几种荧光猝灭的方式
浓度猝灭
浓度猝灭concentration quenching
当激活剂浓度较大时，中心间的距离小于临界距离，它们就会产生级联能量传递，即从一个中心传递到下一个中心，再到下一个中心......（发生能量迁移）直到最后进入一个猝灭中心，导致发光的猝灭，我们把这种猝灭叫做浓度猝灭。
何为猝灭?
由于某些原因使发光材料发生非辐射跃迁，从而降低了发光效率的现象叫做猝灭，猝灭的原因可以各不相同，常见的有温度猝灭，浓度猝灭和杂质猝灭等。
物理机制包括合作上转化（cooperative up-conversion）、交叉驰豫（cross-relaxation）以及能级转化(energy transfer)等。
温度猝灭
温度猝灭 Temperature quenching
温度猝灭也称为热猝灭是指对于各种发光材料，随着温度的上升，其发光强度下降，发射光谱红移。
发光材料发生热猝灭的可能有多种原因, 但起主要作用的一般是两个方面:一是由于温度的升高, 晶格振动加剧, 从而使发光中心的晶格弛豫增强, 无辐射跃迁几率增大, 发光效率降低, 这是人们通常所说的) 温度特性; 二是由于温度升高, 使发光中心的状态或周围的微环境发生某种本质性变化, 从而降低了发光效率, 即人们通常所说的“热稳定性”。
目前，各种商品荧光粉使用在荧光灯上由于长时间照射温度升高，发生温度猝灭，使其荧光性能越来越低，这就是为什么荧光灯用久之后会变暗的原因。
几种常见荧光素极其特性介绍
几种常见荧光素极其特性介绍 荧光素（英语：Fluorescein，又称为荧光黄）是一种合成有机化合物，它是具有光致荧光特性的染料，外观为暗橙色/红色粉末，可溶于乙醇，微溶于水，在蓝光或紫外线照射下，发出绿色荧光。荧光染料种类很多，目前常用于标记抗体的荧光素有以下几种：异硫氰酸荧光素，四乙基罗丹明，四甲基异硫氰酸罗丹明，酶作用后产生荧光的物质。目前荧光素广发应用在免疫荧光、免疫荧光染色实验中。 下面介绍几种常用荧光素及其基本生物学特性： 1、异硫氰酸荧光素，简称“FITC”。是一种小分子荧光素，其效率取决于于溶液的pH 值，因此，在使用FITC时应注意溶液的酸碱度。FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。 FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。 2、藻红蛋白，简称“PE”。相对分子质量较大，约为240kD，最大吸收峰为564nm，当使用488nm激光激发时其发射荧光峰值约为576nm，故可能会对其它大探针产生空间位阻。 但PE的化学结构非常稳定，有很高的荧光效率，并易与抗体分子结合。需要注意的是PE作为天然染料，因来源不同可能造成荧光素结构上的微小差别，导致其特征的不一致。 3、PI和EB。两者都具有嵌入到双链DNA和RNA的碱基对中并与碱基对结合的特异性。为了获得特异的DNA分布，染色前必须用RNA酶处理细胞，排除双链RNA的干扰。 PI和EB不能进入完整的细胞膜，因此，又可以用于检测死活细胞。PI和EB各种理化性质相似，但PI比EB的发射光光谱峰向长波方向移动，因而在做DNA和蛋白质双参数测量时，PI的红色荧光和FITC的绿色荧光更易于区分和测量。另外，PI比EB测得的DNA 分布的变异系统（CV值）低，所以PI得到更广泛的应用。
荧光探针设计原理
荧光化学传感器是建立在光谱化学和化学波导与量测技术基础上的将分析对象的化学信息以荧光信号表达的传感装置。其主要组成部件有三个(图 1.1)：1．识别结合基团(R),能选择性地与被分析物结合,并使传感器所处的化学环境发生改变。这种结合可以通过配位键，氢键等作用实现。２．信号报告基团(发色团, F），把识别基团与被分析物结合引起的化学环境变化转变为容易观察到的输出信号。信号报告基团起到了信息传输的作用，它把分子水平上发生的化学信息转换成能够为人感知(颜色变化)或仪器检测的信号（荧光等)。3.连接基团(S),将信号报告基团和识别结合基团连接起来,根据设计的不同连接基团可有多种选择，一般用做连接基团的是亚甲基等短链烷基。连接基团的合适与否将直接影响是否有输出信号的产生。信号表达可以是荧光的增强或减弱、光谱的移动、荧光寿命的变化等。 图1．1 荧光探针的结构 1.1.1 荧光探针的一般设计原理 (1) 结合型荧光探针[２1］ +
Analyte Signalling subunit Space Binding subunit Output signal 图1．２ 共价连接型荧光探针 结合型荧光探针是利用化学共价键将识别基团和荧光基团连接起来的一类荧光探针,是比较常见的一类荧光探针。该类探针通过对比加入分析物前后荧光强度的变化、光谱位置的移动或荧光寿命的改变等实现对分析物的检测。在该类荧光化学传感器的设计中,必须充分考虑下列三个方面的因素。(ａ） 受体分子的荧光基团设计、合成:考虑到用于复杂环境体系的荧光检测，要求荧光基团要有强的荧光（高荧光量子产率，有利于提高检测的灵敏性）,Ｓｔｏｋｅs 位移要大（可有效消除常规荧光化合物如荧光素等具有的自猝灭现象)，荧光发射最好要在长波长区(最好位于5０0 nm 以上，可避免复杂体系的常位于短波长区的背景荧光的干扰,另外由于长波长区发射的荧光能量的降低可减少荧光漂白现象的发生而延长传感器的使用寿命）。(b) 受体分子的识别基团：受体分子的识别基团设计以软硬酸碱理论、配位作用以及超分子作用力(如氢键、范德华力等）作为理论指导,多选择含氮、硫、磷杂环化合物作为识别分子。(ｃ) 荧光超分子受体的组装:组装荧光超分子受体就是利用一个连接基将识别基团和荧光基团通过共价键连接在一起,要充分考虑到识别基团和荧光
