如何自制核酸探针
如何自制核酸探针？
什么是核酸探针？
核酸探针是能与特定的靶分子发生特异性结合的一段核苷酸分子。通过在核酸探针上连接一些小分子化合物，如生物素、荧光素、地高辛等，或者放射性同位素标记核苷酸，可以达到检测靶基因序列和纯化的目的。这一过程被称为核酸杂交。其原理是碱基互补的两条核酸分子退火形成双链。
探针应用
核酸探针技术作为分子生物学中最常见的技术之一，是印记杂交，原位杂交，实时荧光PCR，microarray（微阵列）等技术不可或缺的组成部分。探针技术能定性或者检测特异性DNA/RNA序列，还可用于病原微生物和寄生虫的检测，疾病诊断等领域。
探针制备
探针标记主要分为放射性和非放射性标记法。探针制备流程如图1所示。Southern印迹、Northern印迹等需要较长的DNA探针，常使用缺口平移法和随机引物法进行标记。而这些方法对于较短的DNA（200 bp以下）来说，效率很低，常使用末端标记法。除了这三种方法，常见的还有PCR标记法。
图1. 探针制备流程。
随机引物法
随机引物法的原理是利用随机引物（random primer，即DNA 水解、分离得到的六聚脱氧核苷酸作）与单链DNA随机互补结合，在Klenow大片段酶的作用下，合成互补链，直至下一个引物。如果模板是RNA，则使用反转录酶。随机引物法可以使标记均匀跨越探针全长。相比于缺口平移法，探针的活性更高，但是产量相对较低。
图2. 随机引物法的原理。
Protocol
试剂：
[α-32P]dCTP (3000Ci/mmol), dATP,dTTP,dGTP (5 mmol/L),Klenow大片段（2U/uL），模板，随机引物，
NA终止/贮存缓冲液（50 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5)，50 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA (pH 8.0)，0.5% (m/V) SDS）
5X 随机引物缓冲液（250 mmol/L Tris (pH 8.0)，25 mmol/L MgCl2，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L 二琉苏糖醇（DTT)，1 mol/L HEPES ( 用 4 mol/L NaOH 调至 pH 6.6），1 mol/L DTT 贮存于 -20℃，临用前用水稀释，使用后弃去稀释的 DTT。）
实验步骤：
1、在一个 0.5 mL 的微量离心管中加入溶于 30 uL 水的模板 DNA ( 25 ng ) 及 1 uL 随机脱氧核苷酸引物（约 125 ng）。
2、使用PCR或者预热的水浴锅95℃热变性10min，迅速放冰上1min。
3、4℃离心混合物10s，重新置于冰上。
4、引物和模板的混合物中加入：
dATP, dTTP, dGTP 各1 uL
5X 随机引物缓冲液 10 uL
[α-32P]dNTP 5 uL
水至 50 uL
然后加入5 uL的klenow片段。
5、轻弹混合均匀,轻甩使液体降至管底。室温反应60min。然后加入10 uL的NA终止/贮存缓冲液。
6、制备好的探针-20℃保存。或者过柱后保存。原位杂交需要过柱。
缺口平移法
缺口平移法标记探针的基本原理是：先用适当浓度的DNA酶I在DNA分子的一条链上打开缺口(nick)，缺口处形成3’羟基末端，再利用大肠杆菌DNA聚合酶I的 5’→3’方向外切酶活性，将缺口处5’端碱基依次切除。与此同时，在大肠杆菌DNA聚合酶I的催化下，以另一条DNA链为模板，以带标记得dNTP为原料，顺序将dNTP连接到切口的3’羟基上，从5，端向3’端方向重新合成一条互补链。
图3. 缺口平移法制备探针原理。
末端标记法
末端标记法可用于标记较短的探针。如图4所示，末端标记法又可以分为T4多核苷酸激酶、Klenow片段、T4 DNA聚合酶。他们各自的原理如下图所示。
-T4多核苷酸激酶
图4. 利用T4 PNK和 [γ-32P]dATP进行末端标记。
-Klenow片段
图5. 利用Klenow片段进行末端标记。
-T4 DNA聚合酶
图6. 利用T4 DNA聚合酶进行末端标记。
寡聚核苷酸探针
寡聚核苷酸多由商家定制合成，可广泛用于测序、杂交和引物外延。末端标记法适合标记合成的寡核苷酸探针。其原理是：在大肠杆菌 T4 噬菌体多聚核苷酸激酶(T4 PNK)的催化下,将标记ATP的磷酸连接到带羟基的待标记寡核苷酸 5′末端上。
PCR标记法
PCR 标记法是将标记过的dNTP添加到DNA模板溶液中,在DNA聚合酶的催化作用下,经过多次变性、退火和延伸过程的重复性循环,合成掺入标记物的DNA 片段。这种方法简便、快速、重复性好,对模板DNA的纯度要求低,可用于大量制备。
图7. PCR标记法。
探针纯化
乙醇可以出去部分未参与反应的核苷酸等物质，而Sephadex等凝胶过滤的方法可以除去几乎所有未参与反应的核苷酸。根据探针分子质量选择Sephadex G50（100bp以上）或者Sephadex G25（100bp以下）。
Protocol
1.将Sephadex G50悬浮于TE，（G25需要悬浮在T50E）,高温高压灭菌，室温保存。
2.将poly-prep柱置于架子上。将悬浮的Sephadex填充入柱子中。并用5ml TE（G25选择T50E）平衡。
3.将标记好的探针放入柱中。
4.缓慢加入400 uL TE（G25选择T50E）.并回收TE（G25为T50E）。每管200 ul，共回收6管。
5.测定各管的放射性强度。选择放射性强的为探针，优先考虑。
参考资料：
《现代分子生物学实验原理与技术》
赵美萍,张新祥,常文保.生化探针技术.大学化学,2004,19:2.
