状物，如果15—20 秒后二者 之间无丝状物，停止搅拌。 判定：无丝状物阳性；有丝状物阴性。 8.2 过氧化氢酶试验（或过氧化氢酶试纸）（产气试验）： 试剂：10%过氧化氢溶液 步骤：在微生物载物片上滴一滴10%过氧化氢，用接种针从培养皿上的菌落中挑取微生物，放在过氧化氢溶液中看是否有气体产生。 判定：产气阳性；不产气阴性。 8.3氧化酶试验 试剂：含1%四甲基双噻二胺和99%的乙醇溶液。 步骤：用上述试剂将一张滤纸浸透（或直接采用氧化酶试纸条），然后进行细菌培养物的涂片试验。 判定：30秒内使显色物质变为深蓝色阳性，不变色阴性。 三、酸包 1、发现酸包后，及时将料液快速转入无菌瓶中。 2、记录批次 3、其它项目检测同胀包。

常见致病菌耐药机制与应对措施

2014年第二季度细菌耐药监测结果预警与应对策略 由于抗菌药物的广泛不合理应用。细菌耐药现象日益严峻，临床出现大量多耐药和泛耐药菌株，给医院感染预防控制带来挑战。细菌耐药有一定的区域性和时间性，及时了解和掌握本院常见多耐药菌的流行现状及耐药特征，有利于临床医师合理选择抗菌药物，提高治疗效果，以达到减少为耐药菌的产生。现对2014年第二季度病原菌分布情况和耐药率进行公布，并向临床科室提供细菌耐药应对措施。 12014年第2季度我院细菌耐药率及预警信息

备注：耐药率超过30%的抗菌药物，提示“预警抗菌药物”；耐药率超过40%的抗菌药物，提示“慎用抗菌药物”；耐药率超过50%的抗菌药物，提示“参照药敏试 验结果用药”；耐药率超过75%的抗菌药物，提示“暂停该类抗菌药物的临床应用”。2细菌产生耐药性机制 2.1铜绿假单胞菌耐药机制 铜绿假单胞菌对生存环境和营养条件要求很低，在自然界分布广泛，甚至在医院内环境经常可见，其具有多药耐药性及耐药机制：（1）该菌能够产生破坏抗菌药物活性的多种灭活

酶、钝化酶和修饰酶。（2）基因突变，作用靶位变异。（3）细胞膜通透性降低。（4）主动泵出机制将进入的药物排到体外。（5）产生生物膜，阻隔白细胞、多种抗体及抗菌药物进入细菌细胞内吞噬细菌。由于铜绿假单胞菌复杂的耐药机制导致其感染具有难治性和迁延性。 2.2大肠埃希氏菌耐药机制 大肠埃希菌是G-杆菌中分离率较高的机会致病菌，可引起人体所有部位的感染并且呈多重耐药性。 （1）怜内酰胺酶的产生 ①大肠埃希菌对P -内酰胺类抗菌药物耐药主要是由超广谱P -内酰胺酶（ESBLs）引起的，对头霉素类及碳青霉烯类药物敏感。ESBLs可分为五大类：TEM型、SHV型、 CTX-M型、OXA型和其他型，大肠埃希菌ESBLs酶以TEM型最常见。TEM型ESBLs 呈酸性，可水解头孢他啶、头孢噻肟。SHV型ESBLs呈碱性，有水解头孢噻吩的巯 基。CTX-M 型ESBLs 呈碱性，对头孢噻肟水解能力强于头孢他啶。OXA 型ESBLs 呈弱酸性或弱碱性，主要水解底物是苯唑西林，OXA 型酶主要见于铜绿假单胞菌中，在大肠埃希菌中的分离率较低。 ②AmpC怜内酰胺酶AmpC酶主要作用于头孢菌素类抗菌药物，且不能被克拉维酸抑制。它是水解酶，与怜内酰胺环羧基部分共价结合，在水分子作用下导致怜内酰胺环开环，破坏0内酰胺类抗菌药物抗菌活性。 ③对酶抑制剂药的耐药的0内酰胺酶对酶抑制剂药的耐药的0内酰胺酶（IRT）主要有TEM 系列衍变而来，又称为耐酶抑制剂TEM 系列酶。 （2）药物作用靶位的改变 （3）主动外排 （4）外膜通透性的下降 2.3肺炎克雷伯杆菌耐药机制肺炎克雷伯杆菌属于阴性杆菌，通常存在于人类肠道、呼吸道，是除大肠埃希氏菌外导致医源性感染的最重要的条件致病菌。由于抗菌药物的大量使用，在选择性压力下多药耐药肺炎克雷伯杆菌（KPN）菌株不断出现，耐药率日益上升，KPN 耐药机制包括：（1 ）产抗菌药物灭活酶 ①0-内酰胺酶包括产超广谱0-内酰胺酶（ESBLs）、AmpC 酶、耐酶抑制剂0-内酰胺酶、碳青霉烯酶（KPC酶）及金属0内酰胺酶（MBLs）等。 ESBLs是耐药KPN产生的最主要的一类酶，由质粒介导，产ESBLsKPN对青霉素类、头孢菌素类及单环类药物耐药，但对头霉素类和碳青霉烯类及酶抑制剂敏感。

