磷酸三苯酯对斑马鱼早期生命阶段的神经毒性研究
2016年第11卷
第1期，
254-260生态毒理学报
Asian Journal of Ecotoxicology
Vol．11，2016
No．1，
254-260基金项目：国家自然科学基金项目（No．21377118）
作者简介：彭涛（1989-），男，硕士生，研究方向为生态毒理学，E-mail ：52382967@qq．com *通讯作者（Corresponding author ），E-mail ：sunliwei@zjut．edu．cn
DOI ：10．7524/AJE．1673-5897．20150506001
彭涛，王思思，任琳，等．磷酸三苯酯对斑马鱼早期生命阶段的神经毒性研究［
J ］．生态毒理学报，2016，11（1）：254-260Peng T ，Wang S S ，Ｒen L ，et al．Neurotoxicity of triphenyl phosphate on the early life stages of zebrafish ［J ］．Asian Journal of Ecotoxicology ，2016，11（1）：254-260（in Chinese ）
磷酸三苯酯对斑马鱼早期生命阶段的神经毒性研究
彭涛1，王思思1，任琳2，芮倩倩2，邵璐滢2，孙立伟3，"，傅正伟
1
1．浙江工业大学生物工程学院，杭州3100322．浙江工业大学海洋学院，杭州3100323．浙江工业大学环境学院，杭州310032收稿日期：2015-05-06录用日期：2015-
05-29摘要：磷酸三苯酯（triphenyl phosphate ，TPP ）作为多溴联苯醚类阻燃剂的替代产品，
是一类生产和需求量均相当高的有机磷酸酯类阻燃剂，目前已在多种环境介质以及生物体内均有不同程度检出。由于结构和有机磷农药具有相似性，其对生物的神经毒性值得关注。本研究以斑马鱼为实验动物，研究了TPP （5 625%g ·L -1）的胚胎发育毒性和行为毒性，并通过检测乙酰胆碱酯酶活性以及神经系统相关基因的转录水平，探讨其可能的毒性机制。研究发现，TPP 可导致斑马鱼胚胎孵化时间延长，体长变短，心率变慢。同时，TPP 暴露也可以影响斑马鱼幼鱼在持续光照和明暗周期刺激下的游泳行为，表现为低浓度增加而高浓度降低其游泳速度。而TPP 暴露后幼鱼乙酰胆碱酯酶活性以及神经发育相关基因转录水平的变化可能是导致其行为毒性的原因。虽然实验中所设定的暴露浓度高于环境中一般浓度，但TPP 在短期暴露中所表现出的胚胎和神经发育毒性表明TPP 对于水生生物可能存在一定风险，需要进一步研究加以确认。
关键词：有机磷酸酯阻燃剂；胚胎毒性；行为毒性；基因转录；乙酰胆碱酯酶文章编号：1673-5897（2016）1-254-07中图分类号：X171．5
文献标识码：A
Neurotoxicity of Triphenyl Phosphate on the Early Life Stages of Zebrafish
Peng Tao 1，Wang Sisi 1，Ｒen Lin 2，Ｒui Qianqian 2，Shao Luying 2，Sun Liwei 3，"，Fu Zhengwei 1
1．College of Biotechnology and Bioengineering ，Zhejiang University of Technology ，Hangzhou 310032，China 2．Ocean College ，Zhejiang University of Technology ，Hangzhou 310032，China 3．College of Environment ，Zhejiang University of Technology ，Hangzhou 310032，China
Ｒeceived 6May 2015accepted 29May 2015
Abstract ：Triphenyl phosphate （TPP ）belongs to the family of organophosphate flame retardants （OPFＲs ）．Due to the phase-out of some brominated flame retardants ，the production and use of TPP has gradually increased as alter-natives．TPP is a frequently detected contaminant in the environment and wildlife ，and the effects of TPP on the de-veloping nervous system are of concern since OPFＲs are structurally similar to organophosphate pesticides．In this study ，the zebrafish were employed as experimental animal ，and the developmental toxicity of TPP （5 625%g ·L -1）on embryo and the behavioral toxicity on larvae were investigated．Moreover ，in order to explore the underlying mechanisms ，the activity of acetylcholinesterase （AChE ）enzyme and the transcriptional responses of nervous sys-
第1期彭涛等：磷酸三苯酯对斑马鱼早期生命阶段的神经毒性研究255
tem genes were measured．The results showed that TPP exposure delayed the time to hatching，and decreased the heart rate and body length．Additionally，TPP exposure caused the changes of swimming behaviors of larvae in the free swimming or the dark–light–dark photoperiod stimulation test，and resulted in the increase of swimming speed at low concentration while the decrease at high concentration．The changes of AChE activity and transcrip-tional responses of nervous system genes might afford the explanation for the behavioral toxicity．Although the expo-sure concentration of TPP used in this study exceeded the environmental concentration，the developmental toxicity on embryo the behavioral toxicity on larvae after short term exposure demonstrated that TPP might pose a risk to a-quatic organism，and deserved more investigations in the future．
Keywords：organophosphate flame retardants（OPFＲs）；embryonic toxicity；behavioral toxicity；acetylcholinesterase（AChE）
磷酸三苯酯（triphenyl phosphate，TPP）是一类生产量相当高的有机磷酸酯类阻燃剂，被广泛用于聚氯乙烯、印刷电路板、胶卷以及液压液中［1］。在2005年，美国环保局就曾预测，由于多溴联苯醚类阻燃剂被逐步禁用，作为其替代产品，TPP的需求量和生产量都将逐步增加［2］。TPP本身具有高挥发性，此外，与多溴联苯醚类阻燃剂类似，TPP是通过添加而非化学键结合的方式加入到最终产品中，这也大大增加了其进入环境介质的能力［3］。多项研究表明，TPP在空气、地表水、沉积物、灰尘以及多种生物体内均有不同程度的检出［3］，因此，TPP的环境暴露可能对人类和其他生物产生健康风险，特别在其发育的敏感窗口期尤为引人关注［4］。
