【2017年整理】实验三 聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清脂蛋白

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第__3__次课授课时间：2006年11月13日～11月17日

总黄酮

生物总黄酮是指黄酮类化合物，是一大类天然产物，广泛存在于植物界，是许多中草药的有效成分。在自然界中最常见的是黄酮和黄酮醇，其它包括双氢黄（醇）、异黄酮、双黄酮、黄烷醇、查尔酮、橙酮、花色苷及新黄酮类等。

简介

近年来，由于自由基生命科学的进展，使具有很强的抗氧化和消除自由基作用的类黄酮受到空前的重视。类黄酮参与了磷酸与花生四烯酸的代谢、蛋白质的磷酸化、钙离子的转移、自由基的清除、抗氧化活力的增强、氧化还原作用、螯合作用和基因的表达。它们对健康的好处有：（ 1 ）抗炎症（ 2 ）抗过敏（ 3 ）抑制细菌（ 4 ）抑制寄生虫（ 5 ）抑制病毒（ 6 ）防治肝病（7 ）防治血管疾病（8 ）防治血管栓塞（9 ）防治心与脑血管疾病（10 ）抗肿瘤（11 ）抗化学毒物等。天然来源的生物黄酮分子量小，能被人体迅速吸收，能通过血脑屏障，能时入脂肪组织，进而体现出如下功能：消除疲劳、保护血管、防动脉硬化、扩张毛细血管、疏通微循环、活化大脑及其他脏器细胞的功能、抗脂肪氧化、抗衰老。近年来国内外对茶多酚、银杏类黄酮等的药理和营养性的广泛深入的研究和临床试验，证实类黄酮既是药理因子，又是重要的营养因子为一种新发现的营养素，对人体具有重要的生理保健功效。目前，很多著名的抗氧化剂和自由基清除剂都是类黄酮。例如，茶叶提取物和银杏提取物。葛根总黄酮在国内外研究和应用也已有多年，其防治动脉硬化、治偏瘫、防止大脑萎缩、降血脂、降血压、防治糖尿病、突发性耳聋乃至醒酒等不乏数例较多的临床报告。从法国松树皮和葡萄籽中提取的总黄酮" 碧萝藏"-- （英文称PYCNOGENOL ）在欧洲以不同的商品名实际行销应用25 年之久，并被美国FDA 认可为食用黄酮类营养保健品，所报告的保健作用相当广泛，内用称之为" 类维生素" 或抗自由基营养素，外用称之为" 皮肤维生素" 。进一步的研究发现碧萝藏的抗氧化作用比VE 强50 倍，比VC 强20 倍，而且能通过血脑屏障到达脑部，防治中枢神经系统的疾病，尤其对皮肤的保健、年轻化及血管的健康抗炎作用特别显著。在欧洲碧萝藏已作为保健药物，在美国作为膳食补充品（相当于我国的保健食品），风行一时。随着对生物总黄酮与人类营养关系研究的深入，不远的将来可能证明黄酮类化合物是人类必需的微营养素或者是必需的食物因子。性状：片剂。

功能主治与用法用量

功能主治：本品具有增加脑血流量及冠脉血流量的作用，可用于缓解高血压症状（颈项强痛）、治疗心绞痛及突发性耳聋，有一定疗效。用法及用量：口服：每片含总黄酮６０ｍｇ，每次５片，１日３次。

不良反应与注意

不良反应和注意：目前,暂没有发现任何不良反应.

洛伐他丁

【中文名称】：洛伐他丁

【英文名称】：Lovastatin

【化学名称】：(S)-2-甲基丁酸-(1S,3S,7S,8S,8aR)-1,2,3,7,8,8a-六氢-3,7-二甲基

-8-[2-(2R,4R)-4-羟基-6氧代-2-四氢吡喃基]-乙基]-1-萘酯

【化学结构式】：

洛伐他丁结构式

【作用与用途】洛伐他丁胃肠吸收后，很快水解成开环羟酸，为催化胆固醇合成的早期限速酶（HMG －coA还原酶）的竞争性抑制剂。可降低血浆总胆固醇、低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白的胆固醇含量。亦可中度增加高密度脂蛋白胆固醇和降低血浆甘油三酯。可有效降低无并发症及良好控制的糖尿病人的高胆固醇血症，包括了胰岛素依赖性及非胰岛素依赖性糖尿病。

【用法用量】口服：一般始服剂量为每日20mg，晚餐时1次顿服，轻度至中度高胆固醇血症的病人，可以从10mg开始服用。最大量可至每日80mg。

【注意事项】①病人既往有肝脏病史者应慎用本药，活动性肝脏病者禁用。②副反应多为短暂性的：胃肠胀气、腹泻、便秘、恶心、消化不良、头痛、肌肉疼痛、皮疹、失眠等。③洛伐他丁与香豆素抗凝剂同时使用时，部分病人凝血酶原时间延长。使用抗凝剂的病人，洛伐他丁治疗前后均应检查凝血酶原时间，并按使用香豆素抗凝剂时推荐的间期监测。

他汀类药物

他汀类药物(statins)是羟甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶抑制剂，此类药物通过竞争性抑制内源性胆固醇合成限速酶(HMG-CoA)还原酶，阻断细胞内羟甲戊酸代谢途径，使细胞内胆固醇合成减少，从而反馈性刺激细胞膜表面(主要为肝细胞)低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)受体数量和活性增加、使血清胆固醇清除增加、水平降低。他汀类药物还可抑制肝脏合成载脂蛋白B-100，从而减少富含甘油三酯AV、脂蛋白的合成和分泌。他汀类药物分为天然化合物(如洛伐他丁、辛伐他汀、普伐他汀、美伐他汀)和完全人工合成化合物(如氟伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、罗伐他汀、pitavastatin)是最为经典和有效的降脂药物，广泛应用于高脂血症的治疗。他汀类药物除具有调节血脂作用外，在急性冠状动脉综合征患者中早期应用能够抑制血管内皮的炎症反应，稳定粥样斑块，改善血管内皮功能。延缓动脉粥样硬化（AS）程度、抗炎、保护神经和抗血栓等作用。

结构比较

辛伐他汀（Simvastatin）是洛伐他汀（Lovastatin）的甲基化衍化物。美伐他汀（Mevastatin，又称康百汀，Compactin）药效弱而不良反应多，未用于临床。目前主要用于制备它的羟基化衍化物普伐他汀（Pravastatin）。

体内过程

洛伐他汀和辛伐他汀口服后要在肝脏内将结构中的其内酯环打开才能转化成活性物质。相对于洛伐他汀和辛伐他汀，普伐他汀本身为开环羟酸结构，在人体内无需转化即可直接发挥药理作用，且该结构具有亲水性，不易弥散至其他组织细胞，极少影响其他外周细胞内的胆固醇合成。除氟伐他汀外，本类药物吸收不完全。除普伐他汀外，大多与血浆蛋白结合率较高。

用药注意

大多数患者可能需要终身服用他汀类药物，关于长期使用该类药物的安全性及有效性的临床研究已经超过10年。他汀类药物的副作用并不多，主要是肝酶增高，其中部分为一过性，并不引起持续肝损伤和肌瘤。定期检查肝功能是必要的，尤其是在使用的前3个月，如果病人的肝脏酶血检查值高出正常上线的3倍以上，应该综合分析病人的情况，排除其他可能引起肝功能变化的可能，如果确实是他汀引起的，有必要考虑是否停药；如果出现肌痛，除了体格检查外，应该做血浆肌酸肌酸酶的检测，但是横纹肌溶解的副作用罕见。另外，它还可能引起消化道的不适，绝大多数病人可以忍受而能够继续用药。