2015年全国细菌耐药监测报告

China Licensed Pharmacist Mar. 2016，Vol. 13 No.3 2015年全国细菌耐药监测网（CARSS）成员单位共有1 427所医院，其中上报数据医院共1 338所。上报数据的成员单位中二级医院359所，三级医院979所；经过数据审核，纳入数据分析的医院共有1 143 所，其中二级医院272所，占纳入数据分析医院总数的23.8%，三级医院871 所，占76.2%。 2015年度监测时限为2014年10月至2015年9月，此期间上报非重复细菌总数为2 400 786株，其中革兰阳性菌695 066株（占28.9%），革兰阴性菌1 705 720株（占71.1%）。 革兰阳性菌排前五位的是：金黄色葡萄球菌223 758株（占32.2 %），表皮葡萄球菌88 593株（占12.8%），粪肠球菌67 432株（占9.7%），肺炎链球菌64 791株（占9.3%）和屎肠球菌61 961株（占8.9%）。 革兰阴性菌排前五位的是：大肠埃希菌510 140株（占29.9%），肺炎克雷伯菌336 829株（占19.8%），铜绿假单胞菌219 630株（占12.9%），鲍曼不动杆菌183 178株（占10.7%），阴沟肠杆菌73 136株（占4.3%）。 位居前三位标本来源的分别为痰标本993 205 株（占41.4%）、尿标本372 161株（占15.6%）和血标本224 481株（占9.4%）。 重要与特殊耐药菌检出率根据CLSI 2014标准按全国及各省、直辖市及自治区进行分析，结果如下： 一、甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（MRSA）检出率 MRSA全国检出率为35.8%，各地区MRSA检出率为20.3% ～47.0%，其中上海市最高，为47.0%，山西省最低，为20.3%（图1）。 二、甲氧西林耐药凝固酶阴性葡萄球菌（MRCNS）检出率 MRCNS全国检出率为79.4%，各地区MRCNS 检出率为66.1% ～84.3%，其中新疆维吾尔自治区最高，为84.3%，海南省最低，为66.1%（图2）。 编者按：为贯彻落实《抗菌药物临床应用指导原则》，加强医疗机构抗菌药物临床应用的监督和管理，国家卫生计生委合理用药专家委员会和全国细菌耐药监测网日前发布了《2015年全国细菌耐药监测报告》，现予全文刊登，以促进合理用药，提高抗菌药物临床应用水平。 2015年全国细菌耐药监测报告 国家卫生计生委合理用药专家委员会 全国细菌耐药监测网 2015年12月12日 doi：10.3969/j.issn.1672-5433.2016.03.001 China Antimicrobial Resistance Surveillance System Report2015 Committee of Experts on Rational Drug Use, National Health and Family Planning Commission of the P.R.China, China Antimicrobial Resistance Surveillance System