卤代烃对_唑化合物荧光猝灭机理_张文勤
卤代烃对 唑化合物荧光猝灭机理* 张文勤** 霍明亮 齐翠娥 (化学系) 摘要 测试了1×10-5mo l /L 5,5’-二苯基-2,2’-联唑(POO P )、反-1,2-双[2-(5-苯基唑 基)]乙烯(PO EO P )、4,4’-双[2-(5-苯基 唑基)]-1,1’-联苯(POBO P )在含不同浓度卤代烃的1, 4-二氧六环溶液中的荧光量子产率,讨论了荧光猝灭机理,计算出CH 3I 、Ph I 、PhBr 对PO EO P 、PO O P 、PO BO P 的荧光猝灭速率常数.研究发现,卤代烃分子越小,卤原子核电荷数越高,其猝灭荧光能力越强.关键词:荧光量子产率,唑化合物,荧光猝灭,重原子效应 分类号:O 644.1 STUDY ON THE MECHANISM OF FLUORESCENCE QUENCHI NG OF HALOHYDROCARBONS ON OXAZOLES Zhang Wenqin Huo Mingliang Qi C uie (Dept.of Chemist ry Tianjin U niv er sity ) Abstract The fluo resce nce quantum yields o f 5,5’-diphenyl-2,2’-biso x azo le (PO O P),tra ns -1,2-bis [2-(5-phenylox azolyl )]e th ene (PO EO P )a nd 4,4’-bis [2-(5-phenylox azolyl )]-1,1’-bipheny l (PO BO P)w er e dete rmined in 1,4-dio xa ne co ntaining halohy droca rbons.The fluo res-cence quenching mechanism w as discussed.T he fluo rescence quenching ra te co nsta nts o f these ha loh ydro ca rbons w ere calculated .It was found that the halohydr ocar bo n mo lecule with small v ol-ume a nd la rg e ha lo -ato mic num ber has a high fluor escence quenching ability. Key words :fluo rescence quantum yield,ox azo les,fluo rescence quenching ,heavy -a tom effect 高核电荷数原子(重原子)无论作为荧光分子的取代基还是溶剂分子的取代基,都可通过其自旋-轨道耦合作用显著增加荧光分子单重态—→三重态的系间窜跃速率,使荧光减弱或消失.对于重原子溶剂,当处于激发态的荧光分子和溶剂分子发生碰撞时,重原子的P 轨道通过自旋-轨道耦合作用对荧光分子的π轨道产生微扰,打破了不同多重态间跃迁禁阻的 1996年7月Jul.1996 天 津 大 学 学 报JOURNAL OF TIANJIN UNIVERSITY 第29卷 第4期 V o l.29 N o.4 本文1994年8月16日收到.1995年5月16日收到修改稿. * 天津大学青年人才启动基金资助项目. ** 1964年生,男,博士,副教授.Born in 1964,m ale ,Dr .,as sociate prof .
不同标记荧光基团的稳定性、半衰期介绍说明
Please refer to STYLE GUIDE.doc for detailed guidelines Color code legene: Red = Proprietary; Pink = Discontinuation; Green = Anecdotal; Blue = Anything else customers will not see Custom Primers – All Modifications TABLE OF CONTENTS PRODUCT DESCRIPTION SHIPPING CONDITIONS STORAGE CONDITIONS STABILITY QC SPECIFICATIONS PROTOCOL & APPLICATION NOTES Modification/scale/purification Manufacturing Details Fluorescein Rhodamine HEX/TET/FAM Phosphate Biotin Amine Gateway Alexa Other dyes Alkaline Phosphatase Horse Radish Peroxidase Phosphorothioate “Fully-Phosphorothioated" Custom Primers Aldehyde Acridine Thiol Delivery Schedule OligoPerfect Designed Primers 3' Modifications of Oligos Reconstitution Protocol A260/A280 ratio of the oligo Oligo Visualization Troubleshooting “Custom Custom” modifications List of current technology limitations COMPETITOR INFORMATION ALTERNATE PRODUCTS & COMPATIBILITY PRODUCT DOCUMENTATION REFERENCES PRODUCT NAME & CATALOG NUMBER COMPONENTS DISCONTINUATION NOTICE ASSOCIATED PRODUCTS PRODUCT QUALITY ISSUES Returning Primers LICENSING INTERNAL CONTACTS