分子信标：新型核酸分子探针要点
分子信标：新型核酸分子探针 摘要： 分子信标是基于荧光共振能量传递原理设计的一种发夹型寡聚核酸分子荧光探针，能够与待测核酸序列分子相互作用发生结构变化产生不同强度的荧光信号及电化学信号等，具有高灵敏度、高选择性、适于活体检测等优点。本文介绍了分子信标的作用原理，不同的分子信标类型以及应用，最后对前景作出了预测。 关键词：分子信标荧光探针灵敏度选择性活体检测 引言： 从20世纪60年代初至今，分子信标（Molecular beacon,MB）已被广泛地应用于生物、药物、化学等多个领域【1,2,3,4】。近年来，MB特别是基于DNA结构的MB，已成为一种重要工具，用于核酸的复制、重组、翻译和表达的研究【5,7,12】。为了满足后基因组时代的发展需求，人们通过各种分子工程策略，发展了许多敏锐性更高、选择性更优的MB。 自从1996年Tyagi和Krame【6】首次建立了分子信标探针，由于其独特的性质和多功能性，如操作简单、灵敏度高、特异性强等。在它出色地完成了液相靶标测定(实时PCR测定)任务之后，人们又将其应用于核酸实时定量测定、活体分析、化学与生物传感、疾病基因检测与诊断等研究中【8,9,10,11】。又由于易于对其进行修饰和改性，在这十来年的发展中，人们在经典分子信标模型的基础上，设计出了许多新型的分子信标，如无茎分子信标，用PNA【13】链代替ssDNA形成的PNA分子信标，以及LNA分子信标等。这些新型的分子信标是为了满足不同的需要而设计的，特异性更强，稳定性更好，为许多新的研究领域提供了一个平台。为了满足基因组学和蛋白质组学的发展，对分子信标的固定化也成了必然的发展趋势，自从谭蔚泓【14】首次将分子信标固定在硅胶上以来，固定化分子信标也迅速发展起来。尤其是后来设计的将分子信标固定在金表面【15,16】，利用金的强摩尔消光系数进行淬灭，简化了分子信标的设计，更加方便对其进行操作，大大促进了基因微阵列技术的发展。
核酸检验基本技术
第六章核酸检验基本技术 第一节分子生物学基本知识 一、DNA和RNA DNA是脱氧核糖核酸的英文缩写。DNA以核苷酸排列顺序形式储存遗传信息。 DNA分子由4种核苷酸组成，由碱基互补维持DNA双螺旋结构。 在动植物、细菌和真菌中都含有DNA，但在病毒中不一定含DNA。 DNA为长丝状分子相互纠缠，其溶液十分黏稠。 它对紫外线有最强的吸收，通常用260nm波长测DNA溶液浓度，它在近中性环境中带负电荷，DNA变性后OD值会升高。 因DNA不溶于乙醇，常用二倍量乙醇沉淀DNA。 在变性温度时，它的黏性突然降低。淬火是为了保持DNA单恋状态。 DNA变性后溶液慢慢冷却，DNA会自动回复双螺旋结构。 RNA是核糖核酸的英文缩写，在大多数生物类型中，RNA起遗传信息传递作用并指导合成蛋白质，但在一部分病毒中，RNA也是遗传信息的保存者。 RNA分子中除了含有核糖而不是脱氧核糖外，凡DNA中出现胸腺嘧啶的地方都代之以尿嘧啶。 二、DNA的复制和修复 细胞分裂一次，染色体DNA就合成一次。 DNA分子拆开成两条链，每一条单链按照碱基配对的原则合成另一条新的单链，成为半保留复制。 在合成DNA时限制性核酸内切酶不是合成DNA的必要条件。 DNA多聚酶只能结合在一长段DNA单链的一小段局部双链结构上，才能顺利开始DNA合成。 在DNA合成中单核苷酸分子必须顺序以共价链连接在已形成核酸链3?末端的羟基上。 在合成大声错误时，DNA多聚酶会切除错误核苷酸，在那个位置上重新加一个正确核苷酸。 在人工合成DNA时，至加一种或两种三磷酸单核苷酸，那么和成就会停止在缺失的核苷酸位置上。 在大肠菌DNA损伤修复时填补缺口最重要的酶是DNA聚合酶Ⅰ，而复制最主要的DNA聚合酶是DNA聚合酶Ⅱ。 该酶的核心聚合酶中，具有3?-5?外切酶活性。DNA修复过程中尿嘧啶糖基酶系统不包括SⅠ核酸酶。 逆转录酶的RNAaseH活性是一般DNA聚合酶所不具备的。 三、转录 在生物体内，DNA知道的RNA合成过程称为转录。 它是按照储存在DNA尚的遗传信息合成。 合成RNA时DNA双链也要解旋，解旋部位称启动子。 大肠菌的RNA聚合酶有5个亚基，其σ亚基有启动子作用。 四、翻译 再合成各种不同RNA中，tRNA具有搬运氨基酸功能。 构成核糖体骨架的是rRNA，而mRNA直接决定蛋白质的结构。 4种核苷酸排列组成遗传信息，很撑蛋白质时转换成20种氨基酸的排列顺序，遗传信息的这种转换称为翻译。 3个核苷酸排列顺序代表一种氨基酸密码，表示蛋白质合成开始的密码有一种，DNA3个终止密码子分别是UAA、UAG、UGA。 在细菌里，依靠rRNA和mRNA之间一段互补序列能发现蛋白质合成开始的位置。 元和生物核糖体是由16SrRNA、23SrRNA和5SrRNA组成，在振和生物核糖体的五种主要的组蛋白中，H1在进化中最不保守。 在核糖体上，有2个位置上暴露出mRNA分子相邻的2个密码子，当蛋白质合成进行到没有携带任何
核酸检测基本 知识
核酸检测基本知识 1.什么是核酸检测 核酸的定义：核酸是由核苷酸或脱氧核苷酸通过3′，5′-磷酸二酯键连接而成的一类生物大分子。 核酸具有非常重要的生物功能，主要是贮存遗传信息 和传递遗传信息。 2.核酸的分类 核酸大分子可分为两类：脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。 3.核酸的组成
DNA和RNA都是由一个一个核苷酸(nucleotide)头尾相连而形成的，由C、H、O、N、P，5种元素组成。DNA是绝大多数生物的遗传物质，RNA是少数不含DNA的病毒（如HIV病毒，流感病毒，SARS病毒等）的遗传物质。RNA平均长度大约为2000个核苷酸，而人的DNA却是很长的，约有3X10^9个核苷酸。 4.核酸的功能 在蛋白质的复制和合成中起着储存和传递遗传信息的 作用。核酸不仅是基本的遗传物质，而且在蛋白质的生物 合成上也占重要位置，因而在生长、遗传、变异等一系列 重大生命现象中起决定性的作用。 DNA与RNA都是核酸，它们在化学组成上有什么区别如 下： DNA与RNA的比较DNA RNA 主要存在部位细胞核细胞质 基本组成单位脱氧核苷酸核糖核苷酸碱基种类A、G、C、T A、G、C、U 五碳糖种类脱氧核糖核糖 核苷酸链两条脱氧核苷酸链一条核糖核苷酸链 5.检测方法 核酸检测方法，主要通过同时进行靶核酸扩增和可检 测信号的生成来检测样品中的靶核酸。可应用于临床微生