第9章 细菌的耐药性与控制策略

第九章细菌的耐药性与控制策略 第一节细菌的耐药性 耐药性是指细菌对药物所具有的相对抵抗性。耐药性的程度以该药对细菌的最小抑菌浓度（MIC）表示。 一、细菌耐药性的分类 细菌耐药性可分为固有耐药性和获得耐药性。前者是指细菌对某些抗菌药物天然不敏感，故也称天然耐药性。后者是指细菌DNA改变而获得了耐药性。 （一）固有耐药性 固有耐药性是指细菌对某种抗菌药物的天然耐药性，固有耐药性是始终如一的，由细菌的种属特性所决定的。抗菌药物对细菌能够起作用首先的条件是细菌必须具有药物的靶位。 （二）获得耐药性 获得耐药性是指正常情况下，敏感的细菌中出现了对抗菌药物有耐药性的菌株。获得耐药性发生有三个方面的因素： 1、染色体突变； 2、质粒介导的耐药性； 3、转座因子介导的耐药性。 二、细菌耐药性的基因控制 （一）基因突变导致的耐药性 有抗生素敏感基因经过基因突变变成耐药性基因，以单一耐药性为主，一般是稳定的，很少自然丢失。 （二）R质粒决定的耐药性 决定细菌耐药性的质粒叫R质粒，通过细菌间接合导致耐药性传递。其特点是：①可以从宿主菌检出R质粒；②以多重耐药性常见；③容易因质粒丢失称为敏感株；④耐药性可经接合传递。 第二节细菌耐药性产生机制 一、钝化酶的产生 耐药菌株通过合成某种钝化酶作用于抗菌药物，使其失去抗菌活性。重要的钝化酶有以下几种： 1、β-内酰胺酶：对青霉素类和头孢菌素类内要的菌株产生β-内酰胺酶，可以特异性地打开药物分子结构中的β-内酰胺环，使其完全失去抗菌活性。 2、氨基糖苷类钝化酶：对氨基糖苷类药物质粒介导的耐药机制是耐药菌株产生磷酸转移酶使氨基糖苷类抗生素的羧基磷酸化，而将抗菌药物钝化失活。 3、氯霉素乙酰转移酶：该酶由质粒编码，使氯霉素乙酰化而失去抗菌活性。、 4、甲基化酶。 二、药物作用的靶位发生变化 1、链霉素：其结合部位是细菌核糖体30S亚基上的S12蛋白。 2、红霉素：靶部位是细菌核糖体上的50S亚基的L4或L12蛋白。 3、利福平：作用点是RNA聚合酶的β亚基。 4、青霉素：靶部位是细菌细胞膜上的特异的青霉素结合蛋白PBP。 5、喹诺酮类药物：靶部位是DNA旋转酶。 三、胞壁通透性的改变和主动外排机制 耐药菌株通过改变细胞壁通透性和主动外排机制而产生耐药性。