红曲米

天然降压降脂食品——红曲米

红曲红曲米又称红曲、红米，主要以籼稻、粳稻、糯米等稻米为原料，用红曲霉菌发酵而成，为棕红色或紫红色米粒。

红曲米是中国独特的传统食品，其味甘性温，入肝、脾、大肠经。早在明代，药学家李时珍所著《本草纲目》中就记载了红曲的功效：营养丰富、无毒无害，具有健脾消食、活血化淤的功效。上世纪七十年代，日本远藤章教授从红曲霉菌的次生级代谢产物中发现了能够降低人体血清胆固醇的物质莫纳可林K（Monacolin-k ）或称洛伐他汀，（Lovastatin），引起医学界对红曲米的关注。1985 年，美国科学家Goldstein 和Brown 进一步找出了Monacolin-k 抑制胆固醇合成的作用机理，并因此获得诺贝尔奖，红曲也由此名声大噪。

红曲米的医疗保健功效如下：

1.降压降脂：研究表明，红曲米中所含的Monacolin-K 能有效地抑制肝脏羟甲基戊二酰辅酶还原酶的作用，降低人体胆固醇合成，减少细胞内胆固醇贮存；加强低密度脂蛋白胆固醇的摄取与代谢，降低血中低密度脂蛋白胆固醇的浓度，从而有效地预防动脉粥样硬化；抑制肝脏内脂肪酸及甘油三酯的合成，促进脂质的排泄，从而降低血中甘油三酯的水平；升高对人体有益的高密度脂蛋白胆固醇的水平，从而达到预防动脉粥样硬化，甚至能逆转动脉粥样硬化的作用。

2.降血糖：远藤章教授等人曾直接以红曲菌的培养物做饲料进行动物试验，除确定含有红曲物的饲料可以有效地使兔子的血清胆固醇降低18%~25%以上外，又发现所有试验兔子在食入饲料之后的0.5 小时内血糖降低23%~33%，而在 1 小时之后的血糖量比对照组下降了19%~29%。说明红曲降糖功能显著。

3.防癌功效：红曲橙色素具有活泼的羟基，很容易与氨基起作用，因此不但可以治疗胺血症且是优良的防癌物质。

4.保护肝脏的作用：红曲中的天然抗氧化剂黄酮酚等具有保护肝脏的作用。

压乐胶囊

压乐胶囊成分

压乐胶囊”唯一成分“红曲酵素”大纪事

1970：红曲米提取6种他汀，制成降脂药世界第一红曲，是寄生在红曲米上，发酵提取

压乐胶囊

的活性生物菌。70年代日本科学家远藤根据《本草纲目》上记载红曲的“活血”功效的启示，从红曲营养液中分离出优良的6种含胆固醇抑制剂和甘油三酯分解剂的红曲菌，被命名为“莫纳可林”即“他汀类”，此后30多年来，红曲米提取的“他汀”被世界医学界公认为最好的降脂药，在临床上大量使用。

2002：降压史上历史性突破----6种他丁+2种红曲降压素=“红曲酵素”2002年，震惊世界的生物领域重大发明，红曲中的降糖、降压、抗癌成分（GABA-GLUCOSAMINE）通过发酵提取，在原来6种他丁的基础上合成“红曲酵素（Monacolin-R），经大量的临床试验，这种复合酵素不仅保留了生物他丁的降脂功效，而且它的降血压效果堪比任何药物，《药日新闻》撰文品论，红曲酵素的出现，将开辟降压药新时代。

2008：6年临床证实“红曲酵素”降血压、治心脑、防猝死、能停药随后的6年，5万名高血压患者临床运用证实：“红曲酵素”对调理器官微血循环、帮助血液进行重新分配，迅速降压，修复受损心脑肝肾作用显著。而且“红曲酵素”降压同时、养心、护脑、清肝、活肾的功效，达到了降压药的顶峰！“红曲酵素”也被世界医学界誉为“可以媲美青霉素的旷世发现！”“红曲酵素”摘取美国医学界最高荣誉“拉斯克奖”“红曲酵素”的发现者日本Biopharm研究所所长远藤章（74岁），因此项发明被授予美国医学界最高荣誉“拉斯克奖”，纽约市长布隆博格将颁奖理由归结于“数千万

人因此得以延长生命！”

通知

各地消费者：

为了打击假冒伪劣产品，保护消费者利益，公司从2011年4月起，正式委托国家GMP认证企业吉林市隆泰参茸制品有限责任公司生产我公司产品《压乐牌鑫康延平胶囊》（以下简称压乐）。

按照国家规定，《压乐》产品盒子和说明书做以下相应调整：

1.委托生产企业由原来的“山西天特鑫保健食品有限公司”，

改为“吉林市隆泰参茸制品有限责任公司”。

2.生产地址由原来的“山西省大同县马连庄”，改为“吉林

省桦甸市经济开发区”。

3.产品企业标准由“Q140200TTX009-2010”改为“Q/HDLTS.

09-2011”.

4.卫生许可证由“晋卫食证字（2007）140000-110039号”，

改为吉卫食证字（2008）第220282-SC4348号。

5.增加了食品流通许可证号SP1101051010090481（1-1）。

6.盒子上增加了“数码钞票花纹防伪”技术，包装上的花纹

清晰，仔细观看，花纹中间有“压乐”字样。

北京鑫康胜生物技术开发有限公司

2011年4月6日

本店郑重声明：不卖假货!

每天解释防伪码的问题真的很累！请顾客买之前先看完。厂家因为不让在网上出售，所以我们的防伪码都要刮掉，那个防伪码对于顾客来讲是查询真伪用的，但是对于代理来讲是厂家用来查串货用的，所以我们网上出售一定要撕掉，希望您理解！如果您不能接受的话，请不要拍，免得没有必要的麻烦！以后凡是因为防伪码被撕申请退货的顾客，本店一律不支持！请您考虑好了再拍！~

我们盒子上的防伪挖掉了一部分，是查不了的，因为厂家严查网上低价串货，厂家可以从防伪数字查出货源，不能接受的请不要拍！绝对正品，收到可以试用几天满意在确认，不满意可以全额退款!