常见有机物及基团的缩写
% %de 非对映体过量百分比（不对称合成术语） %ee 对映体过量百分比（不对称合成术语） A A/MMA 丙烯腈/甲基丙烯酸甲酯共聚物 AA 丙烯酸 AAS 丙烯酸酯-丙烯酸酯-苯乙烯共聚物 ABFN 偶氮（二）甲酰胺 ABN 偶氮（二）异丁腈 ABPS 壬基苯氧基丙烷磺酸钠 Ac 乙酰基 acac 乙酰丙酮基 AIBN 2,2'-二偶氮异丁腈 aq. 水溶液 B BAA 正丁醛苯胺缩合物 BAC 碱式氯化铝 BACN 新型阻燃剂 BAD 双水杨酸双酚A酯 BAL 2，3-巯（基）丙醇 9-BBN 9-硼二环[3.3.1]壬烷 BBP 邻苯二甲酸丁苄酯 BBS N-叔丁基-乙-苯并噻唑次磺酰胺 BC 叶酸 BCD β－环糊精 BCG 苯顺二醇 BCNU 氯化亚硝脲 BD 丁二烯 BE 丙烯酸乳胶外墙涂料 BEE 苯偶姻乙醚 BFRM 硼纤维增强塑料 BG 丁二醇 BGE 反应性稀释剂 BHA 特丁基-4羟基茴香醚 BHT 二丁基羟基甲苯 BINAP （2R,3S）-2.2'-二苯膦－1.1'-联萘，亦简称为联二萘磷，BINAP是日本名古屋大学的Noyori（2001年诺贝尔奖）发展的一类不对称合成催化剂 BL 丁内酯 BLE 丙酮-二苯胺高温缩合物 BLP 粉末涂料流平剂 BMA 甲基丙烯酸丁酯 BMC 团状模塑料 BMU 氨基树脂皮革鞣剂 BN 氮化硼
Bn 苄基 BNE 新型环氧树脂 BNS β－萘磺酸甲醛低缩合物 BOA 己二酸辛苄酯 BOC 叔丁氧羰基（常用于氨基酸氨基的保护）BOP 邻苯二甲酰丁辛酯 BOPP 双轴向聚丙烯 BP 苯甲醇 BPA 双酚A BPBG 邻苯二甲酸丁（乙醇酸乙酯）酯 BPF 双酚F BPMC 2-仲丁基苯基-N-甲基氨基酸酯 BPO 过氧化苯甲酰 BPP 过氧化特戊酸特丁酯 BPPD 过氧化二碳酸二苯氧化酯 BPS 4，4’-硫代双（6-特丁基-3-甲基苯酚）BPTP 聚对苯二甲酸丁二醇酯 Bpy 2,2'-联吡啶 BR 丁二烯橡胶 BRN 青红光硫化黑 BROC 二溴（代）甲酚环氧丙基醚 BS 丁二烯-苯乙烯共聚物 BS-1S 新型密封胶 BSH 苯磺酰肼 BSU N，N’-双（三甲基硅烷）脲 BT 聚丁烯-1热塑性塑料 BTA 苯并三唑 BTX 苯-甲苯-二甲苯混合物 Bu 正丁基 BX 渗透剂 BXA 己二酸二丁基二甘酯 BZ 二正丁基二硫代氨基甲酸锌 Bz 苯甲酰基 C c- 环－ CA 醋酸纤维素 CAB 醋酸-丁酸纤维素 CAM 甲基碳酰胺 CAN 硝酸铈铵 CAN 醋酸-硝酸纤维素 CAP 醋酸-丙酸纤维素 Cat. 催化 CBA 化学发泡剂 CBz 苄氧羰基
荧光材料基本知识
1.把各种能量转换为光能的过程主要有两种: 其一是热辐射，其二是发光。 2. 按照激发能的不同可以把发光分类为光致发光（紫外波段发光或真空紫外波段发光激发）、阴极射线发光（电子束流激发）、电离辐射发光（Ｘ射线、γ射线及高能离子激发）、电致发光（直流或交流电场激发）、化学发光（由化学反应能激发）、生物发光（由生物能激发）、摩擦发光（由机械应力激发）等。 3. 发光材料是由作为材料主体的化合物（基质）和选定掺入的少量以至微量的杂质离子（激活剂）所组成，有时还掺入另一种杂质离子作为敏化剂。 4. 荧光，又作“萤光”，是指一种光致发光的冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波段）；而且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。在日常生活中，人们通常广义地把各种微弱的光亮都称为荧光，而不去仔细追究和区分其发光原理。 5. 荧光淬灭（fluorescence quenching）又称荧光熄灭或萃灭：是指导致特定物质的荧光强度和寿命减少的所有现象。 6.荧光熄灭剂:引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂。如，卤素离子、重金属离子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羧基和羰基化合物均为常见的荧光熄灭剂。
7.荧光淬灭的原因很多，机理也很复杂，主要包括：①因荧光物质的分子和熄灭剂分子碰撞而损失能量；②荧光物质的分子与熄灭剂分子作用生成了本身不发光的的配位化合物；③溶解氧的存在，使得荧光物质氧化，或是由于氧分子的顺磁性，促进了体系间跨越，使得激发单重态的荧光分子生在荧光物质分子与猝灭剂分子之间 8.静态猝灭：当基态荧光分子与猝灭剂之间通过弱的结合生成复合物，且该复合物使荧光猝灭的现象称为静态猝灭。 动态猝灭：如果激发态荧光分子与猝灭剂碰撞使其荧光猝灭则称为动态猝灭。 动态猝灭：温度增高，猝灭增强； 静态猝灭：温度增高，猝灭降低。转变至三重态；④当荧光物质浓度过大时,会产生自淬灭现象。 9. 量子效率也称量子收率, 是指荧光物体分子发射的光量子数与吸收的光量子数之比。其大小是由分子结构决定的, 而与激发光源的能量无关。 10.拉曼散射光谱是指分子对入射光所产生使其频率发生较大改变的一种光散射现象。激光拉曼光谱主要的一些特点: (l)每种物质(分子)都有自己完全独立的特征谱线，因此每种物质的特征谱线可以表征这一物质。(2)拉曼谱线的线宽大多数较窄，并且往往都是成对出现的，也就是具有完全相同大小的正负频差。这两条谱线在短波一边的叫做反斯托克斯谱线，在长波一边的叫做斯托