物学、血液筛选、遗传病诊断和预防、法医学等领域的核 酸检测。 目前主要使用的方法有以下几种： a.核酸序列依赖性扩增法 NASBA是由一对引物介导的、连续均一的、体外特异性 核苷酸序列等温扩增RNA的新技术。反应在42℃进行,可在2h内将RNA模板扩增约109倍。NASBA原理是提取病毒RNA,加入AMV逆转录酶、RNA酶H、T7RNA聚合酶和引物进行扩增。 整个反应分非循环相和循环相:在非循环相中,引物I与模板RNA退火后在AMV逆转录酶的作用下合成cDNA,形成RNA:DNA 杂合体,随即RNaseH降解RNA,引物Ⅱ与cDNA退火,在反转录酶作用下合成第2条DNA互补链。双链DNA可在T7RNA聚合酶的作用下,经其启动子序列起动而转录RNA，RNA又可在反转录酶的作用下反转录成DNA，进入循环相,对模板进行大量 扩增。 b.转录介导的扩增技术 TMA技术原理与NASBA基本一致，略有不同之处是TMA利用的是MMLV逆转录酶及T7RNA聚合酶两种酶，MMLV逆转录酶既有逆转录酶的活性又具有RNA酶H活性。反应在41.5℃进行,可在1h内将RNA模板扩增约109倍。 c.连接酶酶促链式反应(LCR) LCR是基于靶分子依赖的寡核苷酸探针相互连接的一种
如何自制核酸探针
如何自制核酸探针？ 什么是核酸探针？ 核酸探针是能与特定的靶分子发生特异性结合的一段核苷酸分子。通过在核酸探针上连接一些小分子化合物，如生物素、荧光素、地高辛等，或者放射性同位素标记核苷酸，可以达到检测靶基因序列和纯化的目的。这一过程被称为核酸杂交。其原理是碱基互补的两条核酸分子退火形成双链。 探针应用 核酸探针技术作为分子生物学中最常见的技术之一，是印记杂交，原位杂交，实时荧光PCR，microarray（微阵列）等技术不可或缺的组成部分。探针技术能定性或者检测特异性DNA/RNA序列，还可用于病原微生物和寄生虫的检测，疾病诊断等领域。 探针制备 探针标记主要分为放射性和非放射性标记法。探针制备流程如图1所示。Southern印迹、Northern印迹等需要较长的DNA探针，常使用缺口平移法和随机引物法进行标记。而这些方法对于较短的DNA（200 bp以下）来说，效率很低，常使用末端标记法。除了这三种方法，常见的还有PCR标记法。 图1. 探针制备流程。 随机引物法 随机引物法的原理是利用随机引物（random primer，即DNA 水解、分离得到的六聚脱氧核苷酸作）与单链DNA随机互补结合，在Klenow大片段酶的作用下，合成互补链，直至下一个引物。如果模板是RNA，则使用反转录酶。随机引物法可以使标记均匀跨越探针全长。相比于缺口平移法，探针的活性更高，但是产量相对较低。
图2. 随机引物法的原理。 Protocol 试剂： [α-32P]dCTP (3000Ci/mmol), dATP,dTTP,dGTP (5 mmol/L),Klenow大片段（2U/uL），模板，随机引物， NA终止/贮存缓冲液（50 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5)，50 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA (pH 8.0)，0.5% (m/V) SDS） 5X 随机引物缓冲液（250 mmol/L Tris (pH 8.0)，25 mmol/L MgCl2，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L 二琉苏糖醇（DTT)，1 mol/L HEPES ( 用 4 mol/L NaOH 调至 pH 6.6），1 mol/L DTT 贮存于 -20℃，临用前用水稀释，使用后弃去稀释的 DTT。） 实验步骤： 1、在一个 0.5 mL 的微量离心管中加入溶于 30 uL 水的模板 DNA ( 25 ng ) 及 1 uL 随机脱氧核苷酸引物（约 125 ng）。 2、使用PCR或者预热的水浴锅95℃热变性10min，迅速放冰上1min。 3、4℃离心混合物10s，重新置于冰上。 4、引物和模板的混合物中加入： dATP, dTTP, dGTP 各1 uL 5X 随机引物缓冲液 10 uL
地高辛标记核酸探针的标记方法
地高辛标记核酸探针的标 记方法 Last revision on 21 December 2020
地高辛标记核酸探针的标记方法 核酸探针已被广泛用于筛选重组克隆、基因多样性的种性检测和真菌种群内及种群之间的系统发育关系评价。最早使用的放射性同位素标记核酸探针具有敏感性高、特异性好、分辨力强的特点，但放射性同位素标记也存在着一系列令人困扰的问题,如成本高、探针半衰期短、放射性物质危害人体健康等。而且在进行放射性同位素标记实验时,需要有专门的实验室及相应的实验保护设施，还需要由经过培训的专业人员来操作,因而限制了在普通实验室进行分子生物学实验。 近几年发展起来的非放射性核酸探针大多通过酶促、光化学和化学手段掺入一种报道基团,这种报道基团可通过高灵敏度的冷光、荧光或金属沉淀等检测系统检测。另外,应用pH电极或感应器技术的电化学检测系统也有报道。在这些检测系统中,灵敏度最高的是生物素- 亲合素检测系统和半抗原-抗半抗原地高辛检测系统。由于生物样品中常含有内源性生物素及生物结合蛋白，生物素标记的核酸探针会发生一些非特异性结合，从而影响实验效果。与生物素-亲合素系统同样具有高灵敏度，却减少了非特异性结合的地高辛检测系统，已为人们所接受,并得到广泛的应用。 地高辛(Digoxigenin ,DIG) 又称异羟基洋地黄毒甙元，是一种类固醇半抗原分子。其化学结构如图1 所示。 采用人工方法可以将地高辛的线型间隔臂与dUTP 连接起来,形成DIG-11-dUTP，通过随机引物法或PCR法将其掺入到DNA