谁能详细给我介绍一下药品串货。谢谢！浏览次数：697次悬赏分：0 | 解决时间：2010-9-12 16:15 | 提问者：yanyecc

最佳答案药品串货是一种违规操作。一般来说药品的经营，在地方都是有代理商，代理商是负责独家供货，而药品的生产厂家也会给予市场保护，每个地区不能出现同样品种的经营代理商。串货是指通过厂家发货到其他的地方，再把药品流通到有生产厂家代理商的地方市场去销售，形成了市场冲撞！分享给你的朋友吧：

新浪微博

回答时间：2010-9-2 22:29

药品串货对药厂有什么害处浏览次数：607次悬赏分：0 | 解决时间：2010-10-22 11:52 | 提问者：匿名最佳答案首先明确什么是串货。

串货的种类有以下3种：

1.良性串货：厂商在市场开发的初期，有意或者无意地选中了市场中流通性强的经销商，使其产品迅速流向市场空白区域和非重要区域。

2.恶性串货：经销商为了获得非正常利润，蓄意向自己辖区外的市场倾销商品。

恶意串货形成的5个大的原因：

1.市场饱和；

2.厂商给予的优惠政策不同；

3.通路发展的不平衡；

4.品牌拉力过大而通路建设没跟上；

5.运输成本不同导致经销商投机取巧。

对厂家来说：——害处

可追溯性差，出了事搞不清状况。

价格体系混乱长远看影响品牌发展。

消费者得不到应有保证，经销商受到打击，不利于渠道建设。

当然也有好处。所以窜货屡禁不止

这里学问不小，可以慢慢交流。

新浪微博

回答时间：2010-10-22 10:20 | 我来评论

压乐胶囊”唯一成分“红曲酵素”大纪事

1970：红曲米提取6种他汀，制成降脂药世界第一

红曲，是寄生在红曲米上，发酵提取的活性生物菌。70年代日本科学家远藤根据《本草纲目》上记载红曲的“活血”功效的启示，从红曲营养液中分离出优良的6种含胆固醇抑制剂和甘油三酯分解剂的红曲菌，被命名为“莫纳可林”即“他汀类”，此后30多年来，红曲米提取的“他汀”被世界医学界公认为最好的降脂药，在临床上大量使用。

2002：降压史上历史性突破----6种他丁+2种红曲降压素=“红曲酵素”

2002年，震惊世界的生物领域重大发明，红曲中的降糖、降压、抗癌成分（GABA-GLUCOSAMINE）通过发酵提取，在原来6种他丁的基础上合成“红曲酵素（Monacolin-R），经大量的临床试验，这种复合酵素不仅保留了生物他丁的降脂功效，而且它的降血压效果堪比任何药物，《药日新闻》撰文品论，红曲酵素的出现，将开辟降压药新时代。

2008：6年临床证实“红曲酵素”降血压、治心脑、防猝死、能停药

随后的6年，5万名高血压患者临床运用证实：“红曲酵素”对调理器官微血循环、帮助血液进行重新分配，迅速降压，修复受损心脑肝肾作用显著。而且“红曲酵素”降压同时、养心、护脑、清肝、活肾的功效，达到了降压药的顶峰！“红曲酵素”也被世界医学界誉为“可以媲美青霉素的旷世发现！”

?“红曲酵素”摘取美国医学界最高荣誉“拉斯克奖”

“红曲酵素”的发现者日本Biopharm研究所所长远藤章（74岁），因此项发明被授予美国医学界最高荣誉“拉斯克奖”，纽约市长布隆博格将颁奖理由归结于“数千万人因此得以延长生命！”

“压乐胶囊”1粒见效，当天停服所有西药

6个月血压彻底稳定，并发症消失，实现终身停药。

“压乐胶囊”是目前世界上第一个纯生物制剂降压新品，独含的“红曲酵素”成分能调理心脑肝肾器官微循环，帮助血液进行重新分配，减少心脏压力，清除血液垃圾，软化血管，达到不让血压升起来的目的，修复受损心脑肝肾，达到源头治疗高血压的目的。

1粒见效，当天可停服降压西药，3—7天平稳血压

头痛，头晕，耳鸣，胸闷，乏力等症状逐渐改善，7天后，睡的香了，眩晕症状消失，脑供血不足，心

肌缺血等症状明显好转，可减少服用量。

1个月内，逐渐减少“压乐胶囊”的服用量，3天服一粒

血液流动越来越通畅，血压平稳，血脂，血粘度降低。高血压各项指标逐渐恢复正常，腿脚有力，精神好，脑中风、冠心病、心肌梗塞等危险解除。

6个月内，60%高血压患者可停掉“压乐胶囊”

随着患者心、脑、肝、肾器官得到全面修复，心脑肝肾功能恢复年轻态，血液分布完全正常，血液干净，血管有弹性，血压持续平稳，6个月内1期高血压患者达到临床治愈，即可停药。2期高血压患者只需5-10天服用1粒，即可保持血压持续平稳，冠心病、心绞痛等临床症状消失。3期高血压患者冠心病、心梗、中风后遗症得到良好治疗，2-3天服用1粒，不再担心血压高、心梗、中风反复发作，并发症恶化。

根源阻击高血压，不让血压升起来

全面逆转并发症，拯救心脑肝肾

血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳及其定量 实验报告

生物化学实验报告 姓名： 学号: 专业年级: 组别: 生物化学与分子生物学实验教学中心 实验名称血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳及其定量 实验日期实验地点 合作者指导老师 评分教师签名批改日期 一、实验目得 1、１、学习醋酸纤维薄膜电泳得基本原理与操作方法； 1、2、了解电泳技术得一般原理； １、3、掌握电泳分离血清蛋白质及其定性定量得方法。 二、实验原理 2、1、血清中各种蛋白质得等电点不同，一般都低于pＨ７、4。它们在pH8、6得缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动.由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带得电荷量不同，在醋酸纤维素薄膜上电泳得速度也不同。因此可以将它们分离

为清蛋白(Ａlbumin）、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β－球蛋白、γ-球蛋白5条区带. 2、2、血清中不同蛋白质得等电点、分子量及含量 血清蛋白质等电点分子量占总蛋白 得% 清蛋白4、64６9，0０0 57~72 α1－球蛋白5、０6 2００，0０0 2～５ α2—球蛋白 5、06 3０0,000 4～9 β－球蛋白 5、12 ９0，000～１5０，０00 6、5～１２ γ—球蛋白 6、８5～7、３ 1５６,000~950，000 12~2０ 缓冲液ｐH=8、6，ｐI＜pH. 血清蛋白带负电荷,在电场中向正极移动。 预测血清蛋白电泳区带图 血清蛋白依次分为清蛋白，球蛋白得α１、α2、β、γ五个区带 2、3、①膜条经过氨基黑1０B染色后显出清晰色带;②各色带蛋白质含量与染料结 合量基本成正比；③可将各色带剪开，分别溶于碱性溶液中；④用分光光度法计算各种 蛋白质得百分数。

三、材料与方法： 3、1、实验材料： 3、1、1、实验试剂：①样品:健康人血清（新鲜、无溶血);②巴比妥—巴比妥钠缓冲液（pH8、６,离子强度０、０6mol/L）;③氨基黑１0Ｂ染色液;④漂洗液;⑤洗脱液：0、4mol/NaOH溶液。 ３、１、2、实验器材：①Ｖ－１100分光光度计(×1）；②恒温水浴箱(×１）; ③试管(×6)、试管架(×1）；④1000μL加样枪(×1)、加样枪架(×1);⑤醋酸纤维薄膜（2cm*8ｃm,厚度１20μm）；⑥培养皿(×5)；⑦点样器或载玻片(×１）；⑧平头镊子(×2）;⑨剪刀（×1）;⑩电泳槽（×１)；?直流稳压电泳仪（×１) 3、2、实验步骤