(完整word版)荧光机理
1光致电子转移(PET) 递给荧光基团的键合基团(RecePtor)，负责光吸收并产生荧光发射信号的荧光基团(Fluorophorc)—其荧光发射强度反映键合基团的结合状态，以及连接键合集团和荧光基团的连接基团(Spacer)。键合基团和荧光基团通常为电子给体或者电子受体。 光致电子转移是指电子给体或电子受体受光激发后，激发态的电子给体与电子受体之间发生电子转移从而导致荧光的淬灭过程。例如，当荧光分子传感器的键合基团是电子给体，荧光基团是电子受体时，具体PET作过程如下:在光激发下，具有电子给予能力的键合基团能够将其处于最高能级的电子转入激发态下荧光基团空出的电子轨道，使被光激发的电子无法直接跃迁巨}到原基态轨道发射荧光，从而导致荧光的淬灭;当键合基团与底物结合后，降低了键合基团的给电子能力，抑制了PET过程，荧光基团中被光激发的电子可以直接跃迁回到原基态轨道，从而增强了的荧光基团的荧光发射。因此在未结合底物前，传感器分子表现为荧光淬灭，一旦键合基团与底物相结合，荧光基团就会发射荧光(见图) 由于与客底物结合前后的荧光强度差别很大，呈现明显的“关”、“开”状态，因此这类荧光化学传感器又被称为荧光分子开关。PET荧光分子传感器的作用机制可由前线轨道理论“来进一步说明(见图 1.5)。
2分子内电荷转移(ICT) ICT荧光化学传感器由推电子基团、吸电子基团通过p电子体系连接而成，在基态时表现为极化结构，一端为缺电子部分，另一端为富电子部分;而在光激发下，偶极矩增大，强化了这种极化特征，容易发 生ICT过程(如图)。 ICT荧光化学传感器的工作原理有两种(见图l.7a):当底物是缺电子基团(阳离子)时，一种是底物与吸电子基团结合，将增大分子内电荷转移程度，导致荧光光谱红移;一种是底物与推电子基团结合，则使原来向共扼体系转移的孤对电子用于与阳离子形成配位键，导致ICT 推一拉电子的特征下降，导致荧光光谱蓝移。当底物是富电子基团(阴离子)时，情况相反。一般情况下，ICT荧光化学传感器对荧光强度的影响不如PET荧光化学传感器显著。典型例子是同时含有吸电子
荧光机理
1光致电子转移(PET) 光致电子转移是指电子给体或电子受体受光激发后，激发态的电子给体与电子受体之间发生电子转移从而导致荧光的淬灭过程。具体PET过程如下:在光激发下，具有电子给予能力的键合基团能够将其处于最高能级的电子转入激发态下荧光基团空出的电子轨道，使被光激发的电子无法直接跃迁到原基态轨道发射荧光，从而导致荧光的淬灭;当键合基团与底物结合后，降低了键合基团的给电子能力，抑制了PET过程，荧光基团中被光激发的电子可以直接跃迁回到原基态轨道，从而增强了的荧光基团的荧光发射。因此在未结合底物前，传感器分子表现为荧光淬灭，一旦键合基团与底物相结合，荧光基团就会发射荧光(见图) 由于与客底物结合前后的荧光强度差别很大，呈现明显的“关”、“开”状态，因此这类荧光化学传感器又被称为荧光分子开关。PET荧光分子传感器的作用机制可由前线轨道理论来进一步说明(见图1.5)。 2002年Nolan 小组合成了手性的二氮杂环-9-冠-3 衍生物化合物1，它是第一个用来检测Li+的PET 荧光探针[56]。在乙腈溶液中，相较于其它碱金属和碱土金属，能够高选择性的识别锂离子。用280 nm 光激发，不断向溶液中加入
LiClO4，化合物 1（Φ = 0.022）对Li+的滴定表现出 5 倍荧光信号增强效应，表明从胺的冠醚到荧光团的电子转移，荧光量子效率升高（Φ = 0.11），形成 1 : 1 的配合物，结合常数 log β = 5.4。 Gunnlaugsson, Bichell, Nolan, A Novel Fluorescent Photoinduced Electron Transfer (PET) Sensor for Lithium [J]. Tetrahedron Lett., 2002, 43, 4989-4992. NH H 3C O HN CH 3 O N O N ×× PET PET Li + Bozdemir, Altan Sozmen, Fazli Buyukcakir, et al. Reaction-Based Sensing of Fluoride Ions Using Built-in Triggers for Intramolecular Charge Transfer and Photoinduced Electron Transfer[J]. Organic Letters, 2010, 12(7) : 1400-1403. 2010年Akkaya 等[18]通过在BODIPY 的中位引入一个含三异丙基硅烷的酚盐基团,已知酚盐是强的给电子基团,当被硅烧保护后,酚盐的强给电子能力被抑制,即PET 现象被抑制,所以探针2在与F 离子作用之前发出很强的荧光,当探针与F-离子作用之后,硅浣保护基团被去除,酚盐的强给电子能力恢复,发生PET 现象,荧光被淬灭。在F-离子的浓度达到0.5mM 时,探针的荧光被完全淬灭。
荧光淬灭
