细胞培养(hela, 293,239T等细胞的培养)

Hela细胞传代培养操作步骤

1．观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。观察时拧紧盖子。

2．加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。

3．打开超净台（先开风机，后开照明），用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。取小离心管一个，置于架子上。

4．取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。5．取待传代的细胞。打开versene，用酒精灯外焰烧。烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。

6．用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。（加versene 主要是为了将旧培养基洗去）。在离心管中间部分将液体加入。吸液体和加液体时都不要对着细胞。7．打开胰酶，然后将versene弃掉。换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。

8．将细胞放入37度孵箱。放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。别忘了用旧培养基中和。

9．取细胞，镜下观察消化情况。消化程度合适之后（细胞变圆，但不漂起），用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。

10．吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。

11．细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。

12．擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。不要把枪伸到离心管内。

13．吸量管吸取细胞悬液，加入新的培养皿中。镜下观察，摇匀，放入37度孵育。收超净台。

293T细胞

培养条件：

37℃，5% CO2，PH值7.2~7.4，无菌恒温培养。

细胞相关操作：

细胞复苏

1.37°C水浴预热培养基（DMEM+10% FBS）；

2.从液氮中取出细胞迅速放入37°C水浴快速解冻（解冻后不要继续暖细胞）；

3.在超净台中加入5ml培养基重悬细胞，1000rpm离心5min；

4.弃上清，加入5ml培养基重悬细胞后转入T25培养瓶中，轻轻晃匀；

5.置于37°C，5% CO2培养箱中培养(培养瓶盖没有透气孔的话,瓶盖不要拧太紧)；

6.第二天，用新鲜的培养基给细胞换液后继续培养。

细胞传代

1. 当细胞融合度达到90%以上时，给细胞传代；

2. 37°C水浴预热培养基（DMEM+10% FBS）；

3. 在超净台中，弃培养基，加入2-5mlPBS清洗细胞后，再加入1ml胰酶消化细胞；

4. 显微镜下观察到细胞变圆，有细胞开始脱离瓶壁时，加入5ml培养基（DMEM+10% FBS）终止消化；

5.用移液器轻轻吹下瓶壁上剩余的细胞，并轻轻吹打将细胞吹散；

6.将细胞移入离心管中，1000rpm离心5min；

7.弃上清，加入15-20ml的培养基（含血清）重悬细胞后转入T75培养瓶中或按适当比例传到T25瓶中（确保细胞贴壁后融合度在25-50%之间），细胞密度在1×104 cells/cm2 (2.5×105 cells/T-25瓶），混匀细胞悬液，确保细胞均匀分布；

8.将培养瓶置于37°C，5% CO2的无菌培养箱中培养。

细胞冻存

1.37°C水浴预热培养基（DMEM+10% FBS）；

2.消化细胞后给细胞计数:

1)洗净晾干血小板计数板和盖玻片，将盖玻片完全覆盖计数区；

2)充分混匀细胞，取少量(0.1-0.5ml)细胞悬液与等体积的染色液台盼蓝混合，移液器吹吸混合均匀，用移液器取20ul混合液从盖玻片两端(与中间凹槽平行的两端)分别打入细胞，以细胞悬液刚好浸湿盖玻片为佳；

3)显微镜下，数四个计数区的总细胞数，无活性细胞染成蓝色，活细胞不被染色；

4)细胞密度=细胞总数/4×10000×2；

这里10000是不变的，因为计数的细胞是在体积为1mm×1mm×0.1mm即10-4cm3计数池内，1cm3=1ml，将四个计数区的细胞数除以4取平均数，乘2是补偿加等体积台盼蓝形成的稀释。

5)细胞活性=活细胞数/细胞总数×100%。

注:细胞密度高时，可调整细胞悬液和台盼蓝的比例，计数时乘以相应的稀释倍数即可。

3.当细胞密度达到传代密度且细胞活性在90%以上时，可以冻存细胞。

4.在超净台中将要冻存的细胞移入离心管，1000rpm离心5min。

5.弃上清，用90%培养液+10%DMSO的混合液重悬细胞，并调整细胞密度为1-3×106/ml。

6.将细胞悬液分装到冻存管中(1-1.5ml/管)。

7.将装有细胞的冻存管放入程序降温冻存盒，-20°C放1-2h后，-80°C过夜，然后快速转移到液氮中。293细胞培养

293细胞培养特性：

1、293细胞明显适应酸性环境,pH值在6.9～7.1时,可顺利贴壁生长, 换液时动作要轻。一般用高糖的DMEM培养基。

2、传代：倒去废液，PBS洗一次（轻），用0.02%EDTA与0.25%Trypsin消化，生长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin作用30s,镜下观察细胞变圆,就可加DMEM终止消化，反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。12小时-24小时90%以上细胞贴壁。293细胞传代时机为达80-90%汇合，传代比例为1：3。

3、293细胞在低代时容易贴壁，生长良好，在传到几十代以后，易聚集成团，且贴壁不牢，用PBS冲洗时即可能脱落，即使消化后也不容易吹打成单细胞悬液，最好购入时先大量冻存。

4、复苏293细胞的另一生长特性是贴壁所需时间长且贴壁不牢。细胞冷冻后复苏时,都有不同程度的肿胀,若以50ml培养瓶待细胞长满瓶底的70%～80%时消化冻存,复苏时将其全部接种至2

个50ml瓶中时较为合适。刚复苏的293贴壁很慢，复苏接种后24小时内,应尽量减少观察细胞次数或不作观察,以免因晃动而影响细胞贴壁。复苏后48小时左右观察贴壁情况并进行首次更换培养基比较合适,如果用一次性塑料培养瓶可增加细胞贴壁牢度。换液前宜将培养基预热。

5、转染：体外应用293细胞进行细胞转染时，如果是采用磷酸钙转染，一定要注意293细胞不要全部长满细胞培养盘，长满细胞时加入磷酸钙就会使293细胞大片的脱落，最好是当293生长到1/2或2/3时进行磷酸钙转染，可以避免细胞的大量脱落。