蛋白质的盐析与透析

蛋白质的盐析与透析 一、实验目的 1.了解蛋白质的分离纯化方法 2.掌握蛋白质的盐析及透析方法 二、实验原理 在蛋白质溶液中加入一定浓度的中性盐，蛋白质即从溶液中沉淀析出，这种作用称为盐析。盐析法常用的盐类有硫酸铵、硫酸钠等。 蛋白质用盐析法沉淀分离后，需脱盐才能获得纯品，脱盐最常用的方法为透析法。蛋白质在溶液中因其胶体质点直径较大，不能透过半透膜，而无机盐及其它低分子物质可以透过，故利用透析法可以把经盐析法所得的蛋白质提纯，即把蛋白质溶液装入透析袋内，将袋口用线扎紧，然后把它放进蒸馏水或缓冲液中，蛋白质分子量大，不能透过透析袋而被保留在袋内，通过不断更换袋外蒸馏水或缓冲液，直至袋内盐分透析完为止。透析常需较长时间，宜在低温下进行。 三、实验材料和试剂 10%鸡蛋白溶液，含鸡蛋清的氯化钠蛋白溶液，饱和硫酸铵溶液，硫酸铵晶体，1%硝酸银溶液。 四、实验步骤 （一）蛋白质盐析 取10%鸡蛋白溶液5ml于试管中，加入等量饱和硫酸铵溶液，微微摇动试管，使溶液混合后静置数分钟，蛋白即析出，如无沉淀可再加少许饱和硫酸铵溶液，观察蛋白质的析出； 取少量沉淀混合物，加水稀释，观察沉淀是否会再溶解。 （二）蛋白质的透析 注入含鸡蛋清的氯化钠蛋白溶液5ml于透析袋中，将袋的开口端用线扎紧，然后悬挂在盛有蒸馏水的烧杯中，使其开口端位于水面之上。 经过10分钟后，自烧杯中取出1ml溶液于试管中，加1%硝酸银溶液一滴，如有白色氯化银沉淀生成，即证明蒸馏水中有Cl-存在。 再自烧杯中取出1ml溶液于另一试管中，加入1ml 10%的氢氧化钠溶液，然后滴加1-2滴1%的硫酸铜溶液，观察有无蓝紫色出现。 每隔20分钟更换蒸馏水一次，经过数小时，则可观察到透析袋内出现轻微混浊，此即为蛋白质沉淀。继续透析至蒸馏水中不再生成氯化银沉淀为止。 实验报告记录透析完毕所需的时间。 附：胶棉半透膜的制备 市售5%的胶棉液，加入干燥的150mL锥形瓶中，将锥形瓶横斜不断转动，使瓶的内壁和瓶口都均匀沾有胶棉液。倒出多余的胶棉液，然后倒置约1min使乙醚、乙醇不断蒸发，直到干燥。逐步剥离瓶口的薄膜，沿瓶壁薄膜夹缝注入蒸馏水，使薄膜逐步跟瓶壁胶离，轻轻取出，浸入蒸馏水中备用。 如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！

蛋白质分离纯化的步骤

蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤： （一）材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1. 机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 （二）蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100 等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1.等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2.盐析法 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。 3.有机溶剂沉淀法 中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。 （四）样品的进一步分离纯化

血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳实验报告

血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳实验报告 实验名称血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳及其定量 实验日期实验地点xx实验室 合作者xxx 指导老师xxx 评分教师签名批改日期 一、实验目的 1.1.学习醋酸纤维薄膜电泳的基本原理和操作方法； 1.2.了解电泳技术的一般原理； 1.3.掌握电泳分离血清蛋白质及其定性定量的方法。 二、实验原理 2.1.血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。 血清蛋白质等电点分子量占总蛋白的％ 清蛋白 4.64 69,000 57～72 α1－球蛋白 5.06 200,000 2～5 α2－球蛋白 5.06 300,000 4～9 β－球蛋白 5.12 90,000～150,000 6.5～12 γ－球蛋白 6.85～7.3 156,000～950,000 12～20 缓冲液pH=8.6，pI＜pH。

血清蛋白带负电荷，在电场中向正极移动。 预测血清蛋白电泳区带图 血清蛋白依次分为清蛋白，球蛋白的α1、α2、β、γ五个区带 2.3.①膜条经过氨基黑10B染色后显出清晰色带；②各色带蛋白质含量与染料结合量基本成正比；③可将各色带剪开，分别溶于碱性溶液中；④用分光光度法计算各种蛋白质的百分数。 三、材料与方法： 3.1.实验材料： 3.1.1.实验试剂：①样品：健康人血清（新鲜、无溶血）；②巴比妥-巴比妥钠缓冲液（pH8.6，离子强度0.06mol/L）；③氨基黑10B染色液；④漂洗液；⑤洗脱液：0.4mol/NaOH溶液。 3.1.2.实验器材：①V-1100分光光度计（×1）；②恒温水浴箱（×1）；③试管（×6）、试管架（×1）；④1000μL加样枪（×1）、加样枪架（×1）；⑤醋酸纤维薄膜（2cm*8cm，厚度120μm）；⑥培养皿（×5）；⑦点样器或载玻片（×1）；⑧平头镊子（×2）；⑨剪刀（×1）；⑩电泳槽（×1）；?直流稳压电泳仪（×1） 3.2.实验步骤 1．准备与点样：①取2×8cm的膜条；②亚光面距一端1.5cm处取一点样线；③充分浸透在巴比妥缓冲液中；④取出膜条，用滤纸吸去多余的缓冲液；⑤点样器下端粘上薄层血清；⑥垂直点样。 点样示意图：

-生物化学实验--聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质

-生物化学实验--聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质

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聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质 【目的】 1 ．掌握圆盘电泳分离血清蛋白的操作技术。 2 ．熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。 【原理】 带电粒子在电场中向着与其自身电荷方向相反的电极移动，称为电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳（ PAGE ）就是以聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质的电泳。在电泳时，蛋白质在介质中的移动速率与其分子的大小，形状和所带的电荷量有关。 聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，是由丙烯酰胺（ Acr ）单体和少量交联剂 N,N- 亚甲基双丙烯酰胺（ Bis ）在催化剂过硫酸铵（ Ap ）和加速剂四甲基乙二胺（ TEMED ）的作用下发生聚合反应而制得的（其化学结构式见第 2 篇第 1 章）。 聚丙烯酰胺凝胶具有网状结构，其网眼的孔径大小可用改变凝胶液中单体的浓度或单体与交联剂的比例来加以控制。根据血清蛋白分子量的大小，学生实验一般选用 7 ％聚丙烯酰胺凝胶分离血清蛋白质。 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳利用浓缩效应、分子筛效应和电荷效应的三重作用分离物质（见第 2 篇第 1 章），使样品分离效果好，分辨率较高。一般醋酸纤维薄膜电泳只能把血清蛋白质分离出 5 ～ 7 条带，而聚丙烯酰胺凝胶电泳却能分离出十几条到几十条来（图 3-4 ），是目前较好的支持介质，应用十分广泛。

图 3-4 血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱 根据凝胶支持物的形状不同，分为垂直板电泳和盘状电泳两种，二者原理相同。本实验采用的盘状电泳是在直立的玻璃管中，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续体系，使样品在不连续的两相间积聚浓缩（浓缩效应）成厚度为 10 -2 cm 的起始区带，然后再利用分子筛效应和电荷效应的双重作用在分离胶中进行电泳分离。 【器材】 1 ．电泳仪 直流稳压电源，电压 400 ～ 500V ，电流 50mA 。 2 ．垂直管型圆盘电泳装置 目前这类装置的种类很多，可根据不同的实验要求选择其中的一种。这类装置均由两个基本的部分组成，一部分为载胶玻璃管，须选用内径均匀（ 5 ～ 6mm ） , 外径 7 ～ 8mm ，长 80 ～ 100mm 的玻璃管作为材料，也可以使用更细的玻璃管。另一部分为电泳液槽，可分为上下两槽。电泳时，上下两槽通过凝胶柱沟通电流（图 3-5 ）。 图 3-5 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图 (A 为正面， B 为剖面 ) 3 ．大号试管和中号试管 4 ．微量移液器 5 ． 5ml 注射器和 9 号注射针头 6 ．洗耳球、滤纸条、封口膜等