如果这种能量传递不有效的话，可能荧光就强。另外金的plasmon也会增强荧光材料的光吸收，可能会增强荧光总强度。这两个竞争过程除了与波长有关外，朱要与距离有关，一般 5纳米是界限，距离短被淬灭 荧光淬灭有以下几种说法: 1. 动态淬灭(碰撞淬灭,淬灭剂与发光物质的激发态分子之间的相互作用) 2. 静态淬灭(发光分子基态和淬灭剂形成不发光的基态络合物) 3. 转入三重态淬灭 4. 自吸淬灭(浓度高时，自淬灭) 首先确定荧光物质是否有电性，就是说荧光物质是否带有电荷，而且贵金属，例如纳米金，在 制作过程中，表面由于有柠檬酸根而带有负电荷，可以和带正电荷的荧光物质，如带正电荷水 溶性荧光共轭聚合物，通过静电作用，而使荧光猝灭；如果带相同电荷或者一方不带电荷，猝 灭是不怎么明显的。可以这样说，这种猝灭，是通过电荷作用相互吸附在一起，你可以让两者 相互作用后，做一个TEM，就可以判断了。 荧光淬灭有动态淬灭和静态淬灭两种，稳态的荧光强度都显示出荧光强度的衰减，无法分辨， 而动态淬灭至少分裂为2个荧光寿命，意味着能量转移的发生，而静态淬灭只是淬灭剂与荧光 物结合生成非荧光物质，荧光寿命并不发生变化。 Acrylamide和碘离子分别用于疏水淬灭或亲水淬灭，测量蛋白质中Trp残基荧光淬灭的寿命，能够轻易的得知Trp残基是位于蛋白质表面还是内部。 荧光淬灭多用于分析大分子或胶体的结构或构象，用淬灭的方法研究荧光基团在分子内还是分 子表面，有个淬灭的方程，一时写不出来，大概是淬灭剂浓度和荧光变化的关系，有个K常数，和淬灭效率和荧光寿命有关，如果分子构型改变，K会变化，这样就可以用来研究某些化合物 对大分子构型或构象的影响。 荧光漂白，就是用强光把荧光素的激发态全部给消除了，有可逆和不可逆两种，可逆的漂白相 当于清理出一个没有荧光的区域，相当于荧光清零，然后再观察测量某种特定的荧光的扩散、 产生或恢复。漂白是否可以恢复依赖于荧光素的种类和漂白光强，作为副作用，荧光素的漂白 常会发生。 磁性纳米粒子猝灭量子点的荧光很早就有人研究过。 具体原因： 处于导带的电子在回到价带的过程中，由于磁性纳米粒子的存在，发生了电子转移，量子点导带的电子转移到磁性纳米粒子上，结果荧光发生猝灭。因此，通常制备的磁性-荧光双功能纳 米材料都会在量子点表面修饰一层无机壳、聚合物等材料，降低这种电子转移。
荧光淬灭法测定Ni(2)
荧光淬灭法测定Ni(II) 摘要： 目的运用荧光淬灭法检测工业废水①中的Ni(II)是否达标。 方法镍对邻二氮菲的荧光具有淬灭的特性，本文采取标准曲线法，首先测定一系列邻二氮菲的标准溶液的荧光强度，得到以荧光强度（F）与邻二氮菲浓度（c）的曲线，再测定用过量的邻二氮菲处理的Ni(II)试样的荧光强度，最后间接计算出Ni(II)试样的浓度。 通过标准曲线法课以有效地扣除背景，减小误差，结果相对准确，标准曲线的r2约为0.99925②，通过与环境监测部门给出的数据对比，相对误差较小，结果值得信赖。 关键词：镍邻二氮菲荧光淬灭法 Abstract: Purpose use the fluorescence quenching method to detect Ni (II) in the natural lake. Method this method is based on the quenching of fluorescence of phenanthroline due to the formation of complex Ni (II)-phen. Firstly, determine the fluorescence intensity of a series of o-phenanthroline standard solution, so we obtain a standard curve about fluorescence intensity(F) and o-phenanthroline concentration (c) . Then determine the fluorescence intensity of Ni (II) sample with excess o-phenanthroline treatment, and finally indirectly calculate the Ni (II) sample concentration. Through the standard curve method we can effectively deduct the background, reduce errors, the result is relatively accurate, the standard curve r2 is about 0.99925, and by the comparison of the data given by the environmental monitoring department, the relative error is small, the results reliable. Key words: nickel phenanthroline fluorescence quenching 引言：镍是人体必需的微量元素之一, 对体内某些酶有激活作用及刺激造血机能和促进红细胞再生的作用。但过量亦会中毒③。环境中镍的主要污染来源为：镍矿的开采和冶炼；合金钢的生产和加工过程；煤、石油燃烧时排放烟尘中；电镀、镀镍的生产过程④。测定镍的方法有原子吸收法和ICP-AES法、丁二酮肟分光光度法、极谱催化波等⑤。本文基于镍对邻菲罗啉自身荧光淬灭的作用，进行了痕量镍的测定。该方法具有操作简便，测定快速，重现性好，灵敏度高等特点。应用该方法测定了工业废水中的痕量镍，得到了满意的结果。 ①以某冶金厂的废水为测定样本； ②本文中的测定数据均属由在实验中的分子荧光法测定奎宁含量的实际数据类比之后虚拟而得； ③孙成均. 生物材料检验[M] . 北京: 人民卫生出版社, 2006. 49； ④镍有何毒性与危害?南宁环保局网络课堂2005-06-10； ⑤《PAN- Rh6G 能量转移荧光猝灭法测定痕量镍》，宁玲, 吕昌银, 陈云生, 范翔, 贺元文，2008.05