其它的经验：1、用大瓶培养较小瓶要好，可能是更有利于293均匀的分布，利于营养的摄取

2、培养液要新鲜，每次只配1000ml，分为2-4瓶，不用的培养液，冻存在-20度，

3、要及时传代，最好是细胞基本铺满培养瓶底部，但是细胞之间还没有完全贴紧，总是多少有空隙的时候最好。

4、如果细胞贴壁不好，可能是消化过久，或是培养瓶不够干净，当然要除外细胞污染。

5、如果使用用玻璃培养瓶或皿，可以采用高压灭菌的0.2%明胶溶液预处理培养瓶/培养皿，方法是将明胶加入培养皿，使之浸泡到底面的各个部分，然后吸出，置超净台内晾干即可使用。这样处理后细胞贴壁效果好且镜下细胞立体感强。如果是新的塑料培养瓶就不用处理。

培养基；GIBCO DMEM粉剂，加双抗，HEPES，NaHCO3

配置高糖的DMEM培养基1000ml，

1.一袋DMEM培养基（GIBCOBRL)用去离子水溶解

2.加入NaHCO3 2.0g

3.加入谷氨酰胺 0.146g（终浓度为5mM）

4.加入青霉素10万U（终浓度100u/ml），链霉素6.5万U（终浓度100u/ml）

5.定容900ml

6.过滤除菌、分装到两个消毒的500ml瓶子中

7.加入灭活小牛血清100ml。

Jurkat细胞（人外周血白血病T细胞），是一种悬浮细胞。我的经验如下：

1、培养液：RPMI1640，15％小牛血清，2％Na2CO3，1％HEPES，青霉素100IU／1ml，庆大霉素100IU／ml；

2、培养条件：5％CO2，37度，30％湿度；

3、细胞复苏：要快速将冻存管放入37度水中，不断轻轻摇晃，直到细胞完全溶解，加入10ml 左右的培养液，800～1000rpm，10分钟离心，之后倒掉液体，加入新的培养基就可以进行培养了；

4、细胞培养：起初进行传代时由于细胞刚刚复苏，长得比较慢，所以可以3～4天传一代，传过两代后，一般2～3天传一代，每次传代后在倒置显微镜下观察细胞形态，在传过几代合适的时候可以进行实验。

5、细胞冻存：1000rpm离心后，弃去液体，加入含有15％DMSO的冻存液，按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟〕→冰箱冷冻室（30分钟）→低温冰箱（－80℃1小时）→液氮。培养经验

细胞培养箱在每使用1个月最好用酒精擦洗一次，这样可以减少污染；

（2）虽然说加样器放在紫外下照射会不准，但我们还是丢了一把1ml的加样器在超净台，没有

拿出来过，我想这样也许会减少污染；

（3）小牛血清我们用的是国产的，所以在一开始的时候加了15％的小牛血清，但细胞总是长不好，后来摸索条件，把小牛血清的量调到了20％，细胞生长旺盛；

（4）HEPES虽然贵点，但加上去后细胞会长的不错；

（5）在超净台操作前要用0.1％的新洁尔灭或75%酒精擦手。

1.AsPC-1（转移胰腺腺癌细胞）

【细胞复苏的方法】:

（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～42℃水浴中，晃动，使其尽快融化（1分钟左右）。

（2）用培养液稀释至原体积的10倍以上，直接培养。

（3）或低速离心，去上清，加新鲜培养液培养。

SK-OV-3 [SKOV-3]细胞，人卵巢癌细胞细胞(株)

KM12人结肠癌细胞

细胞培养技术个人总结

总结---细胞培养 一．基本理论概论 原代培养: 也叫初代培养，指直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养。 传代培养：将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或传代培养。 细胞系：原代培养物成功传代后，则称之为细胞系。(如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系。) 细胞株：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物称为细胞株。 培养类型：细胞培养，组织培养，器官培养。 细胞生长的方式：贴附生长，悬浮生长 培养细胞的形态（形态不一定，环境改变形态可能改变）：成纤维性型细胞，上皮型细胞（单层膜样生长），游走性细胞（游散生长，常有伪足跟突起） 二．培养过程及要点（切记无菌操作） （一）工作环境的处理 1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 % 酒精擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % 酒精擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。 2. 实验用品以70 %酒精擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。 3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。吸管口切勿碰到容器瓶口 4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒 感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。 5. 定期检测下列项目： CO2 钢瓶之CO2 压力。CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300 小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。 6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。 （二）试验用玻璃塑料用品清洗及其消毒灭菌 清洗： （1）玻璃器皿的清洗（酸液由重铬酸钾，浓硫酸，蒸馏水配置） 浸泡—刷洗—浸酸—冲洗 （2）胶塞的清洗 刚买回的常含滑石粉等杂质，先用自来水冲洗后再按常规方法处理。2%NaoH或洗衣粉煮沸10-20分钟---1%稀Hcl浸泡30分钟或蒸馏水冲洗后再煮沸10-20分钟—晾干备用 （3）塑料制品的清洗 2%NaoH浸泡过夜—自来水冲洗--5%稀Hcl浸泡30分钟—自来水和蒸馏水冲干备用。

细胞培养的操作步骤

传代细胞培养的视频拍摄脚本 一、实验准备 器材 液氮冷冻灌、恒温培养箱、电冰箱、高压灭菌锅、磁力搅拌器、离心机、分析天平、倒置显微镜、超净工作台、弯头吸管（1个）、胶头滴管（9个）、离心管（9个）、带塞培养瓶（不定个）、试管架、量桶、烧杯、酒精灯、抽滤瓶、G6型号细菌过滤漏斗、带塞小玻璃瓶，大三角瓶、无菌冻存管、液氮瓶（一）、器皿 1玻璃器皿的清洗灭菌： 种类：小玻璃瓶、弯头吸管、滴管（3个）、培养瓶、量桶、烧杯、抽滤瓶、大三角瓶，细菌过滤器接口管 药品：5％盐酸溶液、重鉻酸钾120ml、硫酸200ml、蒸馏水200ml （1）浸泡:新使用或重复使用的玻璃器皿须经5％盐酸溶液或自来水浸泡过夜或煮沸30min，水洗。以去除新购进玻璃器皿所带有灰尘、铅、砷等物质，并消除其弱碱性。 （镜头一：实验人员将器皿放进加有5％盐酸溶液的盆内，并以字幕和配音的形式显示浸泡或煮沸时间和浸泡目的） （2）刷洗:浸泡后用软毛刷和优质的洗洁精进行刷洗。刷洗后经行烘干 （镜头二：实验人员刷洗器皿，使用正规的清洗方法，并烘干，只示范其中2--3种即可，实验人员必须介绍操作示范烘干箱的使用方法和相关数据的设置方法） （3）酸浸:刷洗后的玻璃制品酸浸前须适当晾干或烘干，以免造成酸浸液稀释，影响效果。将玻璃制品完全浸泡入清洁液中24h。清洁液具有极强酸蚀作