正确分析血清蛋白电泳扫描图

正确分析血清蛋白电泳扫描图 苏洁平,张晓静 (吉林大学中日联谊医院,吉林长春130031) 血清蛋白电泳虽然是一个传统的检验项目,但目前在临床上对一些疾病的诊断(如对肝病、肾病、多发性骨髓瘤,以及一些自身免疫性疾病等)仍起着不可替代的作用。血清蛋白电泳就是根据血清中各组分蛋白质分子量的不同,将各组分蛋白质分离开, 分子大的泳动慢、分子小的泳动快,依次分为白蛋白、α12球蛋白、α22球蛋白、β2球蛋白(有时可出现前β2球蛋白带区属正常)和γ2球蛋白5个带区(或6个带区)[1,2]。常见几种疾病的蛋白电泳变化见表1。 表1　几种常见疾病的血清蛋白电泳扫描图的变化特征 病名白蛋白 球蛋白 α 12球蛋白α22球蛋白β2球蛋白γ2球蛋白 肾病↓↓↑↑↑↑↓弥慢性肝损伤↓↓↑↓↓↑肝硬化↓↓↓↓β2γ桥原发性肝癌↓↓AFP↑多发性骨髓瘤↓↓↑↑↑慢性炎症↓↑↑↑妊娠↓↑↓无丙种球蛋白血症↓↓双血蛋白血症双峰 注:↑轻度增高,↑↑明显增高,↓轻度降低,↓↓明显降低 下面对几种血清蛋白电泳扫描图作简要说明[3,4]。 1　图1:为正常人血清蛋白电泳扫描图,由左至右为白蛋白峰、α12球蛋白峰、α22球蛋白峰、β2球蛋白峰、γ2球蛋白峰。其含量分别为52%～63%,4%～5%, 6%～9%,9%～12%,15%～23%。 2　图2及图3:见增高的γ2球蛋白峰。肝病患者病程较长,当白蛋白和α12球蛋白降低,γ2球蛋白增高,提示病情较重。当肝细胞严重受损时,β2球蛋白可降低,重症肝炎转为肝坏死后γ2球蛋白增高。 3　图4:可见β区到γ区连续一片,难以分开,是由于IgA、IgM、IgG同时增高所致,称β2γ桥。β2γ桥为肝硬化所独有的特点。如伴有α12球蛋白、α22球蛋白降低即可诊断肝硬化。若治疗后白蛋白回升,标志治疗有效。 4　图5:见明显增高的α22球蛋白峰,β2球蛋白峰同时增高,而白蛋白峰明显减低。由于肾病患者长期丢失白蛋白,故血清中的蛋白明显减少。肾病综合征时高血脂症的发生与肝脏合成脂蛋白增加及脂蛋白分解减少有关,参与脂类分解代谢的某些酶的辅助因子从尿中丢失以致脂蛋白分解减弱,血中胆固醇、甘油三酯明显增高。α22球蛋白、β2球蛋白均是脂蛋白运输载体,为脂蛋白的主要成分。所以肾病患者血清蛋白电泳会出现白蛋白峰减低,α22球蛋白、β2球蛋白峰增高现象。 5　图6及图7:为典型的M峰。由于多发性骨髓瘤患者浆细胞浸润,血清IgM显著增多。γ2球蛋白的主要组成为免疫球蛋白、抗体、补体等,所以在β2球蛋白区和γ2球蛋白区有一明显M带。在扫描图上出现M峰,可分为β型和γ型两种。为多发性骨髓瘤的一项重要诊断指标。 6　图8:见明显降低的γ2球蛋白峰,主要见于体液免疫功能低下患者。 7　其它异常区带: — 2 5 3 —Chin J Lab Diagn,August,2003,V ol7,N o14

蛋白质的分离纯化和表征

蛋白质的分离纯化和表征 第一节蛋白质的酸碱性质 各个解离基团的pK 值与游离氨基酸的不完全相同。等电点要用等电聚焦等方法测定。 第二节蛋白质分子的大小与形状

一、根据化学组成测定最低相对分子质量 假定某种微量成分只有一个，测出其百分含量后，可用比例式算出最低相对分子质量。 若测出两种微量成分的百分含量，分别用比例式算出的最低相对分子质量不相同时，可计算两个最低相对分子质量近似的最小公倍数。 例题：一种纯酶含亮氨酸（Mr 131）1.65%，含异亮氨酸（Mr131）2.48%，求最低相对分子质量。 解：按照Leu 的百分含量计算，最低Mr X1： X1=(100′ 131)/1.65=7939.4。 按照Ile 的百分含量计算最低Mr X2： X2=(100′ 131)/2.48=5282.3。 由于X1 和X2 数字差异较大，提示这种酶含Leu 和Ile 不止1 个，为了估算Leu 和Ile 的个数，首先计算： X1/X2=7939.4/5282.3≈1.5。 这种酶含任何氨基酸的个数均应是整数，说明该酶至少含有2 个Leu，3 个Ile，其最低相对分子质量为： 7939.4 ′2 =15878.8或5282.3×3=15846.9。 二、渗透压法测定相对分子质量 三、沉降分析法测定相对分子质量

基本原理： （一）离心力(centrifugal force，Fc) 当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋转下受到离心力作用时，此离心力“Fc”由下式定义： F=m·a=m·ω2 r a—粒子旋转的加速度，m—沉降粒子的有效质量，ω—粒子旋转的角速度，r—粒子的旋转半径(cm)。 （二）相对离心力(relative centrifugal force，RCF) 由于各种离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同，离心力而受变化，因此在文献中常用“相对离心力”或“数字×g”表示离心力，只要RCF 值不变，一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结果。 RCF 就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。

蛋白质的盐析与透析

蛋白质的分离纯化 一、实验目的 1.了解蛋白质的分离纯化方法 2.掌握蛋白质的盐析及透析方法 二、实验原理 在蛋白质溶液中加入一定浓度的中性盐，蛋白质即从溶液中沉淀析出，这种作用称为盐析。盐析法常用的盐类有硫酸铵、硫酸钠等。 蛋白质用盐析法沉淀分离后，需脱盐才能获得纯品，脱盐最常用的方法为透析法。蛋白质在溶液中因其胶体质点直径较大，不能透过半透膜，而无机盐及其它低分子物质可以透过，故利用透析法可以把经盐析法所得的蛋白质提纯，即把蛋白质溶液装入透析袋内，将袋口用线扎紧，然后把它放进蒸馏水或缓冲液中，蛋白质分子量大，不能透过透析袋而被保留在袋内，通过不断更换袋外蒸馏水或缓冲液，直至袋内盐分透析完为止。透析常需较长时间，宜在低温下进行。 三、实验材料和试剂 10%鸡蛋白溶液，含鸡蛋清的氯化钠蛋白溶液，饱和硫酸铵溶液，硫酸铵晶体，1%硝酸银溶液，双缩脲试剂 四、实验步骤 （一）蛋白质盐析 取10%鸡蛋白溶液5ml于试管中，加入等量饱和硫酸铵溶液，微微摇动试管，使溶液混合后静置数分钟，蛋白即析出，如无沉淀可再加少许饱和硫酸铵溶液，观察蛋白质的析出； 取少量沉淀混合物，加水稀释，观察沉淀是否会再溶解。 （二）蛋白质的透析 注入含鸡蛋清的氯化钠蛋白溶液5ml于透析袋中，将袋的开口端用线扎紧，然后悬挂在盛有蒸馏水的烧杯中，使其开口端位于水面之上。 经过10分钟后，自烧杯中取出1ml溶液于试管中，加1%硝酸银溶液一滴，如有白色氯化银沉淀生成，即证明蒸馏水中有Cl-存在。 再自烧杯中取出1ml溶液于另一试管中，加入1ml 10%的氢氧化钠溶液，然后滴加1-2滴1%的硫酸铜溶液，观察有无蓝紫色出现。 每隔20分钟更换蒸馏水一次，经过数小时，则可观察到透析袋内出现轻微混浊，此即为蛋白质沉淀。继续透析至蒸馏水中不再生成氯化银沉淀为止。 实验报告记录透析完毕所需的时间。