探针中。RNA探针的标记是使用噬菌体信息编码的RNA聚合酶，通过体外转录将DIG-11-dUTP掺入到RNA探针中。寡核苷酸探针的标记则是通过末端转移酶催化，在3'末端加上DIG-11-dUTP/dATP 或DIG-11-ddUTP 尾巴。 对于目的DNA 或RNA 来说，分子杂交后,杂交部分可通过ELISA 实验程序加以检测，即加入一种结合有碱性磷酸酶的地高辛-特异性抗体，它与地高辛半抗原分子形成酶联抗体-半抗原(DIG) 复合物，再加入相应的显色底物，使杂交部分得以显示。 1 地高辛标记核酸探针的主要标记方法 1. 1 DNA 探针的标记方法 1. 1. 1 PCR 掺入法这种标记方法是通过聚合酶链式反应，在Taq 酶的作用下，将DIG-11-dUTP 掺入到新合成的DNA 链中。以本法标记的探针不但灵敏度高，产量也很高。少量的基因组DNA(1ng～50ng) 便可直接通过PCR 进行扩增、标记。 1. 1. 2 随机引物法用随机引物法可将DIG-11-dUTP 标记于DNA 链上。为得到最佳标记效果，标记前模板DNA 需作线性处理，而且至少要用苯酚-氯仿进行一次抽提，再用乙醇沉淀。100～10000 碱基的模板链均可被有效地标记，但大于10000 碱基的模板链则需要在标记前作限制酶切消化。处理好的模板加入随机引物，按碱基互补原则，随机引物与模板DNA 退火后由Klenow 片段从引物3' 端延伸引物，便可将DIG-11-dUTP 均匀掺入到新合成的DNA 链中。
核酸检测技术及其在国内外血液筛检中的应用
核酸检测技术及其在国内外血液筛检中的应用 输血相关传染病的预防和控制已经成为全社会关注的焦点,新技术的引进是进一步提高血液安全性的重要一环。本文就病原体核酸检测技术(nucleic acid testing, NAT)及其在国内外血液筛检中的应用情况和结果作一介绍,并对该方法在我国推广和应用的必要性和可行性作初步探讨。 1. NAT在血液筛检中的必要性 酶免检测(EIA)技术已经广泛运用于血液筛检,该方法的灵敏度和特异性也在不断地改进和提高,但每年仍有少数新发输血后肝炎病例报道,如美国无偿献血者每单位供血传播HBV、HCV和HIV 的危险性分别为1∶66000、1∶103000和1∶676000[1]。这些危险的主要原因是: 病毒感染者“窗口期”献血,病毒变异,免疫静默感染(immuno silent infection)以及人工操作错误[2]。所谓“窗口期”,是指从感染病原开始,直至用某种检测方法能够检测到该病原存在为止的这一段时间[3]。血清学抗原、抗体检测的“窗口期”较长, 如HBsAg、抗-HIV、抗-HCV检测的“窗口期”分别为45-56ｄ、22ｄ、72ｄ[4,5],故美国90%以上输血传播HIV和HBV以及75%以上输血传播HCV的危险性来自“窗口期”感染献血[6]。EIA“窗口期”漏检是当前影响血液安全性进一步提高的瓶颈,对于献血者的筛选,单纯抗原或抗体血清学检测不能有效地保障血液安全。 NAT检测是直接检测病原体核酸的一系列技术的总称。其基本步骤包括核酸提取、扩增、和检测。NAT敏感性高,可检出标本中极微量的核酸,在病毒感染后数天即能检出,可大大缩短“窗口期”。初步研究表明,混合血样NAT检测可将HBV、HCV和HIV感染的平均“窗口期”缩短9d(缩短“窗口期”20%)、59d(82%)和11d(50%)[5,7];此外NAT还可以检出因上述其它3种原因而漏检的被感染献血。如法国应用NAT,从大约150万份献血中筛检出4份HCV RNA阳性、抗体阴性的样本,其中1份即为免疫静默感染[8]。尽管NAT从理论上并不能完全消除感染“窗口期”,但病毒核酸转阳之前的血液传染性极低,可以有效地预防经输血传播病毒性疾病[9]。因此,NAT的引入可使输血传播疾病的危险性降到最低[10]。 2. NAT检测的技术方法 1985年具有划时代意义的聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)的发明,标志着NAT 的诞生。随后,在PCR的基础上,派生出许多其它原理的体外NAT方法[11]。这些技术灵敏度和特异性或高或低,操作或简单或复杂,适合在各自不同的领域运用，目前适用于大样本量血液筛查并能满足高灵敏度要求的扩证扩增技术主要为PCR技术和TMA技术。 2.1 PCR扩增方法 PCR是一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术,以其高敏感性、高特异性和快速简便等优势得到了广泛的应用。通过简单的技术改进和联合,涌现出了各种各样不同的PCR方法,如检测RNA的逆转录PCR(RT PCR)、敏感性和特异性均较高的巢式PCR (nested PCR)、可对靶序列进行定量检测的定量PCR、检测基因超长分布的多重PCR以及PCR结合酶标技术(PCR ELISA)、PCR结合寡核酸探针杂交技术(PCR SSOP)、荧光PCR和免疫PCR等。 目前在临床检测中使用较多的是荧光定量PCR,主要用于各种传染病的诊断、病毒滴度监测以及疗效评估,因采用荧光标记的探针杂交或直接使用能和双链DNA结合的荧光素检测PCR扩增产物,
核酸探针技术在食品检测中的应用
科目：食品生物技术导论 学院：化学生物与材料科学学院专业：生物技术 班级：090551 学号：09055106 姓名：黄菁
核酸探针技术在食品检测中的应用 摘要：本文对于核酸探针技术进行了一系列的介绍，包括探针种类，标记原理，制备方法以及在食品检测中的应用及发展方向。 关键词：食品检测核酸探针基因工程 The nucleic acid probe of the application of the technique in food testing Abstract: in this paper the nucleic acid probe techniques for a series of introduction, including probe types, mark principle, the preparation methods and application in food testing and development direction. Keywords: food testing nucleic acid probe genetic engineering 正文：一、现代生物技术在食品检验中应用的意义 食品检验检测对于保障食品安全、促进食品生产水平都起着及其重要的作用。长期以来获得广泛应用的物理、化学、仪器等检测方法，由于存在某些局限，已不能满足现代食品检测的需要，随着生物技术的发展，人们已逐步认识到生物技术在食品检验中的重要作用及其意义。 生物技术检测方法以自身独特优势在食品检验中显示出巨大的应用潜力，其应用几乎涉及到了食品检验的各个方面，包括食品的品质评价、质量监督、生产过程的质量监控及食品科学研究。 生物技术检测方法不仅具有特异的生物识别功能、极高的选择性，而且它可与现代的物理化学方法相结合，产生一些简单、结果精确、灵敏、专一、微量和快速、成本低廉的检测方法，因此其在食品检验中占有越来越重要的地位。 二、核酸探针技术 化学及生物学意义上的探针(probe)，是指与特定的靶分子发生特异性相互