用，操作过程需戴防护用具。 （镜头三：带好橡胶手套将清洁液加入到盆中，让后进行酸浸，并以字幕的形式显示浸泡时间） （4）冲洗、烘干备用:浸酸后的玻璃器皿先用自来水充分冲洗，吸管需冲洗10min，器皿需每瓶灌满自来水、倒掉反复10次以上，不留任何酸浸液残迹，然后用蒸馏水漂洗2～3次 将清洗好的玻璃器皿放入烘干箱中，烘干后的玻璃器皿要求干净透明，无油烟，不能残留任何有害物质及化学药品等。 （镜头四：自来水冲洗，蒸馏水清洗，烘干一起完成，在这个过程中可在装器皿的盘中放入一定量的玻璃器皿，只对其中一种进行自来水冲洗、蒸馏水清洗，洗好后就将所有仪器放入烘干箱中烘干，并在每一个步骤中以字幕或语音的形式显示相关操作次数和时间） （5）包装灭菌:器材经清洗烤干或晾干后，先应严格包装，然后再行消毒灭菌处理，以防止消毒灭菌后再次遭受污染。包装材料常用包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃或金属制吸管筒、纸绳等。 （镜头五：实验人员对实验器皿中的1—2种进行包装示范，然后将其他包装过的器皿一起放入高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌） （实验人员必须示范操作高压灭菌锅和恒温干燥箱的用法，示范操作步骤，只示范一次即可，在下面的不同灭菌温度和不同灭菌时间可以字幕的形式显示）2、橡胶制品清洗消毒 种类：玻璃瓶橡胶塞、培养瓶瓶塞、皮管、滴管头 新的橡胶制品洗涤方法：0.5mol/L NaOH煮沸15分钟，流水冲洗，0.5mol/L HCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟，50℃烤干备

原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项

初代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒 初代消化培养法 1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速 （500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。 7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。 8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。 3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。

HEK293FT细胞培养

293细胞培养 293细胞是用5型腺病毒75株系转化，含有Ad5 E1区的人胚肾亚三倍体细胞系，是一种E1区缺陷互补细胞系。它是加拿大McMaster University的F.L.Graham与https://www.wendangku.net/doc/3317718864.html,ey 于1976年用DNA转染技术构建而成。293细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型，细胞允许Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖。哺乳细胞的大规模培养方式有三种：贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养。这三种方式均可用于293细胞的大规模培养。293细胞在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长，也可生长在血清浓度降低的培养基中。单层培养细胞在5-10％FBS-DMEM中能生长很好。一般来讲，1:10传代后，一周可以长满。严禁过度生长，这点很重要。因为会导致细胞密度加大和堆积，影响病毒斑的形成和转染，传代时也不易打散。悬浮的293细胞很容易大规模培养，但不容易长期保持稳定。293细胞在传代120次以后，其表型可能改变，生长状况不再完全是单层的了，偶尔会形成局部的细胞成团聚集，应立即抛弃，重新引入新传代的细胞。 293细胞培养特性： 1、293细胞明显适应酸性环境,pH值在6.9～7.1时,可顺利贴壁生长, 换液时动作要轻。一般用高糖的DMEM培养基。 2、传代：倒去废液，PBS洗一次（轻），用0.02%EDTA与0.25%Trypsin消化，生长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin作用30s,镜下观察细胞变圆,就可加DMEM终止消化，反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。12小时-24小时90%以上细胞贴壁。293细胞传代时机为达80-90%汇合，传代比例为1：3。 3、293细胞在低代时容易贴壁，生长良好，在传到几十代以后，易聚集成团，且贴壁不牢，用PBS冲洗时即可能脱落，即使消化后也不容易吹打成单细胞悬液，最好购入时先大量冻存。 4、复苏293细胞的另一生长特性是贴壁所需时间长且贴壁不牢。细胞冷冻后复苏时,都有不同程度的肿胀,若以50ml培养瓶待细胞长满瓶底的70%～80%时消化冻存,复苏时将其全部接种至2个50ml瓶中时较为合适。刚复苏的293贴壁很慢，复苏接种后24小时内,应尽量减少观察细胞次数或不作观察,以免因晃动而影响细胞贴壁。复苏后48小时左右观察贴壁情况并进行首次更换培养基比较合适,如果用一次性塑料培养瓶可增加细胞贴壁牢度。换液前宜将培养基预热。 5、转染：体外应用293细胞进行细胞转染时，如果是采用磷酸钙转染，一定要注意293细胞不要全部长满细胞培养盘，长满细胞时加入磷酸钙就会使293细胞大片的脱落，最好是当293生长到1/2或2/3时进行磷酸钙转染，可以避免细胞的大量脱落。 其它的经验： 1、用大瓶培养较小瓶要好，可能是更有利于293均匀的分布，利于营养的摄取 2、培养液要新鲜，每次只配1000ml，分为2-4瓶，不用的培养液，冻存在-20度， 3、要及时传代，最好是细胞基本铺满培养瓶底部，但是细胞之间还没有完全贴紧，总是多少有空隙的时候最好。