血清蛋白的分离、提纯与鉴定

血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、提纯于鉴定 一、实验目的： 1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法 2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法 3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法 4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法 5、了解柱层析技术 二、实验原理： 蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。对于不同的蛋白质，其分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用不同蛋白质在这些性质上的差别，利用相应的物理方法可分离纯化不同蛋白质。 A.盐析法：在蛋白质溶液中加入大量中性无机盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。同时，加盐后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，从而破坏了蛋白质的胶体性质，导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间易于聚集沉淀，进而使蛋白质从水溶液中沉淀析出。 B.凝胶层析：利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。当溶液通过SephadeG-25凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒网孔，而分子量小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔中，因此在洗脱过程中，小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来，从而达到去盐的目的。 C.离子交换层析:离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。 D.纯度鉴定（醋酸纤维素薄膜电泳）：血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低

于pH7.4。它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此电泳时可将它们分离为清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。 三、材料与方法 A材料 样品：人混合血清 试剂：葡聚糖凝胶（G-25)层析柱、DEAE纤维离子交换层析柱、饱和硫酸铵溶液、醋酸铵缓冲溶液、20%磺基水杨酸、1%BaCl 溶液、氨基黑染色液、漂洗液、pH8.6巴比妥缓 2 冲溶液、电泳仪、电泳槽 B实验步骤 盐析（粗分离）→葡聚糖凝胶层析（脱盐）→DEAE纤维素离子交换层析（纯化）→醋酸纤维素薄膜电泳（纯度鉴定） 具体操作流程示意：

蛋白质纯化的方法选择

蛋白质纯化的方法选择 随着分子生物学的发展，越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种试验技术，并研制成套试剂盒，使基因克隆表达变得越来越容易。但分子生物学的上游工作往往并非是最终目的，分子克隆与表达的关键是要拿到纯的表达产物，以研究其生物学作用，或者大量生产出可用于疾病治疗的生物制品。相对与上游工作来说，分子克隆的下游工作显得更难，蛋白纯化工作非常复杂，除了要保证纯度外，蛋白产品还必须保持其生物学活性。纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的蛋白，重复性良好。这就要求应用适应性非常强的方法而不是用能得到纯蛋白的最好方法去纯化蛋白。在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用中失败，因为后者要求规模化，且在每日的应用中要有很好的重复性。本文综述了蛋白质纯化的基本原则和各种蛋白纯化技术的原理、优点及局限性，以期对蛋白纯化的方法选择及整体方案的制定提供一定的指导。 1、蛋白纯化的一般原则 蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求所用的树脂高容量、高流速，颗粒大、粒径分布宽．并可以迅速将蛋白与污染物分开，防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的分辨率，此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来，要用更小的树脂颗粒以提高分辨率，常用离子交换柱和疏水柱，应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。选择性树脂与目的蛋白结合的特异性，柱效则是指各蛋白成分逐个从树脂上集中洗脱的能力，洗脱峰越窄，柱效越好。仅有好的选择性，洗脱峰太宽，蛋白照样不能有效分离。 2、各种蛋白纯化方法及其优、缺点 2．1 蛋白沉淀蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸，在蛋白质的等电点处若溶液的离子强度特别高或者特别低，蛋白则倾向于从溶液中析出。硫酸铵是沉淀蛋白最常用的盐，因为它在冷的缓冲液中溶解性好，冷的缓冲液有利于保持目的蛋白的活性。硫酸铵分馏常用作试验室蛋白纯化的第一步，它可以初步粗提蛋白质，去除非蛋白成分。蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定，可以短期在这种状态下保存中间产物，当前蛋白质纯化多采用这种办法进行粗分离翻。在规模化生产上硫酸铵沉淀方法仍存在一些问题，硫酸铵对不锈钢器具的腐蚀性很强。其他的盐如硫酸钠不存在这种问题，但其纯化效果不如硫酸铵。除了盐析外蛋白还可以用多聚物如PEG和防冻剂沉淀出来，PEG是一种惰性物质，同硫酸铵一样对蛋白有稳定效果，在缓慢搅拌下逐渐提高冷的蛋白溶液中的PEG浓度，蛋白沉淀可通过离心或过滤获得，蛋白可在这种状态下长期保存而不损坏。蛋白沉淀对蛋白纯化来说并不是多么好的方法，因为它只能达到几倍的纯化效果，而我们在达到目的前需要上千倍的纯化。其好处是可以把蛋白从混杂有蛋白酶和其他有害杂质的培养基及细胞裂解物中解脱出来。 2．2 缓冲液的更换虽然更换缓冲液不能提高蛋白纯度，但它却在蛋白纯化方案中起着极其重要的作用。不同的蛋白纯化方法需要不同pH及不同离子强度的缓冲液。假如你用硫酸铵将蛋白沉淀出来，毫无疑问蛋白是处在高盐环境中，需要想办法脱盐，可用的方法有利用半透膜透析，通过勤换透析液体去除盐分，此法尚可，但需几个小时，通常要过夜，也难以用于大规模纯化中。新型的设备将透析膜夹在两个板中间，板的一侧加缓冲液，另一侧加需脱盐的蛋白溶液，并在蛋白溶液一侧通过泵加压，可以使两侧溶液在数小时内达到平衡，若增加对蛋白溶液的压力，还可迫使水分和盐更多通过透析膜进入透析液达到对蛋白浓缩的目的。也有出售的脱盐柱，柱内的填料是小孔径的颗粒，蛋白分子不能进入孔内，先于高浓度盐离子从柱中流出，从而使二者分离。蛋白纯化的每一步都会造成目的蛋白的丢失，缓冲液平衡的步骤尤甚。蛋白会结合在任何它能接触的表面上，剪切力、起泡沫和离子强度的快速变化很容易让蛋白失活。 2．3 离子交换色谱这是在所有的蛋白纯化与浓缩方法中最有效方法。基于蛋白与离子交换树脂间的相互电荷作用，通过选择不同的缓冲液，同一种蛋白既可以和阴离子交换树脂（能结合带负电荷的分子）结合，也可以和阳离子交换树脂结合。树脂所用的带电基团有四种：二乙基氨基乙基用于弱的阴离子交换树脂；羧甲基用于弱的阳离子交换树脂；季铵用于强阴离子交换树脂；甲基磺酸酯用于强阳离子交换树脂。蛋白质由氨基酸组成，氨基酸在不同的pH环境中所带总电荷不同。大多数蛋白在生理pH（pH6～8）下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化，极端的pH下蛋白会变性失活．应尽量避免。由于在某个特定的pH下不同的蛋白所带电荷数不同，与树脂的结合力也不同，随着缓冲液中盐浓度的增加或pH的变化，蛋白按结合力的强弱被依次洗脱。在工业化生产中更多地是改变盐浓度而不是去改变pH值，因为前者更容易控制。在实验室中几乎总是用盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度能够中和蛋白的电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来。但在工业生产中盐浓度很难精确控制，所以常用分步洗脱而不足连续升高的盐梯度。与排阻层析相比，离子交换特异性更好，有更多的参数可以调整以获得最优的纯化效果，树脂也比较便宜。值得一提的是，即便是用最精确控制的条件，仅用离子交换单一的方法也得不到纯的蛋白，还需要其他的纯化步骤。