细菌的耐药性及检测

细菌的耐药性及检测：体外抗生素敏感试验方法 近年来，由于细菌耐药性不断增加，新的耐药机制和耐药菌株不断被发现，如MRSA、耐万古霉素肠球菌(VRE)、耐青霉素肺炎链球菌(PRP)以及β内酰胺酶中的超广谱β内酰胺酶(ESBLs)、去阻遏持续高产AmpC酶和金属β内酰胺酶等。临床抗生素的选择使用非常困难。因此必须开展体外抗生素敏感试验，了解细菌耐药谱，对抗菌药物的临床使用效果进行预测，对患者选择个体化的治疗方案；同时通过耐药检测及流行病学调查，为医院感染控制方案制订提供依据；也有助于新药的抗菌特性研究。临床细菌学实验室应选择合适的抗菌药物用于体外药敏试验，为临床抗感染治疗提供依据。 (一)药敏试验中抗菌药物的选择原则 抗菌药物药敏试验中测试药物种类的选择，应依据各医院院内感染控制委员会、临床医师、药剂人员及微生物学检验医师等相互协商按本单位的实际情况制订，但必须满足以下条件： 1.选用的抗菌药物应具备一组或一群代表性及预示性，如具有共同的耐药机制，或对某类菌株具有特定的意义等。 2.有助于指导临床抗感染治疗与流行病学的调查。 3.应充分考虑分离菌株的来源部位，如从脑脊液分离的菌株，应选用能通过血脑屏障的抗菌药物进行体外药敏试验等。 4.根据细菌种类或来源，通常选择6～16种不同抗菌药物。 (二)选择方案 在遵循上述原则基础上，可以参照美国CLSI推荐的各菌种抗菌药物的分组选择。结合本院实际情况制定选用方案。 1.肠杆菌科细菌抗菌药物药敏试验抗菌药物选择方案 (1)首选试验和报告的抗菌药物：氨苄西林、氨苄西林／舒巴坦或阿奠西林／克拉维酸或哌拉西林／他唑巴坦或替卡西林／克拉维酸中任一种；头孢唑林或头孢噻吩、头孢呋辛或头孢孟多、头孢西丁或头孢替坦、头孢噻肟或头孢他啶或头孢曲松或头孢哌酮中任选二种；头孢吡肟或头孢匹罗；庆大霉素；环丙沙星或左氧氟沙星或培氟沙星任选1～2种；亚胺培南，复方新诺明。 (2)次选试验和报告的抗菌药物：呋喃妥因、氯霉素、妥布霉素、卡那霉素、阿米卡星、氨曲南、奈替米星、四环素、诺氟沙星或氧氟沙星。 (3)从肠道标本中分离的沙门菌属与志贺菌属细菌常规只应试验和报告氨苄西林、复方新诺明及一种喹诺酮类抗菌药物；分离自肠道以外的沙门菌属菌株应试验和报告多种抗菌药物的药敏试验与报告，包括氯霉素和三代头孢菌素。 (4)分离自脑脊液的肠杆菌科细菌，只需报告氨苄西林、头孢噻吩、头孢唑啉、庆大霉素的药敏结果。 (5)采用合适的方法如双纸片法等检测ESBLs；对产ES-BLs细菌，不管实际药敏检测结果如何，所有青霉素类、头孢菌素类和氨曲南的试验结果报告耐药。 2.铜绿假单胞菌和不动杆菌属等药敏试验抗菌药物选择方案 (1)首选试验和报告的抗菌药物：替卡西林或哌拉西林或美洛西林中的一种，头孢他啶、头孢哌酮、头孢吡肟、氨曲南、亚胺培南或美洛培南；庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素；环丙沙星等。 (2)次选试验和报告的抗菌药物：羧苄西林、头孢噻肟或头孢曲松、奈替米星、氯霉素、四环素、左氧氟沙星或诺氟沙星或氧氟沙星、复方新诺明等。 (3)除铜绿假单胞菌和不动杆菌可用纸片扩散法进行药敏试验，对其他非发酵菌应使用稀释法进行药敏试验。

医院细菌耐药性监测管理办法

文档序号：XXYY-ZWK-001 文档编号：ZWK-20XX-001 XXX医院 细菌耐药性监测管理 办法 编制科室：知丁 日期：年月日

细菌耐药性监测管理办法 一、各临床科室要重视病原微生物检测和药敏试验的送检工作。严格按照《抗菌药物临床应用指导原则》要求，根据药敏试验结果和细菌耐药情况，选用抗菌药物。各临床科室标本送检率应为100%。 二、检验科要对患感染性疾病患者的标本进行病原菌的分离、鉴定及药敏试验，并及时报告细菌培养、药敏试验结果，作为临床医师正确选用抗菌药物的依据。 三、加强对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、耐万古霉素肠球菌（VRE）、产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的细菌和多重耐药的鲍曼不动杆菌等实施目标性监测，发现1例，及时书面通知医院感染科和医务部。发生多重耐药菌感染的暴发时，感染科应当按照《医院感染管理办法》的规定进行报告 四、医院药事管理与药物治疗学委员会、抗菌药物合理应用专家委员会根据细菌耐药情况对相关抗菌药品品种进行重点监控，必要时对医院抗菌药物分级目录进行调整，保证患者用药安全、有效、经济。 五、逐步建立抗菌药物临床应用预警机制，采取相应的干预措施： （一）对主要目标细菌耐药率超过30%的抗菌药物，及时将预警信息通报本院医务人员。