常用核酸探针标记方法
常用核酸探针标记方法 1、切口平移法（nick translation） 原理：先用适量的DNase I 在Mg2+存在下，在双链DNA 上打开若干个单链缺口。利用E. coli DNA 聚合酶I 的5'- 3' 核酸外切酶活性在切处将旧链从5’-末端逐步切除。同时DNA 聚合酶I的5'- 3'聚合酶活性的作用下，顺序将dNTP连接到切口的3’-末端-OH上，以互补的DNA 单链为模板合成新的DNA单链。 图1 切口平移法原理示意图 特点：1）各种螺旋状态（超螺旋、闭环及开环）及线性的双链DNA均可作为缺口平移法的标记底物。但单链DNA和RNA不能采用此方法进标记。双链DNA小片段（>100-200bp）也不是此法标记的理想底物。 2）DNA多聚酶必须是E·Coli DNA多聚酶的全酶。 3）DNA模板要用纯化过DNA
2、随机引物法（random priming） 原理：将待标记的DNA探针片段变性后与随机引物一起杂交，然后以此杂交的寡核苷酸为引物，大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（E·Coli DNA polymerase I Klenow Fragment）的催化下，合成与探针DNA互补的DNA链。当反应液中含有标记的dNTP时，即形成标记的探针。 图2 随机引物标记法原理示意图 特点：1）除了能进行双链DNA标记外，也可用于单链DNA和RNA探针的标记。 2）所得到的标记产物是新合成的DNA单链，而所加入的DNA片段本身并不能被标记。 3）新形成的标记DNA单链的长度与加入寡核苷酸引物的量成反比，因为加入的寡核苷酸数量越多，合成起点也越多，得到的片段的长度也越短。按标准方法得到 的标记产物长度一般为200-400bp。
核酸探针技术 - 副本
核酸探针技术原理是碱基配对。互补的两条核酸单链通过退火形成双链，这一过程称为核酸杂交。核酸探针是指带有标记物的已知序列的核酸片段，它能和与其互补的核酸序列杂交，形成双链，所以可用于待测核酸样品中特定基因序列的检测。每一种病原体都具有独特的核酸片段，通过分离和标记这些片段就可制备出探针，用于疾病的诊断等研究。 (一) 核酸探针的种类 1.按来源及性质划分可将核酸探针分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA 探针和人工合成的寡核苷酸探针等几类。 作为诊断试剂，较常使用的是基因组DNA探针和cDNA探针。其中，前者应用最为广泛，它的制备可通过酶切或聚合酶链反应(PCR)从基因组中获得特异的DNA后将其克隆到质粒或噬菌体载体中，随着质粒的复制或噬菌体的增殖而获得大量高纯度的DNA探针。将RNA进行反转录，所获得的产物即为cDNA。cDNA探针适用于RNA病毒的检测。cDNA探针序列也可克隆到质粒或噬菌体中，以便大量制备。 将信息RNA(mRNA)标记也可作为核酸分子杂交的探针。但由于来源极不方便，且RNA极易被环境中大量存在的核酸酶所降解，操作不便，因此应用较少。 用人工合成的寡聚核苷酸片段做为核酸杂交探针应用十分广泛，可根据需要随心所欲合成相应的序列，可合成仅有几十个bp的探针序列，对于检测点突变和小段碱基的缺失或插入尤为适用 2.按标记物划分有放射性标记探针和非放射性标记探针两大类。放射性标记探针用放射性同位素做为标记物。放射性同位素是最早使用，也是目前应用最广泛的探针标记物。常用的同位素有32P、3H、35S。其中，以32P应用最普遍。放射性标记的优点是灵敏度高，可以检测到Pg级；缺点是易造成放射性污染，同位素半衰期短、不稳定、成本高等。因此，放射性标记的探针不能实现商品化。目前，许多实验室都致力于发展非放射性标记的探针。 目前应用较多的非放射性标记物是生物素(Biotin)和地高辛(digoxigenin)。二者都是半抗原。生物素是一种小分子水溶性维生素，对亲和素有独特的亲和力，两者能形成稳定的复合物，通过连接在亲和素或抗生物素蛋白上的显色物质(如酶、荧光素等)进行检测。地高辛是一种类固醇半抗原分子，可利用其抗体进行免疫检测，原理类似于生物素的检测。地高辛标记核酸探针的检测灵敏度可与放射性同位素标记的相当，而特异性优于生物素标记，其应用日趋广泛。 (二) 核酸探针的标记 1.放射性同位素标记法常将放射性同位素如32 P连接到某种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)上做为标记物，然后通过切口平移法标记探针。 切口平移法(nick translation)是利用大肠杆菌DNA聚合酶I (E.coli DNA polymerase I) 的多种酶促活性将标记的dNTP掺入到新形成的DNA链中去，形成均匀标记的高比活DNA探针。其操作方法如下： (1) 取1?g DNA溶于少量无菌双蒸水中，加入5?l距离大约10×切口平移缓冲液( 0.5mol/L Tris－HCl，PH7.2；0.1 mol/L MgSO4 ；1mmol/L二硫苏糖醇；500?g/mL 牛血清白蛋白)，加入除标记物(如?-32 p-dATP)外的其它三种dNTP(如dCTP，dGTP，dTTP)溶液，20mmol/L溶液各1?l。 (2) 加入100?ci(10?l)标记物溶液，加入无菌双蒸水至终体积为46.5?l,混匀，加入0.5?l稀释的DNaseI溶液，混匀；加入1?l(约5单位)E.coli DNA polymerase I，混
核酸探针技术在病原微生物检测中的