BHK细胞培养小结

BHK细胞培养小结 报告人： 1、细胞培养 （1）培养基：DMEM培养基+10%无支原体新生牛血清+100U/ml青/链霉素 （2）细胞传代：细胞长满瓶壁90%-95%时，将上清倒掉，用D-Hanks液洗2-3遍细胞，加1ml0.25%胰酶37℃温箱消化3-5分钟后，加入3ml培养基将细胞吹下来，转移至15ml离心管，1000转离心5分钟，倒掉上清，加入3ml新鲜培养基重悬细胞，将细胞吹打均匀后按1：2或1：3的比例接种于新的培养瓶中，加入5ml新鲜培养基，放入培养箱培养。 2、细胞冻存及复苏 （1）细胞冻存液：90%无支原体新生牛血清+10%DMSO （2）细胞冻存方法：细胞长满瓶壁90%后，细胞消化离心，弃上清，加入配制好的冻存培养液（含10%DMSO），重悬细胞，或者用细胞计数板计数细胞浓度，将细胞浓度调至106个/ml，将细胞转移至冻存管，每管1ml，用棉花包住冻存管放入-80℃冰箱，2天后将冻存管放入液氮冻存。 （3）细胞复苏：先准备一支15ml离心管，加入5-8ml新鲜培养基，再从液氮取出细胞后立刻放入37-40℃水浴，在1min内融化，然后将细胞转移至装有培养基的离心管，1000转离心5分钟，倒掉上清，加入2ml新鲜培养基重悬，再转移到1个新的培养瓶中，加入4ml新鲜培养基放入培养箱培养，1天后细胞贴壁，换液。 3、注意事项 （1）如果细胞生长太慢可选用含20%无支原体血清的DMEM培养基培养，可加快细胞生长； （2）细胞传代时必须先离心后再重悬，如果不离心直接吹打后传代细胞不能吹打成单个细胞悬液，传代细胞成堆生长，影响细胞状态； （3）细胞传代时不能传得太稀，如果传代时细胞浓度太低的细胞生长速度会很慢，而且细胞容易成堆生长； （4）胰酶在使用前最好预热到37度。由于胰酶平时保存在4度，反复预热对胰酶的活性不好，可以将胰酶进行分装，尽可能避免胰酶反复冷却加热； （5）BHK还是比较好消化的，2-3min应该足够了，消化时间太长对细胞不利。可以在显微镜下观察消化情况，必要时可以拍打培养瓶帮助细胞分散，消化结束后直接加入培养基即可，胰酶会被血清灭活； （6）细胞冻存时要选细胞状态好的细胞冻存，否则细胞不容易复苏。

细胞传代培养的原理及操作步骤,细胞冻存,细胞复苏

细胞传代培养的原理及操作步骤 （一）原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，须进行传代再培养。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 （二）细胞传代培养具体操作 1、细胞：贴壁细胞株 2、操作步骤 1）将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 2)加入0.5-1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。 3)瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。 观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1-3分钟。 4)用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。 细胞冻存 1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min；培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水 浴箱37℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液 2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的 细胞悬液。 4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心(1000r/min，10分钟)。 5. 去上清液，加入与细胞悬液等量的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀 6. 冷存管置于4℃10分钟----20℃30分钟----80℃16～18小时(或隔夜)---液氮槽vaporphase长期储 存。-20℃不可超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 7．记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。 细胞复苏 1.室内紫外消毒；培养基、PBS于37℃恒温水浴预热备用。 2.自液氮罐中取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，离心。 3.去上清，加入培养基，吹打，然后移入培养瓶中，用培养基清洗冻存管，清洗液也移入培养瓶中。 4.于培养瓶中加入适量培养基，放入CO2培养箱中培养 5.记录复苏日期；次日换液。

细胞培养集锦一个培养300多种细胞人的经验总结

细胞培养集锦(一个培养300多种细胞人的经验总结) 一、消化与吹打 版上很多朋友讨论细胞培养问题，见到很多很好的经验总结，这里说一些我个人的经验，因为一些比较特殊的原因，我自己培养接触过近300种细胞，常用于做实验的，累积有百余种，可以说遇到过许多各式各样古怪的细胞。这里挑细胞消化开始做我的第一篇专题，并不是因为细胞消化最重要，而是近期看到大家频繁讨论这个话题，我就抛砖引玉，下面几点拙见，可能与其它朋友总结的一些经验有点出入，仅供大家参考。 许多同学对细胞消化做了许多研究，得出了很多有价值的经验，也见到很多人的困惑。其实细胞培养，尤其是细胞系的培养，就消化而言，不是太难，做得多了，善于总结经验，就能把细胞越养越好。一般的程序步骤，细节操作，我这里就不讲了，只讲一些基本操作背后的知识，如果不对之处，欢迎指正，一起讨论： 1，其实绝大部分细胞消化的时候是只要用胰酶润洗一遍即可，吸去胰酶后，残留的那些无法计算体积的附着在细胞表面的微量胰酶在37度一般不到2min足够消化细胞（绝大部分1min不到）。对于这些细胞原则上不要用胰酶孵育细胞，连续这样传代，对细胞伤害很大。简单的程序是PBS润洗吸去，胰酶润洗吸去，然后37度消化。 2，什么算是消化好了呢？不是细胞全部成间隔分布很离散的单个圆形才算消化好了，一般你肉眼观察贴壁细胞层，只要能移动了，多半呈沙壮移动，其实已经可以了，很多人喜欢把细胞消化或者吹打成完全分离细胞，这是没有必要的。一般能移动了，说明细胞与培养基质材料的附着已经消失了，细胞之间的附着也已经消失了，细胞已经独立分布了（虽然没有呈现很广的离散分布）。这个时候应该停止消化，不要等到看到镜下所有细胞都分离得非常好，间隙很大，才停止。细胞就是完全成单个细胞悬液，之后在贴壁的过程中仍然会聚集，这个是贴壁培养的细胞，尤其是肿瘤细胞的一个特性，无论死活的细胞都是如此，你可

HUVEC细胞培养心得

HUVEC 培养交流讨论： 各位仁兄，我查了一下，关于HUVEC 的贴子有几千篇，不知有那位知道的多的能给总结一下？我想应该有以下几 1、讲清HUVEC 与ECV304区别 2、HUVEC 原代与细胞株的关系、区别问题 3、能否总结一下国内有哪些单位可以买到HUVEC ？是原代还是细胞株？ 4、培养中到底添加ECGS 还是ECGF ？ 5、有些推荐细胞的应该讲清自己的是原代还是细胞株，能养多少代。 希望能抛砖引玉。 票数+收藏2回帖16浏览2686我也要发帖 举报 ? 浙江医院招聘浙江省老年医学研究所（临床医学） ? 请教关于HUVEC 细胞的培养 ? 求购HUVEC ? 【互助小组】正在养或已经养过HUVEC 的请进。 docter_zhao ? 0 2004-08-03 15:14 消息 引用 分享 huvec 必需加ECGS 及肝素，否则很难生长增殖 举报 ? zjqlucky ? 15 ? 5 ? 7 2004-08-03 17:27 消息 引用 分享 docter_zhao wrote: huvec 必需加ECGS 及肝素，否则很难生长增殖 这个好像也未必吧，我养的原代的huvec 只用20％胎牛血清的RPMI1640也长的很好呀，只是传ecgs 能传这么多代吧 票数+收藏1 举报 ? 2004-09-08 00:20 消息 引用 分享 我们曾试过用m199或DMEM 加20％胎牛血清原代培养，感觉效果不佳，后来加了ECGS 及肝素，发现细胞长得能有改变 票数+收藏1 举报 引用 分享 huvec 是脐静脉内皮细胞,不是那么难养,细胞可以从脐带自己提取,卖现成的细胞株也不贵,用内皮细胞的配套培email-sinian19988@https://www.wendangku.net/doc/3317718864.html,