荧光猝灭类型
荧光猝灭一般有静态猝灭和动态猝灭。可以通过测定猝灭常数与温度的关系来区分。静态猝灭是由于猝灭剂与荧光基团发生了结合生成不发荧光的物质，因而当温度升高的时候，体系紊流程度增加，导致猝灭常数减小；而动态猝灭是由于猝灭剂与荧光基团发生碰撞导致荧光强度减少，因而当温度升高，进而体系紊流增大是碰撞加剧，从而猝灭常数增大。你可以查找相关文献比如Y.-Q. Wang, H.-M. Zhang, G.-C. Zhang, W.-H. Tao, S.-H. Tang, Interaction of the flavonoid hesperidin with bovine serum albumin: A fluorescence quenching study, Journal of Luminescence, 126 (2007) 211-218. 无论是动态猝灭还是静态猝灭，F0/F与之间均存在着线性关系，单独通过测量荧光强度所得到的荧光猝灭数据而没有提供其他信息的情况下，是很难判断所发生的猝灭现象究竟属于动态猝灭还是静态猝灭。通常需要提供猝灭现象与寿命、温度和粘度的关系及吸收光谱的变化情况等信息。 (1) 变温实验动态猝灭由于与扩散有关，而温度升高时溶液的粘度下降，同时分子的运动加速，其结果将使分子的扩散系数增大，从而增大双分子猝灭常数。反之，温度升高可能引起配合物的稳定度下降，从而减小静态猝灭的程度。根据Stern-V olmer方程作图，如果高温的斜率大于低温的斜率，则为动态猝灭；反之，则为静态猝灭。 (2) 测量吸收光谱动态猝灭只影响到荧光分子的激发态，因而并不改变荧光物质的吸收光谱；而在静态猝灭中，基态配合物的生成往往
荧光化合物及影响荧光的因素
（一）荧光化合物 为了使用荧光检测器对化合物进行有效的检测，应当了解化合物的结构与发生荧光的关系。 具有对称共轭体系的分子能发射荧光。荧光通常发生在具有刚性结构和平面结构的π电子共轭体系的分子中，并且随π电子共轭度和分子平面度的增加，荧光效率增大，荧光光谱向长波方向移动。 具有芳香环并带有给电子取代基的化合物，或具有共轭不饱和体系的化合物都能发出荧光。在芳香烃上导入给电子基团，如—OH，—NH2，—OCH3，—NR3等均增强了荧光，主要是由于产生了p-π共轭作用，在不同程度上增强了π电子的共轭。而吸电子基团如—NO2、—COOH 等减弱了荧光。取代基位置对芳香烃荧光的影响通常为：邻位、对位取代增强荧光，间位取代抑制荧光。 （二）影响荧光强度的因素 pH 值对可离子化的某些荧光化合物的影响很大。例如未解离的苯酚和苯胺分子会产生荧光，但其离子却不产生荧光。苯酚在pH=1 , 的溶液中荧光最强，而在pH=13的溶液中无荧光；苯胺在pH为7-12的溶液中能产生荧光，而在pH<2和pH>13的溶液中都不产生荧光。 溶剂的极性和溶液的温度对荧光强度有明显的影响。增大溶剂的极性，导致荧光增强。通常荧光物质溶液的荧光效率和荧光强度，随着温度的升高而降低。液相色谱中，荧光检测器通常在室温下操作，可以保证足够的灵敏度。 当样品浓度较高时，荧光物质分子易与溶剂分子或其它溶质分子相互作用，引起溶液的荧光强度降低，荧光强度不再与浓度呈线性关系，这种现象称为荧光猝灭效应。其中，样品浓度过大时，荧光在样品池中分布不均匀，以及荧光在未射出样品池之前就被溶液中未被激发的荧光物质吸收的现象又称内滤效应。溶液浓度越大，该效应越显著。 除了荧光物质分子间碰撞及其与溶剂分子碰撞可能引起猝灭外，溶液中其它成分，特别是顺磁性物质的存在，将使猝灭效应加剧。因此，在进行荧光检测时，
4无辐射跃迁和荧光的温度猝灭
5.4 无辐射跃迁和荧光的温度猝灭 5.4.1 无辐射跃迁 绝热近似下局域中心的本征波函数X ψψ=包含两个因子，一个是依赖于原子实位形的电子波函数() ,R r ψ，另一个是描述原子实系统在绝热势中运动的波函数() X R 。一般来说，局域中心系统的总能量与电子-原子实相互作用有关，无法把相互作用能分割为电子的能量和原子实的能量。然而，在绝热近似下，原子实在绝热势中运动，相应的本征能量就很自然的被归之为晶格振动能，而绝热势的极小值，则通常被归之为电子能。在这样的绝热近似下，电子能与晶格振动能不能相互转换。 实际上，我们在作绝热近似时忽略了下面列出的项: 2 212I I I I I X X AX A m ψψψ?? -???+?≡=ψ ?? ?∑ （5.4-1） 其中的算符A 称之为非绝热算符。考虑到这一项的存在，状态X ψψ=不再是严格的定态。两个这种类型的状态，如果能量相同，就可能以一定几率从一个状态跃迁到另一个状态。也就是说，非绝热算符A 把电子和声子的 运动耦合在一起，正是由于这种电子-声子相互作用，会导致中心状态间的跃迁。跃 迁的结果，电子能和声子能都 变了，但跃迁前后二者之和不变。这种过程与辐射场无关，称之为非（无）辐射过程（nonradiative processes ）。 这种非辐射过程大多是由处在较高电子态（因而较低振动态）的中心能级跃迁到较低电子态的能级，两个态的电子能之差0ωp 全部变为晶格振动（声子）能 p ?ω，即 0p p =。 0ω 图5.4-1 无辐射跃迁的位形坐标图