简述核酸探针技术及其在微生物检测中的应用 核酸探针技术及在病原细菌检测中的应用 随着分子生物学和分子化学的飞速发展，对病原微生物的鉴定已不再局限于对它的外部形态结构及生理特性等一般检验上，而是从分子生物学水平上研究生物大分子，特别是核酸结构及其组成部分。在此基础上建立的众多检测技术中，核酸探针（Nuclear acid probe）以其敏感、特异、简便、快速的特点成为世人瞩目的生物技术革命的新产物，已逐步应用于病原微生物的检测。 核酸探针是将已知核苷酸序列DNA片段用同位素或其他方法标记，加入已变性的被检DNA中，在一定条件下即可与该样品中有同源序列的DNA区段形成杂交双链，从而达到鉴定样品中DNA的目的，这种能认识到特异性核苷酸序列有标记的单链DNA分子就称为核酸探针或基因探针。根据核酸探针中核苷酸成分的不同，可将其分为DNA探针或RNA 探针，一般大多选用DNA探针；根据选用基因的不同分为两种，一种探针能同微生物中全部DNA分子中的一部分发生反应，它对某些菌属、菌种、菌株有特异性，另一种探针只能限制性同微生物中某一基因组DNA发生杂交反应，如编码致病性的基因组，它对某种微生物中的一种菌株或仅对微生物中某一菌属有特异性。这类探针检测的基因相当保守，包括大部分rRNA，因为他既可能在一种微生物中出现，又可代表一群微生物。如应用rRNA探针检测作为筛选食品污染程度的指示菌E.Coli。选择探针的原则是只能同检测的细菌发生杂交反应，而不受非检菌存在的干扰。 1 核酸探针的特点： 1.1探针的特异性核酸探针检测技术的最大特点是特异性，就是说一个适当组建的DNA探针能绝对特异性地与所检微生物而不与其他微生物发生反应。对食品检测而言，就是不与样品中内源性杂菌和样品自身DNA发生非特异性反应。以往检测方法检测的是基因的表达产物（蛋白质或其他产物）。检测这种物质受多种因素影响。比如食品中微生物因受应激损伤（高温、冷冻、化学制剂等）会导致基因组的变化，从而引起其表达产物的变化。而核酸探针检测的基因本身，它能识别基因本身的变异，不受基因表达产物的影响。常规免疫学方法检测抗原、抗体，他们都是蛋白质，这些蛋白质由氨基酸组成，而氨基酸由核苷酸序列确定，一旦这种序列受外界影响发生变异，就会导致其产物的变化，影响抗原抗体间的反应，使检测特异性下降。检测病毒主要通过组织培养后，检测病毒相关的蛋白质囊膜，即使采用超低温保存，有时也会引起编码蛋白质囊膜基因的变化，而采取DNA探针检测病毒则不用改变其蛋白质结构，而只需检测是否有相应特异性的编码蛋白质囊膜的病毒靶DNA 序列。另外，核酸之间的识别连接比抗原抗体准确，并且探针检测比免疫学方法灵活。尽管看来形成抗原抗体复合物比核酸杂交快，但能通过加磺化葡聚糖把退火速度增加100倍，从而提高反应速度，核酸比蛋白质耐受高温（100℃）、有机溶剂、螯合剂和高浓度工作液的破坏作用，所以用比提取蛋白质强烈的多的方法制备核酸，不会影响杂交反应。当然RNA探针除外，因为RNA不耐受碱处理，需用其它方法制备检测用RNA。核酸探针的特异性取决于探针的碱基序列和使用条件，如在不严格条件下（低温高盐）探针与靶DNA误交结合力比严格条件下稳定。探针长度也会影响反应的特异性，一般加Formamide增加反应特异性。 1.2 探针的敏感性研制核酸探针是为了检测出单个病毒和细菌。DNA探针敏感性取决于探针本身和标记系统。32P标记物通常可检出10－8摩尔特异DNA片段，相当于0.5pg，1000个碱基对的靶系列，相当于1000－10000个细菌。用亲和素标记探针检测1小时培养物DNA含量在110pg，两者敏感性大致相同，而血清学方法只能达到1ng的水平。延长培
第6章 核酸分子探针
第六章 基于分子工程的核酸分子探针
生命的本质是一系列可自主调控的化学、物理过程，但主角不是简单的化合物而是复杂的生物大分子。核酸与蛋白质是生命发生、发展和繁衍中最重要的两类物质，正是它们之间复杂、精巧而协调的相互作用演绎出神奇、千变万化、令人叹为观止的生命现象。 因此，在分子水平上研究核酸、蛋白质等生物大分子及其相互作用是我们深入理解生命现象、揭示生命奥秘最为关键的内容之一。
红细胞:6,000-9, 000nm 白细胞:10,000nm 一般细菌: 1,000 –10,000 nm 一般病毒:75 –100 nm 蛋白质5 –50 nm DNA (双链宽) 2 nm 研究人员需要一些合适的分析工具和手段，在分子水平上，最好是在活体内，将生物分子的成分、结构、相互作用等信息转变为易于检测的光、电信号变化，非常灵敏、准确地反映出来。
以体系的功能为导向，在分子水平上设计所需结构，并定向合成功能分子，是分子工程的重要特征。通过在分子水平上研究生物分子间的相互作用，设计、合成和筛选具有特定功能的分子探针并发展其生物医学应用，是分子工程的前沿研究领域之一。 核酸分子探针是一种重要的分子生物学研究手段。它非常巧妙地利用了核酸的结构及其识别能力上的特点，例如核酸的杂交、立体构象转变、与蛋白质、寡聚高分子甚至金属离子的特异性结合等，结合分子水平的信号传导机制，将相关的生命信息转变为易于检测的信号，例如拉曼、荧光、化学发光、电流、放射性等。随着其他相关学科如化学、材料科学的发展，核酸分子探针的合成、标记和检测技术取得了长足的进展，已经能在单个活细胞，甚至单分子水平上观测分子的行为。与荧光蛋白技术相比，核酸分子探针一般不需要对目标细胞预先进行基因操作，不仅更能反映生命活动的真实状况，而且也便于直接研究临床样品。
核酸探针技术及应用