细胞培养操作步骤

培养基的配置：基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml 冻存液的配置：DMS018ml+胎牛血清2ml。 依次比例酌量配置。 超净工作台常规配置 移液器1套（2.5小20 d、200 pl> 1ml）,酒精灯1盏，液器1台，斜架1台， 酒精喷壶 1 个，酒精棉球缸 1 个，污缸 1 个， 常规耗材：培养瓶（50 cm 2）,定量移液管（5ml、10ml）,枪头（1ml、200小 10 d）,培养皿，6/24/48/96孔板，医用脱脂棉球，保种管 所需试剂：gibco高糖培养基，胎牛血清，双抗，DMSO,胰酶，苯扎溴氨，75% 酒精…… 实验前准备： 所需的各项高压后的耗材放于超净工作台内，用酒精喷壶喷洒实验台面，并关闭工作台打开紫外灯照射30min 后开始实验操作。 首次传代前细胞的复苏，首先用一大烧杯盛满37C的温水放于液氮罐旁边，待 细胞株取出后留上端1/3于37C水面上尽最大速摇动管使其在2min内迅速融化。若 种管顶部含有冻存的细胞液在摇动期间用力甩动使其降于管底后再摇动。这一过程可在超净工作台外操作。 实验步骤 一、原代细胞的培养 1. 紫外消毒30min 后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的 双手。 2. 将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒 精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3 次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。 3. 取1 个高压后的新培养瓶，瓶口在酒精灯上消毒2-3 次，旋开后分别再次消毒瓶 口和瓶盖2-3 次分别放于酒精灯两侧，把保种管在超净台外用酒精棉球擦拭下2/3 后拿进超净台内在酒精灯上消毒保种管口2-3次放于台面左手边，取1ml 移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2 次，然后再装上枪头吸取保种管内的细胞液，悬空移入培养瓶内。 4. 拿出1 支高压后的5ml 定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器上， 再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3 次，悬空进入培养基瓶内吸取4ml 培养基再悬空移入培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3 次后拧紧平放，在瓶身做好实验标记。 5. 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3 次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试 剂及污缸等，关闭超净工作台。 6?将培养瓶放于28C,5%CO2的培养箱内培养，旋开瓶口少许。注意整个培养箱底托盘内一定要放高压后的水，且定期更换确保无菌。 在CO2培养箱内培养10-12h，瓶盖拧紧后拿出培养箱，置于荧光倒置显微镜下观察细胞贴壁情况，及细胞形态。最后更换培养液。 、培养液的更换

293T细胞培养标准操作规程

百利药业生物药研发部 标准操作规程 题目：293T细胞传代培养操作规程 编号：SOP-M-e-003- 制定者：（签名）日期：年月日 批准者：（签名）日期：年月日 生效日期：年月日 题目：293T细胞培养操作规程 1目的293T细胞是常用于包装和扩增病毒载体的工具细胞，因此做好293T细胞的培养，为保证相关实验的正常进行提供必要条件。 2适用范围本部门293T细胞培养 3操作方法 将移液器和移液枪、15ml离心管、离心管架、75cm2新的细胞培养瓶放于生物安全柜中，按照生物安全柜的标准操作规程，将生物安全柜的紫外开启半小时。 将含10%胎牛血清和100U/ml双抗的DMEM及PBS放于37℃水浴锅中预热。 3.2.1将已长到80%-90%的293T细胞培养瓶从37℃，5%的CO2培养箱中取出，先用75%的酒精喷洒于瓶表面，将细胞培养瓶旋转放于生物安全柜中，用无菌的移液管吸净其中的培养基，加5ml的预热的PBS洗涤一次，吸净PBS。 3.2.2将含%tyption用PBS稀释两陪到五倍，向该75cm2的细胞瓶中加入3ml稀释好的%tyption，让其充分平铺于细胞表面。盖好瓶盖，将细胞瓶放在显微镜下观察，直到细胞变圆，加含10%胎牛血清的DMEM终止反应，用移液管轻轻将瓶上的细胞吹下，将细胞液移到15ml无菌的离心管中，1000rpm离心3分钟。

3.2.3将离心上清吸弃掉，用手指轻轻拍打离心管底将底部细胞分散开，再加3mlDMEM 培养基将分散的细胞重悬稀释开，取一定量的细胞液进行n倍稀释后计数，按照细胞计数标准操作规程进行。 3.2.4计数好之后细胞传代密度按照2~5×104个细胞/cm2进行传代培养，每个75cm2的培养瓶中加10mlDMEM培养基，放于37℃，5%的CO2培养箱中培养。 3.2.524小时后观察细胞状态，待细胞长到80%-90%时进行下一次传代培养。