蛋白质的分离纯化方法(参考资料)

蛋白质的分离纯化方法 2.1根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白 质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1]。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7]。 2.2 根据溶解度不同进行分离纯化 影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。 等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最

【CN109810185A】一种重组人血清白蛋白的分离纯化方法【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910276004.5 (22)申请日 2019.04.08 (71)申请人 北京蛋白质组研究中心 地址 102206 北京市海淀区中关村生命科 学园生命园路38号 (72)发明人 钱小红　张养军　余谦　张普民　 高方圆　焦丰龙　夏朝双　张汉卿　 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 (51)Int.Cl. C07K 14/765(2006.01) C07K 1/36(2006.01) C07K 1/18(2006.01) C07K 1/20(2006.01) C07K 1/30(2006.01) (54)发明名称 一种重组人血清白蛋白的分离纯化方法 (57)摘要 本发明公开了一种重组人血清白蛋白的分 离纯化方法。该方法首先采用热乙醇沉淀法从转 基因猪血浆中对重组人白蛋白进行粗提纯，再利 用两种色谱方法以串联方式进一步精纯化，即先 用阴离子交换色谱法进行第一步精纯化，再采用 反相色谱法或者凝胶色谱法进行二次精纯化。结 果表明，本发明能从转基因猪血浆中分离纯化出 高纯度的重组人血清白蛋白，并有望替代人血清 白蛋白用于临床用药和生化研究中。权利要求书2页 说明书5页 附图3页CN 109810185 A 2019.05.28 C N 109810185 A

权　利　要　求　书1/2页CN 109810185 A 1.一种对含有重组人血清白蛋白的血浆中的重组人血清白蛋白进行分离纯化方法，包括： 1)去除含有重组人血清白蛋白的血浆中的凝血因子和纤维蛋白原后，将所得血浆上清液用热乙醇沉淀法进行粗提纯，得到rHSA粗提取液； 2)将所述rHSA粗提取液脱盐浓缩后，用阴离子交换色谱柱洗脱，收集洗脱液即为第一步精纯化rHSA溶液； 3)将所述第一步精纯化rHSA溶液脱盐浓缩后，用反相色谱柱或凝胶色谱柱进行二次精纯化，即得到rHSA溶液，完成所述重组人血清白蛋白的分离纯化。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述含有重组人血清白蛋白的血浆按照如下步骤制得：对含有重组人血清白蛋白的血进行血浆抗凝处理后离心，收集上清液而得； 具体的，所述血浆抗凝处理步骤中，所用抗凝剂为柠檬酸钠水溶液；所述含有重组人血清白蛋白的血与抗凝剂的体积比为15:1～20:1；所述抗凝剂的浓度为70g/L～90g/L； 所述离心步骤中，离心力为1500-2500×g；具体为2000×g；时间为20-40min；具体为30min。 3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤1)去除含有重组人血清白蛋白的血浆中的凝血因子和纤维蛋白原的方法包括：将所述含有重组人血清白蛋白的血浆冷冻沉淀，解冻后离心，收集上清液，即为所述血浆上清液； 具体的，所述冷冻沉淀步骤中，温度为-30--10℃；具体为-20℃； 所述解冻步骤中，温度为0-10℃；具体为4℃； 所述离心步骤中，离心力为4500-5500×g；具体为5000×g；时间为10-20min；具体为15min。 4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤1)热乙醇沉淀法包括：将所述血浆上清液与由蛋白保护剂、变性剂、氯化钠和水组成的混合液混匀后，调节pH至 5.0～7.0，在55℃～80℃，恒温保持20～60min，冷却至室温后调节pH至4.0～5.0，静置，一次离心，收集上清，淋洗所得沉淀，再进行二次离心，收集上清，合并两次上清，即为所述rHSA粗提取液。 5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述蛋白保护剂为辛酸钠；所述辛酸钠在由蛋白保护剂、变性剂、氯化钠和水组成的混合液中的浓度为5～10g/L； 所述变性剂为有机溶剂；具体为乙醇；所述氯化钠在由蛋白保护剂、变性剂、氯化钠和水组成的混合液中的浓度为5～9g/L；所述由蛋白保护剂、变性剂、氯化钠和水组成的混合液的体积用量与所述血浆上清液相同； 所述变性剂的用量为所述血浆上清液体积的8％～12％； 所述静置步骤中，温度为室温；时间为1-3h；具体为2h； 所述淋洗步骤中，所用淋洗液为pH值为4.8的蒸馏水； 所述一次离心和二次离心步骤中，离心力为4500-5000×g；具体为5000×g；时间为50-70min；具体为60min。 6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所用流动相A为0.02mol/L Tris-HCl，流动相B为0.02mol/L Tris-HCl+0.3mol/L NaCl； 所用阴离子交换色谱柱为DEAE弱阴离子交换色谱柱；流速为1mL/min；柱温为室温；检 2

血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验

血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验 一．实验原理 1、电泳是指带电质点在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。在一定pH条件下，不同的质点由于具有不同的等电点而带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率不同，因此，可使它们分离。 2、影响电泳迁移率的外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象。 3、影响电泳迁移率的内在因素：质点所带净电荷的量、质点的大小和形状。 4、采用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法称为醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤维素薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无拖尾和吸附现象等优点。 5、醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯，将它溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约为120 μm，有很强的通透性，对分子移动阻力很小。 6、本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血清蛋白。血清中含有清蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组成、分子量、等电点及形状不同，在电场中的迁移速度不同。以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在pH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条区带。其中清蛋白的泳动速度最快，其余依次为α1-、α2-、β-及γ-球蛋白。 二．实验仪器和试剂 ?器材 醋酸纤维素薄膜（3×8cm），培养皿，载玻片，电泳仪，电泳槽，粗滤纸，镊子 ?材料 新鲜血清（未溶血） ?试剂 1、巴比妥缓冲液（pH 8.6，离子强度0.06）： 巴比妥1.66g, 巴比妥钠12.76g，加水至1000ml。置4℃冰箱保存，备用。（已配置） 2、染色液：氨基黑10B 0.5g, 甲醇50ml, 冰醋酸10ml，蒸馏 水40ml，混匀。 3、漂洗液：含95％乙醇45ml，冰醋酸5ml，蒸馏水50ml，混匀。 4、NaOH溶液：称取NaOH 16g，定容至1000ml。 三．实验过程 一.准备与点样 1.将薄膜剪成3×8cm的小条，在薄膜无光泽面距一端1.5cm处用铅笔轻轻划一条直线，表示点样位置。