核酸探针技术及应用 基因检测技术的发展，使对某些疾病的诊断达到了特异性强、敏感性高及简便快速的目的。近年来各种血清学方法发展很快，但血清学方法主要是测抗体，是间接的证据随着分子生物学的发展，应用DNA—DNA杂交建立了核酸探针(Probe)技术，该技术是目前基因检测最常用的方法，目前已成为诊断各种感染性疾病，恶性肿瘤，遗传病，检测抗生紊的耐药性，法医学鉴定及从分子水平上研究发病机制与流行病学规律等方面的一种重要手段。本文主要介绍了核酸探针技术的原理，核酸分子杂交方法及核酸探针的应用等方面。 一、核酸探针技术的原理 DNA 或RNA 片段能识别特定序列基因的DNA 片段，能与互补的核苷酸序列特异结合，这种用同位素非同位素标记的单链DNA片段即为核酸探针。 核酸探针技术是将双链DNA 经加热或硷处理，使硷基对间的氢链被破坏而变性，解开成两条互补的单链。它们在一定温度和中性盐溶液条件下，又可按A—T，G—C碱基配对的原则重新组合成双链为复性。这种重组合只是在两股DNA是互补(同源)或部分互补(部分同源)的条件下才能实现。正是由于双链DNA的这种可解离与重组合的性质，才可用一条已知的单链DNA，用放射性同位素或其他方法标记后制备成核酸探针，与另一条固定在硝酸纤维素滤膜上的变性单链DNA进行杂交，(另一条DNA链与核酸探针是配对碱基，称为靶)再用放射自显影或其他显色技术检测，以确定有无与探针DNA (或RNA)同源或部分同源的DNA(或RNA)存在。因为探针只与靶病原体的DNA或RNA杂交，而不与标本中存在的其他DNA 或RNA 杂交。 二、核酸探针技术的基本方法 被检标本用去污剂和酶分解以去除非DNA成分或直接提取DNA，用各种方法处理DNA使其变性，把DNA双螺旋的两条链分开，单链DNA结合于固态基质上，(如滤膜)使其固定。再加上已制备好的探针进行杂交，探针便可找出已固定的DNA中的互补序列，与之配对结合，然后洗掉未结合部分，由于探针已将放射性同位素掺入，再用x射线敏感的胶片自显影，见黑色影印者即为阳性。探针亦可用3H标记，最后用液闪计数器计致。还可用生物素，抗生物素等标记，最后用酶标法显色，均能得到满意效果。 1 核酸探针的制备 核酸探针可分为DNA探针、CDNA探针、RNA探针和寡糖核苷酸探针，因其种类不同制备方法也不同。 1．1 DNA探针 DNA探针可分为基因探针和基因片段探针。全基因组基因探针的制备最简单，只要将染色体DNA分离纯化，然后进行标记即可。基因片段探针则需要将染色体DNA用限制性内切酶酶解，得到许多随机片段，然后与质粒重组，转化大肠杆菌(E·coli)，筛选含特异目的基因片段的克隆株进行扩增，再提取基因片段作探针。 1．2 CDNA探针 通过提取纯度较高的相应mRNA或正链RNA病毒的RNA，反转录成CDNA作为探针。也可以进一步克隆在大肠杆菌中进行无性繁殖，再从重组质粒中提取CDNA作探针。 1．3 RNA探针 有些双链RNA病毒的基因组在标记后，可直接用作探针。另一种是从CDNA 衍生而来的
寡核酸探针
寡核酸探针 一般情况下，只要有克隆的探针，就不用寡核苷酸探针。在DNA序列未知而必须首先进行克隆以便绘制酶谱和测序时，也常应用克隆。克隆探针一般较寡核苷酸探针特异性强，复杂度也高，从统计学角度而言，较长的序列随机碰撞互补序列的机会较短序列少，克隆探针的另一优点是，可获得较强的杂交信号，因为克隆探针较寡核苷酸探针掺入的可检测标记基因更多。但是，较长的探针对于靶序列变异的识别能力又有所降低。对于仅是单个碱基或少数碱基不同的两序列，克隆探针不能区分，往往杂交信号相当。这既是其优点，又是其缺点。优点是当用于检测病原微生物时，不会因病毒或细菌DNA的少许变异而漏诊，缺点则是不能用于点突变的检测。这种情况下，通常要采用化学合成的寡核苷酸探针。 合成的寡核苷酸探针具有一些独特的优点：①由于链短，其序列复杂度低，分子量小，所以和等量靶位点完全杂交的时间比克隆探针短，如20nt的寡核苷酸探针在浓度为 100ng/ml，靶序列为1～100pg、1kb片段或3×10-18~3×10-16mol/L时，达到最大程度的杂交只需10min，而用2kb的克隆探针在同样条件下达到完全杂交则需16h。②寡核苷酸探针可识别靶序列内1个碱基的变化，因为短探针中碱基的错配能大幅度地降低杂交体的Tm 值。③一次可大量合成寡核苷酸探针（1～10mg），使得这种探针价格低廉，与克隆探针一样，寡核苷酸探针能够用酶学或化学方法修饰以进行非放射性标记物的标记。尽管克隆探针较特异，但通过细心筛选序列和/或选择相对长的序列（＞30nt）亦可设计出非常特异的寡核苷酸探针。最常用的寡核苷酸探针有18～40个碱基，目前的合成仪可有效地合成至少50个碱基的探针。下面是筛选寡核苷酸针的一些原则。 ①长18～50nt，较长探针杂交时间较长，合成量低；较短探针特异性会差些。 ②碱基成分：G+C含量为40%～60%，超出此范围则会增加非特异杂交。 ③探针分子内不应存在互补区，否则会出现抑制探针杂交的“发夹”状结构。 ④避免单一碱基的重复出现（不能多于4个），如-CCCCC-。 ⑤一旦选定某一序更符合上述标准，最好将序列与核酸库中核酸序列比较，探针序列应与含靶序列的核酸杂交，而与非靶区域的同源性不能超过70%或有连续8个或更多的碱基的同源，否则，该探针不能用。 按上述原则选出的探针会增加成功的机会，选定后进行合成与标记，并摸索合适的杂交条件。方法是制备几张点有特异靶DNA和不相关DNA的膜，各膜分别在不同温度下与探针杂交，特异靶DNA杂交信号强而非特异DNA不产生任何杂交反应的就是最适杂交温度。在进行点突变检测杂交的反应时，洗膜条件和温度物选择往往更为重要。所选漂洗条件必需使野生型靶DNA与探针产生强的杂交信号而突变型靶DNA则不产生杂交信号，这可以通过逐渐提高洗膜温度来完成。 寡核苷酸探针还有一个重要用途。在用于检测单个碱基差异时尚可采用一种称为寡核苷酸限制（oligonucleotide restriction）的技术。该技术只有在突变点位于某一限制性内切酶识别位点时才有效。例如，镰刀状红细胞贫血是因β珠蛋白基因的第6个寡码子由GAG 变成GTG，从而导致所编码氨基酸由酪氨酸变成缬氨酸。突变的β-珠蛋白功能异常，称作
核酸探针技术