研究表明，TPP可通过其在塑料中的沥出和挥发以及液压液的泄露等途径进入水体环境中［5］。国外研究发现TPP在河流中的浓度一般在低于检测限到几十ng·L-1之间［3，6］，而丹麦环保局则曾检测到7900ng·L-1的高浓度［5］。对于污水处理厂而言，TPP浓度相对较高，挪威的一项研究发现进出水中其浓度分别高达3100 14000ng·L-1和1700 3500ng·L-1［7］。在我国的地表水中，TPP也是检出频率最高的有机磷酸酯阻燃剂之一。在华北地区，95%的河流水样中有TPP检出，最高浓度为15．7ng ·L-1，这与松花江和珠江的结果类似［8-10］。此外，TPP在我国多个城市的自来水中也均有检出，平均值为40．0ng·L-1［11］。TPP也存于瓶装水中，其浓度可高达14．8ng·L-1［11］。
虽然有学者认为TPP并不是持久性或者可生物富集的［12］，但目前发现其在野生生物体内也有检出。早在1999年，丹麦环保局就曾在鱼体中检测到TPP，其浓度高达600%g·kg-1［5］。而挪威和瑞典所进行的一系列研究则表明TPP可在鱼类、蟹类以及水鸟中存在［3，7，13-15］。对于北美地区，在淡水鱼以及大湖区水鸟的血清和鸟蛋中均发现有TPP［16-17］。但是，关于TPP对生物的毒性，相关研究则非常有限。
有机磷酸酯阻燃剂在结构上和有机磷杀虫剂类似，而后者已被证实可损害脑部发育，具有神经毒性［18］。因此，有机磷酸酯阻燃剂是否也具有神经毒性值得关注。目前，已有研究表明TDCPP等有机磷酸酯阻燃剂可以导致神经毒性［18-19］，然而，有关TPP 对于硬骨鱼类的神经发育毒性还鲜有报道。因此，本论文将以国际上通用的模式鱼斑马鱼为实验动物，通过胚胎发育毒性、幼鱼行为毒性、乙酰胆碱酯酶（AChE）活性等指标，并结合神经系统相关基因的转录水平变化，探讨TPP对于斑马鱼幼鱼的毒性，从而为有机磷阻燃剂的生态风险评价提供依据。
1材料与方法（Materials and methods）
1．1化学试剂
磷酸三苯酯（TPP，纯度＞99%，CAS：115-86-6）购自美国Sigma公司，用二甲基亚砜（DMSO）配制成母液，-20?保存。
1．2实验动物
AB系斑马鱼购于中科院水生所，养殖用水为经活性碳过滤并曝气的自来水，水温控制在（28?1）?，光周期为14h：10h（昼：夜），溶氧不低于7 mg·L-1。饲养期每天投喂饲料3次，即颗粒商品饵料2次和刚孵化的丰年虫幼虫1次，并及时清除多余饵料和排泄物。
1．3斑马鱼胚胎发育毒性实验
收集斑马鱼鱼卵，镜检并挑选发育正常的受精后2h斑马鱼胚胎。胚胎暴露于TPP溶液中，浓度设置为5，25，125和625μg·L-1。暴露在96孔板中进行，每孔1个胚胎，相应的暴露液为100μL。同时设溶剂对照（0．01%DMSO）。每个浓度3个平行，每个平行20个胚胎。暴露持续120h，期间每天换水。每天观察并记录畸形数和孵化数，测定胚胎
256生态毒理学报第11卷
48h的心跳，并在120h时测定其行为毒性。在暴露结束后测量幼鱼体长。
1．4斑马鱼幼鱼行为毒性实验
在120h时将96孔板置于Zebralab高通量行为分析仪（ViewPoint Life Sciences，France）中进行行为毒性测试。主要测试鱼在自由游泳行为和在光周期下的游泳行为。自由游泳行为是指在20min 连续光照下的运动行为，而光周期实验持续30min，明暗周期设置为10min暗-10min亮-10min暗，检测斑马鱼对暗亮转换刺激的反应。在实验之前需进行10min的适应，实验后剔除不能正常发育幼鱼的行为数据。
1．5斑马鱼幼鱼乙酰胆碱酯酶活性检测
按照上述暴露条件另处理斑马鱼胚胎至120h，采样并整体匀浆，检测其乙酰胆碱酯酶活性。每个处理组3个平行，每个平行30条幼鱼（剔除未正常发育个体）。乙酰胆碱酯酶活的测定是基于将乙酰胆碱转变为蓝色产物三硝基苯的显色反应。按照乙酰胆碱酯酶检测试剂盒说明书（南京建成），在酶标仪上（Powerwave，Biotek，US）进行检测。检测光波长为412nm。总蛋白浓度用BCA法进行测定。1．6神经系统相关基因的转录水平检测
将检测完行为毒性的幼鱼（剔除未正常发育个体）整体匀浆，每个浓度3个平行，每个平行15条幼鱼，按照Trizol（Takara，Japan）厂家使用说明，提取总ＲNA。以紫外分光光度计测定ＲNA浓度，并以A260nm/A280nm比值（1．8 2．0）以及琼脂糖凝胶电泳确定ＲNA纯度。每个样取500ng的ＲNA进行cDNA第一链合成（ＲeverTra Ace qPCＲＲT kit，Toyobo）。基于之前的研究［20］，选择乙酰胆碱酯酶基因（ache）以及mbp，syn2a，shha，gap43，elavl3，α1-tublin，gfap等与神经发育相关的基因，进行荧光定量PCＲ分析。所用的仪器为Mastercycler ep real-plex（Eppendorf），并使用SYBＲGreen荧光定量PCＲ试剂盒（Toyobo，Japan）。PCＲ反应条件为95?C3min；95?C15s，60?C1min，40个循环。相对转录水平以管家基因&-actin进行校正。
1．7统计分析
组间差异分析通过单因素方差分析（ANOVA）并以Dunnett’s检验进行多重比较。设P＜0．05时有统计学差异。
2结果（Ｒesults）
2．1TPP对斑马鱼胚胎发育的影响
TPP不同浓度暴露后对斑马鱼的胚胎发育毒性结果如表1所示。从表中可以看出，TPP暴露后斑马鱼胚胎随暴露浓度升高其孵化时间延长，心率变慢，体长变短，并在高浓度有显著性差异。同时畸形率有上升趋势而孵化率下降，但未见统计学差异。2．2TPP对斑马鱼幼鱼游泳行为的影响
自由游泳行为是在连续20min光照条件下对斑马鱼幼鱼的运动轨迹追踪。从图1A中可以看出，低浓度（5μg·L-1）TPP暴露后可使幼鱼游动速度显著加快，之后随着暴露浓度的升高，其游泳速度降低，并在最高暴露浓度（625μg·L-1）与对照有显著差异。同时我们还进行了光周期刺激实验，结果见图1B。从图中可以看出，由暗转明时，幼鱼游泳速度变慢，而由明转暗时，其速度则变快。与自由游泳相类似，在光周期刺激实验中，TPP暴露后幼鱼的游泳速度不论是在光期还是暗期均呈现低浓度上升而高浓度下降的趋势。在前后两个暗期中，最低浓度组的幼鱼与对照组相比游泳速度显著上升，而最高浓度则显著下降。在明期中，最低浓度组有上升但没有显著差异，而最高浓度组则显著下降。
表1TPP对斑马鱼胚胎的发育毒性
Table1Developmental toxicology of TPP on zebrafish embryo
暴露浓度/（μg·L-1）Exposure concentration/（μg·L-1）
孵化率/%
Hatchability/%
孵化时间/d
Time to hatching/d
畸形率/%
Abnormality rate/%
体长/mm
Body length/mm
心率/（次獉min-1）
Heart rate/（beat獉min-1）
095．0?4．13．09?0．123．5?0．984．03?0．10190?2．3
598．0?1．43．21?0．064．7?1．074．05?0．04187?4．6
2590．1?5．13．32?0．193．6?0．653．98?0．09185?6．9
12589．4?5．43．40?0．103．9?0．543．90?0．11176?2．0*
62589．8?4．83．75?0．13*6．1?1．033．75?0．01*170?1．1*
注：结果以平均值?标准误差表示；星号表示在TPP暴露组和对照组间有显著差异（*：P＜0．05，＊＊：P＜0．01）。下同。
Note：The results are represented as means?SEM．The asterisk symbols denotes significant differences compared with the control group（*：P＜0．05，＊＊：P＜0．01）．The same below．
第1期彭涛等：磷酸三苯酯对斑马鱼早期生命阶段的神经毒性研究
257
图1TPP 暴露对斑马鱼幼鱼（A ）自由游动速度和（B ）光周期刺激实验中游泳速度的影响Fig．1
Effects of TPP on the speed of zebrafish larvae in （A ）the free swimming or （B ）the