细胞培养

2011年7月11日（以细胞换液为例子） 今天培养293细胞,培养前准备两个蓝盖瓶(200mL),1mL枪头一盒，并将蓝盖瓶和枪头高压灭菌后置于烘箱干燥。 取一双干净的手套专门用于细胞操作，将手套置于超净台中，并在超净台上放置蓝盖瓶、枪头、酒精棉球、移液器、垃圾存放盒。这些放入超净台后打开紫外灯照射30分钟左右，在这时可以将已经配好的培养基和PBS温浴30分钟。（买好的现成培养基可以直接在超净台中配好，在DMEM 中加入10%的血清，血清需要从-20度中取出解冻后使用，使用完毕后注意用封口膜封好血清管口，倒培养基的过程直接在超净台中进行，注意无菌操作！） 在实验室找一个塑料篮，在其中放入酒精喷壶、完全培养基、PBS液（如果细胞需要计数的话还可以带入计数板和刻度离心管）、所需规格的细胞培养皿将装好物品的塑料篮带入细胞间。 用酒精喷壶喷洒培养基和PBS瓶口处，然后放入超净台中（注意平放，防止液体与瓶口接触造成污染），并喷洒所带的手套。 取出超净台中的酒精棉球擦拭培养基、PBS瓶口，擦拭培养皿口，并擦拭超净台工作区。 从细胞培养箱中取出细胞，并在显微镜下观察细胞生长情况，然后将细胞带入工作间，注意按紧平皿。 细胞放在工作区中间位置，两只手的操作在其两侧不能在试剂瓶或者培养皿的上方活动。培养基、磷酸盐缓冲液、无菌培养皿、酒精棉球、血清管放在左手侧，细胞放在中间区域，垃圾存放盒、枪头、移液器放在右手侧。 将细胞培养皿微微背对自己打开，将枪头背对自己打开吸出其中原有的培养基，之后取一定量的磷酸盐缓冲液沿着培养皿壁打入培养皿中。注意：在取液体时枪头不要碰到试剂瓶，且移液器的其他部位也不要碰到试剂瓶，谨防试剂污染。磷酸盐缓冲液进入培养皿后缓慢转动培养皿以清洗细胞碎片和杂物，反复进行两遍或三遍。 枪头背对自己打开，吸取一定量的新鲜培养基沿着培养皿壁注入，盖好培养皿后取出，观察细胞情况后放入细胞培养箱中继续生长。 不同规格培养皿的倒液量（参考）： 10cm细胞培养皿中一般冲洗液加入2mL，培养基加入10mL 5cm细胞培养皿中一般冲洗液加入1mL，培养基加入5mL（实际操作时4毫升就可以了）2011年7月12日 今天独立地对昨天的293细胞换液,换液后细胞碎片少了,可是细胞却是扎堆在一起,可能要吹一下效果才比较好。 今天独自配制了1×PBS（8.0g氯化钠、0.2g氯化钾、0.24g磷酸二氢钾、1.44g磷酸氢二钠，加双蒸水至800毫升后调节pH值到7.2左右，再定容至1升），学习了pH计的使用方法，先校准后测量。 今天还看了马师兄配制DMEM培养基的过程，先将一袋DMEM粉倒入1000mL的烧杯中（烧杯先用洗涤剂洗，后用自来水冲刷几遍，再用单蒸水过一遍，最后用双蒸水过），然后向烧杯中称量放入3.7g碳酸氢钠，加入约900mLdd水后用浓盐酸调节pH到7.2，大约加入200uL浓盐酸，再定容至1L。配好后去已经放好手套、1L蓝盖瓶、高压过的过滤器、60mL注射器、酒精棉球、垃圾存放盒并紫外照的超净台中抽滤。烧杯进超净台之前需要用酒精棉球擦拭全身，然后放入超净台中开始抽滤，蓝盖瓶要注意防止污染。 2011年7月13日 今天上午对昨天换液的细胞(293)进行消化处理，处理前的准备和换液前的准备一样，首先取出培养基和磷酸盐缓冲液温浴，同时将移液器、枪头、手套、酒精棉球、垃圾存放盒以及从4度中取出的胰蛋白酶进行紫外照30分钟。 取一个塑料篮放入已经温浴的培养基和磷酸盐缓冲液、酒精喷壶进入超净台，进入超净台之前

细胞培养基本操作

细胞复苏是将休眠的细胞重新活化，使之重新生长，进入细胞周期，进而分裂产生子细 胞的过程。细胞复苏后，可进入细胞周期，重新获得细胞类型特异的生物学功能。 一、实验前准备 实验开始前，水浴箱调节至36度恒温。取细胞完全培养基，放于水浴箱中预热。 消毒双手和超净台。取约1ml 细胞完全培养基放于15ml 离心管中。 水浴箱调节至40度恒温，由液氮中取出冻存的细胞，迅速将冻存管投入到已经预热到40度的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，注意管口处高于水面，以免进入导致污染。整个解冻过程最好在1分钟以内，以防融化过程中产生大量冰晶损伤细胞，约1min后冻存管内液体完全溶解，用酒精喷拭冻存管的外壁，立即拿入超净台内。 注：解冻到0度时（即冻存管里还有最后一点冰）立刻转移到含培养基的离心管中。然后用5ml的热培养基以0.5ml的加入量逐步将细胞内的DMSO渗透出来，之后补全生于的培养基到细胞瓶中。 二、制备细胞悬液 吸取细胞冻存液，置于已放入细胞完全培养基的离心管中，吸取1ml培养液加入冻存管，将剩余细胞全部吸入离心管中。上下吹打5次，使冻存液与完全培养基充分混匀，尽量减少冻存液中DMSO 的浓度，减轻细胞损伤。 离心：1000rpm，室温离心3min。 注：细胞复苏后最好等几分钟再离心，因为冻存前加了胰酶消化，对细胞造成一定损伤，复苏后立即离心对细胞造成损伤较大。 三、细胞培养 离心后，倒掉上清液，缓慢操作，不要倒掉底部的细胞沉淀。向离心管内的细胞沉淀加入1ml 细胞完全培养基，反复吹打制成细胞悬液。培养瓶内加入4ml 完全培养基，细胞悬液加入培养瓶内，左右前后轻轻摇动培养瓶，把细胞摇均匀，将培养瓶放入37℃，5％CO2 的培养箱中培养。24-48 小时后换液或传代继续培养，换液传代的时间由细胞情况而定。 四、注意事项 1、解冻速度要快 在常温下，冻存液中的DMSO 对细胞的毒副作较大，因此，必须在一到两分钟内使冻 存液完全融化。如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤。 2、一次复苏细胞不宜过多 细胞在解冻时，需要迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。并且一次复苏细胞过多，容易忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。 3、培养瓶上注明细胞类型，日期，人名。

细胞传代培养标准操作规程

细胞传代培养（消化法）标准操作规程 一、原理 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。 传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 二、材料和试剂 1. 无菌磷酸生理缓冲液(PBS) 2. 胰酶-EDTA溶液(0.05%胰酶-0.53mM EDTA-4Na): 以10ml分装于15 ml无菌离心管中，保存于–20℃，使用前放在37℃水槽回温。 3. 新鲜培养基 4. 无菌吸管/离心管/培养瓶 三、操作步骤 1. 传代前准备 （1）预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。 （2）用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。 （3）正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。 （4）点燃酒精灯：注意火焰不能太小。 （5）准备好将要使用的消毒后的空培养瓶。 （6）取出预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。 （7）从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。 （8）打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。 2. 胰蛋白酶消化 （1）加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。