核酸探针技术 化学及生物学意义上的探针(probe)，是指与特定的靶分子发生特异性相互作用，并可被特殊的方法探知的分子。抗体-抗原、生物素-抗生物素蛋白、生长因子-受体的相互作用都可以看作是探针与靶分子的相互作用。 核酸探针技术原理是碱基配对。互补的两条核酸单链通过退火形成双链，这一过程称为核酸杂交。核酸探针是指带有标记物的已知序列的核酸片段，它能和与其互补的核酸序列杂交，形成双链，所以可用于待测核酸样品中特定基因序列的检测。每一种病原体都具有独特的核酸片段，通过分离和标记这些片段就可制备出探针，用于疾病的诊断等研究。 (一) 核酸探针的种类 1.按来源及性质划分可将核酸探针分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA 探针和人工合成的寡核苷酸探针等几类。 作为诊断试剂，较常使用的是基因组DNA探针和cDNA探针。其中，前者应用最为广泛，它的制备可通过酶切或聚合酶链反应(PCR)从基因组中获得特异的DNA后将其克隆到质粒或噬菌体载体中，随着质粒的复制或噬菌体的增殖而获得大量高纯度的DNA探针。将RNA进行反转录，所获得的产物即为cDNA。cDNA探针适用于RNA病毒的检测。cDNA探针序列也可克隆到质粒或噬菌体中，以便大量制备。 将信息RNA(mRNA)标记也可作为核酸分子杂交的探针。但由于来源极不方便，且RNA极易被环境中大量存在的核酸酶所降解，操作不便，因此应用较少。 用人工合成的寡聚核苷酸片段做为核酸杂交探针应用十分广泛，可根据需要随心所欲合成相应的序列，可合成仅有几十个bp的探针序列，对于检测点突变和小段碱基的缺失或插入尤为适用 2.按标记物划分有放射性标记探针和非放射性标记探针两大类。放射性标记探针用放射性同位素做为标记物。放射性同位素是最早使用，也是目前应用最广泛的探针标记物。常用的同位素有32P、3H、35S。其中，以32P应用最普遍。放射性标记的优点是灵敏度高，可以检测到Pg级；缺点是易造成放射性污染，同位素半衰期短、不稳定、成本高等。因此，放射性标记的探针不能实现商品化。目前，许多实验室都致力于发展非放射性标记的探针。 目前应用较多的非放射性标记物是生物素(Biotin)和地高辛(digoxigenin)。二者都是半抗原。生物素是一种小分子水溶性维生素，对亲和素有独特的亲和力，两者能形成稳定的复合物，通过连接在亲和素或抗生物素蛋白上的显色物质(如酶、荧光素等)进行检测。地高辛是一种类固醇半抗原分子，可利用其抗体进行免疫检测，原理类似于生物素的检测。地高辛标记核酸探针的检测灵敏度可与放射性
核酸杂交检测技术
核酸杂交检测技术 核酸杂交技术是分子生物学的基本技术之一,近年来正逐渐用于病毒病的特异、敏感和快速诊断。杂交的基本原理是碱基互补的二条单链核酸退火形成双链。用于诊断目的的杂交双方是已知序列的病毒探针和待测样品中的病毒核酸,杂交后通过特定方法检测。如有杂交信号, 则说明样品中存在病毒核酸,进而证明病毒感染的存在。待测的病毒核酸可以从病料中提取,也可以从纯化的病毒粒子提取。提取后可在膜上与探针杂交(固相杂交)。或直接在试管的杂交液中杂交(液相杂交),此外, 也可直接在组织切片或细胞涂片上对细胞中的病毒核酸进行杂交(原位杂交)。下面重点介绍如何建立杂交体系及适用于病毒诊断的几种杂交方法。(一) 建立杂交体系核酸杂交是多种环境因素与二条互补核酸链综合作用的结果,它有较高的技术要求。了解各种组份及反应条件对杂交的影响是建立杂交体系,获得理想结果的基础。1、温度杂交反应中,双链核酸的变性与复性主要是温度控制的。选择适当的杂交和洗膜温度是实验成败最关键的因素之一。杂交反应通常在低于解链温度(T m值)15～25℃的条件下进行。T m值受核酸链组成 (G+C) 、溶液的离子强度、pH值及反应体系是否含变性剂等的影响。在杂交体系不含变性剂的情况下,DNA 之间的杂交反应通常在68℃进行,当含50%变性剂甲酰胺, 则在42℃进行。2、pH值杂交体系的pH在5～9的范围内对复性无明显影响。杂交反应通常在pH6 5 ～ 75之间进行。较高的pH值产生更严格的杂交条件。 3、盐离子浓度体系中往往加入单价离子的盐,因为单价阳离子与核酸链上的磷酸基团发生静电反应,所以能降低核酸链之间的静电排斥,维持双链DNA的稳定性。盐浓度增加,稳定性提高。杂交体系中通常采用6倍SSC(1倍SSC为015 mol/L NaCl和0015mol/L柠檬酸钠，pH70)缓冲液。 4、变性剂杂交体系中加入变性剂可降低T m值,所以杂交可在更低的温度下进行。常用变性剂是甲酰胺。 5、DNA浓度浓度愈高,复性速度愈快。所以杂交反应中应加入足够的探针,还应尽量减少杂交体积,一般每百cm2滤膜用25ml杂交液。 6、探针长度溶液中DNA复性率与片段长度的平方根成正比。所以用长的探针可获得高的复性率。但原位杂交通常用较短的探针,以减少探针进入细胞并扩散到靶核酸的阻力。 7、硫酸葡聚糖在水溶液中,此化合物表面可吸附DNA 探针分子,从而浓缩探针,促进二条核酸链间的缔合。其10%的浓度可提高杂交速度10～100倍。使用硫酸葡聚糖可能导致背景加深,所以一般在探针浓度过低的情况下才使用。 8、杂交时间它受探针的长度与浓度、反应体积等因素的影响,较短的探针、较高的探针浓度和较小的杂交体积,需要较短的杂交时间。一般来说,杂交时间通常在2～16小时。 9、预杂交在杂交前进行预杂交,封闭非特异的DNA结合位点,降低非特异杂交,是杂交的
基于CRISPR的核酸检测技术SHERLOCK
基于CRISPR的核酸检测技术——SHERLOCK CRISPR/Cas技术以出众的基因编辑能力闻名于世，但显然这技术应用范围绝不仅限于基因编辑。CRISPR/Cas技术的大牛Jennifer Doudna教授早在2016年就将该技术应用于RNA检测，只是由于灵敏度太低而缺乏应用价值。随后张锋利用Cas13蛋白的天然RNase活性将其改进，使之有了实际应用价值，并将其取名为SHERLOCK（Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing），并且开发了升级版的SHERLOCK v2。后来Jennifer Doudna的实验室利用Cas12a的非特异性ssDNA降解能力开发出另一种称为DETECTR的方法。 SHERLOCK的原理 SHERLOCK的核心是一种叫做Cas13的CRISPR相关蛋白。Cas13包含四个不同的家族成员（Cas13a-d），是一种RNA引导的RNase，靶向RNA的单链区域，在具有特定碱基的靶RNA区域产生多个切割位点。Cas13表现出靶依赖性的混杂RNA酶活性，导致旁观RNA分子的反式切割，这种效应被称为“collateral activity （附带活性）”。研究人员利用这一“脱靶缺陷”，加入一种可淬灭的荧光RNA，当荧光RNA被切开时，会发出荧光信号而显示检测结果。最近发现其它类型CRISPR-Cas系统的Cas酶也显示collateral activity ，如Cas12的亚家族。尽管Cas13具有称为原间隔物侧翼位点（PFS）的PAM样序列基序，仅对某些目标位点有活性，但是许多非常活跃的Cas13直系同源物，例如LwaCas13a，不显示PFS。