dark-light-dark photoperiod stimulation
test
图2TPP 暴露对斑马鱼幼鱼体内乙酰胆碱酯酶活性的影响Fig．2
The changes of acetylcholinesterase （AChE ）activity in zebrafish larvae following exposure to TPP
2．3TPP 暴露对斑马鱼幼鱼乙酰胆碱酯酶活性以
及神经系统相关基因的转录水平影响
一般认为乙酰胆碱酯酶是水环境中暴露于神经
毒性化合物的生物标志物。从图2中可以看出，25μg ·L -1的TPP 可诱导乙酰胆碱酯酶活性上升，但未见显著差异，而更高浓度的TPP （125和625μg ·L -1）则可抑制酶活。而对于乙酰胆碱酯酶的基因转录
（图3）而言，最低浓度（5μg ·L -1
）TPP 暴露使ache
的mＲNA 水平升高，而最高浓度（625μg ·L -1）TPP 则降低其转录水平。
此外，我们还研究了一系列神经系统相关基因
的转录水平（见图3）。其中’1-tubulin ，elavl3，shha 和gap43是在神经元干细胞或者发育的神经元中表
达，从图中可以看出在所设定的TPP 暴露浓度范围内，随着暴露浓度升高，’1-tubulin
基因转录水平呈
图3
TPP 暴露对斑马鱼幼鱼体内神经系统相关基因转录水平的影响
Fig．3
Transcriptional responses of genes related to nervous system in zebrafish larvae following exposure to TPP
258生态毒理学报第11卷
先上升后下降的趋势，且在最低和最高浓度处理组与对照组相比有统计学差异。而对于gap43，elavl3，shha等3个基因而言，随着TPP暴露浓度的上升，虽然其mＲNA水平也呈现先上升后下降的趋势，但仅有gap43基因在最高浓度组与对照组有显著差异。基因syn2a是突触形成的生物标志物，TPP暴露后其转录水平在高浓度组有显著上升。而gfap 和mbp是在组成神经系统的其他类型细胞中表达，在TPP暴露后，mbp水平在最高浓度组显著上升，而gfap在除最低浓度之外的3个浓度组均比对照组显著升高。
3讨论（Discussion）
TPP可能对人类影响较低，但对于水生生物则具有很强的毒性［3］。目前对于TPP的水生生物毒性研究多集中在急性毒性上。有研究认为TPP是对鱼类、虾类以及大型溞毒性最大的三苯基类有机磷酸酯［5，21］。然而，亟需更多的毒性数据以判明其生态风险。
目前，国际上普遍认可鱼胚胎在毒性测试中的应用不受动物福利相关法规的限制。同时，由于鱼胚胎毒性数据和传统的鱼类急性毒性间存在良好的相关性，斑马鱼胚胎作为毒理学动物模型其应用越来越广泛。本研究发现较高浓度的TPP可导致斑马鱼胚胎孵化时间延长，体长变短，心率变慢，而其中心率是相对敏感的毒性指标。然而，其对于畸形率和孵化率没有影响。类似的，之前的研究也显示斑马鱼胚胎在高达20mg·L-1的TPP暴露浓度下，孵化率和存活率均没有显著变化，而2mg·L-1也未见畸形率上升［22］。而对于心率的变化，已有研究显示500%g·L-1的TPP可以导致斑马鱼胚胎发育期心脏的发育畸形，同时也可以改变与心脏发育相关基因的转录水平［4，23］，因此，我们所观察到的心率变化可能和以上机理有关。
一般而言，鱼类游泳行为的变化与毒物暴露呈现一定的关系。我们的研究发现，不论是在持续光照下还是在光周期刺激下，随TPP的暴露浓度的升高，斑马鱼幼鱼的游泳速度均呈现先上升后下降的趋势，并在最低和最高浓度和对照组有显著差异。斑马鱼幼鱼在暴露于低浓度污染物时平均游泳速度上升，一般是表明其对污染物的逃避反应，是鱼通过行为对环境的一种适应性机制。而在最高浓度游泳速度下降，则很可能意味着此浓度的TPP已对斑马鱼幼鱼的机体（特别是神经系统）造成一定的损伤。此外，和胚胎发育毒性的结果相比较也可以看出，斑马鱼幼鱼游泳行为是相对敏感的毒性指标。之前关于有机磷酸酯阻燃剂的研究也发现，TDCPP和TCEP均可导致斑马鱼幼鱼平均游泳速度下降［19］。
乙酰胆碱酯酶（AChE）在神经系统的信息传导中起重要作用［24］。研究发现有机磷和氨基甲酸酯农药对生物的AChE具有明显的抑制作用，从而破坏生物的神经功能，导致一系列生物学效应。如前所述，既然有机磷酸酯阻燃剂和有机磷农药在分子结构上存在相似性，因此，有必要确定TPP是否能如有机磷农药一样抑制AChE活性。从结果中可以发现，TPP在125和625μg·L-1可使AChE活性降低。从转录水平上看，高浓度TPP暴露后ache的mＲNA水平也显著下降，与酶活数据相符，但低浓度对ache转录水平的诱导则可能是反映了斑马鱼幼鱼对TPP暴露的补偿调节。此外，由于功能蛋白在其基因转录后还需经过多个步骤才能表现出其生物学作用，因此酶活数据和mＲNA水平的变化不完全一致在之前的研究中也多有发现，比如多溴联苯醚DE-71暴露后斑马鱼的AChE酶活显著升高，但在转录水平上未见差异［24］。
本论文所研究的神经发育相关基因中，’1-tu-bulin，elavl3，shha和gap43等4个基因是在神经元干细胞或者在发育的神经元中表达。其中，微管蛋白α1-tublin是一种中间丝纤维蛋白，对维持神经细胞结构具有重要意义，已有许多研究将其作为神经细胞骨架的生物标志物［20］。神经系统特异性ＲNA 结合蛋白elavl3是斑马鱼早期神经元的标志基因。音猬因子shaa是一种重要的形态发生素，在调节脊椎动物器官发育中起关键作用。而生长相关蛋白gap43作为蛋白激酶C的主要底物，通常视为神经发育期间轴突生长的生物标记物［20］。因此，高浓度TPP暴露导致gap43和α1-tublin转录水平的下降可能意味着神经元发育受到干扰，而低浓度的诱导效应则很可能表明其对TPP暴露的补偿作用。此外，我们也注意到shha在神经系统以外也有表达，因此，虽然shha转录水平有先上升后下降的趋势，但由于ＲNA提取过程中鱼体整体匀浆，可能导致这种变化未见显著性差异。
此外，突触蛋白syn2a是一种神经磷蛋白质，在突触形成和神经递质释放过程中发挥重要作用［20］。在TPP暴露后，较高浓度可诱导其转录水平。类似的诱导作用也发生在gfap和mbp基因中。神经胶
第1期彭涛等：磷酸三苯酯对斑马鱼早期生命阶段的神经毒性研究259
质纤维酸性蛋白gfap是一种中间丝蛋白，在中枢神经系统的放射状胶质细胞和星形胶质细胞中有高表达，而髓鞘碱性蛋白mbp则是髓鞘形成的生物标志物。这3个基因的转录水平上升，则可反映神经系统对TPP损害效应的补偿。类似的，对于乙醇这种公认对生物体神经发育有显著作用的化合物而言，在暴露后的斑马鱼幼鱼体内，包括gfap在内的多个基因转录水平出现显著诱导［20］。
对于TPP的神经毒性，不同研究有不同的结论。Anderson等［25］研究表明其可能有神经毒性，Ni 等［26］则发现其和延迟神经毒性相关，而Pakalin 等［12］研究发现TPP神经毒性较低。然而，丹麦环保局发现动物实验中没证据表明TPP有神经毒性，而TPP生产车间中的操作人员和对照组相比也未表现出差异［5］。我们的研究则表明TPP暴露能改变神经发育相关基因的转录水平，影响在行为和认知功能的调节中起重要作用的乙酰胆碱酯酶，并导致斑马鱼幼鱼游泳行为的改变。
总而言之，在本研究所设定的浓度范围内，TPP 暴露斑马鱼胚胎可导致孵化时间延长，体长变短，心率变慢。同时，TPP暴露也可以影响斑马鱼幼鱼的游泳行为，而这种行为的变化则很可能是由于神经发育相关基因转录水平以及乙酰胆碱酯酶的变化所导致。虽然我们所设定的TPP浓度其最低值接近于环境中地表水或者污水处理厂进出水的极端高值，但我们的研究结果是基于短期暴露，因此，环境浓度长时间暴露对野生生物还是有可能存在危害。WHO认为TPP在水环境中浓度较低，不会对水中生物造成毒性［27］，而美国环保局则认为TPP作为decaBDE的替代品是有问题的［28］。因此，对于TPP 的生态风险，还需要更多的研究加以确证。此外我们的研究也为其它有机磷酸酯阻燃剂的毒性评价提供了有益的参考。
通讯作者简介：孙立伟（1980—），男，环境科学博士，副教授，硕士生导师。主要研究方向为生态毒理学，已发表论文40余篇。
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文献综述-斑马鱼及其应用