盐析法

盐析法综述 摘要：沉淀法是利用沉淀反应，将被测组分转化为难溶物，以沉淀形式从溶液中分离出来，并转化为称量形式，最后称定其重量进行测定的方法。盐析法是其中的一种，盐析法是在中药水提液中,加入无机盐至一定浓度,或达饱和状态,可使某些成分在水中溶解度降低,从而与水溶性大的杂质分离。常作盐析的无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。 关键词:沉淀法；盐析；原理；方法评价；蛋白质盐析 沉淀法 沉淀法是利用沉淀反应，将被测组分转化为难溶物，以沉淀形式从溶液中分离出来，并转化为称量形式，最后称定其重量进行测定的方法。 有机溶剂沉淀法多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。有机溶剂的沉淀机理是降低水的介电常数，导致具有表面水层的生物大分子脱水，相互聚集，最后析出。等电点沉淀法用于氨基酸、蛋白质及其它两性物质的沉淀。但此法单独应用较少，多与其它方法结合使用。两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低，不同的两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可进行分离。、非离子多聚体沉淀法用于分离生物大分子非离子多聚物是六十年代发展起来的一类重要沉淀剂，最早用于提纯免疫球蛋白、沉淀一些细菌和病毒，近年来逐渐广泛应用于核酸和酶的分离提纯。最常用的是铅盐法，可以用于除去杂质，也可用于沉淀有效成分。沉淀法通常是在溶液状态下将不同化学成分的物质混合,在混合液中加人适当的沉淀剂制备前驱体沉淀物,再将沉淀物进行干燥或锻烧,从而制得相应的粉体颗粒。一般来说，所有固体溶质都可以在溶液中加入中性盐而沉淀析出，这一过程叫盐析。在生化制备中,许多物质都可以用盐析法进行沉淀分离，如蛋白质、多肽、多糖、核酸等，其中以蛋白质沉淀最为常见，特别是在粗提阶段。 对沉淀形式的要求 （1）沉淀的溶解度要小，以保证被测组分能沉淀完全。 （2）沉淀要纯净，不应带入沉淀剂和其他杂质。 （3）沉淀易于过滤和洗涤，以便于操作和提高沉淀的纯度。 （4）沉淀易于转化为称量形式。 盐析法 胶体的盐析 胶体的盐析是加盐而使胶粒的溶解度降低，形成沉底析出的

蛋白质分离与纯化教学设计课题

蛋白质分离与纯化教学设计 一、教学背景分析 【教材分析】 “蛋白质的分离与纯化”实验是《高中生物》选修1生物技术实践 5.3血红蛋白的提取与分离中的容。本节课的主要容包括蛋白质的提取、分离纯化等基本知识，主要要求学生掌握凝胶电泳的实验原理以及操作方法。“血红蛋白分离与纯化”实验不仅是学习血红蛋白的提取、分离纯化方法，而且也是进一步掌握蛋白质的组成、结构和功能的基础。 【学情分析】 到目前为止，学生已经学习了蛋白质的相关知识，对蛋白质有了一定的了解，“蛋白质的分离与纯化”实验目的是使学生体验从复杂细胞混合物体系中提取和纯化生物大分子的基本原理、过程和方法，虽然操作难度较大，但原理清晰，动手机会较多，学习兴趣很高。学生有必修“生命活动的主要承担者——蛋白质”的基础，在一定程度上掌握了蛋白质的组成、结构和功能等基础知识，学生在进行实验前还是能大概了解影响蛋白质分离纯化的因素的，再者经过老师的指导，实验能取得良好的结果的。 二、教学目标 【知识目标】 1.了解从血液中提取蛋白质的原理与方法。 2.说出凝胶电泳的基本原理与方法。 【能力目标】 运用凝胶电泳对蛋白质进行分离纯化。 【情感态度与价值观目标】 1.培养学生科学实验的观点。 2.初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神。 三、教学重难点

【教学重点】 从血液中提取蛋白质；凝胶电泳分离纯化蛋白质。 【教学难点】 样品预处理，色谱柱的装柱，纯化分离操作。 四、实验实施准备 【教师准备】 1.分组。学生按学科能力的强中弱平均分组，各组尽量平衡，各组自行分工，并由实验员统一安排实验过程。 2.实验材料：血液 仪器：试管、胶头滴管、烧杯、玻璃棒、离心机、研磨器、透析袋、电泳仪等。 试剂：20mmol/L磷酸缓冲液（pH为8．6）、蒸馏水、聚丙烯酸铵、生理盐水、5％醋酸水溶液等。 【学生准备】 1.预习实验“蛋白质分离纯化”，了解蛋白质的相关信息。 2.进行分组。 五、教学方法 【教法】分析评价法、任务驱动法、直观演示法 【学法】自主学习法、合作交流法 六、教学媒体 黑板、多媒体 七、课时安排 两个课时（80min） 一个课时用来讲述理论部分知识：样品处理与色谱柱分离纯化蛋白质的原理与方法； 另一课时用来进行实验。

牛血清白蛋白分离提纯工艺

课程设计说明书 课程名称：生物分离工程 设计题目：牛血清白蛋白的分离提纯工艺 院系：环境与化学工程学院 学生姓名：孙盼盼 学号：41004020111 专业班级：10级生物工程01班 指导教师：王晓军 2013年6月20日

目录 1.设计任务书 (1) 2.设计背景 (1) 2.1 牛血清白蛋白分离提纯的简介 (1) 2.2 牛血清白蛋白分离提纯的意义 (1) 3.设计原理 (2) 4.设计工艺流程及设计方案说明 (2) 4.1对原材料的粗分级分离 (3) 4.2对粗分离成分进行细分级分离 (3) 4.3 蛋白的结晶与重结晶 (3) 4.4 对分离出的蛋白质进行纯度鉴定 (3) 4.5 牛血清白蛋白质分离提纯的整个工艺流程 (3) 5.操作过程 (4) 5.1蛋白质分离的准备阶段 (4) 5.2细分级分离设备的设计 (4) 5.3蛋白质的纯度鉴定 (8) 6.参考文献 (8) 7.课程设计心得 (9)

1.设计任务书 现有一混合物料液中含有酪蛋白（分子量：57000Da，pI 4.5）、β-乳球蛋白（分子量：35000Da，pI 5.1）、α-乳白蛋白（分子量：14000Da，pI 4.2）和牛血清白蛋白（分子量：66200Da，pI 4.7），设计一个分离纯化工艺纯化其中的牛血清白蛋白。 2.设计背景 2.1 牛血清白蛋白分离提纯的简介 蛋白质是（protein）是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。因此，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质占人体重量的16%~20%，即一个60kg重的成年人其体内约有蛋白质9.6~12kg。人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。 蛋白质具有很多生物化学共性，运用相关性质进行蛋白质的分离制备多种不同的单一蛋白质，更好的为人们所有。蛋白质的分离提纯技术已经很成熟，相关的工艺流程包含各种不同的分离提纯设备，这些设备运用蛋白质的不同原理对其进行分离纯化，单一蛋白质的分离提纯在现实生活中具有重要意义！ 2.2 牛血清白蛋白分离提纯的意义 牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分（38g/100ml），分子量68kD。等电点4.8。含氮量16%，含糖量0.08%。仅含已糖和已糖胺，含脂量只有0.2%。白蛋白由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