（二）对主要目标细菌耐药率超过40%的抗菌药物，应慎重经验用药。 （三）对主要目标细菌耐药率超过50%的抗菌药物，应参照药敏试验结果选用。 （四）对主要目标细菌耐药率超过75%的抗菌药物，应暂停该类抗菌药物的临床应用，根据追踪细菌耐药监测结果，再决定是否恢复其临床应用。 六、违反本规定的科室和当事人，将根据医院有关规定处理。知丁

细菌耐药性监测及预警机制

细菌耐药性监测及预警机制 多重耐药菌感染已成为延长患者住院时间、增加医疗费用和导致患者死亡的重要原因。为了加强对多重耐药菌感染监控与细菌耐药预警，更好地为临床合理使用抗菌药物提供科学依据，依照卫生部卫办医政发（2011）5号《多重耐药菌医院感染预防与控制技术指南（试行）》、卫生部（卫生令第84号）《抗菌药物临床应用管理办法》及卫办医政发（2009）38号《关于抗菌药物临床使用管理有关问题的通知》的精神，结合我院具体情况，现就建立完善细菌耐药监测与预警机制相关工作要求如下，请科室立即遵照执行。 一、临床科室 （一）对多重耐药菌感染患者或定植高危患者要进行监测，高危患者：（如1、长期住院患者；2、在ICU内；3、高龄、营养不 良及慢性疾病病人；4、机体免疫低下；5、前期使用多种抗生 素；6、外科手术、创伤及烧伤；7、侵袭性诊断；8、使用呼 吸机；）通过对无感染症状患者的标本（如鼻试纸、咽试纸、 伤口、气道内、肛试纸或大便）进行培养、监测，发现MDRO 定植患者；及时采集有关标本送检，并追踪结果，以及时发现、早期诊断多重耐药感染患者。属医院感染，应在24小时内填 《医院感染上报表》报告感控科。 （二）科内及科间告知制度： 1、主管医生发现或接到检验科室多重耐药菌感染病例报告，应立即开“特殊疾病护理”医嘱，报告科室主任及科室感控员。

2、感控员应在早交班上告知全科医护人员。 3、护士感控员落实消毒、隔离措施，并填报《耐药菌控制措施督查表》。 4、责任护士负责告知家属及陪护人员相关隔离常识。 5、主管医生根据患者治疗情况判断解除隔离的时机，如果患者转科/转院或死亡，护士做好多重耐药菌患者床单元的终末消毒。 6、转床、转科、送医技科室辅助检查或需要手术治疗时应告知相关科室的接诊医生或护士，做好消毒隔离。 7、感控员及时对耐药感染预防控制措施的有效性进行追踪总结。（三）科室短时间内发生特殊耐药表型或3例以上名称相同、耐药表型相同的耐药菌病例，应立即向感控科报告。班外时间、 节假日报院总值班，院总值班通知感控看负责人。 （四）科室应按《多重耐药菌管理流程》落实相关院感防控措施。（五）应了解医院前五位目标细菌及科室（重点科室）前五位目标细菌名称及耐药率，根据细菌耐药性情况分析和耐药预警报 告，指导经验性使用抗菌药物。 二、检验科 （一）应及时对临床送检标本进行细菌培养及药敏，发现多重耐药菌应填写《多重耐药菌病人交接班登记本》并及时通知 临床科室，及感控科。 （二）一旦发现特殊耐药表型或短时间内某一病区有3例及以上某耐药表型相同病原菌，应立即通知感控科及相关临床科