斑马鱼及其研究应用 作者：杜颖指导老师：张源淑 摘要：斑马鱼作为一种新兴的重要模式动物之一，体外受精、胚胎透明，因此可在显微镜下直接观察发育过程及检测药物引起的内脏组织变化，在生命科学领域中应用前景十分广阔。斑马鱼体型小,适合高通量研究,还具有生长繁殖周期短及其与人类高度相似的基因组等优点，已经广泛用于人类疾病模型的建立、新药研发和药物的筛选，此外，斑马鱼还被应用于毒理学、发育生物学和遗传学等的研究。因为斑马鱼对污染物反应灵敏，现已用于监测环境污染物及污水检测。本文主要从几个方面对斑马鱼的研究进展进行了整理和归纳。 关键字：斑马鱼模式动物科学研究发育感染药物 Zebrafish and Its Application Abstract:Zebrafish as an important model animal emerging, its in vitro fertilization, transparent embryo, internal organs can be directly observed during the development and testing organ change caused by drugs under the microscope, has very broad application prospects in the field of life sciences. zebrafish also has a live, high-throughput, growth and short reproduction cycles and highly similar to the human genome, etc., it is widely used in modeling human diseases, drug screening, and secondly, zebrafish also is applied in toxicology research, developmental biology and genetics, etc.. Because of its sensitivity, it has been used to monitor environmental pollutants and water testing.This paper mainly from several aspects of zebrafish research progress has been collated and summarized Key words:zebrafish Animal models Scientific research Development Infection Drug 斑马鱼(Danio rerio)又名蓝条鱼、花条鱼、蓝斑马鱼、印度鱼、印度斑马鱼,产于孟加拉、印度东部、巴基斯坦、缅甸、尼泊尔等地,是一种常见的热带淡水硬骨鱼。属辐鳍鱼纲( Actinopterygii)鲤科( Cyprinidae)。斑马鱼身体细长,呈纺锤形，成鱼体长约4-6cm,因全身布满深蓝色条纹似斑马样而得名。斑马鱼雌雄鉴别容易,雄鱼体型细长，颜色偏黄，条纹较为显著，纵纹为柠檬色；雌鱼身体肥胖，颜色较淡，纵纹呈蓝色加银灰色，在性成熟后腹部肥大。雌鱼每次可产卵300多枚，鱼卵易收集，其胚胎透明,繁殖能力强且生长发育速度快，对饲养要求低，可高密度饲养，与其他实验动物相比有很大优势，是一种非常受欢迎的实验动物模型。近三十年来，已有约20个斑马鱼品系的基因数据库资料，全球已有超过1500个斑马鱼实验室，而我国也有超过250个实验室利用斑马鱼开展相关研究。英国桑格研究所（Wellcome Trust Sanger Institute）于2013年完成了斑马鱼的参考基因组，研究人员在此基础上比较了斑马鱼与人类基因组的异同，并进行了系统性的全基因组分析.在此综合近几十年的研究，在胚胎及遗传发育学、基因组学、药物筛选、疾病模型的建立等方向探讨斑马鱼的研究成果及进展。 1.胚胎及遗传生物学方向 斑马鱼的发育分为6个阶段：卵裂期，囊胚期，原肠胚期、分裂期、成形期
斑马鱼动物模型的应用介绍
斑马鱼动物模型的应用 斑马鱼（Danio rerio）属于辐鳍亚纲（Actinopterygii）鲤科（Cyprinidae）短担尼鱼属（Danio）的一种硬骨鱼，原产于南亚，是一种常见的热带观赏鱼，因其体侧具有斑马一样暗蓝与银色相间的纹条而得名。 斑马鱼个体小，易于饲养，成体长4-5cm，雄鱼体修长，雌鱼体肥大。可在有限空间里养殖相当大的群体，可满足样本需求量大的研究。斑马鱼发育迅速，在28.5℃培养条件下受精后约40min完成第一次有丝分裂，之后大约每隔15min分裂一次，24h后主要器官原基形成，相当于28d的人类胚胎，幼鱼孵出后约3个月达到性成熟。雌雄鱼通过调控光周期控制14:10（光照:黑暗）产卵时间，成熟鱼每周可产卵一次，一尾雌鱼每次可产卵100-300枚。胚胎体外受精，体外发育，胚体透明，易于观察。受精卵直径约1mm，易于进行显微注射和细胞移植等操作。 一、斑马鱼的品系 经过30多年的研究应用和系统发展，已有约20个斑马鱼品系，斑马鱼基因数据库-ZFIN （http://zfin/org）里有相关的资料可供查询和下载。目前研究中常用的斑马鱼野生型品系主要为AB 品系、Tuebingen（Tu）品系、WIK 品系，斑马鱼基因组计划所用品系是Tu。AB 品系是实验室常用的斑马鱼品系，由单倍体细胞经早期加压法获得。Tu品系斑马鱼具有胚胎致死突变基因，用于基因组测序前敲除该致死突变基因。WIK品系较Tu品系具有更多的形态多样性。此外，还保存有3000多个突变品系和100多个转基因品系。这些品系资源对于利用斑马鱼开展各种科学研究起着很大的推动作用。 二、斑马鱼突变品系的筛选 斑马鱼突变的方法主要有三种：已基亚硝脲（ENU）化学诱导、γ或χ射线照射和插入诱变。ENU是一种DNA烃基化试剂，在生殖细胞减数分裂前诱导碱基对的替换，诱导产生的突变率为0.1%-0.2%，涉及单个基因的突变。射线照射导致染色体大片段的缺失或染色体重排，产生突变率达1%。插入诱变是以逆转录病毒为载体，用显微注射法将目的基因片段导入斑马鱼受精卵，整合到基因组中，干扰正常基因表达。射线照射产生的突变率是ENU 化学诱导的10倍，但由于突变涉及多个基因，突变的表型是受若干基因调控的结果，不利于基因功能的分析，因此，ENU化学诱导法是斑马鱼突变的主要方法。研究含有纯合致死
_助溶剂甲苯和二甲基亚砜对斑马鱼胚胎发育的复合毒性效应
第28卷 第6期 2009年 11月环 境 化 学E NV I RONMENTAL C H E M I STRY V o.l 28,N o .6N ove m ber 2009 2009年2月10日收稿. *湖北省科技攻关计划(N o .2006AA301C35)和国家科技支撑计划(N o 2007BAC27B01)资助.**通讯联系人. 助溶剂甲苯和二甲基亚砜对斑马鱼胚胎发育的 复合毒性效应 *李 佳1 周 珍1 胡 芹2 王 玥1 梁 勇 1,3**(1 江汉大学医学院,武汉,430056;2 华中农业大学资源与环境学院,武汉,430070;3 中国科学院生态环境研究中心,环境化学与生态毒理学国家重点实验室,北京,100085) 摘 要 研究了甲苯和二甲基亚砜(DM S O )对斑马鱼胚胎生长、发育的毒性效应.实验结果表明:低剂量 的甲苯(0 05%)单一暴露对斑马鱼胚胎发育有一定毒性,DM S O (0 45%)对斑马鱼胚胎无明显毒性;但甲 苯与D M SO 具有较强的复合毒性效应,随着D M S O 含量的增加,与甲苯单一暴露组相比,斑马鱼胚胎死亡 率显著增加、胚胎孵化率下降、胚胎发育迟缓并生成大量畸形;但甲苯以及甲苯和DM SO 复合物对人胚肾 HEK 293细胞株和人胃癌SGC 7901细胞株的活力均没有明显效应. D M S O 可通过提高甲苯在水中的分散性,增加甲苯的神经毒性,但对离体实验模型无显著效应,故在选择不同生物模型评估有机污染物毒性效 应时,需考虑不同类型助溶剂所产生的复合效应,以减少实验误差. 关键词 甲苯,二甲基亚砜,斑马鱼,毒性. 常用的助溶剂二甲基亚砜(DM SO)、丙酮、乙醇等在常用的浓度下,对环境毒理学常用的模式动物如鱼类、两栖类等没有明显的毒性效应 [1].为评估二英、多氯联苯、多溴联苯醚中某些高氯代、高溴代异构体的生物效应,在常规的D M SO 溶剂中,会适当添加少量的甲苯、正己烷等极性低的有机溶剂,以增加其溶解性[2 5],但这些已知具有较高毒性的溶剂与其它助溶剂之间是否存在相互作用, 并对实验结果造成偏差,需要加以评估. 甲苯作为一种常见的有机溶剂,其脂溶性高,挥发性较强,可通过鳃、体表进入鱼体,能轻易透过血脑屏障,进而抑制乙酰胆碱酯酶活性,并造成神经系统功能损伤、影响神经系统发育,具有明显的神经毒性效应 [6,7].斑马鱼胚胎发育毒性技术是国际认可的评价化学品毒性效应的标准方法[1,8 10]. 在本研究中,选取低剂量的甲苯(0 05%)和不高于0 45%的DM SO,研究助溶剂单一、复合暴露后,对斑马鱼胚胎发育的毒性效应;同时,为进一步验证斑马鱼胚胎毒性实验结果,选择人胚肾293细胞株和人胃癌7901细胞株,研究助溶剂对离体细胞活力的影响,以综合评价其毒性效应. 1 实验方法 1 1实验材料 将性成熟斑马鱼(Danio rerio ,AB 系)雌雄分缸,饲养于流水养殖系统.水温保持在26 2 左右,光照/黑暗周期控制在12h /12h .暴露实验开始前两天将雌雄以1 2配对,自然交配产卵.取受精1hpf(hour post fertilization)以内受精卵进行暴露实验. 1 2暴露实验 挑选正常发育的受精卵,3hpf 开始染毒进行暴露实验.实验于直径为7c m 的玻璃表面皿中进行,所用水均取自系统曝气水.试验浓度为:0(对照组)、0 05%甲苯、0 45%DM SO 、0 1%(D M SO +甲苯)、0 3%(DMSO+甲苯)和0 5%(D M SO +甲苯)(V /V ).其中,3种助溶剂复合物(DM SO +甲苯)分别由甲苯与D M SO 按不同体积比(1 1,1 5,1 9)混合配制而成,各助溶剂复合物试验组中甲