（2）显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。 （3）吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。 3. 吹打分散细胞 （1）吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。 （2）吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。 （3）平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8 分钟。 （4）弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。 4. 分装稀释细胞 （1）显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好标记。 （2）分装：将细胞悬液吸出分装至2～3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。（3）继续培养：用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。 5. 悬浮型细胞的传代 （1）吸出细胞培养液，放入离心管中，离心1000 rpm 5 分钟。 （2）吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。 注意事项： 1.严格的无菌操作。 2.适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。

细胞培养心得

目录 293和293T 293T细胞的培养心得293T细胞的培养与传代Jurcat细胞的传代 悬浮细胞培养方法Jurcat细胞培养方法

293T细胞的培养心得 点击次数： 12 发表于：2008-08-24 23:25转载请注明来自丁香园 来源：丁香园 293T细胞差点被我养死，幸好我又将它起死回生，一点心得。 细胞传代：当细胞在细胞培养瓶内长满达到80％时就要传代，一传二，24小时后再传代。48小时传就不好了，如果在24小时后细胞没有长到80％，应该换新的培养基，不然，培养基变黄，细胞脱落。 细胞消化：将细胞培养瓶竖立放置，吸走培养基，如果培养基中的脱落细胞较多，说明细胞现在很容易脱落，只要加入1ml的PBS+EDTA(0.02%)，来回轻微晃动培养瓶直到细胞完全脱落，加入10mlMEM(10%杭州四季青胎牛血清），混匀，不能吹打，分装2瓶，如果细胞没长满就脱落，则只需加入5mlMEM，不分装。如果培养瓶中的细胞贴壁较牢固，培养基上清没有细胞脱落碎片，且细胞长满达到80％以上，吸走培养基，加入5ml 的PBS+EDTA(0.02%)，迅速轻微晃动，竖立培养瓶，吸走，加入1ml0.05%胰酶，37度消化不超过3min，细胞完全消化脱壁，取出加入10ml培养基轻微吸打混匀，分装2瓶。 培养基：MEM(GIBCO)+10%胎牛血清（杭州四季青）＋双抗 293T细胞的培养与传代 点击次数： 24 发表于：2008-08-25 20:47转载请注明来自丁香园 来源：丁香园 293细胞是转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系，293T细胞由293细胞派生，同时表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区的质粒可以复制。 大家注意293T细胞的一个重要特性：室温下不贴壁，但37度时可以重新贴壁。

细胞培养的注意事项

相关疾病： 每天对待细胞比孝敬爹妈还用心，那真是捧在手里怕碎了，含在嘴里怕化了，看在眼里怕丢了，培养细胞时有哪些惨痛经验教训可以分享呢? 早走早脱身，从此专注黑生物 1. 严格无菌操作，多喷喷酒精，要是对灭菌的东西不放心，自己包自己送自己烘干。 2. 不要和别人共用试剂耗材，自己准备一套。 3. 有可能的话在拿到新细胞的时候做好支原体衣原体检测。 4. 水浴锅很脏，生化培养箱要是得手动加湿的话盘里的水也会很脏，勤换(灭菌水加进去)。 5. 晚上离开的时候最好给细胞房照紫外，超净台是用完就开。 6. 最好的是同一时间就你一个人在用细胞房在养细胞。 非科班出身经验分享 1. 别怕浪费。枪头什么的只要有可能污染就换，如果用酒精灯就什么都稍微烤一下，别直接放到火上，离一段距离。 2. 动作要既轻柔又有力。动作太重会有一堆一堆的气泡，动作太轻就吹不下来... 刚开始的时候吹细胞太痛苦了，稍微一下就起泡。后来就是吹的时候枪里的培养基不要一次全都压出来，留一点，枪的最头部尽量深的在液面以下。 3. 离开过操作台的东西再进操作台之前一定要用酒精喷一遍，包括一切实验耗材、仪器、以及你带着手套的手。 4. 实验结束后对实验台的消毒。紫外什么的，用前用后都照个30 分钟。 5. 身体的各个部分尽量的少接触不需要接触的地方的地方。比如实验台，又比如培养箱内部。 6. 细胞的密度根据细胞的性质、传代的时间以及自己的心情来定。培养基的话最多最多不要超过2 天就要换一次。细胞可以不传代，但是培养基是一定要换的。 大概就是，不该碰的地方不碰，有影响的地方少碰; 该使劲的时候绝对不含糊，不该使劲的地方一定忍住。如果是比较简陋的操作台就一定要摆个酒精灯，所有操作紧密围绕在酒精灯周围进行。如果是高级台子就多用酒精喷喷。感觉生物的实验，心疼钱就还是不要做了。 最后一点点绝对非科班的经验。癌细胞真是坚挺。有一次实在是不想传了，放了 5 天

动物细胞培养总结!!!!

动物细胞培养总结 一．实验准备 1.实验器械、器皿的清洗和消毒 （1）清洗和包装 离心管，2ml,15ml)若干，冻存管若干放进铝饭盒，用牛皮纸包裹，系紧棉绳，用笔在饭盒上和牛皮纸上标记盒内所装物品名称、数量、日期和所属人名称。 蓝枪头两盒，黄枪头白枪头各一盒用牛皮纸包裹，用棉绳扎紧。 取适量蒸馏水于4L玻璃瓶，瓶盖拧松半圈。 过滤器，250ml玻璃瓶，500ml玻璃瓶用自来水毛刷洗涤剂刷洗，蒸馏水润洗，烘干。 过滤器两部分分别包裹，先将瓶口部位用锡纸包裹后，再罩以牛皮纸，再用棉布密包起来，用棉绳扎紧。 玻璃瓶拧下瓶盖，瓶身浸酸。浸酸时应注意安全，须穿戴耐酸手套和白大褂，注意保护好面部和身体裸露部分，提前备好一盆水在旁以便浸酸结束后清洗耐酸手套，防止走动时酸液滴到地板上不好清洗。瓶口慢慢沉入液面下，注意缓慢降低瓶身，使液体慢慢浸入瓶内，以免产生气泡溅出酸液，发生危险。浸酸时器皿要充满酸液，勿留气泡，浸泡过夜。取出瓶身时，须穿戴耐酸手套和白大褂，注意保护好面部和身体裸露部分，提前备好一盆水在旁，取出后将瓶身放入盆内水中在转移至水池边清洗，以免酸液滴落地板不好清洗。换水洗几次，待水澄清后开始冲洗，每瓶都用自来水灌满，倒掉，重复15次，再用