图5.4-1中的箭头示出了一个非辐射跃迁的元过程 Vm Un →。跃迁初态的振动态是上电子态的低振动态，末态是下电子态的高振动态，跃迁前后状态的能量相同，但能量的组成变了，电子能之差变成了振动能 0()p n m p ωωω→-≡ 处在上电子态的中心，可能处在不同的振动态，从这些不同初态都可以通过无辐射跃迁到相应末态。在热平衡条件下，这些无辐射跃迁过程的统计平均就是总 的无辐射跃迁速率。仿照前面关于辐射跃迁的讨论，在热平衡条件下，这种总的无辐射跃迁的速率可表示为： 0002 ,0max(0,) (1),,m p NR p m p A NW N r r u p m v m ∞ =-==-+∑ （5.4-2） 其中，放出的声子数是恒定的， 0p p =，常数N 与跃迁涉及的两个电子 态及相应的电子-声子相互作用有关。通常，N 在1011 s -1到1014 s -1范围内。 或者，利用黄昆的解析表达式(,)p W S m ，该速率可写成： 0000012max(0,) 0120 0()(1)(,)e ()!!()(1)e ()!!p j j S m p NRp j p p j j S m j S m S m A NW S m N p j j S m S m N p j j +∞ -+=-+∞ -+=+==++=+∑∑ （5.4-3） 按照经典弗兰克-康顿原理，电子态间的跃迁最可能发生在上下电子态相应位形坐标曲线的交点所对应的位形。如图5.4-1 所示，上电子态的位形曲线在交点处的振动能量为?E ，在热平衡条件下，处在那样的振动状态的几率正比于玻尔兹曼因子B T e -?E 。因而可以认为无辐射跃迁 几率与之成比例。尽管从式（5.4-2）看这并不一定成立，黄昆讨论了高温强耦合 的情形，得出在这一近似下，无辐射跃迁速率的确满足关系 B k T NR A e -?E 。 （5.4-4）
荧光染料基础知识大全
荧光染料基础知识大全 益阳纺织染整团队今天 荧光显微镜技术的基本原理是借助荧光剂让细胞成分呈现高度具体的可视化效果，比如在目的蛋白后面连一个通用的荧光蛋白—GFP。在组织样本中，目的基因无法进行克隆，则需要用免疫荧光染色等其他技术手段来观察目的蛋白。为此，就需要利用抗体，这些抗体连接各种不同的荧光染料，直接或间接地与相应的靶结构相结合。此外，借助荧光染料，荧光显微镜技术不只局限于蛋白质，它还可以对核酸、聚糖等其他结构进行染色，即便钙离子等非生物物质也可以检测出来。 1免疫荧光 (IF) 在荧光显微镜技术中，可以通过两种方式观察到你的目的蛋白：利用内源荧光信号，即通过克隆手段，用遗传学方法将荧光蛋白与目的蛋白相连；或利用荧光标记的抗体特异性结合目的蛋白。 有些生物学问题采用第二种方法会更有用或更有必要。比如，组织学样品无法使用荧光蛋白，因为通常来说，标本都是从无法保存荧光蛋白的生物体中获取。此外，当有一个有功能的抗体可用时，免疫荧光法会比荧光蛋白技术快很多，因为后者必须先克隆目的基因再将DNA转染到适当的细胞中。 荧光蛋白的另一项劣势在于其本身属于蛋白质。因此，细胞内的这些荧光蛋白具有特定的蛋白质特性，其会导致附着的目的蛋白质发生功能紊乱或出现误释的情况。然而，荧光蛋白技术仍然是观察活细胞的首选方法。 免疫荧光法利用了抗体可以和相应抗原特异性结合的这个特性，对此它还有两种不同的表现形式。最简单的方式是使用可与目的蛋白相结合的荧光标记抗体。这种方法被称为“直接免疫荧光法”。 在很多情况下，我们可以利用两种不同特性的抗体。第一种抗体可以结合目的蛋白，但其本身并未进行荧光标记（一抗）。第二种抗体本身就携带荧光染料（二抗），并且可以特异性结合一抗。这种方法被称为“间接免疫荧光法”。 这种方法存在诸多优势。一方面，它会产生放大效应，因为不只一个二抗可以与一抗相结合。另一方面，没有必要始终用荧光染料标记目的蛋白的每个抗体，但可以使用市售荧光标记的二抗。免疫荧光中广泛使用的荧光染料包括FITC、TRITC 或一些Alexa Fluor?染料，下文均有提及。 2FITC 和TRITC 异硫氰酸荧光素(FITC) 是一种有机荧光染料，目前，这种荧光染料仍用于免疫荧光和流式细胞术中。在495/517 nm 处，该染料会产生激发/发射峰值，并可借助异硫氰酸盐反应基团与不同抗体结合，该基团可以和蛋白质上的氨基、巯基、咪唑、酪氨酰、羰基等基团相结合。 而它的基本成分——荧光素，其摩尔质量为332 g/mol，常被用作荧光示踪剂。FITC(389 g/mol) 是用于荧光显微镜技术的首批染料，且其被当成Alexa Fluor?488 等后续荧光染料的发端。该染料的荧光活性取决于它的大共轭芳香电子系统，而该系统受蓝色光谱中的光所激发。
常见荧光基团
Dihydrorhodamine 123 二氢罗丹明123 Tetramethylrhodamine-6-maleimide 四甲基罗丹明-6-马来酰亚胺 Tetramethylrhodamine-5-maleimide 四甲基罗丹明-5-马来酰亚胺 5--IAF ,5-Iodoacetamidofluorescein 5-吲哚乙酰氨基荧光素 6-TET 6-羧基-2',4,7',7-四氯荧光素琥珀酰亚胺酯 BIS[N,N-BIS(CARBOXYMETHYL)AMINOMETHYL]FLUORESCEIN TETRASODIUM SALT 双[NN-双(羧甲基)氨甲基]荧光素四钠盐 Fluorescein-5-maleimide 荧光素-5-马来酰亚胺 5-FITC cadaverine 5-异硫氰酸荧光素尸胺 Sulforhodamine G 磺基罗丹明G 7-Hydroxy-4-methylcoumarin 7-羟基-4-甲基香豆素 3-Cyano-7-hydroxycoumarin 3-氰基-7-羟基香豆素 Fluorescein, disodium salt 荧光素二钠盐 Fluorescein 荧光素 6-FAM phosphoramidite 5'-荧光素氨基磷酸酯 6-TRITC四甲基罗丹明-6-异硫氰酸 6-Carboxy-X-rhodamine, succinimidyl