物质对淡水鱼(斑马鱼)急性毒性测定方法
《水质物质对淡水鱼(斑马鱼)急性毒性测定方法》 编制说明 （征求意见稿） 国家环境保护总局南京环境科学研究所 2008年03月
目次 1．任务来源及工作过程 (1) 1.1任务来源 (1) 1.2工作过程 (1) 2．修订本标准的必要性及法律依据 (2) 2.1 必要性及目的意义 (2) 2.2 修订本标准的法律依据 (3) 3．标准修订的原则与技术路线 (3) 3.1 标准修订的原则 (3) 3.2技术路线 (5) 4．标准适用范围 (5) 4.1 试验方法选择 (5) 4.2 试验用鱼选择 (6) 5. 标准的主要内容说明 (6) 5.1 方法原理 (6) 5.2 试剂和材料 (6) 5.3 仪器设备 (7) 5.4 干扰及消除 (8) 5.5 样品 (8) 5.6 试验步骤 (9) 5.7 结果计算 (10) 6. 参考文献 (10)
1．任务来源及工作过程 1.1任务来源 本标准由2006年国家质检总局（国质检财函[2007]971号）和2007年国家质检总局（国质检财函[2007]9909号）和国家环保总局2006 年（环办函（2006）371 号）下达编制任务，由国家环境保护总局南京环境科学研究所负责起草，项目编号为992号。本标准是在已颁布的GB/T 13267-91《水质物质对淡水鱼(斑马鱼)急性毒性测定方法》文本基础上修订的。 1.2工作过程 国家环境保护总局南京环境科学研究所为本标准的修订单位，根据标准修订要求成立了标准编制组，主要成员如下： 表1 编制组主要成员名单 姓名职称专业备注 周军英研究员环境生物项目负责人，制定方案 韩志华助研环境毒理主要人员，组织实施、执笔人 单正军研究员环境毒理主要人员，审定 石利利研究员环境化学主要人员，审定 卜元卿助研环境毒理主要人员，具体实施 其他略参加人 1.2.1 标准开题论证 标准修订任务下达后，国家环境保护总局南京环境科学研究所即投入了前期的调研工作，并于2007年2月12~13日在南京召开了《水质物质对淡水鱼（斑马鱼）急性毒性测定方法》标准修订开题论证会。会议邀请了浙江大学、南京大学、沈阳化工研究院等与标准制订有关的各方面专家5人，专家组认真听取了承担单位的汇报，详细审阅了承担单位提交的开题报告材料，经过充分讨论，提出了专家组意见。专家组肯定了标准编制原则、技术路线并提出了专家组修改意见，标准修订组根据专家意见对方案进行了修改和补充。
斑马鱼-全胚胎免疫组织化学染色
斑马鱼-全胚胎免疫组织化学染色 斑马鱼胚胎的全组织免疫化学染色被广泛应用，这一技术需要额外的步骤来固定和通透以确保卵膜能够完全被溶液渗透。固定、封闭、抗体孵育、洗脱、通透以及底物显色过程都需要比正常的免疫细胞化学/免疫组化更长的时间，以使得溶液可以渗透到达样品的中心。 实验步骤： 1. 将胚胎置于5ml的器皿中固定1h。固定液的选择要谨慎，取决于两点：一是对于同一 种抗体，在冰冻切片中成功使用的固定液，可用来做全胚胎染色实验，二是根据目的蛋白。可用4%的多聚甲醛或者预混合的固定液来固定，预混合的固定液十分适合于神经蛋白。 使用Pasteur移液管来移动胚胎、吸取溶液，这有利于防止来自于移液管窄末端对胚胎的损坏。 2. 用含1%Triton的PBS清洗胚胎至少四次，每次5分钟。 3. 将胚胎置于冰丙酮/PBS混合液中8分钟。 丙酮可用帮助通透坚固的卵膜，对于其他样品如鸡和鼠这一步可省略。 4. 用含1%Triton的PBS清洗胚胎至少四次，每次5分钟。 5. 用封闭液（含1%Triton、10%胎牛血清的PBS）室温孵育胚胎1h。 6. 阻断过氧化物酶：将胚胎置于含0.1%H2O2的封闭液中4°C过夜。 7. 用封闭液清洗胚胎2次。 8. 将Pasteur移液管末端剪掉形成2ml的管子，用其转移胚胎。加入合适浓度的一抗。 一般在全胚胎染色中抗体孵育的时间比较久，为了防止微生物的生长，在稀释一抗的封闭液中会加入0.02%的叠氮化钠。 9. 样品在混合器上4°C缓慢旋转孵育1-4天。 根据不同的抗体以及胚胎的大小，孵育的时间需要进行一些优化。 10. 用含1%Triton、10%胎牛血清的PBS清洗胚胎3次，每次1h。 11. 用含1%Triton的PBS清洗3次，每次10分钟。 12. 用DAB底物室温孵育胚胎2-3h。 13. 将胚胎转移到一个碟子中，加入新鲜的配制的显示底物（每1mlDAB加5ul的过氧化氢）。 14. 用PBS清洗3次，使得样品达到理想的染色强度。 15. 爬片观察胚胎：观察分析前样品于4°C避光储存。 爬片：用融化的含1%琼脂糖的PBS爬片。一旦加入琼脂糖后，用含70%甘油的PBS 覆盖琼脂糖，再在样品上放置一个盖玻片。
斑马鱼的胚胎发育与影响因素
鲁东大学生命科学学院学院20 10 －20 11 学年第 二 学期 《 发育生物学 》课程论文 课程号：2522080 任课教师 刘泽隆 成绩 论文题目：（可指定题目，也可说明题目范围。） 斑马鱼的发育及其发育的影响因素 论文要求：（对论文题目、内容、行文、字数等作出判分规定。） 1. 论文题目：准确得体，简短精炼，醒目 2. 摘要：文字简练，字数不超过正文的5%；关键词不少于三个，关键词之间用分号间隔 3. 正文：内容充实，论据充分、可靠，论证有力，主题明确语言流畅，条理清晰，字数不少于3000字 4.字体：摘要、关键词宋体5号字；题目黑体三号字；正文宋体四号字 10分 教师评语： 教师签字： 年 月 日 斑马鱼的发育及其发育的影响因素 摘要：斑马鱼(zebra fish)，又名蓝条鱼、花条鱼、斑马担尼。斑马鱼由于个体小，养殖花费少，能大规模繁育，且具许多优点，经过30多年的研究应用和系统发展，已有约20个斑马鱼品系，斑马鱼基因数据库里有相关斑马鱼的资料可供查询和下载，方便了研究。本文主要介绍了斑马鱼的发育过程以及葡萄糖溶液的浓度，温度，TCDD 对胚胎发育的影响。 Abstract ：Zebra fish because of the individual small, breeding cost less, can breed, and with many large scale advantage, after 30 DuoNian of research and application and development of the system already had about 20 zebra fish strain, zebra fish genes related data in the material available for inquires zebra fish and download, convenient research. This paper mainly introduces the development process and zebra fish glucose solution concentration, temperature, the influence of TCDD for embryonic development .关键词：斑马鱼；发育；葡萄糖；溶液浓度；温度；TCDD 一、斑马鱼简介 斑马鱼(zebra fish)，又名蓝条鱼、花条鱼、斑马担尼鱼。 斑马鱼是一种常见的热带鱼。斑马鱼体型纤细，成体长3-4cm ，对水质要求不高。孵出后约3个月达到性成熟，成熟鱼每隔几天可产卵一次。卵子体外受精，体外发育，胚胎发育同步且速度快，胚体透明。发育温度要求在25-31℃之间。斑马鱼由于个体小，养殖花费少，能大规模繁育，且具许多优点，吸引了众多研究者的注意。经过30多年的研究应用和系统发展，已有约20个斑马鱼品系，斑马鱼基因数据库里有相关 斑马鱼的资料可供查询和下载，方便了研究。斑马鱼的细胞标记技术、组织移植技术、突变技术、单倍体育种技术、转基因技术、基因活性抑制技术等已经成熟，且有数以千计的斑马鱼胚胎突变体， 学院______________ 专业_____________ 年级________ 班________ 学号_____________姓名______________ 密封线 学生须将文字写在此线以下