蒸馏水漂洗5次，去离子水漂洗3次，烘干备用。 （2）消毒灭菌 1>全自动高压灭菌锅：插电源，打开开关，检查水位，若水位不足加蒸馏水补足，放入物品，瓶类物体须拧松盖子后放最上面一筐，盖上灭菌锅盖，拧紧盖子至温度显示栏的左上角有一红点亮灯，按start开始升温。若灭有无菌水或玻璃瓶待降温至常温再打开，打开后立即拧紧，无菌水瓶口封上封口膜。若没灭瓶类物品，降温至80度左右即可打开灭菌锅，须戴上线手套取出。 2>手提式高压灭菌锅：插电源，打开开关，检查水位，若水位不足加蒸馏水补足，检查设定是否为121度20分钟，放入物品，盖上灭菌锅盖，注意导气管一定插到锅底并不能堵塞，用手对称地拧紧锅盖螺栓，再用扳手继续拧紧。加温升压之前，先打开排气阀门，加温约半小时后见排气阀处开始排残留在锅内的冷空气，排气五分钟，关闭排气阀，继而开始升压。灭菌后不要立即打开气阀放气以免水汽喷出。待自然降温至常压才能打开气阀。 玻璃瓶须拧紧，饭盒，枪头灭菌后放入烘箱烘干备用。 2.无菌间消毒及设备检查 用84消毒液拖地，用原液按照1：29的比例兑水，抹布、拖把擦洗。配400ml 75%酒精于盆中，用酒精棉仔细擦拭CO2培养箱，超净台，超净台内物品，显微镜，桌面，若培养箱内未培养细胞可以再打开高温灭菌模式将培养箱灭菌一次。 用蒸馏水擦拭清洗水浴锅内壁，注意底座不要沾水。

细胞培养的流程

细胞培养的流程，从购买试剂、分装，到无菌操作、实验、观察的过程？ 对于新手来说，细胞培养真是太难了，很多的细节你不可能一下子就考虑到、预见到，因此请教细胞培养的高手就显得非常重要且可贵了。 细胞培养包括仪器的清洗、消毒灭菌，试剂的购买、配制、分装，细胞的分离，无菌操作，培养细胞的观察，实验的设计，及结果的分析等等。但这每一个过程的含金量都很高，要求非常严格。 如果你正在培养细胞，或曾经培养过细胞，你一定有很多的经验值得大家分享，你一定有你自己的一套培养细胞的流程，从哪开始到哪结束你也一定有太多的想说。因此，你不妨说说你的细胞培养流程，以便我们广大的细胞培养新借以一鉴。 于此，我先代表广大细胞培养新手谢谢各位园丁里的奉献者！ 有空整理一下再写写。。呵呵谢了先版主建议不错，我刚开始养细胞时遇到的各种困难可以说是不计其数了，解决困难耗费了大量地时间，可惜呀！ 养细胞是一项即有难度又很讲究技术的过程，作起来不易，要真正详细的写出来示人更难！书上的规范和标准很多，但作起来每人都有自己的方法，适宜就好。 我看还没有人跟帖，我就先说一点，从最初阶段开始：（自己的做法） （一）仪器的清洗 总的分为两大类：可泡酸的和不可泡酸消毒的。酸指消毒的清洁液（由浓硫酸、重铬酸钾和蒸馏水配置的次强酸液） 可泡酸的主要是玻璃仪器培养细胞的板子，离心管等塑料器皿。消毒过程：自来水冲洗3-5遍----→超声波清洗30′----→烘干----→濅入清洁液过夜（不少于6h）----→自来水冲洗15－20遍----→蒸馏水洗3-5遍，烘干备用。 不可泡酸的主要是胶塞和盖子，虑器等，先在清水中濅泡后冲洗烘干----→2%NaOH濅泡过夜，自来水冲洗，5%HCl濅泡三○min，流水冲洗----→蒸馏水漂洗----→烘干备用。 消毒好的器具一定找个干净的柜子保存，使用前高压消毒灭菌，我科室主要使用铝制饭盒分装器具，挺方便的，用前高压。 今天暂说一点，以后有机会再续，望给师弟妹们有所借鉴。斑竹不厚道，现在知道为什么没有别的战士跟贴了么？我怎么也耗了几十分钟打的字，你就这样打击别人的信心，还有可能往后面延续么！再说，经验何止这些这点...... 您的帖子我看见了，您的抱怨我也接受！并且跟您补上一分！ 每个斑竹给分的标准有一定的差别，但是可以肯定的是：我们有自己的加分原则，大原则是不变的！比如：版内讨论得很多的东西，重复发帖一般不予以加分！ 您的这个帖子属于改范畴！ 感谢您对细胞版的支持！如果有问题可以直接pm我们！ 再次感谢！再多说点啊！ 呵呵接着说呀，很好，很有帮助，我是新手，要多向你学习顶一下。我也说说我的一些体会吧。 1、首先说清洗： 对于玻璃器皿（如移液管、盖玻片之类）可先用酸液浸泡24h以上，再用清水浸泡24h。之后用清水将移液管冲洗10遍，除去残留酸液，再用双蒸水冲洗3-5遍，彻底洗净后放入不锈钢筒中，双层牛皮纸扎口，高压灭菌20min，烘干待用。我们实验室的酸液一般是次强酸液（重铬酸钾120g 浓硫酸200 mL 蒸馏水1 000 mL）配液时要小心烫伤。装培养基的瓶子则要在每次用完培养基以后就要立即洗净，临用时再次用清水冲洗3-5遍，再用双蒸水漂洗3次，洗净后瓶口盖上锡箔纸，外包双层牛皮纸扎口后高压灭菌20min，与其配套的瓶盖则洗净后另行包好同时灭菌、烘干。培养基过滤器灭菌同瓶子，也要在用完后及时洗净、