ester 6-羧基-X-罗丹明琥珀酰亚胺酯 5-Carboxy-X-rhodamine, succinimidyl ester 5-羧基-X-罗丹明琥珀酰亚胺酯 6-Carboxy-X-rhodamine 6-羧基-X-罗丹明 5-TAMRA, 5-Carboxytetramethylrhodamine, succinimidyl ester 5-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯 6-TAMRA, 6-Carboxytetramethylrhodamine 6-羧基四甲基罗丹明 5-TAMRA, 5-Carboxytetramethylrhodamine 5-羧基四甲基罗丹明 6-CR6G, 6-Carboxyrhodamine 6G 6-羧基罗丹明6G 5-FITC, luorescein-5-isothiocyanate 异硫氰酸荧光素 6-FAM,succinimidyl ester 6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯 5-FAM,succinimidyl ester 5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯 5-FAM 5-羧基荧光素 6-FAM 6-羧基荧光素 Rhodamine B 罗丹明B Rhodamine 6G 罗丹明6G AMC, 7-Amino-4-methylcoumarin 7-氨基-4-甲基香豆素 Cy3,succinimidyl ester Cy3,succinimidyl ester Cy3 Cy3 AP2635 Cy5,,succinimidyl ester Cy5,,succinimidyl ester Cy5 Cy5
荧光
第5章分子发光—荧光、磷光和化学发光法(Molecular Emisssion and Luminescence)（3学时） 教学目的和要求： 1.学会分子发光——荧光、磷光和化学发光原理。 2.了解分子发光——荧光、磷光和化学发光法的特点和应用。 教学要点和所涵盖的知识点： 荧光、磷光和化学发光原理、仪器、分析方法及应用 重点和难点： 荧光的原理、仪器、分析方法及应用。 分子发光：处于基态的分子吸收能量(电、热、化学和光能等)被激发至激发态，然后从不稳定的激发态返回至基态并发射出光子，此种现象称为发光。发光分析包括荧光、磷光、化学发光、生物发光等。物质吸收光能后所产生的光辐射称之为荧光和磷光。 第一节荧光分析法 一、概述 分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。 荧光分析的特点： 灵敏度高：视不同物质，检测下限在0.1~0.001μg/mL之间。可见比UV-Vis 的灵敏度高得多。 选择性好：可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。 结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、光强、荧光量子效率、荧光寿命等。 应用不广泛：主要是因为能发荧光的物质不具普遍性、增强荧光的方法有限、外界环境对荧光量子效率影响大、干扰测量的因素较多。 二、基本原理 1、分子荧光的产生 处于分子基态单重态中的电子对，其自旋方向相反，当其中一个电子被激发时，通常跃迁至第一激发态单重态轨道上，也可能跃迁至能级更高的单重态上。
这种跃迁是符合光谱选律的，如果跃迁至第一激发三重态轨道上，则属于禁阻跃迁。单重态与三重态的区别在于电子自旋方向不同，激发三重态具有较低能级。在单重激发态中，两个电子平行自旋，单重态分子具有抗磁性，其激发态的平均寿命大约为10-8s; 而三重态分子具有顺磁性，其激发态的平均寿命为10-4~1s以上(通常用S和T分别表示单重态和三重态)。 处于激发态的电子，通常以辐射跃迁方式或无辐射跃迁方式再回到基态。辐射跃迁主要涉及到荧光、延迟荧光或磷光的发射；无辐射跃迁则是指以热的形式辐射其多余的能量，包括振动弛豫(VR)、内部转移(IR)、系间窜跃(IX)及外部转移(EC)等，各种跃迁方式发生的可能性及程度，与荧光物质本身的结构及激发时的物理和化学环境等因素有关。 2、去活化过程(Deactivation) 处于激发态分子不稳定，通过辐射或非辐射跃迁等去活化过程返回至基态。这些过程包括： (1)振动弛豫(Vibrational Relaxation, VR) 在液相或压力足够高的气相中，处于激发态的分子因碰撞将能量以热的形式传递给周围的分子，从而从高振动能层失活至低振动能层的过程，称为振动弛豫。 (2)内转化(Internal Conversion，IC ) 对于具有相同多重度的分子，若较高电子能级的低振动能层与较低电子能级的高振动能层相重叠时，则电子可在重叠的能层之间通过振动耦合产生无辐射跃迁，如S2-S1；T2-T1。 (3)荧光发射 处于第一激发单重态中的电子跃迁至基态各振动能级时，将得到最大波长为λ3的荧光。注意：基态中也有振动驰豫跃迁。很明显，λ3的波长较激发波长λ1或λ2都长，而且不论电子开始被激发至什么高能级，最终将只发射出波长为λ3的荧光。荧光的产生在10-7-10-9s内完成。 三、荧光与有机化合物的结构 1、跃迁类型 对于大多数荧光物质，首先经历π→π*，然后经过振动弛豫或其他无辐射跃迁，再发生π*→π跃迁而得到荧光。π*→π跃迁常能发出较强的荧光(较大的量子产率)。这是由于π→π*跃迁具有较大的摩尔吸光系数(一般比n→π*大100-1000倍)。