磷酸三苯酯对斑马鱼早期生命阶段的神经毒性研究
2016年第11卷 第1期， 254-260生态毒理学报 Asian Journal of Ecotoxicology Vol．11，2016 No．1， 254-260基金项目：国家自然科学基金项目（No．21377118） 作者简介：彭涛（1989-），男，硕士生，研究方向为生态毒理学，E-mail ：52382967@qq．com *通讯作者（Corresponding author ），E-mail ：sunliwei@zjut．edu．cn DOI ：10．7524/AJE．1673-5897．20150506001 彭涛，王思思，任琳，等．磷酸三苯酯对斑马鱼早期生命阶段的神经毒性研究［ J ］．生态毒理学报，2016，11（1）：254-260Peng T ，Wang S S ，Ｒen L ，et al．Neurotoxicity of triphenyl phosphate on the early life stages of zebrafish ［J ］．Asian Journal of Ecotoxicology ，2016，11（1）：254-260（in Chinese ） 磷酸三苯酯对斑马鱼早期生命阶段的神经毒性研究 彭涛1，王思思1，任琳2，芮倩倩2，邵璐滢2，孙立伟3，"，傅正伟 1 1．浙江工业大学生物工程学院，杭州3100322．浙江工业大学海洋学院，杭州3100323．浙江工业大学环境学院，杭州310032收稿日期：2015-05-06录用日期：2015- 05-29摘要：磷酸三苯酯（triphenyl phosphate ，TPP ）作为多溴联苯醚类阻燃剂的替代产品， 是一类生产和需求量均相当高的有机磷酸酯类阻燃剂，目前已在多种环境介质以及生物体内均有不同程度检出。由于结构和有机磷农药具有相似性，其对生物的神经毒性值得关注。本研究以斑马鱼为实验动物，研究了TPP （5 625%g ·L -1）的胚胎发育毒性和行为毒性，并通过检测乙酰胆碱酯酶活性以及神经系统相关基因的转录水平，探讨其可能的毒性机制。研究发现，TPP 可导致斑马鱼胚胎孵化时间延长，体长变短，心率变慢。同时，TPP 暴露也可以影响斑马鱼幼鱼在持续光照和明暗周期刺激下的游泳行为，表现为低浓度增加而高浓度降低其游泳速度。而TPP 暴露后幼鱼乙酰胆碱酯酶活性以及神经发育相关基因转录水平的变化可能是导致其行为毒性的原因。虽然实验中所设定的暴露浓度高于环境中一般浓度，但TPP 在短期暴露中所表现出的胚胎和神经发育毒性表明TPP 对于水生生物可能存在一定风险，需要进一步研究加以确认。 关键词：有机磷酸酯阻燃剂；胚胎毒性；行为毒性；基因转录；乙酰胆碱酯酶文章编号：1673-5897（2016）1-254-07中图分类号：X171．5 文献标识码：A Neurotoxicity of Triphenyl Phosphate on the Early Life Stages of Zebrafish Peng Tao 1，Wang Sisi 1，Ｒen Lin 2，Ｒui Qianqian 2，Shao Luying 2，Sun Liwei 3，"，Fu Zhengwei 1 1．College of Biotechnology and Bioengineering ，Zhejiang University of Technology ，Hangzhou 310032，China 2．Ocean College ，Zhejiang University of Technology ，Hangzhou 310032，China 3．College of Environment ，Zhejiang University of Technology ，Hangzhou 310032，China Ｒeceived 6May 2015accepted 29May 2015 Abstract ：Triphenyl phosphate （TPP ）belongs to the family of organophosphate flame retardants （OPFＲs ）．Due to the phase-out of some brominated flame retardants ，the production and use of TPP has gradually increased as alter-natives．TPP is a frequently detected contaminant in the environment and wildlife ，and the effects of TPP on the de-veloping nervous system are of concern since OPFＲs are structurally similar to organophosphate pesticides．In this study ，the zebrafish were employed as experimental animal ，and the developmental toxicity of TPP （5 625%g ·L -1）on embryo and the behavioral toxicity on larvae were investigated．Moreover ，in order to explore the underlying mechanisms ，the activity of acetylcholinesterase （AChE ）enzyme and the transcriptional responses of nervous sys-
基于斑马鱼的模式生物的关于人类疾病的最新研究进展
基于斑马鱼的模式生物的关于人类疾病的最新研究进展 摘要：作为一种理想的生物实验模型，斑马鱼在生物学和人类疾病发面有着广泛的科研价值。参考以斑马鱼物生物模型所得的实验研究对于人类疾病的防治有重要的借鉴意义。 关键词：斑马鱼，模式生物，人类疾病 正文： 随着现代生物科学的不断发展，传统的以单一生物模型为研究模板的方式已经不能 满足日益丰富的研究内容，越来越多的生物学研究开始转向以模式生物为研究对象。由于 模式生物的基因在进化的保守性以及遗传密码的通用性，模式生物为其他的实验生物提供 了良好的实验模板，因此，选择合适的模式生物可以使实验祈祷事半功倍的效果。[1] 就目前所用于科学实验的模式生物而言，主要有果蝇，大肠杆菌，斑马鱼，小鼠， 酵母菌和拟南芥等。其中，斑马鱼以其容易捕获，易于饲养，生长周期短，繁殖能力强， 基因组与人类有高度保守性，使得斑马鱼及其胚胎在模式生物研究领域起着不可替代的重 要作用[2]。早在1981年，在Oregon带血的著名遗传学家Streisinger等就在Nature杂志 上发表了第一篇关于斑马鱼的科研论文。自此之后，斑马鱼就开始广泛的运用于发育与遗 传毒理学、生物学、医学、环境毒理学和药物研发等多个领域。[3]在这里主要介绍斑马鱼 及其胚胎在人类疾病模型构建中的研究应用。 一、关于造血疾病的模型研究 斑马鱼血小板和人类的有所差异，主要为带有稀疏细胞质巨大细胞核的有核细胞。但在电镜下表面较为光滑，染色质细密，较易于观察。不过最主要的是两者在生理功能上 具有某些相似性，包括血小板的黏附、激活聚集和释放反应等。所以斑马鱼作为模式生物 研究血小板具有较强的可行性。Gregory等[4]通过将斑马鱼幼鱼暴露在FeCl3中，利用激光损伤的方法损伤血管壁，构建血管闭塞模型。发展了激光介导血栓形成的方法，并通过这 个方法来了解斑马鱼血小板功能的变化。Langenau等[5]将源于小鼠的c-myc基因与斑马鱼 胚胎的Rag2基因融合，再在这个基因的尾部连接上GFP基因，之后植入到斑体细胞，从而影响了造血细胞的的基因表达，建立了斑马鱼白血病模型。 二、关于神经系统疾病的模型研究 在斑马鱼关于人类神经系统的疾病研究主要指关于阿尔茨海默病(AD)，帕金森综合 症(PD)，亨廷顿舞蹈症(HD)以及肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)的疾病研究。
台湾地区斑马鱼研究现状
HEREDITAS (Beijing) 2012年9月, 34(9): 1089―1096 ISSN 0253-9772 https://www.wendangku.net/doc/3b7009794.html, 综 述 收稿日期: 2012?03?01; 修回日期: 2012?09?12 基金项目:马偕中原合作计划项目(编号：MMH-CY-9905; MMH-CY-10001; MMH-CY-10005)资助 作者简介:陈吉芳, 博士后, 研究方向：转基因斑马鱼。Tel: 886-32653546; E-mail: randeonneo@https://www.wendangku.net/doc/3b7009794.html, 通讯作者:萧崇德, 助理教授, 研究方向：建立斑马鱼疾病模式。E-mail: cdhsiao@https://www.wendangku.net/doc/3b7009794.html,.tw 网络出版时间: 2012-8-7 15:00 URL: https://www.wendangku.net/doc/3b7009794.html,/kcms/detail/11.1913.R.20120807.1500.003.html DOI: 10.3724/SP.J.1005.2012.01089 台湾地区斑马鱼研究现况 陈吉芳1, 陈持平2, 萧崇德1,3 1. 中原大学生物科技系, 中坜 32023; 2. 马偕纪念医院医学研究部, 淡水 25160; 3. 中原大学奈米科技中心, 中坜 32023 摘要: 台湾地区斑马鱼研究起始于1996年, 在经历了约8年的萌芽期(1996~2003年)之后, 目前已进入到茁壮 期(2004~现今), 现今全台湾共有83个实验室使用斑马鱼作为实验材料, 台湾地区斑马鱼研究社群的研究主题可大致分成3大类: (1) 胚胎发育; (2)人类疾病; (3) 生物技术。累积至今与斑马鱼相关论文发表总数已达到342篇。自2010年起, 台湾也成立了两个斑马鱼种质资源库(TZCAS 与ZeTH)。在种质资源库的充分协助下, 目前许多医院的临床医师、工程与生物信息相关领域的研究人员, 也开始加入斑马鱼研究社群进行跨领域的整合性研究, 成为现今台湾地区斑马鱼研究的一大特色。 关键词: 斑马鱼; 种质资源库; 台湾地区 Zebrafish research in Taiwan CHEN Chi-Fang 1, CHEN Chih-Ping 2, HSIAO Chung-Der 1,3 1. Department of Bioscience Technology , Chung Yuan Christian University , Chung-Li 32023, Taiwan, China ; 2. Department of Medical Research , Mackay Memorial Hospital , Tamsui 25160, Taiwan, China ; 3. Center of Nanotechnology , Chung Yuan Christian University , Chung-Li 32023, Taiwan, China Abstract: The initiation time for zebrafish research in Taiwan was around 1996 and experienced eight years (1996-2003) to establish the fundamental base. From 2004 onwards, zebrafish research project and population in Taiwan is exponentially increasing to a total number of 83 independent research laboratories at this moment. Three major research topics of devel-opmental biology, human disease, and biotechnology are conducted by zebrafish community in Taiwan. Up to now, 342 scientific refereed papers have been published by Taiwan researchers. By 2010, two zebrafish stock centers of TZCAS and ZeTH have been established to provide fish resources to zebrafish community. By the fully support of two zebrafish stock centers, attending physicians and experts in the fields of engineering and bioinformatics are working together with zebrafish people and obtained fruitful results in zebrafish researches in recent years. Keywords: zebrafish; stock center; Taiwan
斑马鱼在新药药理毒理方面的研究_梁爽
中山大学研究生学刊(自然科学、医学版) 第30卷第3期 J O U R N A LO FT H EG R A D U A T E S V O L.30№3 2009 S U NY A T-S E NU N I V E R S I T Y(N A T U R A LS C I E N C E S、M E D I C I N E) 2009 斑马鱼在新药药理毒理方面的研究＊ 梁 爽 (中山大学生命科学学院,广州510275) 【内容提要】斑马鱼作为一种新的模式动物,已经在新药的药理和毒理研究 方面得到了广泛的应用。随着基因学和胚胎学的发展,证明了斑马鱼的生物学 特性接近于人类生长全过程,使其在人类疾病研究等方面表现出重要的作用。 本文阐述了斑马鱼的特点,以及其应用于人类疾病模型和药物药理毒理方面的 成果和前景。 【关键词】斑马鱼;模式动物;药理;毒理 斑马鱼(D a n i o r e r i o)俗称蓝条鱼、花条鱼、斑马担尼鱼,隶属鲤科、短担尼 鱼[1],是一种热带观赏鱼,因其体侧具有像斑马一样纵向的暗蓝与银色相间的条纹而得名。产于孟加拉和印度等国。斑马鱼成鱼体型较小,体长4～6厘米,胚胎透明且体外发育,易于活体观察;生长发育快,受精后24小时主要器官原基基本形成,便于研究组织器官的发育和功能;2～3个月可长成成鱼,繁殖能力强且易于饲养,单独一对成年的鱼一星期就可以繁殖一次,雌鱼每周可产卵200～300枚,可快速获得大量胚胎[2]。斑马鱼的特点使其早在20世纪30年代,就作为经典的生长和胚胎模型。在20世纪70年代开始受到科学家们的关注,并成为最重要的模式脊椎动物之一[3]。S t r e i s i n g e r等( 1981)在“N a t u r e”上发表了斑马鱼的体外受精技术、单倍体诱导技术,建立了纯合品系,并介绍了斑马鱼的第一个自然突变体—g o l d e n,这是斑马鱼成为模式动物新宠的开端[4]。自20世纪90年代初以来,斑马鱼因其多方面的优点已成为模式动物家族中重要的一员,受到越来越多的重视和利用。 斑马鱼由于发育前期细胞分裂快,胚体透明,特定的细胞类型易于识别等有利因素,成为脊椎动物中最适于做发育生物学和遗传学研究的模式生物[5]。很多致力于用胚胎和基因处理疾病模型的研究者都转而对斑马鱼产生了兴趣。随着今年来的研究发现,斑马鱼虽然不是哺乳动物,但是随着斑马鱼基因技术得到了发展,如克隆,转基因技术,诱变和绘制方法,以及斑马鱼基因组测序工程的完成,发现斑马鱼的基因与人类的基因保守度达到85%,使得斑马鱼后来居上成为了新一代的人类疾病模型。 ＊收稿日期:2009-09-17 作者简介:梁爽,女,中山大学生命科学学院药理学2008级硕士研究生,研究方向:天然药物药理;E-m a i l:c o l d v i v i@126.c o m.
斑马鱼在转基因动物研究中的应用
·研究报告· 生物技术通报 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第2期 1981年美国俄勒冈大学著名遗传学家George Streisinger 在《Nature》杂志上发表关于斑马鱼人工雌核发育的研究论文，标志着斑马鱼开始进入实验室模式生物研究领域，至今已有超过30年的历史。20世纪90年代中国开始参与斑马鱼研究。近几年，随着斑马鱼模式生物南方中心、北方中心和国家种质资源库相继成立，中国斑马鱼研究也开始进入高速发展阶段。由于体积小、代时短、胚胎透明、体外发育等特点，斑马鱼在模式生物研究中的地位越来越重要。随着显微注射、重组体构建以及荧光标记等技术的快速发展，转基因斑马鱼已经广泛用于脊椎动物基因表达调控、发育分化、形态发生、人类疾病、药物筛选和环境检测等研究领域。本文将 收稿日期：2012-07-20基金项目： 中国高技术研究发展“863”计划（2008AA10Z402），国家自然科学基金项目（31170119），中国农业科学院基础研究基金项目 （0042011006，0042012003） 作者简介：刘丽丽，女，硕士研究生，研究方向：微生物分子生物学与基因工程；E -mail ：lilyinmay@https://www.wendangku.net/doc/3b7009794.html, 通讯作者：闫艳春，女，博士，教授，研究方向：微生物分子生物学与基因工程；E -mail ：yanyanchun@https://www.wendangku.net/doc/3b7009794.html, 斑马鱼在转基因动物研究中的应用 刘丽丽?王健?吴巍?王海胜?闫艳春 （中国农业科学院研究生院，北京 100081） 摘 要： 近年来的研究表明，脊椎动物斑马鱼已发展成为一种十分重要的模式生物，在基因表达调控、发育与分化、形态发生、发病机理、药物筛选和环境检测等诸多研究领域都有重要的应用价值。在回顾模式生物应用与发展的基础上，着重概述斑马鱼作为模式生物的优越性、斑马鱼转基因技术的发展现状、转基因斑马鱼的应用领域，并提出斑马鱼转基因技术进一步发展可能面临的问题。 关键词： 模式生物 斑马鱼 Danio rerio 转基因动物 应用 Application of Zebrafish in Research of Transgenic Organisms Liu Lili Wang Jian Wu Wei Wang Haisheng Yan Yanchun （Graduate School of Chinese Academy of Agracultural Sciences ，Beijing 100081） Abstract:?The recent explosion of transgenic zebrafish lines in the literature demonstrates the value of this model system for detailed in vivo analysis of gene regulation, development and differentiation and morphogenetic movements, as well as drug screening and environment monitoring. After an outline of the application and development history of vital models from Escherichia coli to Musmusculus , the superiority of zebrafish as a model organism will be emphasized. Then this article will review the development history of transgenic technology in zebrafish and the uses of transgenic zebrafish. And finally problems in future development of transgenic zebrafish will be presented. Key?words:?Model organism Zebrafish Danio rerio Transgenic animal Application 就斑马鱼在转基因动物研究中的应用进行介绍，并对该领域存在的问题进行总结。 1 常见模式生物 1.1 模式生物的发展历史 模式生物（model organism）能够代表一类生物的基本特点，结构相对简单并易于进行试验操作，因此普遍用于遗传学、发育生物学、生理学和分子细胞学等方面的研究。其普遍特点是：首先，生理特征能够代表生物界的某一大类群；其次，试验材料容易获得，并易于在实验室内饲养、繁殖速度快，研究维持费用低；最后，容易进行试验操作，特别是遗传学分析［1］。一般认为模式生物的应用源于格
香加皮对斑马鱼发育毒性及心脏毒性的影响
536 环球中医药2017年5月第10卷第5期 Global Traditional Chinese Medicine,May 2017,Vol.10,No.5 四论著四 基金项目:北京市科学研究与研究生培养共建项目(2050205) 作者单位:100102 北京中医药大学中药学院 中药品质评价北京市重点实验室[冯娅茹(硕士研究生)二赵崇军二倪媛媛二田敬欢二夏青二樊娇娇二张文婷二马志强二林瑞超] 作者简介:冯娅茹(1993-),女,2015级在读硕士研究生三研究方向:中药毒性成分研究三E?mail:1043742239@https://www.wendangku.net/doc/3b7009794.html, 通信作者:林瑞超(1954-),博士,教授,研究员,博士生导师三研究方向:中药质量控制与物质基础研究三E?mail:linrch307@https://www.wendangku.net/doc/3b7009794.html, 香加皮对斑马鱼发育毒性及心脏毒性的影响 冯娅茹 赵崇军 倪媛媛 田敬欢 夏青 张文婷 樊娇娇 马志强 林瑞超 【摘要】 目的 探讨香加皮水提液对斑马鱼的发育毒性及不同暴露时间药物对心脏毒性的影响三方法 参照经济合作与发展组织推荐的方法,将受精后6小时(6hour?post?fertilization,6hpf)胚胎暴露在含有不同浓度香加皮水溶液的24孔板中,分别在24二48二72二96hpf 阶段测定胚胎/幼鱼的自主抽动次数二心率二孵化率二死亡率等指标三随后,使用不同浓度的香加皮水溶液处理发育至48二72二96hpf 的斑马鱼24小时,通过死亡率确定不同暴露阶段对斑马鱼心脏毒性的影响三结果 各暴露组24hpf 自主抽动次数增加二48hpf 心率以及72hpf 孵化率显著降低,与正常对照组相比均有显著性差异(P <0.05);24hpf 低浓度给药组胚胎发育迟缓二眼点未发育二头部偏小或未发育,高浓度组发育畸形或停留在体节期;48hpf 胚胎卵黄囊畸形二黑色素生成抑制二尾芽未脱落;72hpf 幼鱼出现身体弯曲二心包水肿二卵黄囊畸形等中毒症状三不同发育阶段斑马鱼急性毒性暴露实验结果表明:香加皮对48二72二96hpf 斑马鱼的半数致死浓度(LC 50)分别为:0.866mg /mL二0.693mg /mL 和0.843mg /mL三结论 香加皮对斑马鱼具有明显的发育毒性和心脏毒性,且48hpf 斑马鱼非常适合进行心 脏毒性药物筛选三【关键词】 香加皮; 发育毒性; 心脏毒性; 斑马鱼 【中图分类号】 R285.5 【文献标识码】 A doi:10.3969/j.issn.1674?1749.2017.05.006Effects of Cortex Periplocae on zebrafish developmental toxicity and cardiac toxicity FENG Yaru ,ZHAO Chongjun ,NI Yuanyuan ,et al. School of Chinese Materia Medica ,Beijing University of Chinese Medicine ,Beijing 100102,China Corresponding author :LIN Ruichao ,E?mail :linrch307@https://www.wendangku.net/doc/3b7009794.html, 【Abstract 】 Objective To study the toxic effects of Cortex Periplocae on zebrafish embryo development,and the effects of different exposure duration on the heart toxicity.Methods The methods recommended by Organization for Economic Co?operation and Development was refered,zebrafish embryos of 6hour?post?fertilization were exposed to 24?well plates with aqueous extraction of Cortex Periplocae of various concentrations.Spontaneous movements,heart rate,hatching rate,mortality rate in 24hpf and 48hpf were used to assess the effects of Cortex Periplocae on the zebrafish development under the microscope.Zebrafish at 48hpf,72hpf,96hpf were treated with aqueous extraction of cortex periplocae with various concentrations for 24h to determine the effects of different exposure duration on the heart toxicity.Results Compared with the normal control group,the number of spontaneous movements of 24hpf,heart rate of 48hpf and the hatching rate of 72hpf were significantly lower in the exposed group,the results had significant difference (P <0.05).Embryos of 24hpf exposed to low concentration showed immature development of head and eyes spot,and embryos in high concentration group were malformed or stayed in